CN115073680A - 温敏缓释水凝胶载体、载MicrocinC7水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

温敏缓释水凝胶载体、载MicrocinC7水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了温敏缓释水凝胶载体、载MicrocinC7水凝胶及制备方法和应用，属于缓释水凝胶技术领域。温敏缓释水凝胶载体的制备方法为：以pH为9‑10的水为溶剂，甲基丙烯酸缩水甘油酯与明胶进行化学接枝，得到改性明胶。以水为溶剂，加入改性明胶混合均匀后，在加入异丙基丙烯酰胺和2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱得到水凝胶前驱体溶剂，加入引发剂，发生自由基引发双键交联反应，加热成胶后得到温敏缓释水凝胶载体。本发明提供的温敏缓释水凝胶载体，作为载体，可以有效降低降解MicrocinC7的速率，增加药物缓释时间。

Description

温敏缓释水凝胶载体、载MicrocinC7水凝胶及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及缓释水凝胶技术领域，更具体的涉及温敏缓释水凝胶载体、载MicrocinC7水凝胶及制备方法和应用。
背景技术
牙周炎(periodontitis)是一种以厌氧菌为主的致病菌诱导引起牙周组织的破坏的慢性进行性疾病，牙菌斑生物膜为牙周病始动因子，主要以G-厌氧菌和一些真菌为主。由于龈上及龈下菌斑的长期积聚，导致牙周致病菌产生大量有害副产物和酶，如白细胞毒素、胶原酶、纤溶蛋白酶等，触发宿主免疫反应，破坏牙周支持组织。牙周病的初始阶段是牙龈炎，此时炎症仅局限于牙龈，保持良好的口腔卫生习惯可以有效地去除大量菌斑，缓解牙龈炎症。相反，牙菌斑如果没有被及时清除，则会慢慢变硬，形成牙垢或牙结石，日常刷牙以及用牙线清洁等方法无法清除牙结石。进而细菌开始侵入深部牙周组织，导致牙周膜破坏、牙槽骨吸收、牙龈结合上皮沿着牙齿表面向根部迁移，在牙龈和牙齿之间形成病理性牙周袋，此时的疾病状况被称为牙周炎。牙周炎会造成牙齿支持组织组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)持续性不可逆转的破坏，是导致人类牙齿缺失的首要原因。牙齿缺失进而影响人们的咀嚼、面容美观和发音，对患者社交及心理产生不良影响。不仅如此，牙周炎还与系统性疾病如心血管疾病、呼吸系统疾病、风湿性关节炎以及糖尿病等发生相关。因此，牙周炎是影响口腔健康乃至全身健康的重要疾病。牙周疾病的治疗，若能从病原因子的层面阻断疾病的发生发展，是最为理想的方法。而清除牙菌斑，减缓及防止菌斑的再聚集是治疗牙周病、防止其复发的主要途径。
牙周炎的基本治疗方法是通过机械治疗去除致病菌，例如超声龈上洁治术、龈下刮治术和根面平整术，然而这些方法都难以进入牙周袋底部及根部分叉等器械难以到达的区域。在牙周炎的临床治疗中，虽然在绝大多数情况下单独机械治疗可以有效改善牙周状况，但口腔局部抗菌药物辅助治疗可有效增加疗效，且在机械治疗尽可能清除龈下菌斑、破坏菌斑生物膜后使用药物，可最大程度发挥药效。因此，用抗菌药物辅助治疗牙周炎成为牙周病药物治疗的主要用药方法。
牙周炎辅助用药治疗包括全身用药和局部用药两大类，全身用药(硝基咪唑类、四环素类、青霉素类、大环内酯类等药物)存在牙周袋浓度较低、易诱导耐药菌群的产生、易产生副作用、菌群失调、不易坚持用药等问题。与全身给药相比，局部用药能有效消除或抑制牙龈菌群、减少炎症、并有助于停止骨吸收、减少毒副作用、药物浓度高、作用时间长等优点，但同时也存在如生物分布差、疗效选择性低、药物突发释放等弊端。
牙周局部抗菌缓释剂具有用药剂量小、到达病变部位的药物浓度保持在有效范围内、有效血药浓度维持时间长、血药浓度峰谷波动小、提高病人服药的顺应性等优点，在牙周炎的临床治疗中展示了良好的治疗效果和应用前景。
理想的牙周缓释剂材料应具备以下的特性：①药物缓释作用，袋内所携带的药物可保留较长时间，能够保持较长时间的有效浓度水平；②足够的机械强度和粘附力，使其在拉扯过程中不易断裂或脱落；③良好生物降解性；④生物相容性高；⑤生物安全性，要求它可通过水解或酶解而成为对机体无害的小分子，并通过新陈代谢排出体外或被吸收；⑥价格合适。
目前临床“金标准”为盐酸米诺环素软膏(派丽奥)，其主要成分是二甲胺四环素，以羟乙基纤维素，氨基烷基甲基丙烯酸酯，三乙酸甘油酯和甘油为载体，活性成分为2％盐酸米诺环素，有抗菌作用强、局部浓度高、药物缓慢释放、在牙周袋内停留时间长等优点，是目前临床应用非常好的牙周缓释剂。但派丽奥它的主要成分是四环素，属于抗生素类药物，长久使用会产生一定的细菌耐药性，对人体造成危害，同时它也是一种溶性油脂缓释剂，遇水变为较硬的高粘度凝胶状，不易从牙周袋流出，不能被组织吸收，这是需要改善的地方。
医学迅速发展的同时，医用材料在临床上的应用意义变得越来越重要。医用材料的应用虽然给患者带来了很大的方便，但是往往会引起患者的感染。据美国疾病控制与预防中心2013年报道，在美国耐药病原体感染了近300万人，可以看到耐药细菌感染的严重性。细菌耐药的机制为细菌可以明确地限制或降低其细胞膜对抗生素的通透性，从而产生耐药性。研究表明，大多数耐药菌都会产生生物膜，生物膜的形成是细菌耐药的重要机制。而将抗菌肽应用于抗菌材料则可以有效地应对细菌的耐药。因此对于抗菌材料的创新和完善已经成为了当前的一大研究热点。
抗菌肽(antimicrobialpeptides,AMPs)是一类两亲性阳离子短肽，其氨基酸数量多在100以内。细菌的细胞膜上含有丰富的阴离子，与真核细胞相比，阳离子多肽与细菌的细胞膜之间更易产生静电相互作用，使细胞膜上形成孔洞，胞内物质泄漏，某些抗菌肽也可以抑制细菌核酸、蛋白质或细胞壁的合成。抗菌肽不仅具有广谱抗菌活性，比如对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等多种病原菌均具有良好的抗菌活性，还能够抑制细菌生物被膜的形成；同时能够调节机体的免疫反应和全身炎症反应，发挥良好的抗感染治疗效果。
MicrocinC7(McC7)是广泛分布于肠杆菌属细菌中一种很有希望解决抗生素耐药性问题的特洛伊木马式抗菌肽，仅由七个氨基酸和一个腺苷酸组成，是可以有效地导入细菌细胞的天冬氨酸tRNA合成酶抑制剂，作用机制主要表现为：MicrocinC7通过YejABEF转运子转运到细菌体内，载体MR被蛋白水解过程除去，释放有效的天冬氨酸tRNA合成酶抑制剂，干扰微生物翻译蛋白来实现抑菌作用，进而细菌体内天冬氨酸tRNA合成酶活性被抑制导致其生命活动发生紊乱。
然而当MicrocinC7在使用时，可能存在药物突释、降解速度快等缺点，基于此，本发明提供了一种温敏缓释水凝胶载体，作为载体，可以有效降低降解MicrocinC7的速率，增加药物缓释时间。
发明内容
基于此，本发明提供了一种温敏缓释水凝胶载体、载MicrocinC7温敏缓释水凝胶及其制备方法和应用，在加入温敏缓释水凝胶载体后，MicrocinC7在使用时避免药物突释，稳定血药浓度，增强药物生物相容性和组织靶向性，减少不良反应，提高生物利用率，良好生物可降解和安全性。
本发明的第一个目的是提供一种温敏缓释水凝胶载体的制备方法，按照以下步骤制备：
步骤1、以pH为9-10的水为溶剂，甲基丙烯酸缩水甘油酯与明胶进行化学接枝，得到改性明胶。
步骤2、以水为溶剂，加入改性明胶混合均匀后，在加入异丙基丙烯酰胺和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱得到水凝胶前驱体溶剂，加入引发剂，发生自由基引发双键交联反应，加热成胶后得到温敏缓释水凝胶载体。
优选的，步骤1中，化学接枝的反应温度为50-55℃，反应时间为2.5-3h。
优选的，步骤1中，明胶、水、甲基丙烯酸缩水甘油酯的比例为1g：10-15ml： 1-2ml，采用碳酸钠调节水的pH值为9-10。
优选的，步骤2中，水凝胶前驱体溶剂的合成温度为70-75℃；自由基引发双键交联反应的反应温度为70-75℃，反应时间为0.5-1h；
其中，改性明胶与水的比例为5mg：1-2mL；改性明胶、异丙基丙烯酰胺和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的质量比为5-7：70-90:10-15；
引发剂的添加量为改性明胶、异丙基丙烯酰胺和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱质量之和的2％-5％；
加热成胶的温度为35-37℃。
优选的，步骤2中，引发剂为高硫酸铵。
本发明的第二个目的是提供上述制备方法制备得到的温敏缓释水凝胶载体。
本发明的第三个目的是提供一种载MicrocinC7水凝胶，将上述的温敏缓释水凝胶载体与含MicrocinC7的溶液进行混合，置于摇床中，常温振荡24-28h 后，加热成胶得到载MicrocinC7温敏缓释水凝胶。
优选的，含MicrocinC7的溶液是以水为溶剂制备得到浓度为5-15mg/ml 的含MicrocinC7的溶液。
优选的，摇床振荡的转速为260-300r/min，加热成胶温度为35-37℃。
本发明的第四个目的是提供上述载MicrocinC7水凝胶在口腔内特异性细菌的抗感染治疗中的应用。
与现有技术相比，本发明具有有益效果：
(1)、本发明制备了一种新型的GGNM温敏缓释水凝胶载体，相比以往使用的临床用药，能够通过牙周袋内龈沟液以及口腔内唾液得到降解，降解的过程中缓慢释放药物，从而达到药物缓释的作用。同时具有生物安全性，溶血实验中溶血性<5％，溶血指数值<5％的材料可以被视为具有血液相容性。同时在常温下呈液态更好保存，且不易变性。
(2)、抗菌肽小分子MicrocinC7(McC7)，是广泛分布于肠杆菌属细菌中一种的特洛伊木马式抗菌肽，仅由七个氨基酸和一个腺苷酸组成，是可以有效地导入细菌细胞的天冬氨酸tRNA合成酶抑制剂，属于非抗生素类药物，从而大大降低了患者临床用药后细菌耐药性，有望解决抗生素耐药性问题，降低了抗生素滥用后造成的各种细菌感染的风险。
本发明将抗菌肽药物McC7结合到新型温敏缓释水凝胶GGNM上，得到一种耐药性更低、缓释作用更好、生物安全性及血液相容性良好的载药缓释凝胶，通过抑菌实验证明了载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶对于牙龈卟啉单胞菌具有一定的抑制效果，载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶在小鼠口腔内可以快速成胶，用于治疗牙周炎，有望在将来可以用于临床治疗当中，为牙周炎治疗过程中耐药性的预防提供新思路，并且也为抗菌肽类牙周温敏缓释剂的制备提供理论基础和新的研发策略。
附图说明
图1为温敏缓释水凝胶载体的制备流程图；
图2为实施例1制备得到的GGNM在37℃加热前后的状态图；
图3为明胶、改性明胶、GGNM的傅立叶变换红外光谱图；
图4为实施例1制备的不同倍数下温敏缓释水凝胶载体的SEM图，由左到右依次为300倍、500倍、1000倍；
图5为实施例1制备的GGNM的降解预实验；
图6为GGNM的降解实验，其中，图6a为GGNM水凝胶在人工唾液中不同时间点宏观性状，图6b为GGNM水凝胶在人工唾液中不同时间溶胀及降解率；
图7为溶血实验的状态图(上)和溶血率(下)；
图8a为McC7在人工唾液中最大吸收波长测定；
图8b为McC7在人工唾液中中标准曲线；
图8c为不同浓度的McC7-GGNM水凝胶的药物缓释曲线；
图9为McC7在不同体液中的稳定性结果；
图10为不同材料的细菌抑制率；
图11是从左到由依次将实施例1制备得到的GGNM温敏缓释水凝胶放置于大鼠舌下的三种不同角度示意图；
图12是将实施例4制备得到的载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶放置于大鼠牙周袋后的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料如无特殊说明，均可从商业途径获。另外需要说明的是，GEL代表明胶， Gel-GMA代表改性明胶，NIPAAm代表异丙基丙烯酰胺，MPC代表2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱。
本发明制备了一种温敏缓释水凝胶载体，如图1所示，首先对明胶进行改性处理，在反应过程中，将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)接枝于GEL上， GMA主要通过氧化开环反应，使乙烯基位于支链上，即“V”型聚合物，明胶中的-NH2和-OH基团通过酯交换和环氧化物开环机制与GMA反应，形成改性明胶(Gel-GMA)；
在GGNM合成过程中，改性明胶属于主体长链部分，通过自由基引发，改性明胶自身双键交联、改性明胶与NIPAAm和MPC双键交联，形成三维网络结构，最后形成GGNM。
McC7-GGNM水凝胶制备机理：McC7负载于GGNM水凝胶主要依附于 McC7和改性明胶的结合，McC7上的醛基和改性明胶的氨基进行结合，形成动态席夫碱反应，从而使得McC7可以和GGNM很好的结合在一起。
实施例1
步骤1、改性明胶(Gel-GMA)的制备
量取10ml的水，采用碳酸钠调节水的pH为9，向水中加入1g明胶和1ml 甲基丙烯酸缩水甘油酯，50℃下反应3h，得到改性明胶(Gel-GMA)；
步骤2、取6mg Gel-GMA与1ml纯水进行混合，并放置于70℃的水浴锅中加热5分钟，之后于涡旋搅拌器中搅拌均匀后，加入80mg NIPAAm和15mg MPC，同时加入APS引发剂4mg，放置于70℃的高温水浴锅中加热1h，取出后冷却，再放置于37℃水浴锅中检测是否可以成胶，可以成胶则表示制作完成，得到温敏缓释水凝胶载体Gel-GMA-NIPAAm-MPC，记为GGNM。
如图2所示，实施例1制备得到的GGNM常温(25℃)下呈淡黄色透明液体，37℃时变成乳白色胶状固体，成胶时间约15s。
图3由上到下分别为明胶(GEL)、改性明胶(GEL-GMA)、凝胶(即 GGNM)的傅立叶变换红外光谱图，由图3可以看出，1630cm-1处表示明胶的羰基的振动峰，GEL-GMA的特征峰出现在1060cm-1和1030cm-1处，对应于 C-O-C官能团。结果说明明胶双键断裂，GMA成功接枝到GEL上，表明明胶改性成功。凝胶(即GGNM)的光谱图可以看出在GEL-GMA的特征峰1060cm-1和1030cm-1处对应的双键消失，即表明GGNM合成成功。
图4为实施例1制备的温敏缓释水凝胶载体的SEM图，分别在300倍、 500倍、1000倍下观察其形貌特征，水凝胶呈孔状网络结构，有利于药物、水分子及营养物质的代谢，孔径约5-25nm。
降解实验
取0.5ml实施例1制备的GGNM置于分别置于5ml的人工唾液(左)和 PBS溶液(右)中进行三次平行降解预实验，如图5所示，3月18日为实验第一天，通过目测法大致得知降解时间约为12-13天(3.18-3.30)，水凝胶在人工唾液中基本完全降解，在PBS中体积无明显变化。
之后取0.5ml实施例1制备的GGNM置于5ml人工唾液中进行三次平行降解，如图6和表1所示，通过目测法大致得知降解时间约为24天，水凝胶在人工唾液中基本呈匀速降解，由于正式实验水凝胶体积由0.5ml增加到1ml，因此降解速度有一定减慢。通过降解实验可以观察到，GGNM水凝胶第一天质量增加，表明发生了溶胀反应，水凝胶体系中有水分子进入内部，之后开始降解，直到24天基本完全降解。
表1 GGNM的降解质量变化
Figure BDA0003720596700000081
Figure BDA0003720596700000091
溶血实验
实验用品：
含抗凝剂的专用采血管、健康人血、0.9％NaCl注射溶液、凝胶样品、移液枪、96孔板/24孔板、玻璃棒、烧杯、等离子水、0.01mol/LPBS溶液。
实验仪器：
37℃恒温培养箱、酶联免疫检测仪、离心机、
实验方法：
GGNM溶血毒性实验：红细胞溶血判定
(1)采血：用含抗凝剂的专用采血管采取SD实验大鼠(雌性)血液；
(2)离心：取健康人血5mL，每分钟1000～1500转离心15分钟，除去上清液，取下层血细胞；
(3)5％红细胞液：将所得红细胞用0.9％NaCl注射溶液配成5％(0.35ml/7ml)的混悬液，备用。阴性对照(加体积百分比为0.9％NaCl)，3个孔设为阳性对照(加去离子水)，向各个孔中分别加入500uL 5％的红细胞混悬液；
(4)GGNM水凝胶样品浸泡法：将制作好的水凝胶按照不同体积百分比放入纯水中浸泡72h。每组取3个平行样。
(5)加入500uL不同成分的样品(样品见表2)+500uL2％红细胞悬液，使每个EP管总体积为1mL,轻轻摇匀后立即放入37+0.5℃的烘箱中进行温育， 1-3h后观察溶血反应。
(6)离心(1500rpm，5min)取上清液，分别吸取100ul的上清液转入96 孔板中(3个平行样)，进行吸光度的测定。计算每孔的溶血率值。
(7)使每个孔板总体积为1mL,将酶标仪波长调至245nm,测量3次，取平均值进行溶血率的计算，公式如下:计算：溶血率(％)＝(试验管吸光度-阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度-阴性对照管吸光度)×100。
表2为溶血实验的五种不同成分
组别 成分 总体积
A组 去离子水 1ml
B组 0.9％NaCl 1ml
C组 0.1ml凝胶+0.9mlNaCl 1ml
D组 0.2ml凝胶+0.8mlNaCl 1ml
E组 0.4ml凝胶+0.6mlNaCl 1ml
表3溶血试验结果判断标准
全溶血 溶液澄明，红色，管底无红细胞残留
部分溶血 溶液澄明，红色或棕色，底部有少量红细胞残留；镜检红细胞稀少或变形
不溶血 红细胞全部下沉，上清液体无色澄明；镜检红细胞不凝聚
红细胞凝聚 溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散
结果如图7所示，不同体积配比的水凝胶加入水中，37℃下浸泡72h，提取其浸出液进行溶血实验，取100ul,每组6个平行样本，结果取平均值，凝胶组溶血率均<5％，为人血红细胞溶血性安全浓度。
实施例2
步骤1、改性明胶(Gel-GMA)的制备
量取15ml的水，采用碳酸钠调节水的pH为10，向水中加入1g明胶和2ml 甲基丙烯酸缩水甘油酯，55℃下反应2.5h，得到改性明胶(Gel-GMA)；
步骤2、取7mg Gel-GMA与1ml纯水进行混合，并放置于73℃的水浴锅中加热5分钟，之后于涡旋搅拌器中搅拌均匀后，加入70mg NIPAAm和10mg MPC，同时加入APS引发剂1.74mg，放置于73℃的高温水浴锅中加热0.5h，取出后冷却，再放置于36℃水浴锅中检测是否可以成胶，可以成胶则表示制作完成，得到温敏缓释水凝胶载体。
实施例3
步骤1、改性明胶(Gel-GMA)的制备
量取12ml的水，采用碳酸钠调节水的pH为9.5，向水中加入1g明胶和 1.5ml甲基丙烯酸缩水甘油酯，53℃下反应160min，得到改性明胶(Gel-GMA)；
步骤2、取5mg Gel-GMA与1ml纯水进行混合，并放置于75℃的水浴锅中加热5分钟，之后于涡旋搅拌器中搅拌均匀后，加入90mg NIPAAm和13mg MPC，同时加入APS引发剂5.4mg，放置于75℃的高温水浴锅中加热50min，取出后冷却，再放置于35℃水浴锅中检测是否可以成胶，可以成胶则表示制作完成，得到温敏缓释水凝胶载体。
实施例4
步骤1:改性明胶(Gel-GMA)的制备
量取10ml的水，采用碳酸钠调节水的pH为9，向水中加入1g明胶和1ml 甲基丙烯酸缩水甘油酯，50℃下反应3h，得到改性明胶(Gel-GMA)；在反应过程中，将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)接枝于GEL上，GMA主要通过氧化开环反应，使乙烯基位于支链上，即“V”型聚合物，明胶中的-NH2和 -OH基团通过酯交换和环氧化物开环机制与GMA反应，形成改性明胶(Gel-GMA)；
步骤2、取6mg Gel-GMA与1ml纯水进行混合，并放置于70℃的水浴锅中加热5分钟，之后于搅拌器中搅拌均匀后，加入80mg NIPAAm和15mg MPC，同时加入APS引发剂4mg，放置于70℃的高温水浴锅中加热1h，取出后冷却，再放置于37℃水浴锅中检测是否可以成胶，可以成胶则表示制作完成，得到温敏缓释水凝胶载体。
步骤3、将制备得到的480mg GGNM与3.5mg MicrocinC7药物粉末进行混合，涡旋磁力搅拌器搅拌1分钟，超声震荡机震荡5分钟(温度控制于 23-28℃)，之后静置24h后，在放置于37℃的水浴锅中加热成胶，得到载 MicrocinC7温敏缓释水凝胶，记为载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶，其质量百分比为0.7wt％。
实施例5
与实施例4相同，区别在于，步骤3中含MicrocinC7药物7mg，其质量百分比为1.4wt％。
实施例6
与实施例4相同，区别在于，步骤3中含MicrocinC7药物10.5mg，其质量百分比为2.1wt％。
实施例7
与实施例4相同，区别在于，步骤3中200mg GGNM，含MicrocinC7药物2mg，其质量百分比为1wt％。
实施例8
与实施例4相同，区别在于，步骤3中200mg GGNM，含MicrocinC7药物6.25mg，其质量百分比为3wt％。
实施例9
将实施例2制备得到的480mg GGNM与3.5mg MicrocinC7药物粉末进行混合，涡旋磁力搅拌器搅拌3分钟，超声震荡机震荡6分钟(温度控制于 23-28℃)，之后静置28h后，在放置于35℃的水浴锅中加热成胶，得到载 MicrocinC7温敏缓释水凝胶，记为载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶，其质量百分比为0.7wt％。
实施例10
将实施例3制备得到的480mg GGNM与3.5mg MicrocinC7药物粉末进行混合，涡旋磁力搅拌器搅拌3分钟，超声震荡机震荡7分钟(温度控制于 23-28℃)，之后静置26h后，在放置于36℃的水浴锅中加热成胶，得到载 MicrocinC7温敏缓释水凝胶，记为载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶，其质量百分比为0.7wt％。
载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶的缓释性能测试
一、最大波长测定
将McC7用人工唾液配置成浓度为8mg/ml的溶液，放置于96孔板，进行全波长光谱扫描，波长范围为200nm-999nm，先以间隔为100nm测量，确定最大吸收峰为200nm-300nm之间，再缩小范围继续扫描，最后逐步找到最高峰，确定245nm为McC7在人工唾液中最大吸收峰，如图8a所示。
二、McC7标准曲线测定
将McC7用人工唾液配置成浓度为8mg/ml的溶液，放置于96孔板，平行三组，进行浓度倍比稀释法，空白组采用人工唾液测试，使用紫外分光光度计在245nm处测试，利用OD差值在Prism软件中绘制McC7标准曲线，如图8b 所示。
三、药物缓释行为测试
将载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶放置在试管中，加入人工唾液(浴比 1:100,w/w)，在37℃培养箱中以120r/min的速度温育，一定时间后取出温育中的样品300μL转移到新的试管中，继续加入新的300μL人工唾液进行温育。每隔一段时间重复此操作，间隔时间为0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、 48h、96h、144h、192h、288h，收集每个阶段的缓释溶液，采用紫外分光光度法测试每个阶段缓释溶液中的药物含量。
如图8c所示，图8c表示为三组不同浓度McC7-GGNM水凝胶的药物缓释曲线，从结果可以看出，药物在0h时累计释放率为0％，说明没发生药物扩散效应，药物基本全部被水凝胶所包裹，之后水凝胶发生溶胀反应，水凝胶内部和外界渗透压相同后，药物开始向外释放。从结果图看来，以直线形式缓慢释放，前100h缓慢释放，100h后逐渐到达顶点，同时，0.7wt％(实施例4)、 1.4wt％(实施例5)、2.1wt％(实施例6)三组不同质量百分比的McC7的载 McC7-GGNM温敏缓释水凝胶中，0.7wt％(实施例4)、1.4wt％(实施例5) 累计释放量高于2.1wt％(实施例6)组，12天后0.7wt％(实施例4)、1.4wt％ (实施例5)、2.1wt％(实施例4)三组的累计释放量分别为88％、88％、81％，但三组组间无明显差异。
McC7在不同体液中的稳定性实验；将含1mg/ml的含McC7肽液(溶剂为纯水)分别放置于牛血清(FBS)、人唾液(S.a)、PBS、BHI培养基中2、 4、6、8h用反相液相色谱法检测其稳定性变化：
图9结果表明：在牛血清、BHI、PBS中有较高的稳定性，8h后基本在40％以上，但在人唾液中降解较快，8h后相对残留量不及20％。
抑菌实验
(1)牙龈卟啉单胞菌的培养
从液氨罐内取出P.gingivalis冻存管，用镊子夹住冻存管，置常温下，待菌液完全融化，在洁净的细菌操作台中，用移动液枪将细菌悬液转移至100ul 离心管内，加入一定量含有氯化血红素和维生素K的脑心浸液，置于厌氧罐中，加入一定数量厌氧包后放置于37度培养箱培养，3d到7d后可见菌液浑浊。离心机4000rpm/min离心10min弃上清，用酶标仪测定光密度为600nm时的细菌吸光度，加PBS进行稀释，使得菌液OD值为0.3左右时即可当作实验菌液。
(2)抑菌实验
本实验在超净台中操作，取上述稀释好的菌液后，分别加入各个灭菌后的5ml EP管，每个管中各加1ml菌液，实验分组为空白组、GGNM组(实施例 1制备得到)、MPod组、McC7-GGNM-1组(McC7质量百分比为1wt％，即实施例7)、McC7-GGNM-2组(McC7质量百分比为3wt％，即实施例8)、派丽奥阳性组，每组各加入250ul，空白组不做处理，培养七天后，摇匀，各组抽取100ul菌液放置于96孔板，平行三组，用酶标仪测定光密度为600nm 时的细菌吸光度，连续测3次，在prism中进行数据统计与分析。
计算公式如下：细菌生长抑制率(％)＝(阴性对照管吸光度-试验管吸光度)/ (阴性对照管吸光度-阳性对照管吸光度)×100。
在图10中可看出，MPod组(赛吉瑞医用多肽口腔敷料)细菌生长抑制率约为28％左右，而水凝胶-1组(1wt％)细菌抑制率约为50％左右、水凝胶 -2组(3wt％)抑制率则达到97％左右，具有较好的抑菌效果。
具体实验方法如下：
1、大鼠牙周炎模型制备
SD雄性大鼠，体重180-200g，精神、毛色正常，标准化饮食适应性饲养 1周后开始实验。
饲养环境：饲养于西安交通大学创新港动物实验中心。温度为(22±1)℃、相对湿度为(60±5)％、通风干燥。
5％水合氯醛腹腔注射麻醉，体位固定，4-0丝线环绕结扎于上颌两侧第二磨牙，每周检查一次丝线是否在位，标记丝线脱落小鼠并重新结扎，连续两次脱落小鼠剔除。连续结扎4周后，开始实验，实验分组如下图所示，连续给药一个月后，对其进行检测。
取实施例1制备的GGNM温敏缓释水凝胶，麻醉情况下放置于大鼠舌下，约30s后可看到乳白色凝胶，如图11所示，表明在实验大鼠口内可以成胶。
同时取载McC7-GGNM温敏缓释水凝胶，麻醉情况下放置于大鼠牙周袋内，约5s后可看到乳白色凝胶，如图12所示，表明在实验大鼠牙周袋内可以成胶进行使用。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种温敏缓释水凝胶载体的制备方法，其特征在于，按照以下步骤制备：
步骤1、以pH为9-10的水为溶剂，甲基丙烯酸缩水甘油酯与明胶进行化学接枝，得到改性明胶；
步骤2、以水为溶剂，加入改性明胶混合均匀后，在加入异丙基丙烯酰胺和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱得到水凝胶前驱体溶剂，加入引发剂，发生自由基引发双键交联反应，加热成胶后得到温敏缓释水凝胶载体。
2.根据权利要求1所述的一种温敏缓释水凝胶载体的制备方法，其特征在于，步骤1中，化学接枝的反应温度为50-55℃，反应时间为2.5-3h。
3.根据权利要求1所述的一种温敏缓释水凝胶载体的制备方法，其特征在于，步骤1中，明胶、水、甲基丙烯酸缩水甘油酯的比例为1g：10-15ml：1-2ml，采用碳酸钠调节水的pH值为9-10。
4.根据权利要求1所述的一种温敏缓释水凝胶载体的制备方法，其特征在于，步骤2中，水凝胶前驱体溶剂的合成温度为70-75℃；自由基引发双键交联反应的反应温度为70-75℃，反应时间为0.5-1h；
其中，改性明胶与水的比例为5-7mg：1mL；改性明胶、异丙基丙烯酰胺和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的质量比为5-7：70-90：10-15；
引发剂的添加量为改性明胶、异丙基丙烯酰胺和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱质量之和的2％-5％；
加热成胶的温度为35-37℃。
5.根据权利要求1所述的一种温敏缓释水凝胶载体的制备方法，其特征在于，步骤2中，引发剂为高硫酸铵。
6.一种权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的温敏缓释水凝胶载体。
7.一种载MicrocinC7水凝胶，其特征在于，将权利要求6所述的温敏缓释水凝胶载体与MicrocinC7药物，搅拌1-3分钟，超声震荡5-7分钟，之后静置24-28h后，加热成胶，得到载MicrocinC7温敏缓释水凝胶。
8.一种权利要求7所述的载MicrocinC7水凝胶，其特征在于，载MicrocinC7温敏缓释水凝胶中，MicrocinC7药物的质量百分比为0.7wt％-3wt％。
9.一种权利要求7所述的载MicrocinC7水凝胶，其特征在于，超声震荡温度为23-28℃，加热成胶温度为35-37℃。
10.一种权利要求7-9任一项所述的载MicrocinC7水凝胶在口腔内特异性细菌的抗感染治疗中的应用。
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