CN115074402A - 一种采用酶法合成的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶及其合成方法 - Google Patents
一种采用酶法合成的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶及其合成方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种采用酶法合成的γ‑聚谷氨酸钠交联水凝胶及其合成方法,该水凝胶包括由聚谷氨酸钠、甲基葡萄糖二油酸酯及余量去离子水组成的反应原料,以及促进反应原料中聚谷氨酸钠与甲基葡萄糖二油酸酯进行交联反应的脂肪酶催化剂;制备时先将聚谷氨酸钠分散于一半去离子水中,获得溶液A,再将甲基葡萄糖二油酸酯加入另一半去离子水中,获得溶液B,最后将溶液A和溶液B混合,调节pH并加入发酵罐内,加入脂肪酶催化剂,搅拌反应后,冷却静置,将反应产物油酸过滤去除,即可。本发明通过脂肪酶催化技术,用聚谷氨酸钠和甲基葡萄糖二油酸酯合成交联γ‑聚谷氨酸钠交联水凝胶,最后反应物产物油酸不溶于水,能够很好地分离提纯水凝胶。
Description
技术领域
本发明属于γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶制备领域,尤其涉及一种采用酶法合成的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶及其合成方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸钠是一种由大豆发酵来源的水溶性高分子,由 D-谷氨酸和 L-谷氨酸通过 γ- 谷氨酰胺键聚合而成,其侧链存在大量游离羧基,易于修饰,多种方式均可以制备交联的γ-聚谷氨酸钠水凝胶,可溶涨大于其自身重量几百至几千倍的水,其应用广、安全性高,因此已经应用于医疗、化妆品等行业。
γ-聚谷氨酸钠水凝胶常见的交联方法有物理交联法和化学交联法。物理法需要电子直线加速器或60Co辐射装置,因此其广泛应用受到限制。化学交联法主要有交联剂与γ-聚谷氨酸钠在一定条件下发生反应,交联剂的种类有很多,有多糖、二元胺、卤代烷、硫化物、环氧树脂、复合盐,还有乙二醇缩水甘油醚等等,不同的交联剂制得的聚谷氨酸水凝胶的性质不同,应用也不同。
目前研究报道生物安全性最高、得到的水凝胶性能和降解速率最佳的是用多糖作为交联剂,但是此反应需要二甲基亚砜水溶性中有碳化二亚胺存在下,通过酯化作用一步合成,这个反应实际交联剂还是碳二亚胺,并且还有试剂残留的风险。
由此,现亟需一种新型的制备γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的工艺,而使得产物易于分离纯化。
发明内容
发明目的:本发明的第一目的是提供一种利用脂肪酶来促进聚谷氨酸钠与甲基葡萄糖二油酸酯进行交联反应,以葡萄糖基为连接的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶;
本发明的第二目的是提供上述γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的合成方法。
技术方案:本发明采用酶法合成的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶,包括由聚谷氨酸钠0.8-1.2%、甲基葡萄糖二油酸酯0.1-0.24%及余量去离子水组成的反应原料,以及促进反应原料中聚谷氨酸钠与甲基葡萄糖二油酸酯进行交联反应的脂肪酶催化剂。
本发明通过脂肪酶催化技术,用聚谷氨酸钠和甲基葡萄糖二油酸酯合成交联γ-聚谷氨酸钠水凝胶,最后反应物产物油酸不溶于水,能够很好地分离提纯水凝胶,使得其性能更优。其反应原理如下所示:
其中,a,b,c,n:代表聚谷氨酸钠1个或2个及以上的分子数量。
进一步说,本发明水凝胶采用的脂肪酶催化剂可为皱褶假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶。
进一步说,本发明水凝胶采用的脂肪酶催化剂的浓度为100-200mg/ml。
进一步说,本发明水凝胶采用的聚谷氨酸钠的分子量为1万和/或70万。
本发明合成上述γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的方法,包括如下步骤:
(1)将聚谷氨酸钠分散于一半去离子水中,搅拌至完全溶解,获得溶液A;
(2)将甲基葡萄糖二油酸酯加入另一半去离子水中,加热搅拌溶解后降温,获得溶液B;
(3)将溶液A和溶液B混合,采用pH调理剂调节pH并加入发酵罐内,加入脂肪酶催化剂,在40-45℃条件下搅拌反应36-42h后,冷却静置,将反应产物油酸过滤去除,即可。
进一步说,本发明制备方法的步骤(1)中,所述搅拌速率为200-400rpm,搅拌时间为20-60min。
进一步说,本发明制备方法的步骤(2)中,所述加热至50-70℃。
进一步说,本发明制备方法的步骤(3)中,所述pH调理剂为柠檬酸、柠檬酸钠或氢氧化钠。
进一步说,本发明制备方法的步骤(3)中,所述pH值为6.5-7.0。
进一步说,本发明制备方法的步骤(3)中,所述搅拌的速率为100-300rpm。
有益效果:与现有技术相比,本发明的显著优点为:该γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶以天然化合物为交联剂,应用于环境和生物医学领域,能够最终在环境或者人体内降解,安全无害;同时,制备时通过脂肪酶催化技术,用聚谷氨酸钠和甲基葡萄糖二油酸酯合成交联γ-聚谷氨酸钠水凝胶,最后反应产物油酸不溶于水,能够很好分离提纯水凝胶;且通过对反应条件的控制能够提高产物的纯度和产量,使大分子化合物的分子量分布更均匀。
附图说明
图1为空白对照组0h的细胞划痕修复测试图;
图2为空白对照组24h的细胞划痕修复测试图;
图3为空白对照组48h的细胞划痕修复测试图;
图4为实施例11的0h的细胞划痕修复测试图;
图5为实施例11的24h的细胞划痕修复测试图;
图6为实施例11的48h的细胞划痕修复测试图;
图7为本发明水凝胶的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。需说明的是,本发明所采用的原料均可购自市售。
实施例1-11
本发明实施例1至实施例11的制备工艺参数如下表1所示。
表1 实施例1至实施例11的制备工艺参数
上述实施例中余量为去离子水,下述对比例中同理。
上述实施例的制备方法包括如下步骤:
(1)将聚谷氨酸钠分散于一半去离子水中,开启搅拌200-400rpm搅拌20-60min至完全溶解,获得溶液A;
(2)将甲基葡萄糖二油酸酯加入另一半去离子水中,加热至50-70℃搅拌溶解后降温,获得溶液B;
(3)将溶液A和溶液B混合,调节pH并加入于发酵罐内,加入CRL,在40-45℃条件下100-300rpm搅拌,36-42h反应完全;
(4)冷却静置,将反应产物油酸过滤去除。
其中,pH调节可采用柠檬酸、柠檬酸钠或氢氧化钠。
对比例1
采用目前常用的乙二醇二缩水甘油醚与聚谷氨酸钠进行交联反应,其组分及反应条件如下表2所示。
表2 对比例1的水凝胶的制备工艺参数
该对比例的水凝胶的制备方法包括如下步骤:将一定量的聚谷氨酸钠和交联剂乙二醇二缩水甘油醚溶于去离子水,200-400rpm搅拌20-40min,水浴50-70℃保温60-80min。
对比例2
该对比例即为pH值为7.0、分子量为70万的聚谷氨酸钠1%和余量水。
性能检测
(一)稳定性测试
γ-聚谷氨酸钠水凝胶属于非牛顿流体,不同分子量能带来不同的黏度变化,相对分子质量与特性黏数的关系遵循爱因斯坦粘度定律。本发明用NDJ-9S粘度仪测试水凝胶粘度。γ-聚谷氨酸钠水凝胶置于45℃恒温考察箱2个月,复测粘度。粘度测试条件:3#/4#转子,12rpm,所获得的结果如下表3所示。
表3 实施例1-实施例11及对比例1、对比例2的粘度性能
通过表3可知,本发明采用特定的原料及工艺能够制备获得水凝胶,且该水凝胶稳定性强。
(二)生物安全性测试
将L929细胞培养在含10%胎牛血清和抗生素(青霉素100 U/mL,链霉素100 ug/mL)的MEM培养液中,置于37 °C,5% CO2培养箱中培养。用0.25%胰酶(含EDTA)消化细胞制备成单细胞悬液,细胞悬液离心(200 G,3 min),然后将细胞重新分散于培养基中,调整细胞密度为1×105 个/mL的细胞悬液;接种上述细胞悬液到1个96孔培养板中,每孔100 L,置37 °C培养箱中(5% CO2,37 °C,>90%湿度)培养24 h;待细胞长成单层后,吸出原来的培养液,分别加入100 uL不同浓度的试验样品浸提液(100%、75%、50%、25%)、空白对照液、阳性对照(100%)和阴性对照液(100%)37 °C,5% CO2培养24 h。每组做5个平行样;培养24 h后,取出96孔板先做细胞形态学观察,然后吸出原来的培养液,每孔加50 μLMTT(1 mg/mL),置于37°C,5% CO2培养箱中培养2 h,吸弃上清,加100 μL 99.9%纯度的异丙醇溶解结晶。
在酶标仪上以570 nm为主吸收波长,650 nm为参考波长测定吸光度值。
细胞存活率%= [OD(样品)-OD(空白)] / [OD(对照)- OD(空白)]×100%
实施例100%浸提液细胞存活率对比,如下表4所示。
表4 实施例1-实施例11及对比例1、对比例2的生物安全性能
通过表4可知,所有实施例在细胞毒性测试中均可以判断为对细胞无毒,实施例6、实施例10及实施例11的生物安全性结果显示,更有益于细胞的增殖。由此,选取实施例6、实施例10和实施例11进行细胞划痕修复测试。
(三)细胞划痕修复测试
(1)将所用器材在超净台内紫外照射30 min,用马克笔在6孔板背后用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔0.5-1 cm一道,横穿过孔,每孔至少穿过5条线。
(2)收集对数期3T3细胞,1000 rpm,5 min离心后用完全培养基重悬并调整细胞悬液浓度,每孔加入500 μL,每孔细胞数量为1.3×106,掌握为过夜能铺满孔底,每组设3个复孔。5%CO2,37 ℃孵育24 h,至细胞单层铺满孔底。
(3)用200 μL枪头比着直尺,垂直于背后的横线划痕,枪头要垂直,不要倾斜;用PBS洗细胞3次,去除划去的细胞,将孔中的完全培养基替换为500 μL含不同浓度药物的无血清培养基,同时设立空白对照组,用倒置显微镜对每个孔进行拍照,作为0h时的细胞图像;
(4)将细胞放入5%CO2,37℃培养箱中孵育,每隔24h进行观察拍照,培养至48h时结束实验,分别如下图2至图6所示。用imageJ软件处理照片,计算出每张照片中划痕的宽度。
表5 实施例不同时刻划痕宽度
结合表5和图2至图6可知,与空白对照组相比,本发明制备的γ-聚谷氨酸钠水凝胶和γ-聚谷氨酸钠对细胞修复都有正面影响,实施例11对于细胞修复有更好的作用,且安全无残余试剂。相比于对比例1,本发明的制备的γ-聚谷氨酸钠水凝胶更优。
此外,针对实施例16制备的水凝胶进行结构表征,获得的结果如图7所示。通过该图7可知,本发明的交联方式可以达到预期的效果,水凝胶有明显的交联结构,呈3D网络状。
除上述实施例之外,本发明采用的脂肪酶催化剂还可为南极假丝酵母脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶。
Claims (10)
1.一种采用酶法合成的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶,其特征在于:该水凝胶包括由聚谷氨酸钠0.8-1.2%、甲基葡萄糖二油酸酯0.1-0.24%及余量去离子水组成的反应原料,以及促进反应原料中聚谷氨酸钠与甲基葡萄糖二油酸酯进行交联反应的脂肪酶催化剂。
2.根据权利要求1所述采用酶法合成的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶,其特征在于:所述脂肪酶催化剂为皱褶假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶。
3.根据权利要求2所述采用酶法合成的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶,其特征在于:所述脂肪酶催化剂占反应原料的浓度为100-200mg/ml。
4.根据权利要求1所述采用酶法合成的γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶,其特征在于:所述聚谷氨酸钠的分子量为1万和/或70万。
5.一种合成权利要求1所述γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将聚谷氨酸钠分散于一半去离子水中,搅拌至完全溶解,获得溶液A;
(2)将甲基葡萄糖二油酸酯加入另一半去离子水中,加热搅拌溶解后降温,获得溶液B;
(3)将溶液A和溶液B混合,采用pH调理剂调节pH并加入发酵罐内,加入脂肪酶催化剂,在40-45℃条件下搅拌反应36-42h后,冷却静置,将反应产物油酸过滤去除,即可。
6.根据权利要求5所述合成γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述搅拌速率为200-400rpm,搅拌时间为20-60min。
7.根据权利要求5所述合成γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的方法,其特征在于:步骤(2)中,所述加热至50-70℃。
8.根据权利要求5所述合成γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的方法,其特征在于:步骤(3)中,所述pH调理剂为柠檬酸、柠檬酸钠或氢氧化钠。
9.根据权利要求5所述合成γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的方法,其特征在于:步骤(3)中,所述pH值为6.5-7.0。
10.根据权利要求5所述合成γ-聚谷氨酸钠交联水凝胶的方法,其特征在于:步骤(3)中,所述搅拌的速率为100-300rpm。
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