CN115058492A - 一种基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,包括如下步骤:基于均分组合理念的DNA编码微球的设计与制备;基于SCDB微球的转录组测序文库构建(SCDB‑seq)的设计;基于SCDB‑seq的空间转录组测序的设计与实现。本方法可以以单细胞分辨率(~10μm)对新鲜冰冻样本切片和福尔马林固定石蜡包埋样本切片上的微区进行可选择性的、高多路复用性的中通量(50~1000样本)空间转录组测序文库构建,能够可以选择性地获得组织切片中多个特定微区样本的基因表达谱;本方法实验操作量和试剂成本仅为已有同类方法的~1%和~13%,展现出良好的人力和试剂成本控制。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞转录组测序、空间转录组测序的NGS测序cDNA文库构建方法,特别涉及一种可以适配于激光显微切割(Laser capture microdissection,LCM)、激光诱导前向转移(Laser-induced forwardtransfer,LIFT)以及微区采样等组织切片微区样本采集方法的中等检测通量(50~1000个)、高多路复用性的转录组测序文库构建方法。
背景技术
基于NGS的空间分辨转录组技术利用带有oligo-dT的引物对目标微区内的mRNA进行捕获,随后应用某种RNA-seq方案进行逆转录及cDNA扩增以得到满足测序要求的cDNA文库。现有的基于NGS的空间分辨转录组技术多直接应用与其检测通量相当scRNA-seq方案的cDNA文库构建方法或其改进版本,例如在基于原位捕获的高通量方法中:ST、HDST应用InDrop中的建库测序方案,即cDNA合成后通过IVT进行线性扩增,随后进行二次逆转录并通过PCR扩增得到测序文库以实现对低丰度转录本的高并行、高灵敏度检测,slide-seq、DBiT-seq采用Drop-Seq中的方案,即一种基于Smart-seq2方案、针对高通量检测进行改进的版本,在逆转录过程中仍进行模板转换及两轮PCR扩增,但Tn5转座酶打断后对仅3’端DNA片段进行扩增以保留DNA条形码和UMI的序列;在基于显微切割的空间分辨转录组方法中:Geo-seq、LCM-seq直接使用Smart-seq2的逆转录及cDNA文库构建方案,以对目标微区内的mRNA分子进行全长测序。
随着各种显微切割、微区采样技术的发展,对单个目标区域进行采样所需的时间不断缩短且自动化程度持续提升,具有对一组组织切片内成百上千个目标微区进行连续取样的潜力。但目前此类技术仅能依靠Smart-seq2进行测序文库构建,Smart-seq2方案无法使用具有DNA条形码的捕获引物,仅能在PCR扩增建库过程中通过不同的index序列进行特异性标记。因此Smart-seq2是一种低通量、低并行性的全长转录本测序方案(多针对几个或几十个微区样本)。在文库构建过程中,各微区样本无法在逆转录后混合进行并行建库测序,导致实验操作量及试剂消耗量与采集微区样本数成正比,限制了基于显微切割的空间分辨转录组方法对组织切片内目标区域进行中通量(50~1000样本数)、高并行性基因表达谱检测,阻碍了此类技术应用于明确生物组织内区域特异性基因表达谱和细胞集体行为。
发明内容
发明目的:本发明目的是提供一种检测效果好、成本低、可选择性的、高多路复用性的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,
技术方案:所述基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,包括如下步骤:
(1)基于SCDB微球的设计与制备;
(2)SCDB-seq的设计与使用;
(3)基于SCDB-seq的空间转录组测序的设计与实现。
进一步地,所述步骤(1)的设计方法如下:使用两段具有特定序列设计的引物:引物1-N(1≤N≤8)、引物2-M(1≤M≤12)采用均分组合制备方法在微球表面进行DNA条码引物制备。将一定量的编码微球均分为8份分别放入离心管并命名为“1-N”(1≤N≤8),向离心管中加入对应引物1-N进行第一轮编码。随后将8支离心管中的微球按照特定顺序(离心管1-1~1-8对应96孔PCR板上的A~H排)均分至一块96孔PCR板中加入对应引物2-M进行第二轮编码,最终生成96种具有独特DNA条码组合的编码微球。
进一步地,所述步骤(1)的设计方法如下:使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)将微球表面的羧基基团转换成可与氨基反应的O-酰基异脲中间体,该中间体能够迅速与5’端修饰有氨基基团的引物1-N形成酰胺键,从而将引物1-N共价固定在微球表面。凭借特殊的引物设计,引物2-M的3’末端可与引物1-N的3’末端产生反向互补,随后在等温扩增DNA聚合酶的作用下将引物2-M中的序列反向互补延伸到引物1-N的3’末端,从而完成微球表面编码引物的制备。
进一步地,所述引物1-N序列设计(5’→3’)为:1)PCR引物(PCR Primer),用于通过PCR扩增cDNA文库;2)DNA条形1-N(Barcode1-N),起到DNA编码作用的特异条码序列,共8种;3)连接序列(Adaptor),用于与引物2-M3’末端反向互补;所述引物2-M序列设计(5’→3’)为:1)poly-dA,用于生成具有mRNA捕获功能poly-dT;2)UMI*,起到特异性分子识别作用的序列;3)DNA条形2-M*(Barcode2-M*),起到DNA编码作用的特异编码序列,共12种;4)反向互补连接序列(Adaptor*),用于与引物1-N 3’末端反向互补。
进一步地,所述微球为单分散磁性微球,微球内核为SiO2或聚苯乙烯,内核外覆盖有一层Fe3O4表面包裹有修饰为羧基的化学修饰层。
进一步地,所述微球的粒径大小为0.1μm至100μm,具体操作中采用200μm、1μm、20μm三个粒径的微球。
进一步地,所述步骤(2)中SCDB-seq的设计方法,,包括如下步骤:
1)使用SCDB微球对样本中的mRNA进行捕获;
2)对捕获到的mRNA分子进行逆转录;
3)通过PCR扩增构建满足第二代测序(next generation sequencing,NGS)的cDNA文库;
4)使用纯化磁珠富集目标cDNA片段。
进一步地,所述步骤(3)中基于SCDB-seq的空间转录组测序,其特征在于:
1)应用于新鲜冰冻组织切片的实验方案在mRNA捕获环节增加了0.5%浓度的Triton X-100以透化细胞膜,使mRNA得以从细胞中充分释放且被SCDB微球捕获;
2)应用于FFPE组织切片的实验方案除增加0.5%浓度的Triton X-100外,由于FFPE组织切片内的mRNA已存在一定程度的降解,故取消了用于使mRNA发生片段化的Mg2+热处理环节,且在mRNA释放及捕获环节添加0.125μg/μL浓度的蛋白酶K并在60℃下进行1h的孵育,充分去除FFPE组织中存在的分子间交联,以尽可能释放出mRNA分子。
优选方案如下:
所使用的两段用于合成SCDB微球的引物:引物1-N(1≤N≤8)、引物2-M(1≤M≤12)具有特殊的引物设计:(1)引物1-N序列设计(5’→3’)为:1)PCR引物(PCR Primer),用于通过PCR扩增cDNA文库;2)DNA条形1-N(Barcode1-N),起到DNA编码作用的特异条码序列,共8种;3)连接序列(Adaptor),用于与引物2-M 3’末端反向互补;(2)引物2-M序列设计(5’→3’)为:1)poly-dA,用于生成具有mRNA捕获功能poly-dT;2)UMI*,起到特异性分子识别作用的序列;3)DNA条形2-M*(Barcode2-M*),起到DNA编码作用的特异编码序列,共12种;4)反向互补连接序列(Adaptor*),用于与引物1-N 3’末端反向互补。
使用引物1-N、引物2-M采用均分组合制备的方法在微球表面制备DNA编码引物,即将一定量的编码微球均分为8份分别放入1.5ml离心管并命名为“1-N”(1≤N≤8),向离心管中加入对应引物1-N进行第一轮编码。随后将8支离心管中的微球按照特定顺序(离心管1-1~1-8对应96孔PCR板上的A~H排)均分至一块96孔PCR板中加入对应引物2-M进行第二轮编码,最终生成96种具有独特DNA编码组合的编码微球。具体合成方案为微球表面的羧基基团在EDC的作用下转换成可与氨基反应的O-酰基异脲中间体,该中间体能够迅速与5’端修饰有氨基基团的引物1-N形成酰胺键,从而将引物1-N共价固定在微球表面,随后凭借特殊的引物设计,引物2-M的3’末端可与引物1-N的3’末端产生反向互补,随后在等温扩增DNA聚合酶的作用下将引物2-M中的序列反向互补延伸到引物1-N的3’末端,从而完成微球表面编码引物的制备。
完成DNA编码引物合成的SCDB微球引物设计为:1)PCR引物(PCRPrimer),用于通过PCR扩增cDNA文库;2)DNA条形1-N(Barcode1-N),起到DNA编码作用的特异条码序列,共8种;3)连接序列(Adaptor),用于与引物2-M 3’末端反向互补;4)UMI,起到特异性分子识别作用的序列;5)DNA条形2-M(Barcode2-M),起到DNA编码作用的特异条码序列,共12种;6)poly-dT,用于捕获mRNA。
SCDB-seq适配于LCM、LIFT和微区采样等组织切片微区样本采集方法,对待分析的FF组织切片、FFPE组织切片进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色,使得组织切片内细胞核呈现蓝紫色,细胞质则为红色。基于H&E染色结果进行引导对组织切片上的目标区域进行LIFT显微切割,单个切割点直径约为20μm。应用于新鲜冰冻组织切片的实验方案在mRNA捕获环节增加了0.5%浓度的Triton X-100以透化细胞膜,使mRNA得以从细胞中充分释放且被SCDB微球捕获。应用于FFPE组织切片的实验方案除增加0.5%浓度的Triton X-100外,由于FFPE组织切片内的mRNA已存在一定程度的讲解,故取消了用于使mRNA发生片段化的Mg2+热处理环节,且在mRNA释放及捕获环节添加0.125μg/μL浓度的蛋白酶K并在60℃下进行1小时的孵育,充分去除FFPE组织中存在的分子间交联,以尽可能释放出mRNA分子。
作用于根据预采集样本数量n计算各种溶液的配置量,在预冷至0℃的电子恒温加样台上,配制mRNA片段化Mix(Fragmentation Mix)和模板转换-逆转录Mix(TS-RT Mix)各n+n/5份。向PCR管或96孔板中分别加入Fragmentation Mix和10mg/mL SCDB微球悬液,并进行振荡混合。使用激光诱导前向转移(Laser-induced forward transfer,LIFT)或微区采样将目标组织微区收集到PCR管管帽中,随后紧闭管帽将PCR管倒置以使溶液浸泡目标组织以进行组织透化释放出RNA分子。将PCR管或96孔板倒置于恒温金属浴中按照程序进行裂解,然后将PCR管短暂离心使溶液集中于管底,通过显微镜观察目标样品是否完全裂解。若目标样本已完全裂解,取出PCR管或96孔板并向每孔中加入LCM TS-RT Mix,随后通过振荡混合,将PCR管或96孔板放入恒温金属浴中,按照程序完成逆转录。
随后将PCR管或96孔板进行振荡,吸取微球悬液至一支PCR管,磁吸附后去除部分上清液。按照配制预扩增PCR Mix,随后将PCR管或96孔板放入PCR热循环仪中进行预扩增,并利用DNA纯化磁珠进行cDNA文库的纯化浓缩。
配制PCR扩增建库Mix加入到上述PCR管中,并将PCR管放入PCR热循环仪中按照进行PCR扩增构建测序文库。并利用DNA纯化磁珠进行cDNA文库的纯化浓缩,最后进行Qubit检测cDNA浓度并进行Aligent电泳,若确认无误进行送测。
本发明针对混合-均分法制备的DNA编码(Split-Pool DNA barcode,SPDB)微球具有的DNA条形码序列处于未知状态、应用于空间分辨转录组测序需要通过某种方式进行解码的问题,本发明提出了SCDB微球制备方案,通过将微球不断均分连接序列不同且已知的DNA条形码以得到多种编码微球。不同于SPDB微球,此方法制备出来的编码微球所带有的DNA条形码序列已知,使用时记录所使用编码微球与样本编号的对应关系即可将通过测序得到的mRNA文库与其空间位置信息相对应,完成空间分辨转录组测序。为保证RNA-seq对于微小组织样本或RNA降解样本,例如FFPE组织,中mRNA分子的高灵敏度、高准确性检测,本发明在Smart-3SEQ方案的基础上进行优化使其适配于SCDB微球,并称为SCDB-seq。将SCDB-seq与Smart-seq2进行对比,证明该方案在能够对微区样本内的转录组有效检测且对多样本的检测具有多路复用性,实验过程中无需进行繁琐操作、试剂成本大幅度降低。
有益效果:本发明与现有技术相比,具有如下优势:
1、本方法在广泛应用于DNA编码编码微球制备的混合均分(Split-Pool)策略的基础上进行改进提出了一种均分组合(Split-Combinatorial)的理念,基于此理念设计并实现了96种SCDB微球的制备。区别于基于Split-Pool策略制备的DNA编码微球,SCDB微球装载于96孔PCR板,每孔中SCDB微球的DNA编码组合序列已知且相同,同时与所处微孔编码存在对应关系。
2、本方法在设计实验方案时对实验材料和试剂经济性进行了充分考虑,以期得到一种检测性能卓越且实验成本较低的转录组测序文库构建方法。在SCDB微球制备过程中,设计对照实验确认各粒径微球的最适引物1-N添加浓度以减少DNA编码捕获引物制备过程中存在的引物浪费。经计算可知,相较于制备96种DNA编码捕获引物,制备SCDB微球的成本仅为其15%。相较于Smart-seq2,SCDB-seq使用Mg2+热打断法片段化mRNA分子,无需使用价格高昂的Tn5转座酶对cDNA进行打断,且得益于SCDB-seq的多路复用性,除mRNA逆转录过程外,其余实验步骤均仅消耗1份试剂。故使用SCDB-seq对96个样本进行转录组测序文库构建时,其消耗试剂的成本约为采用Smart-seq2所需成本的13%。
3、本方法可以以单细胞分辨率(~10μm)对新鲜冰冻(Fresh Frozen,FF)样本切片和福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded,FFPE)样本切片上的微区进行可选择性的、高多路复用性的中通量(50~1000样本)空间转录组测序文库构建,从而能够可以选择性地获得组织切片中多个特定微区样本的基因表达谱;本方法实验操作量和试剂成本仅为已有同类方法的~1%和~13%,展现出良好的人力和试剂成本控制。
附图说明
图1为SCDB微球制备原理图;
图2为互补荧光探针质控原理图及结果;
图3为SCDB-seq测序文库构建示意图。
具体实施方式
分别取62.5μL 50mg/ml的200nm粒径的羧基化磁珠至8支新的1.5ml离心管,使用1mL 0.1M MES-缓冲液(pH 5.0)洗涤两次,洗涤后溶解于500μL 0.1M MES缓冲液(pH 5.0)中。将62.5μL 50mg/mlEDC溶液和50μL 100μM引物1-N加入到各只1.5ml离心管中,并命名为“1-N”。将8支1.5ml离心管在分子杂交炉中28℃1500rpm旋转孵育5h。磁性分离后,吸取上清液至另一支1.5ml离心管,用于Qubit检测和凝胶电泳。使用1ml TET缓冲液(pH=7.8)清洗8支离心管3遍,磁性分离,最终将微球溶于312.5μl 1x TET缓冲液(pH=7.8)并置于4℃保存。
吹打重悬微球,取5μL微球悬液至新的1.5ml离心管,磁性分离去除上清液。洗涤微球2遍,洗涤条件为向其中加入100μl QC溶液,在室温下磁性分离,去除上清液后,加入QC溶液至终体积为5μL。向1.5ml离心管中加入1μL的100μM荧光探针1,移液枪吹打混合,然后将试管在室温下避光孵育30min。用QC缓冲液洗涤微球三遍,以除去多余的探针。洗涤条件为:100μl QC缓冲液,涡旋混合,磁性分离,然后去除上清液。最后一次洗涤结束时,除去上清液,离心管中最终体积为10μL离心管涡旋振荡后,分三次取2.5μL至盖玻片上,置于荧光显微镜下观察。
将上述8支1.5ml离心管离心后置于1.5ml磁力架上完全去除上清液,用1x TE缓冲液将离心管洗涤3次,最后一次洗涤后完全去除上清液,洗涤条件为:1mL 1x TE缓冲液洗涤,磁性分离完全上清液。向8支1.5ml离心管分别加入32.5μL 10x等温扩增缓冲液、235μL无酶水与32.5μL 10mM dNTP,混合后得到300μL微球mix。取1块新的96孔PCR板,依次将1-N分装至96孔板A-H排的1-12孔中,每孔25μL。从冰箱中取出100μM引物2-M,在室温下以1000g离心1min。将引物2-M放在设置在72℃的金属浴中3min,然后在4℃下20s,以去除引物二聚体。使用排枪向96孔PCR板的微孔中加入6μL对应的引物2-M(M=微孔的列数),并将96孔PCR板转移至恒温振荡金属浴中85℃下孵育2分钟,并后用封口膜小心密封引物2、将其储存在-20℃。取一支1.5ml离心管,按照表2.5在冰上配制等温反应Mix,并上下颠倒15次混合Mix并在冰上保存。向96孔PCR板每孔中分别加入14μL等温反应混合物,随后将96孔PCR板放回恒温振荡金属浴中65℃下孵育120分钟,较长的孵育时间没有有害影响。
准备20ml新配置变性溶液向96孔PCR板中每孔加入50μL变性溶液,恒温振荡金属浴85℃振荡2min,离心后趁热去除上清液,此步骤重复三次,最后完全去除上清液。用中和溶液洗涤微球:向96孔PCR板中每孔加入50μL中和溶液,涡旋振荡后离心去除上清液,此步骤重复三次。向96孔PCR板中每孔加入50μL TET缓冲液,至此SCDB微球制备完成。按照“2.3.2(2)利用荧光探针验证编码制备引物固定效果”方案,使用荧光探针1和荧光探针2验证SCDB微球表面是否存在目标寡核苷酸链,以判断反应是否顺利进行。
作用于根据预采集样本数量n计算各种溶液的配置量,在预冷至0℃的电子恒温加样台上,配制mRNA片段化Mix(Fragmentation Mix-FF):SMARTScribe first-strandreaction buffer,5X,2μL;dNTP mix,(10mM),2μL;MgCl2(80mM),1μL;Triton X-100,0.5%(v/v),1μL;RNase Inhibitor(40U/ul),1μL和模板转换-逆转录Mix(TS-RT Mix):Betame(5M),4μL;DTT,20mM,2μL;dd H2O,1μL;2S primer,20μM,1μL;SMARTScribe reversetranscriptase,100U/μL,1μL各n+n/5份。向PCR管或96孔板中分别加入9.0μLFragmentation Mix-FF和1.0μL 10mg/mL SCDB微球悬液,并进行振荡混合。使用激光诱导前向转移(Laser-induced forward transfer,LIFT)或微区采样将目标组织微区收集到PCR管管帽中,随后紧闭管帽将PCR管倒置以使溶液浸泡目标组织以进行组织透化释放出RNA分子。将PCR管或96孔板倒置于恒温金属浴中,按照如下程序进行裂解:60℃20min,然后将PCR管短暂离心使溶液集中于管底,通过显微镜观察目标样品是否完全裂解。若目标样本已完全裂解,取出PCR管或96孔板并向每孔中加入10μL LCM TS-RT Mix,随后通过振荡混合,将PCR管或96孔板放入恒温金属浴中,按照如下程序完成逆转录:42℃,30min;70℃,10min;4℃,保存。随后将PCR管或96孔板进行振荡,吸取微球悬液至一支PCR管,磁吸附后去除部分上清液,保留20μL。按照配制预扩增PCR Mix-FF:HiFi HotStart ReadyMix,2X,25μL;20μM 1S-Primer(PCR),2.5μL;20μM 2S-Primer(PCR),2.5μL,随后将PCR管或96孔板放入PCR热循环仪中按照:98℃,5min;(98℃,15s;60℃,30s;72℃,2min)20循环;72℃,5min;4℃,∞进行预扩增-FF,并利用DNA纯化磁珠进行cDNA文库的纯化浓缩。
配制PCR扩增建库Mix-FF:HiFi HotStart ReadyMix,2X,25μL;20μM P7 indexed,2.5μL;20μM P5 universal,2.5μL,加入到上述PCR管中,并将PCR管放入PCR热循环仪中按照:98℃,5min;(98℃,15s;60℃,30s;72℃,30s)15循环;72℃2min;4℃,∞进行PCR扩增构建测序文库。并利用DNA纯化磁珠进行cDNA文库的纯化浓缩,最后进行Qubit检测cDNA浓度并进行Aligent电泳,若确认无误进行送测。
图1为SCDB微球制备原理图:(A)基于均分组合的编码微球合成原理示意图,显示通过两轮均分实现96种编码微球的合成;(B)20μm羧基磁性微球的明场图像;(C)基于均分组合的编码微球合成方案及流程示意图;(D)引物1-N、引物2-M引物设计。
图2为互补荧光探针质控原理图及结果:(A)使用荧光引物表征编码微球示意图;(B-D)荧光引物1表征结果、荧光引物2表征结果及其荧光信噪比。
图3为SCDB-seq测序文库构建示意图:(A)SCDB-seq实验流程示意图;(B)SCDB-seq文库制备流程示意图。
Claims (8)
1.一种基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)SCDB微球的设计与制备;
(2)SCDB-seq的设计与使用;
(3)基于SCDB-seq的空间转录组测序的设计与实现。
2.根据权利要求1所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,其特征在于:所述步骤(1)的设计方法如下:使用两段具有特定序列设计的引物:引物1-N(1≤N≤8)、引物2-M(1≤M≤12)采用均分组合制备方法在微球表面进行DNA条码引物制备,将一定量的编码微球均分为8份分别放入离心管并命名为1-N(1≤N≤8),向离心管中加入对应引物1-N进行第一轮编码,随后将8支离心管中的微球按照特定顺序,即离心管1-1~1-8对应96孔PCR板上的A~H排,均分至一块96孔PCR板中加入对应引物2-M进行第二轮编码,最终生成96种具有独特DNA条码组合的编码微球。
3.根据权利要求2所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,其特征在于:使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)将微球表面的羧基基团转换成可与氨基反应的O-酰基异脲中间体,该中间体能够迅速与5’端修饰有氨基基团的引物1-N形成酰胺键,将引物1-N共价固定在微球表面,引物2-M的3’末端可与引物1-N的3’末端产生反向互补,随后在等温扩增DNA聚合酶的作用下将引物2-M中的序列反向互补延伸到引物1-N的3’末端,从而完成微球表面编码引物的制备。
4.根据权利要求2所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,其特征在于:所述引物1-N序列设计,即5’→3’,为:1)PCR引物,用于通过PCR扩增cDNA文库;2)DNA条形1-N,起到DNA编码作用的特异条码序列,共8种;3)连接序列,用于与引物2-M3’末端反向互补;所述引物2-M序列设计,即5’→3’,为:1)poly-dA,用于生成具有mRNA捕获功能poly-dT;2)UMI*,起到特异性分子识别作用的序列;3)DNA条形2-M*,起到DNA编码作用的特异编码序列,共12种;4)反向互补连接序列,用于与引物1-N3’末端反向互补。
5.根据权利要求2所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,其特征在于:所述微球为单分散磁性微球,微球内核为SiO2或聚苯乙烯,内核外覆盖有一层Fe3O4表面包裹有修饰为羧基的化学修饰层。
6.根据权利要求5所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,其特征在于:所述微球的粒径大小为0.1μm至100μm。
7.根据权利要求1所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,其特征在于:所述步骤(2)中SCDB-seq的设计方法,包括如下步骤:
(1)使用SCDB微球对样本中的mRNA进行捕获;
(2)对捕获到的mRNA分子进行逆转录;
(3)通过PCR扩增构建满足第二代测序的cDNA文库;
(4)使用纯化磁珠富集目标cDNA片段。
8.根据权利要求1所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法,其特征在于:所述步骤(3)中基于SCDB-seq的空间转录组测序的设计,包括如下步骤:
(1)应用于新鲜冰冻组织切片的实验方案在mRNA捕获环节增加了0.5%浓度的TritonX-100以透化细胞膜,使mRNA得以从细胞中充分释放且被SCDB微球捕获;
(2)应用于FFPE组织切片的实验方案除增加0.5%浓度的Triton X-100外,由于FFPE组织切片内的mRNA已存在一定程度的降解,故取消了用于使mRNA发生片段化的Mg2+热处理环节,且在mRNA释放及捕获环节添加0.125μg/μL浓度的蛋白酶K并在60℃下进行1h的孵育,充分去除FFPE组织中存在的分子间交联,释放出mRNA分子;
(3)在cDNA测序文库构建过程中,使用96种SCDB微球与12种P7 indexed引物相结合,使SCDB-seq单次实验检测通量达到1,152。
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