CN115073492A - 一种奥氮平衍生物抗原、奥氮平抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种奥氮平衍生物抗原、奥氮平抗体及其应用,属于免疫检测技术领域。本发明将奥氮平衍生物半抗原和载体蛋白偶联制备完全抗原,经免疫动物后,筛选获得的奥氮平单克隆抗体具有高灵敏度识别奥氮平的能力,且对氯氮平、去甲奥氮平、N‑O奥氮平、7‑羟基奥氮平、10‑N‑glucuronide奥氮平无交叉反应,特异性优于现有的奥氮平抗体,为建立准确监测血液和/或尿液中奥氮平浓度提供了保障。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域,具体涉及一种奥氮平衍生物抗原、奥氮平抗体及其应用。
背景技术
精神分裂症是一组病因未明的慢性疾病,多在青壮年缓慢或亚急性起病,临床上往往表现为症状各异的综合征,涉及感知觉、思维、情感和行为等多方面的障碍以及精神活动的不协调。患者一般意识清楚,智能基本正常,但部分患者在疾病过程中会出现认知功能的损害。病程一般迁延,呈反复发作、加重或恶化,部分患者最终出现衰退和精神残疾,但有的患者经过药物治疗与心理治疗后可保持痊愈或基本痊愈状态。
奥氮平是适用于精神分裂症和其他有严重阳性症状和(或)阴性症状的精神病的治疗药物,亦可缓解精神分裂症及相关疾病常见的继发性情感症状。
奥氮平血药浓度存在较大的个体间和个体内变异,提示血药浓度监测可以在判断奥氮平疗效、评价治疗效果、规避副反应以及个体化用药方案调整等方面发挥重要作用。此外,精神疾病患者依从性差,不按时按量服用药物,耽误治疗,尿液中的总奥氮平浓度可以作为一种有效的监测手段。但目前奥氮平血药浓度监测国内临床实践中开展很少,与奥氮平血药浓度检测方法繁琐、人们缺乏血药浓度监测的意识,以及奥氮平的多种代谢物干扰测定等有关。奥氮平的检测分析主要有LC-MS-MS法,但是这类方法满足不了临床高通量、快速准确的检测需求。
免疫学检测是离体样本检测的常见方法。要建立高灵敏度高特异性的奥氮平免疫学检测的前提是获得高质量的抗奥氮平抗体,进一步的依赖于奥氮平完全抗原的设计和制备。公开号为CN 110632234 A、CN 110068644 A和CN 110455945 A的中国专利均公开了采用液质联用法测定奥氮平浓度的方法,单该方法需要复杂的前处理和专业的操作人员,不能满足快速检测的临床要求。
另外,公开号CN 110938082 A(公布日 2020.03.31)的中国专利公布了一种奥氮平半抗原的衍生方法及抗体制备方法,可用于定性测定奥氮平含量,灵敏度为100ng/mL,而奥氮平的血药浓度治疗窗为20~80ng/mL,因此无法满足奥氮平TDM的需求,此外该专利没有披露该抗体对奥氮平代谢物的特异性。
此外,公开号CN 109400708 A(公布日 2019.03.01)的中国专利公布了一种奥氮平半抗原的衍生方法及抗体制备方法,但获得抗体同氯氮平有严重的交叉反应,此外没有披露该的抗体对奥氮平代谢物的特异性。综上所述,目前缺乏制备高检测灵敏度的同时特异性非常好的抗奥氮平抗体的抗原。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种奥氮平衍生物抗原,免疫产生的抗体特异性识别奥氮平,但对无活性代谢物及氯氮平无交叉反应。
本发明的目的还在于提供一种奥氮平抗体及其应用,筛选得到的抗体不仅对奥氮平具有极高的检测灵敏度,并且对无活性的去甲奥氮平、N-O奥氮平、7-羟基奥氮平、10-N-glucuronide奥氮平以及氯氮平无交叉反应,适合于奥氮平药物浓度监测中的应用。
本发明提供了一种奥氮平衍生物半抗原,结构如式I所示;
本发明提供了一种奥氮平衍生物完全抗原,包括所述奥氮平衍生物半抗原和载体蛋白;所述奥氮平衍生物半抗原和载体蛋白利用化学交联剂进行共价偶联。
优选的,所述化学交联剂包括1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N,N'-羰基二咪唑中的至少一种。
优选的,所述载体蛋白包括以下一种或多种蛋白:牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白和兔血清白蛋白。
本发明提供了一种由所述奥氮平衍生物完全抗原免疫筛选获得的杂交瘤细胞,保藏编号为CGMCC No.45161。
本发明提供了一种由所述杂交瘤细胞分泌的抗奥氮平抗体28G7。
本发明提供了所述抗奥氮平抗体28G7在非疾病诊断目的的免疫检测奥氮平血药浓度或制备免疫检测奥氮平血药浓度的试剂盒中的应用。
优选的,所述免疫检测的方法包括以下一种或几种:酶联免疫法、磁珠化学发光法、均相酶法、荧光免疫层析法和胶体金免疫检测法。
本发明提供了一种基于均相酶免疫检测法的奥氮平检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1为含质量百分含量0.01%~0.1%的所述抗奥氮平抗体28G7、20 mM NAD、30 mM葡萄糖-6-磷酸G6P、55 mM pH值8.0的Tris缓冲液;
所述试剂R2为含质量百分含量0.01%~1% 6-磷酸葡萄糖脱氢酶标记奥氮平衍生物半抗原、0.1M pH值8.5的Tris缓冲液。
本发明提供了一种基于磁微粒化学发光法非疾病诊断目的的奥氮平血药浓度检测方法,包括以下步骤:
将待检测样本、磁微粒标记的所述抗奥氮平抗体28G7工作液和酶标记所述奥氮平衍生物半抗原工作液混合孵育,清洗,加入所述酶对应的发光底物反应显色,测定发光值RLU,代入标准四参数方程式,计算待检测样本中奥氮平血药浓度。
本发明提供的奥氮平衍生物半抗原,结构如式I所示,其衍生位点远离奥氮平与氯氮平、去甲奥氮平、N-O奥氮平、7-羟基奥氮平、10-N-glucuronide奥氮平的共同的特征结构,因此制备的抗体能够等效识别奥氮平,而无法识别无活性代谢物及氯氮平;同时在2号位的甲基处衍生最大程度的保留了奥氮平本身的结构完整性。
本发明提供的由所述杂交瘤细胞分泌的抗奥氮平抗体28G7,具有能够高灵敏度识别奥氮平的能力,同时具备优于现有技术已有的抗体特异性,即同氯氮平、去甲奥氮平、N-O奥氮平、7-羟基奥氮平、10-N-glucuronide奥氮平无交叉反应;同时所述28G7抗体与同批筛选得到的杂交瘤分泌的抗体相比具有较高的检测灵敏度,28G7抗体表现出对奥氮平极高的灵敏度,IC50约为2ng/mL。可见本发明提供的抗奥氮平抗体28G7为建立准确监测奥氮平血液和尿液浓度的方法提供了基础。
生物材料保藏信息
分类命名为杂交瘤细胞株,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2022.5.19。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCCNo.45161,细胞编号为28G7。
附图说明
图1为奥氮平衍生物半抗原合成路线;
图2为磁微粒发光法检测奥氮平定标曲线;
图3为本发明构建的均相酶法与LC-MS法测定奥氮平结果的相关曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种奥氮平衍生物半抗原,结构如式I所示;
在本发明中,所述奥氮平衍生物半抗原的制备方法,见图1,优选包括以下步骤:
1)在碱性条件下,将氨基-3-氰基-5-溴甲基噻吩和邻硝基氟苯在-5~5℃下进行缩合反应,分离化合物3;
2)将所述化合物3在氯化亚锡和盐酸的作用下回流反应,分离得到化合物4;
3)在酸性条件下,将所述化合物4和N-甲基哌嗪发生缩合反应,分离化合物6;
4)在碱性条件下,将所述化合物6和3-羟基丁酸甲酯进行缩合反应,分离奥氮平衍生物半抗原。
本发明在碱性条件下,将氨基-3-氰基-5-溴甲基噻吩和邻硝基氟苯在-5~5℃下进行缩合反应,分离化合物3。
在本发明中,氨基-3-氰基-5-溴甲基噻吩和邻硝基氟苯优选以DMF为溶剂。氨基-3-氰基-5-溴甲基噻吩和邻硝基氟苯的摩尔比优选为1~1:1~1.01,更优选为1:1.005。所述缩合反应优选持续1.5~2.5h,更优选为2h。所述分离化合物3的方法优选将反应液缓慢倒入冰水混合物中,分别用二氯甲烷提取,合并有机层,蒸出溶剂得到红色固体为化合物3。所述提取的次数优选为2~3次。所述反应液、冰水混合物和二氯甲烷的体积比优选为2:50:5。所述化合物3的收率为72.21%。
得到化合物3后,本发明将所述化合物3在氯化亚锡和盐酸的作用下回流反应,分离得到化合物4。
在本发明中,所述化合物3的溶剂优选为乙醇。所述滴加氯化亚锡盐酸溶液温度优选为45~55℃,更优选为50℃。所述回流反应的时间优选为5~7h,更优选为6h。所述化合物3、乙醇、氯化亚锡和盐酸的质量体积比为12.0g:100ml:25.0g:80ml。所述分离化合物4的方法,优选为将反应液去除乙醇后降温至15~20℃结晶2小时,过滤,真空烘干得到化合物4。所述化合物4的收率为81.5%。
得到化合物4后,本发明在酸性条件下,将所述化合物4和N-甲基哌嗪发生缩合反应,分离化合物6。
在本发明中,所述化合物4和N-甲基哌嗪的溶剂为甲苯和DMSO。所述化合物4、N-甲基哌嗪、甲苯,DMSO的质量体积比优选为7~9.0g:20~24.0g:28~32ml:8~12ml,更优选为8.0g:22.0g:30ml:10ml。所述缩合反应的温度优选为118~122℃,更优选为120℃。所述缩合反应的时间优选为19~21h,更优选为20h。所述缩合反应优选进行回流加热。反应结束后反应液降温至50℃缓慢加入水40ml,降温至10~15℃搅拌析晶10h,过滤,所得滤饼水洗、干燥,得到粗品化合物6。所述粗品化合物6优选经乙腈重结晶得到化合物6,收率75.3%。
得到化合物6后,本发明在碱性条件下,将所述化合物6和3-羟基丁酸甲酯发生缩合反应,分离奥氮平衍生物半抗原。
在本发明中,所述化合物6的溶剂优选为DMSO。所述碱性条件优选为氢氧化钠。所述化合物6、DMSO、氢氧化钠和3-羟基丁酸甲酯的质量比为 7.5g:20ml:5.0g:2.7g。所述缩合反应的时间优选为1.5~2.5h,更优选为2h。所述分离奥氮平衍生物半抗原的方法优选为将反应液过滤去除不溶物,滤液和水混合,调pH值至5.5后,控制温度0~10℃结晶2h,过滤,固体粉末真空烘干得到化合物8即为奥氮平衍生物半抗原,收率87.5%。
本发明提供了一种奥氮平衍生物完全抗原,包括所述奥氮平衍生物半抗原和载体蛋白;所述奥氮平衍生物半抗原和载体蛋白利用化学交联剂进行共价偶联。
在本发明中,所述化学交联剂优选包括1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N,N'-羰基二咪唑中的至少一种。所述载体蛋白优选包括以下一种或多种蛋白:牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白和兔血清白蛋白。
在本发明中,所述奥氮平衍生物完全抗原的制备方法,优选包括以下步骤:将奥氮平衍生物半抗原溶液和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐混合,得到溶液A;
将所述溶液A和载体蛋白溶液混合,室温搅拌,反应液经透析得到奥氮平衍生物完全抗原。
在本发明中,所述奥氮平衍生物半抗原溶液中奥氮平衍生物半抗原、奥氮平半抗原衍生物溶液和载体蛋白溶液中载体蛋白的质量比为1:1:2。所述奥氮平衍生物溶液中溶剂优选为DMSO。所述载体蛋白溶液的溶剂优选为PBS。所述透析用溶液优选为PBS溶液。所述PBS溶液的制备方法优选为磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.24g,磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1.44g,氯化钠(NaCl) 8.0g,氯化钾(KCl)0.2g,加水至1000mL。所述透析的时间优选为3~4次。
在本发明中,所述奥氮平衍生物完全抗原在制备多克隆抗体中的应用。所述多克隆抗体的制备方法,优选包括以下内容:将奥氮平衍生物完全抗原和弗式完全佐剂(购自sigma)等体积混合进行初次免疫动物,间隔1个月后进行加强免疫3次,间隔2周时间,最后一次加强免疫7d后采血,测定血清效价和特异性。所述加强免疫用免疫原为奥氮平衍生物完全抗原和弗式不完全佐剂(购自sigma)等体积混合得到。每次免疫的剂量优选为0.5~2mg/只,更优选为1mg/只。所述动物优选包括兔、山羊和绵羊等。所述多克隆抗体实现等同单抗的效果。
本发明提供了一种由所述奥氮平衍生物完全抗原免疫筛选获得的杂交瘤细胞,保藏编号为CGMCC No.45161。
在本发明中,所述杂交瘤的制备方法,采用经典的杂交瘤细胞融合技术完成,具体优选将奥氮平衍生物完全抗原与佐剂混合后免疫动物,得到的脾细胞与Sp2/0细胞融合,得到的杂交瘤经过效价及竞争测定,得到杂交瘤细胞。本发明提供了一种由所述杂交瘤细胞分泌的抗奥氮平抗体28G7。28G7对奥氮平表现出极高的灵敏度,IC50约为2ng/mL,并且对无活性的去甲奥氮平、N-O奥氮平、7-羟基奥氮平、10-N-glucuronide奥氮平以及氯氮平交叉反应非常低,适合监测奥氮平药物浓度。
本发明提供了所述抗奥氮平抗体28G7在非疾病诊断目的的免疫检测奥氮平血药浓度或制备免疫检测奥氮平血药浓度的试剂盒中的应用。
在本发明中,所述免疫检测的方法优选包括以下一种或几种:酶联免疫法、磁珠化学发光法和胶体金免疫检测法。
在本发明中,基于磁珠化学发光法检测试剂盒,优选包括磁微粒标记的所述抗奥氮平抗体28G7溶液和酶标记所述奥氮平衍生物半抗原溶液。所述磁微粒标记的所述抗奥氮平抗体28G7溶液的制备方法优选包括以下步骤:将磁珠和pH值为8.0 BB缓冲液和奥氮平抗体28G7混合反应7~9h;反应液在磁力作用下去除上清,用TBST重悬并反应12h,所得反应液在磁力作用下再次去除上清,再次用TBST重悬并反应12h,得到抗奥氮平抗体28G7溶液。在使用时,将抗奥氮平抗体28G7溶液用TBST稀释到0.4mg/mL,得到抗奥氮平抗体28G7工作液。在本发明中,所述酶标记奥氮平衍生物半抗原溶液优选为向酶溶液中添加奥氮平衍生物和EDC固体,室温反应2h后,得到的反应液进行透析,得到酶标记奥氮平衍生物半抗原溶液。所述酶溶液、奥氮平衍生物半抗原和EDC固体的体积质量比为1ml:0.5mg:1mg。所述酶溶液的浓度为1mg/ml。所述酶的种类优选为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖6磷酸脱氢酶。所述酶溶液的溶剂优选为PBS。所述透析用溶液为PBS。所述酶标记奥氮平衍生物半抗原溶液优选用稀释液稀释到1μg/mL,得到酶标记奥氮平衍生物半抗原工作液。所述稀释液的配方优选为含50mM MES、0.9% NaCl、5mg/mL BSA、1mM MgCl2 pH值6.7的溶液。
本发明提供了一种基于磁微粒化学发光法非疾病诊断目的的奥氮平血药浓度检测方法,包括以下步骤:
将待检测样本、磁微粒标记抗奥氮平抗体28G7工作液和酶标记奥氮平衍生物半抗原工作液混合孵育,清洗,加入所述酶对应的发光底物反应显色,测定发光值RLU,代入标准四参数方程式,计算待检测样本中奥氮平血药浓度。
在本发明中,所述待检测样本、磁微粒标记抗奥氮平抗体28G7工作液和酶标记奥氮平衍生物半抗原工作液的体积比为1:4:5。所述孵育的温度优选为36~38℃,更优选为37℃。所述孵育的时间优选为4~6min,更优选为5min。所述清洗用溶液为含质量百分含量0.9%NaCl、体积浓度0.1% TW20的20mM Tris溶液,pH值为8.0。所述发光底物优选为AMPPD发光液。所述测定发光值RLU的波长优选400~600nm。
在本发明中,所述标准四参数方程式见公式(1)和图2;
Y = (A - D) / [1 + (X/C)B] + D 公式(1)
其中:A = 23609196.479353,B = 1.05695480033706,C = 0.524419797595972,D= 21843.3780017757;相关系数R2:0.9999995。
在本发明中,所述磁微粒化学发光法检测奥氮平多种代谢物(去甲奥氮平、N-O奥氮平、7-羟基奥氮平、10-N-glucuronide奥氮平)和氯氮平无明显的交叉反应,仅能检测奥氮平。说明所述检测方法检测奥氮平的特异性好。同时所述检测方法具有较高的检测灵敏度和检测精度。
本发明提供了一种基于均相酶免疫检测法的奥氮平检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2;所述试剂R1为含质量百分含量0.01%~0.1%的所述抗奥氮平抗体28G7、20 mM NAD、30mM葡萄糖-6-磷酸G6P、55 mM pH值8.0的Tris缓冲液;所述试剂R2为含质量百分含量0.01%~1% 6-磷酸葡萄糖脱氢酶标记奥氮平衍生物、0.1M pH值8.5的Tris缓冲液。
在本发明中,所述试剂盒的使用方法,优选包括以下步骤:将试剂R1、试剂R2和待测样品混合孵育,测定OD340,带入标准曲线中,得到待测样品中奥氮平的浓度。
在本发明中,选取临床40例奥氮平尿液浓度样本,用本发明构建奥氮平检测试剂盒进行均相酶免疫检测,与LC-MS法测定奥氮平结果比对,结果表明,均相酶法测定奥氮平含量同LC-MS法相关性良好,符合临床需求。
下面结合实施例对本发明提供的一种奥氮平衍生物抗原、奥氮平抗体及其应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
奥氮平衍生物的人工合成方法,见图1,具体包括以下步骤:
1)合成化合物3
将2-氨基-3-氰基-5-溴甲基噻吩(化合物1)10.8g,邻硝基氟苯(化合物2)7.05g和DMF 100 ml配制成溶液待用。经20ml DMF加入250ml三口烧瓶降温至0℃,分批加入氢氧化钾4.8g,控制温度0℃,滴加配好的溶液,滴加结束后室温反应2h。将反应液缓慢倒入500g冰水混合物中,分别用50ml二氯甲烷提取两次;合并有机层,蒸出溶剂得到红色固体为化合物3,重量12.15g,收率72.21%。
2)合成化合物4
在250ml三口烧瓶中加入化合物3 12.0g和乙醇100ml,升温至50℃滴加氯化亚锡25.0g盐酸(5mol/L)80ml的溶液。回流反应6h,反应结束蒸出乙醇降温至20℃结晶2小时,过滤,真空烘干得到化合物4 8.95g,收率81.5%。
3)合成化合物6
在250ml三口烧瓶中加入化合物4 8.0g、N-甲基哌嗪22.0g、甲苯30ml和DMSO10ml,回流反应20h;反应结束降温至50℃缓慢加入水40ml,降温至15℃搅拌析晶10h,过滤滤饼水洗干燥后得到化合物6粗品9.1g。粗品化合物6用乙腈重结晶得到化合物6 7.65g,收率75.3%。
4)合成化合物8
在100ml三口烧瓶中加入化合物6 7.5g、DMSO 20ml,溶液降温15℃加入粒装氢氧化钠5.0g,3-羟基丁酸甲酯2.7g继续反应2h,过滤去除不溶物。滤液转入1000ml反应瓶匀速加入加入300ml水。用5mol/L盐酸调节反应液pH至5.5。控制温度5℃结晶2h,过滤,固体粉末真空烘干得到化合物8 6.95g,收率87.5%。
化合物8经过核磁共振分析结果如下:1HNMR (DMSO-d6,400MHz) 7.28-7.24 (m,1H), 7.17-7.11 (m, 2H), 6.91-6.89 (m, 1H), 6.58-6.54 (s, 1H), 4.91-4.89 (s,2H), 3.89-3.82 (m, 1H), 3.78-3.67 (m, 4H), 2.62-2.29 (m, 6H), 2.15-2.07 (s,3H), 1.38-1.27 (s, 3H)。
实施例2
奥氮平完全抗原的制备方法
1.取10mg上述奥氮平半抗原衍生物,加入1mL的DMSO溶解完全;
2.称取10mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐,溶解在100ul水中,加入到a中,室温反应1h得到A液;
3.称取牛血清白蛋白20mg溶解在5mL的PBS中,得到B液;
4.混合A和B液,室温搅拌2h;
5.对PBS透析(透析袋的孔径为7kDa)4次,-20度冷冻保存。
实施例3
奥氮平鼠单克隆抗体的制备方法
奥氮平单抗的制备采用本领域公知的技术,采用经典的杂交瘤细胞融合技术。
用PBS将奥氮平完全抗原稀释到1mg/mL,加入等体积的弗氏完全佐剂,乳化完全,小鼠按照0.1mg/只的剂量进行首次免疫;
间隔4周后,取1mg奥氮平抗原同弗式不完全佐剂等体积混合乳化后,免疫0.1mg/只。
取脾细胞与Sp2/0细胞融合,用1μg/mL奥氮平-BSA 包被ELISA 96孔板,采用间接竞争ELISA技术对融合细胞分泌物进行抗体水平的测定,筛选得到3株杂交瘤细胞(4F8、9H6和28G7)。具体为用奥氮平-BSA(牛血清白蛋白)1μg/mL包被的ELISA 96孔板,对融合细胞上清进行ELISA效价测定;选取效价测定阳性(OD>0.5)的细胞克隆上清竞争ELISA测定,筛选竞争性排序较高的克隆进行亚克隆;对筛选到的竞争性高的克隆进行亚克隆,获得单细胞克隆株。
三株杂交瘤细胞的上清的检测结果如表1所示。
表1 细胞上清的间接竞争ELISA结果
其中,抑制率按照公式I计算得到:
抑制率(%)=(1-含竞争物的测定OD值/不含竞争物的OD值)×100%
公式I
由表1结果可知,28G7表现出对奥氮平极高的灵敏度,IC50约为2ng/mL,并且根据抑制率结果可知,28G7对无活性的去甲奥氮平、N-O奥氮平、7-羟基奥氮平、10-N-glucuronide奥氮平以及氯氮平交叉反应非常低,适合于奥氮平药物浓度监测方法的建立。因此,对28G7小鼠腹水制备,并Protein A/G纯化,用于后续奥氮平血药浓度检测方法的建立。
实施例4
利用磁微粒化学发光法检测奥氮平血药浓度的方法
1)50mg Dynal beads M280 Tosyl磁珠,稀释在2mL 50mM、pH值8.0 BB 缓冲液中,加入1mg奥氮平抗体28G7,混匀后,37℃震荡反应8h。
2)磁吸去除上清,加入TBST(50mM Tris 0.9%Nacl 0.1%TW20 pH值7.4)37℃反应12h。
3)磁吸去除上清,加入TBST,稀释到0.4mg/mL,命名为磁微粒工作液,2~8℃保存待用。
4)1mg ALP溶解在1mL PBS中,加入0.5mg奥氮平衍生物(溶解在100ul DMSO中),混合均匀,加入1mg EDC固体,室温混匀2h。经透析到PBS中,用50mM MES 0.9%NaCl 5mg/mLBSA 1mM MgCl2 pH值6.7稀释到1μg/mL,命名为酶标工作液。
5)反应程序:10μl样本+40μl磁微粒液工作液+50μl 酶标工作液,于37℃孵育反应5min,清洗,加入AMPPD发光液显色,终止反应后,在400-600nm下测定发光值RLU。
采用小牛血清基质配制不同浓度的奥氮平的校准品(0、50、150、300、600、1200ng/mL),按照上述测定方法制定标准曲线如图2和表2所示。
表2 磁微粒发光法奥氮平定标曲线数据
测定精密度和最低检出限。具体为重复测定低值和高值质控各10次,并按照SD/Mean计算CV;LoB为测定一个零值样本20次,并按照Mean+2SD作为最低检出限。
结果如表3和表4所示。结果表明,重复性的CV不高于3%,说明精密度高;LoB为0.041ng/mL很低,说明检测灵敏度较高。综上,采用28G7抗体制备的磁微粒发光法奥氮平检测试剂盒的检测灵敏度高,精密性好。
表3 精密度和灵敏度
在浓度为20ng/mL的奥氮平样本中加入不同浓度的交叉测试物(见表4)进行测定,按照公式II计算交叉反应率。
交叉反应率=(实测浓度-理论浓度)/添加的交叉物浓度*100% 公式II
表4 交叉反应性结果
结果表明,磁微粒发光法的奥氮平对多种代谢物及氯氮平无明显的交叉反应,特异性好。
实施例5
奥氮平均相酶免疫检测试剂的制备方法
奥氮平均相酶免疫检测试剂包括试剂R1和试剂R2,具体如下:
试剂R1的制备:制备含20 mM NAD,30 mM葡萄糖-6-磷酸G6P、55 mM pH=8.0 的Tris缓冲液作为均相酶底物;向均相酶底物加入0.05%的抗奥氮平特异性抗体28F7上述均相酶底物中。
试剂R2的制备:0.1M pH值8.5的Tris缓冲液中加入0.05%制备的奥氮平衍生物-G6PDH酶标偶联物。其中奥氮平衍生物-G6PDH酶标偶联物是采用600U G6PDH溶解在1mL PBS中,加入0.5mg 奥氮平衍生物(溶解在100μl DMSO中),混合均匀,加入1mg EDC固体,室温混匀2h。透析到PBS中,用100mM Tris 0.9%Nacl 5mg/mL BSA pH值8.5稀释到5U/mL,命名为R2工作液。
检测方法:将20μl样本和50μl试剂R1反应5min后,加入50μl 试剂R2继续反应5min,并测定OD340值。
选取临床40例奥氮平尿液浓度样本,对比本发明构建的均相酶法同LC-MS法(Patel, Dinesh S., et al. "LC–MS/MS assay for olanzapine in human plasma andits application to a bioequivalence study." Acta Pharmaceutica Sinica B 2.5(2012): 481-494.)的测定奥氮平结果进行比对。
结果见图3。结果表明,基于本发明制备的抗体建立的均相酶法测定奥氮平含量同LC-MS法相关性良好,符合临床需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
2.一种奥氮平衍生物完全抗原,其特征在于,包括权利要求1所述奥氮平衍生物半抗原和载体蛋白;所述奥氮平衍生物半抗原和载体蛋白利用化学交联剂进行共价偶联。
3.根据权利要求2所述奥氮平衍生物完全抗原,其特征在于,所述化学交联剂包括1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N,N'-羰基二咪唑中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述奥氮平衍生物完全抗原,其特征在于,所述载体蛋白包括以下一种或多种蛋白:牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白和兔血清白蛋白。
5.一种由权利要求2~4任意一项所述奥氮平衍生物完全抗原免疫筛选获得的杂交瘤细胞,保藏编号为CGMCC No.45161。
6.一种由权利要求5所述杂交瘤细胞分泌的抗奥氮平抗体28G7。
7.权利要求6所述抗奥氮平抗体28G7在非疾病诊断目的的免疫检测奥氮平血药浓度或制备免疫检测奥氮平血药浓度的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,所述免疫检测的方法包括以下一种或几种:酶联免疫法、磁珠化学发光法、均相酶法、荧光免疫层析法和胶体金免疫检测法。
9.一种基于均相酶免疫检测法的奥氮平检测试剂盒,其特征在于,包括试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1为含质量百分含量0.01%~0.1%的权利要求6所述抗奥氮平抗体28G7、20 mMNAD、30 mM葡萄糖-6-磷酸G6P、55 mM pH值8.0的Tris缓冲液;
所述试剂R2为含质量百分含量0.01%~1% 6-磷酸葡萄糖脱氢酶标记奥氮平衍生物、0.1M pH值8.5的Tris缓冲液。
10.一种基于磁微粒化学发光法非疾病诊断目的的奥氮平血药浓度检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
将待检测样本、磁微粒标记的权利要求6所述抗奥氮平抗体28G7工作液和酶标记权利要求1所述奥氮平衍生物半抗原的工作液混合孵育,清洗,加入所述酶对应的发光底物反应显色,测定发光值RLU,代入标准四参数方程式,计算待检测样本中奥氮平血药浓度。
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