CN115068443A - 一种双响应的核-壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物及其制备和应用 - Google Patents

一种双响应的核-壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双响应的核‑壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物及其制备和应用，所述复合物为核壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物。本发明制备的pH响应的核‑壳超结构树状大分子作为抗癌药物载体时，具有低毒、高载药率、在肿瘤微环境智能释放等优点，并可用于肿瘤MR成像及化疗和化学动力学治疗，具有诊疗一体化性能；本发明利用诊疗一体化材料的分子医学成像和肿瘤治疗效果，具有良好的应用前景。

Description

一种双响应的核-壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物 及其制备和应用
技术领域
本发明属于功能性复合物领域，特别涉及一种双响应的核-壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物及其制备和应用。
背景技术
乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因，化疗在其综合治疗中占有十分重要的地位。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，占所有女性恶性肿瘤的24％，每年全球新发乳腺癌约210万例，占全球女性恶性肿瘤的11.6％，严重影响女性患者的健康。
近年来，肿瘤的持续增长促使人们不断研发新的有效的抗癌药物，而新药研发是一个漫长的过程，需负担昂贵的经济成本，并且在研发过程中容易出现频繁失败。因此，研究人员将研究目标转向一些传统的低廉、低毒和临床广泛应用的药物。DSF又叫戒酒硫，是一种高效、廉价、安全的抗酗酒的药物，近年来报道其具有广泛抗肿瘤作用，然而关于它的作用机制一直存在争议。2017年，来自丹麦的Jiri Bartek教授及他的团队报道了DSF抗肿瘤的潜在作用机制，为DSF的临床应用奠定了基础。
聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子是目前研究得较为普遍和透彻的一类树状大分子，是高度支化的单分散大分子，具有独特的树状(tree-like)分支和紧凑的球面几何构型。其结构主要包含三个部分：核、内腔和外壳。核心决定了树状大分子的三维形状，内部的疏水腔能够包裹疏水性抗癌药物如阿霉素和甲氧基雌二醇，并且能够以持续的方式释放药物。PAMAM树状大分子可通过支化单元逐步重复反应得到。随着PAMAM树状大分子代数的增加，其分子逐渐表现出高度分枝且呈球状，表面分布着大量官能团，具有疏水性的空腔。然而，用传统的方法合成更高代的、结构更精确的树状大分子时，要重复的合成步骤太多，反应控制困难(PAMAM G9树状大分子，尺寸10nm，需要18步反应)。因此需找到一种简易、快速、可控的合成方法获得具有高代聚酰胺-胺树状大分子。有人使用表面氨基的较高代树状大分子做核，表面羧基的较低代树状大分子做壳，通过EDC催化羧基与氨基的反应，构建核-壳结构的树状大分子(Uppuluri,et al.Adv.Mater.,2000,12(11):796-800.)。有人通过使用超分子主客体化学的方法合成了一种低代数为壳，高代数为核的核-壳结构树状大分子(FengChen,et al.J.Mater.Chem.B.,2017,5,8459)。然而所形成的核-壳结构树状大分子在肿瘤环境无法解离，达到药物的响应性释放。设计一种在肿瘤微环境下能够快速响应进而快速释放药物的核-壳结构树状大分子药物载体非常关键。
检索国内外相关文献和专利结果表明：利用苯硼酸脂键作用构建pH响应和ROS响应的核-壳超结构树状大分子用于药物载体的方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种双响应的核-壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物及其制备和应用，克服现有技术无法在肿瘤微环境解离从而提高释放效率的缺陷。
本发明提供一种核-壳结构树状大分子复合物，所述复合物为核壳结构树状大分子内部包裹铜离子/药物复合物；其中核壳结构以苯硼酸修饰的第五代树状大分子作核，甘露糖修饰的第五代树状大分子作壳。
所述药物为双硫仑DSF。
本发明的一种核-壳结构树状大分子复合物的制备方法，包括：
(1)将4-(溴甲基)苯硼酸PBA溶液、第五代聚酰胺-胺树状大分子G5 PAMAM溶液进行混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-PBA；
(2)将甘露糖Man溶液、第五代聚酰胺-胺树状大分子G5 PAMAM溶液进行混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-Man；
(3)将G5.NH2-PBA溶液、G5.NH2-Man溶液，混合，在搅拌条件下反应，透析、冷冻干燥，得到核-壳超结构树状大分子G5.NH2-PBA/Man-G5.NH2，也即CSTD.NH2；
(4)透析，冷冻干燥，得到G5.NHAc-PBA/Man-G5.NHAc，也即CSTD.NHAc；
(5)将CSTD.NHAc的水溶液和铜盐溶液混匀，超滤离心10～15min，得到的产物重新分散在水中，得到CSTD.NHAc-Cu(II)溶液；
(6)将药物溶液、CSTD.NHAc-Cu(II)溶液混合，搅拌反应，离心，得到核壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMSO；所述PBA和G5 PAMAM的摩尔比为35:1～45：1；所述反应温度为50℃～60℃，反应时间为20～24h。
所述步骤(1)中透析的条件为：用截留分子量为1000的透析袋透析2-3天。
所述步骤(2)中溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMSO；所述甘露糖Man和G5 PAMAM的摩尔比为35:1～45：1；所述反应温度为80℃～90℃，反应时间为20～24h。
所述步骤(2)中透析的条件为：用截留分子量为1000的透析袋透析2-3天。
所述步骤(3)中溶液的溶剂均为水，进一步为超纯水；G5.NH2-PBA和G5.NH2-Man的摩尔比为1：9～1：10；所述反应温度为50℃～60℃，反应时间为20～24h。
所述步骤(3)中透析的条件为：用截留分子量为50000的透析袋透析2～3天。
所述步骤(4)中将CSTD.NH2的水溶液中滴加三乙胺，室温搅拌反应30～45min后，继续滴加乙酸酐，室温下继续搅拌20～24h；所述CSTD.NH2、三乙胺、乙酸酐的的摩尔比为1：5000～4500：4500～4000。
所述步骤(5)中铜盐为CuCl2；铜盐溶液浓度为1.6～1.7mg/mL，铜盐溶液的溶剂为水，进一步为超纯水；所述CSTD.NHAc和铜盐的摩尔比为1：300～1：350。
所述步骤(5)中超滤离心管的截留分子量为10k，室温下7000g离心10～20min。
所述步骤(6)中药物为双硫仑DSF，药物溶液的溶剂为甲醇；CSTD.NHAc-Cu(II)溶液的溶剂为水，进一步为超纯水；CSTD.NHAc-Cu(II)中的Cu(II)和药物的摩尔比为1：0.85～1：1.15；所述搅拌反应为室温下搅拌反应过夜。
所述步骤(6)室温下3000r/min，离心10～20min。
本发明的一种所述核-壳结构树状大分子复合物在制备化疗和化学动力学联合治疗肿瘤靶向药物中的应用。
本发明的一种所述核-壳结构树状大分子复合物在制备MR成像、特异性靶向治疗功能的纳米平台中的应用。
本发明基于第五代聚酰胺-胺树状大分子为核壳结构，在作为核的第五代聚酰胺-胺树状大分子修饰苯硼酸，在作为壳的第五代聚酰胺-胺树状大分子修饰甘露糖,内部包裹Cu(II)/DSF复合物，得到具有MR成像和特异性靶向治疗功能的纳米平台。
本发明通过核磁共振氢谱(1H NMR)对修饰在树状大分子上的苯硼酸和甘露糖的数量进行了表征；通过二维核磁共振氢谱(2D NOSEY)对核-壳结构树状大分子进行表征；通过荧光光谱显微镜对核壳树状大分子pH响应和ROS响应进行了表征，电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)和紫外可见吸收光谱(UV-vis)分别对修饰在纳米平台上的铜离子和DSF的数量进行了表征；透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)对纳米平台的表面形貌和尺寸大小进行了表征；使用UV-vis、Zeta电势及动态光散射分析(DLS)等方法表征材料的物理化学性质；然后通过CCK-8法来探索评价该纳米平台的细胞毒性并对比在不同肿瘤细胞的IC50以及安全指数数值；通过ICP-OES分析该纳米平台在细胞内吞噬；细胞通过和流式细胞仪分析该纳米平台对细胞内ROS、GSH含量以及细胞周期和细胞凋亡等情况；激光共聚焦显微镜(CLSM)对该纳米平台在细胞内ROS、LPO进行定性分析。
本发明中该方法以聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子为反应单元，利用构建pH响应和ROS响应的核-壳超结构树状大分子，该方法具有易操作，制备过程简单，在超纯水下即可反应，具有高的药物装载率、癌细胞内pH响应和ROS响应等优点，制备的药物载体具备良好的分散性和生物相容性，在肿瘤化疗、化学动力学治疗及MR成像方面有良好的应用前景。
本发明通过苯硼酸修饰的第五代树状大分子作核，甘露糖修饰的第五代树状大分子作壳，利用硼酸脂键的键合作用构建pH和ROS双响应的核-壳超结构树状大分子。本发明制备的pH响应的核-壳超结构树状大分子作为抗癌药物载体时，具有低毒、高载药率、在肿瘤微环境智能释放等优点，并可用于肿瘤MR成像及化疗和化学动力学治疗，具有诊疗一体化性能；本发明利用诊疗一体化材料的分子医学成像和肿瘤治疗效果，具有良好的应用前景。
有益效果
(1)本发明简单，易于操作和分离纯化，并且所用原料成本低廉，具有良好的发展前景；
(2)本发明制备的核-壳结构树状大分子具有良好的生物相容性，具有良好的水溶性，为构建安全高效的化学药物和化学动力学联合治疗载体，提供了应用前景；
(3)本发明制备的核-壳结构树状大分子纳米平台具有pH响应和ROS响应特性，且具有特异性靶向治疗功能，在肿瘤微环境下能实现药物的智能释放，为进一步研究肿瘤微环境下药物的智能释放提供了新思路。
附图说明
图1为本发明的工艺流程示意图；
图2为本发明制备的G5-PBA(a)、G5-Man(b)、CSTD.NHAc(c)的1H NMR谱图；
图3为本发明制备的CSTD.NHAc的2D ROESY图谱；
图4为本发明制备的CSTD.NHAc的原子力显微镜(AFM)图；
图5为本发明制备的G5.NHAc-PBA/Man-G5.NHA在不同pH条件(a)和有无H2O2下(b)的荧光强度变化的光谱图；
图6为本发明制备CSTD.NHAc、DSF、CuCl2、CSTD.NHAc-Cu(II)、CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF的UV-Vis谱图；
图7为本发明制备的CSTD.NHAc-Cu(II)的TEM图(a)、粒径分布直方图(b)、CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF的TEM图(c)粒径分布直方图(d)；
图8为本发明制备的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF在48小时内不同pH和不同H2O2浓度下条件下DSF的释放；
图9为本发明制备的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF的弛豫率曲线图；
图10为本发明制备的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF在7天内不同溶剂中的粒径变化；
图11为本发明制备的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF的生物相容性照片和溶血率；
图12为本发明用CCK-8法测定MCF-7细胞(a～c)和L929细胞(d～f)与8种不同浓度的6种纳米材料共孵育24h后的细胞活力；
图13为本发明制备的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF+Man和CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF在不同浓度下与MCF-7细胞共孵育6h后细胞内吞噬Cu的含量；
图14为本发明制备的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF和6组对照材料与MCF-7细胞共孵育6h后，流式细胞仪检测细胞内ROS的荧光信号强度(a-b)和共聚焦显微镜下细胞内ROS的荧光强弱(c)；
图15为本发明制备的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF和6组对照材料与MCF-7细胞共孵育6h后，酶标仪检测细胞内GSH的含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。除非特殊说明，否则所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。PBA购自上海毕得医药科技有限公司(上海，中国)。甘露糖购自Sigma-Aldrich贸易有限公司(上海，中国)。二水合氯化铜(CuCl2·2H2O)购自北京百灵威科技有限公司(北京，中国)。双硫仑购自赛默飞世尔科技有限公司(上海，中国)。第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH2)购自Dendritech公司(美国)。三乙胺和乙酸酐购自国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)。RPMI 1640培养液、胎牛血清(FBS,GIBCO)、青霉素-链霉素(HyClone,ThermoScientific,Logan,UT)和胰蛋白酶0.25％溶液(HyClone)购自杭州吉诺生物医药技术有限公司(杭州，中国)。MCF-7细胞(小鼠乳腺癌细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自碧云天生物技术有限公司(上海，中国)。再生纤维素透析膜(MWCO＝1000、50000)购自上海源叶生物科技有限公司。所有实验中使用的电阻率高于18.2MΩ.cm的超纯水均通过实验室水净化系统(Milli-Q Plus 185，美国)进行净化。
实施例1
(1)称取20mg G5 PAMAM、6.61mg PBA分别溶于5mL DMSO中并使其充分溶解，将PBA溶液加入到G5 PAMAM溶液中60℃磁力搅拌反应24h；待反应结束后，将反应液转移至截留分子量为1000的透析袋中，在超纯水中透析3天，最后经冷冻(-80℃)、干燥得到固体产物G5.NH2-PBA，储存于-20℃。
(2)称取50mg G5 PAMAM、13mg甘露糖分别溶于10mL DMSO中并使其充分溶解，将甘露糖溶液加入到G5 PAMAM溶液中90℃磁力搅拌反应24h；待反应结束后，将反应液转移至截留分子量为1000的透析袋中，在超纯水中透析3天，最后经冷冻(-80℃)、干燥得到固体产物G5.NH2-Man，储存于-20℃。
(3)称取5mg G5.NH2-PBA、50mg G5.NH2-Man分别溶解在10mL超纯水中，60℃磁力搅拌反应24h；待反应结束后，将反应液转移至截留分子量为1000的透析袋中，在超纯水中透析3天，最后经冷冻(-80℃)、干燥得到固体产物CSTD.NH2，储存于-20℃。
(4)称取30mg CSTD.NH2溶解在5mL超纯水中，向上述溶液中缓慢滴加73.5μL三乙胺，室温搅拌反应30min后，继续向上述溶液中滴加41.5μL醋酸酐，室温下继续搅拌反应24h，待反应结束后将使用截留分子量为8000-14000的透析袋在超纯水中透析3天，冷冻(-80℃)、干燥得到固体产物CSTD.NHAc，储存于-20℃。
(5)称取10mg CSTD.NHAc和3.26mg CuCl2溶解在5mL超纯水中，将CuCl2溶液在超声中加入到CSTD.NHAc溶液中混合均匀，将上述反应液用截留分子量为10k的超滤离心管以7000g离心15min，然后将得到的产物重新分散在5mL超纯水中CSTD.NHAc-Cu(II)溶液，储存于4℃。
(6)取5mL上述CSTD.NHAc-Cu(II)溶液，称取0.86mg DSF溶解在1mL甲醇中，然后将DSF溶液逐滴滴加到CSTD.NHAc-Cu(II)溶液中，室温下磁力搅拌反应过夜，反应结束后将上述反应液以3000r/min离心15min，取上清溶液，得到CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF溶液，储存于4℃。
实施例2
分别称取实施例1中G5.NH2-PBA、G5.NH2-Man、CSTD.NHAc各5mg，分别将其溶于500μL D2O中，进行核磁共振氢谱分析(如图2所示)。如图2(a)所示，其中7.20-7.61ppm处为PBA的特征峰，2.3-3.2ppm为G5 PAMAM的特征峰，表明PBA与G5 PAMAM成功连接；如图2(b)所示，7.8-8.0ppm处为Man的特征峰，2.3-3.2ppm为G5 PAMAM的特征峰，结果表明Man成功修饰到G5表面；如图2(c)所示，其中6.9-7.1ppm处为PBA的特征峰，7.8-8.0ppm处为Man的特征峰，2.3-3.2ppm处为G5 PAMAM的特征峰，1.88ppm处的质子峰源于G5表面末端氨基的乙酰化，通过积分计算得到G5.NH2-PBA表面修饰了约6个G5.NH2-Man。
实施例3
CSTD.NH2的2D ROESY表征结构如图3所示。化学位移7.8-8.0ppm处的甘露糖基团与化学位移7.20-7.61ppm处苯硼酸基团出现了明显的相关交叉信号，由此可以说明甘露糖与苯硼酸发生了相互作用，紧密结合。同时证明了G5.NH2-PBA和G5.NH2-Man通过硼酸脂键作用成功构建出了的核-壳超结构树状大分子CSTD.NH2。
实施例4
称取实施例1中的CSTD.NHAc 0.5mg配置成0.5mg/mL的水溶液进行AFM测试。如图4所示，材料直径在13.96nm左右，鉴于第五代树状大分子的尺寸在5.5nm左右，所以进一步证明成功构建出了的核-壳超结构树状大分子CSTD.NH2。
实施例5
称取4份实施例1中的CSTD.NHAc 2mg，分别溶于pH＝7.4、pH＝6.4、pH＝5.4的磷酸缓冲液以及0.1mM H2O2溶液(pH＝7.4)中，配置成浓度为1mg/mL的溶液，用荧光光谱仪测试溶液的激发光谱(发射波长为388nm)。结果如图5(a)所示，随着pH值的降低，最大吸收波长302nm处的荧光强度升高，证明核-壳结构树状大分子在弱酸及酸性环境中由于苯硼酸酯键的断裂而解离。参见说明书附图5(b)所示，最大吸收波长302nm处的荧光强度降低，证明核-壳结构树状大分子中在H2O2的存在下由于PBA与H2O2的反应而解离。从而证明了核壳树状大分子具有pH响应和ROS响应。
实施例6
分别取实施例1中CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF以及四个对照组材料G5.NHAc-PBA/Man-G5.NHA、CuCl2、DSF、和CSTD.NHAc-Cu(II)配置成0.5mg/mL的溶液，测量紫外吸收，结果如图6所示。其中Cu2+在812nm处有明显的特征吸收峰，CSTD.NHAc-Cu(II)在300nm处有明显的特征吸收峰，DSF在290nm处有明显的特征吸收峰，CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF在300nm和460nm处有特征吸收峰，这说明Cu2+和DSF已经成功负载到CSTD.NHAc内部。
实施例7
对实施例1中制备的CSTD.NHAc-Cu(II)、CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF进行TEM测试，即将实施例1中制备的CSTD.NHAc-Cu(II)、CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF配置成浓度为0.5mg/mL的溶液，取5μL滴在透射电镜超薄铜网上，用日本JEOL电子显微镜进行形貌观察。结果如图7(a～b)所示，CSTD.NHAc-Cu(II)粒径为4.42nm，如图7(c～b)所示，CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF，粒径为5.07nm。
实施例8
分别配制pH＝7.4、pH＝6.4的磷酸盐缓冲溶液，并用pH＝7.4、pH＝6.5的缓冲液配制成终浓度为10mM的H2O2溶液，将制备的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF分别用上述缓冲溶液稀释为1mg/mL的溶液，置于透析袋中，再将透析袋置于含有20mL上述不同的pH缓冲溶液的50mL离心管中，置于37℃的恒温摇床中振荡。在不同的时间点吸取透析袋外液1mL，再向离心管中补充1mL对应的pH缓冲溶液，并测量取出液体在290nm处的吸光值。缓释结束后，绘制CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF在不同pH和不同H2O2条件下的DSF释放曲线，图8所示，pH＝6.4，含H2O2的条件下释放的药物最多，进一步证明了核壳树状大分子具有pH响应和ROS响应。
实施例9
分别配制铜浓度为0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mM的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF溶液，取1mL置于1.5mL离心管中，用0.5T的纽曼核磁共振成像仪测定不同浓度材料的弛豫时间，将弛豫时间的倒数与相对应的铜浓度进行拟合，直线斜率即为材料的弛豫率，如图9所示。
实施例10
称取实施例1中的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF 1mg，分别溶于的1mL超纯水、PBS和无血清RPMI 1640中，连续测试了这些样品在7天内的电势和粒径变化，如图10所示。结果表明在放置的一周时间内，CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF的尺寸和电势均没有明显变化，说明材料具有良好的稳定性，这为材料在细胞和体内的低细胞毒性提供了保障。
实施例11
为了验证材料的血液相容性，进行了血液相容性实验。取2mL裸鼠全血加入抗凝管中，通过离心洗涤沉淀5次后收集红细胞，再用PBS稀释10倍。在7个离心管中各加入100μL上述稀释的红细胞，将不同浓度的CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF溶液(CCu 2+＝12.5、25、50、100、200μM)、超纯水和PBS溶液各取1mL依次加入到离心管中混合，37℃静置2h后离心(10000rpm，5min)。以PBS为阴性对照，纯水为阳性对照，测每组上清液在540nm处的紫外吸收值。溶血率的计算公式为：溶血率(％)＝(Dt-Dnc)/(Dpc-Dnc)×100％(其中，Dt是测试样品在540nm处的吸光值，Dpc与Dnc分别是阳性对照和阴性对照在540nm下的吸光值。)实验结果如图11所示，只有阳性对照组的红细胞出现破裂，溶液变为红色，其他组未发生溶血现象；溶血率计算表明：各组溶血率均低于5％，是安全的，不会出现溶血现象。
实施例12
通过CCK-8比色法，以L929细胞和MCF-7细胞为模型细胞评价实施例1中制备的材料CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF和对比材料CuCl2、DSF、CSTD.NHAc、CSTD.NHAc-Cu(II)、CSTD.NHAc-DSF对细胞存活的影响。将上述材料分散在无菌PBS缓冲液中配制成DSF浓度为500μM的母液，并用紫外照射过夜杀菌。取培养好的L929细胞和MCF-7细胞分别接种于96孔板中，按照1×104细胞/孔的密度接种，每孔体积100μL。培养过夜后，加入各稀释梯度的样品，每孔DSF浓度最终分别为1.25、2.5、6.25、12.5、25、62.5、125μM，对应的CSTD.NHAc浓度分别为0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、200μg/mL，对应的铜浓度分别为0.5、1、2.5、5、10、25、50μM与细胞共培养24h。每个梯度做6个平行孔，以PBS缓冲液作为空白对照。随后用CCK-8法检测细胞活力，每孔加100μL 10倍稀释的CCK-8溶液，在37℃下培养3h。之后用酶标仪检测450nm处吸光度。CCK-8测试结果如图12(a)(d)所示，DSF、CSTD.NHAc-DSF、CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF与2种细胞共培养后，细胞存活率随着材料浓度增加逐渐降低，说明纳米平台提高了DSF的生物相容性，提高了Cu/DSF的肿瘤杀伤性；如图12(b)(e)所示，在MCF-7细胞和L929细胞几乎没有死亡，说明载体材料无明显细胞毒性；如图12(c)(f)所示，CuCl2的细胞毒性比CSTD.NHAc-Cu(II)要大，说明纳米平台提高了材料的生物相容性。为了比较纳米平台对不同细胞的抑制效果与安全性，计算了DSF、CSTD.NHAc@DSF、CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF在MCF-7细胞和L929细胞中的IC50值以及安全指数，如表1所示，从而验证了CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF是一种安全有效的选择性药物。
表1.三种材料对不同细胞的IC50值和安全指数
Sample DSF CSTD.NHAc@DSF CSTD.NHAc@DSF
IC<sub>50</sub>(L929) 13.34μM 129.91μM 20.02μM
IC<sub>50</sub>(MCF-7) 19.78μM 26.17μM 11.32μM
安全指数 0.67 4.96 1.78
实施例13
以MCF-7细胞为细胞模型评价CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF在细胞内的分布情况以及纳米平台的靶向功能。将MCF-7细胞接种于6孔板中，按照2×105细胞/孔的密度接种，每孔体积1mL，在37℃培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，弃去培养基，用PBS清洗三次，然后用无血清培养基配置浓度为40μMMan溶液和无血清培养基和细胞共孵育4h，弃去培养基，用PBS清洗三次，然后将不同浓度CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF(CCu 2+＝1、2.5、5μM)的培养基与MCF-7细胞在37℃培养箱中共培养6h。培养结束后用PBS清洗三次，用王水消化4h后加2mL超纯水稀释，通过ICP-OES检测细胞中铜的含量。实验结果如图13表明，细胞内Cu的吞噬量随Cu的浓度升高而增强，并且通过甘露糖阻断的细胞中铜的含量明显低与单纯材料组，说明了CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF能够靶向MCF-7细胞，提高细胞对材料的摄取。
实施例14
为了验证材料的化学动力学治疗效果，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测了细胞内ROS的含量。将MCF-7细胞按照2×105细胞/孔的密度接种在6孔板上培养过夜。然后将培养基换成含有CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF和对比材料CuCl2、DSF、CSTD.NHAc、CSTD.NHAc-Cu(II)、CSTD.NHAc-DSF的培养基(对应DSF浓度为12.5μM,铜的浓度为5μM)与细胞共培养6h。培养结束后，用PBS清洗三次，每孔加入1.5mL稀释好的DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育20min。随后将所有孔板的细胞消化、离心、收集，用流式细胞仪检测细胞样品的荧光强度(如图14所示)。将MCF-7细胞以15×104细胞/孔的密度接种于confocal皿中，在37℃培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，弃去培养基，用PBS洗三次，然后用无血清培养基将换成含有CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF和对比材料CuCl2、DSF、CSTD.NHAc、CSTD.NHAc-Cu(II)、CSTD.NHAc-DSF的培养基(对应DSF浓度为12.5μM,铜的浓度为5μM)，与MCF-7细胞在37℃培养箱中共培养6h。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10mΜ，去除细胞培养液，用PBS清洗三次，每孔加入1.5mL稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20min。培养结束后用PBS清洗三次，然后用4％的戊二醛固定15min，固定后用DAPI染色5min，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞的荧光信号(如图14所示)。结合图14所示，单独DSF和CuCl2能够是细胞内活性氧水平上升，而最终组材料能够通过化学动力学治疗和化疗，产生更多的活性氧水平，影响细胞内氧化还原状态。
实施例15
为了进一步验证材料的化学动力学治疗效果，对细胞内GSH含量进行了测定。将MCF-7细胞按照2×105细胞/孔的密度接种在6孔板上培养过夜。然后将无血清培养基换成含有CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF和对比材料CuCl2、DSF、CSTD.NHAc、CSTD.NHAc-Cu(II)、CSTD.NHAc-DSF的培养基(对应DSF浓度为12.5μM,铜的浓度为5μM)，与细胞共培养6h。随后将所有孔板的细胞消化、离心、收集，按照试剂盒说明测定细胞内GSH含量。如图15所示，CSTD.NHAc-Cu(II)@DSF的GSH含量明显低于其他组，表明的最终组材料具有更优异化学动力学治疗效果。

Claims (10)

1.一种核-壳结构树状大分子复合物，其特征在于，所述复合物为核壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物；其中核壳结构以苯硼酸修饰的第五代树状大分子作核，甘露糖修饰的第五代树状大分子作壳。
2.一种核-壳结构树状大分子复合物的制备方法，包括：
(1)将4-(溴甲基)苯硼酸PBA溶液、第五代聚酰胺-胺树状大分子G5 PAMAM溶液进行混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到第五代树状大分子-苯硼酸G5.NH2-PBA；
(2)将甘露糖Man溶液、第五代聚酰胺-胺树状大分子G5 PAMAM溶液进行混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到第五代树状大分子-甘露糖G5.NH2-Man；
(3)将G5.NH2-PBA溶液、G5.NH2-Man溶液，混合，在搅拌条件下反应，透析、冷冻干燥，得到核-壳超结构树状大分子CSTD.NH2；
(4)将CSTD.NH2的水溶液中滴加三乙胺，室温搅拌反应，继续滴加乙酸酐，室温下继续搅拌，透析，冷冻干燥，得到乙酰化的核-壳树状大分子CSTD.NHAc；
(5)将CSTD.NHAc的水溶液和铜盐溶液混匀，超声振荡10～15min，超滤离心，得到的产物重新分散在水中，得到包裹铜的核-壳树状大分子CSTD.NHAc-Cu(II)溶液；
(6)将药物溶液CSTD.NHAc-Cu(II)溶液混合，搅拌反应，离心，得到核壳结构树状大分子包裹铜离子/药物复合物。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMSO；所述PBA和G5 PAMAM的摩尔比为35:1～45：1；所述反应温度为50℃～60℃，反应时间为20～24h。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMSO；所述甘露糖Man和G5 PAMAM的摩尔比为35：1～45:1；所述反应温度为80℃～90℃，反应时间为20～24h。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中溶液的溶剂均为水；G5.NH2-PBA和G5.NH2-Man的摩尔比为1：9～1：10；所述反应温度为50℃～60℃，反应时间为20～24h。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中CSTD.NH2的水溶液中滴加三乙胺，室温搅拌反应30～45min后，继续滴加乙酸酐，室温下继续搅拌20～24h；所述CSTD.NH2、三乙胺、乙酸酐的摩尔比为1：5000～4500：4500～4000。
7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中铜盐为CuCl2；铜盐溶液浓度为1.6～1.7mg/mL，铜盐溶液的溶剂为水；所述CSTD.NHAc和铜盐的摩尔比为1：300～1：350。
8.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中药物为双硫仑DSF，药物溶液的溶剂为甲醇；CSTD.NHAc-Cu(II)溶液的溶剂为水；CSTD.NHAc-Cu(II)中的Cu(II)和药物的摩尔比为1：0.85～1：1.15；所述搅拌反应为室温下搅拌反应过夜。
9.一种权利要求1所述核-壳结构树状大分子复合物在制备化疗和化学动力学联合治疗肿瘤靶向药物中的应用。
10.一种权利要求1所述核-壳结构树状大分子复合物在制备MR成像、特异性靶向治疗功能的纳米平台中的应用。
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