CN115058389A - 一种绿原酸-钙纳米缓释剂及在促进干细胞成骨分化中的应用 - Google Patents

一种绿原酸-钙纳米缓释剂及在促进干细胞成骨分化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绿原酸‑钙纳米缓释剂及在促进干细胞成骨分化中的应用。该缓释剂的粒径为200‑300nm；在弱酸性环境中，可释放绿原酸分子和钙离子。将钙盐溶于双蒸水中得到钙盐溶液；将绿原酸溶于乙醇中得到绿原酸溶液；将绿原酸溶液滴加到钙盐溶液中得到混合液，调整混合液的pH值至9.0，加热并搅拌至产物不再析出，收集析出产物后依次进行洗涤、真空冷冻干燥，得到绿原酸‑钙纳米缓释剂。本发明的绿原酸‑钙纳米缓释剂可经胞吞进入细胞溶酶体后释放绿原酸和钙离子，可实现间充质干细胞定向分化，为干细胞定向分化提供了一种创新性的思路和方法，对开发基于干细胞疗法的骨缺损疾病的治疗具有重要临床应用价值和社会意义。

Description

一种绿原酸-钙纳米缓释剂及在促进干细胞成骨分化中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种绿原酸-钙纳米缓释剂及在促进干细胞成骨分化中的应用。
背景技术
随着当今社会交通业和工业的发展，骨折等骨损伤正在呈现逐年增高的趋势。高能量损伤导致的骨折常常伴有骨质的缺损和严重的软组织损伤，并伴有骨折延迟愈合和骨不连的发生，从而严重影响患者的生活质量。对于骨损伤的临床治疗，目前常用的方法有保守治疗和手术治疗。保守治疗的方法包括物理治疗、分子生物治疗和中医中药治疗等。手术治疗的方法包括髓内钉手术、钢板内固定术和自体或异体骨移植手术等。保守治疗和手术治疗均存在骨不连无法治愈的情况，这给患者及其家庭带来了极大的痛苦和负担。因此，寻找一种更加安全有效的治疗方法成为了创伤骨科研究领域的一项重点问题。
近年来，干细胞疗法为骨缺损的修复提供了新的希望。骨折后的修复过程存在两种骨化形式：软骨内成骨和膜内成骨。软骨内成骨是由间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)聚集并分化成软骨细胞及软骨组织，然后由骨组织取代软骨组织完成骨化；膜内成骨则是由骨膜内间充质干细胞直接分化为成骨细胞，形成骨组织。因此，骨修复过程中需要骨折局部聚集数量足够的间充质干细胞。然而，骨缺损周围往往缺乏足够的活的间充质干细胞。所以，向骨缺损部位引入足够的间充质干细胞，是促进骨修复的重要的条件。间充质干细胞是一类来源于中胚层的，具有多项分化潜能的多能干细胞，其中骨髓间充质干细胞在成骨分化及骨愈合方面具有巨大潜力。但是直接利用骨髓间充质干细胞移植来治疗骨缺损具有一定的风险，比如分化方向不确定性及致瘤性等问题，且治疗周期过长。因此，探索实现间充质干细胞快速、精准分化的有效方法是我们需要迫切解决的科学问题。
小分子化合物因其便捷性、可控性、功能多样性等特点在干预干细胞增殖分化等生物学行为中具有巨大优势。其中具有抗氧化、抗炎作用的生物来源小分子化合物在调控干细胞成骨分化方面已有广泛研究。例如绿原酸(Chlorogenic acid，CA)已证实可以促进多种干细胞包括胚胎干细胞、间充质干细胞等向成骨细胞分化。然而，生物来源小分子化合物均存在稳定性差、靶向性低、半衰期短、作用机制不明确等问题，使得小分子化合物在干预干细胞分化过程中生物利用度较低。研究表明，利用纳米粒子作为药物递送载体可以改善药物生物利用度低的问题。将小分子化合物修饰到纳米粒子表面、包裹在纳米凝胶/粒子内部、封装在有机/无机纳米粒子中，可实现小分子的稳定、持续、靶向递送。如何在考虑生物来源小分子化合物固有特性前提下，实现小分子化合物的纳米化构建，需要结合其物化性质寻找可行有效的物理或化学结合途径。可知绿原酸小分子化合物具有羧酸结构，其可与多种无机金属离子(Fe3+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等)发生络合反应得到羧酸盐固体产物，且羧酸盐在弱酸性条件下可再次缓慢降解释放出游离的药物小分子和金属离子。值得注意的是，Ca2+作为骨的重要组成成分，对骨再生具有重要的促进作用。
综上所述，生物来源绿原酸小分子化合物与无机金属离子Ca2+的结合，或可通过分化方向与分化速度的双效干预，实现间充质干细胞的快速、精准调控。目前，有机酸钙盐对干细胞成骨分化的研究未见报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种绿原酸-钙纳米缓释剂及在促进干细胞成骨分化中的应用。本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂经胞吞进入细胞溶酶体，在弱酸性环境下可释放绿原酸和钙离子，有望调控间充质干细胞的定向分化，为干细胞定向分化提供了一种创新性的思路和方法，对开发基于干细胞疗法的骨缺损疾病的治疗具有重要临床应用价值和社会意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种绿原酸-钙纳米缓释剂，所述绿原酸-钙纳米缓释剂材料的粒径为200-300nm；在弱酸性环境中，绿原酸-钙纳米缓释剂可释放绿原酸分子和钙离子。
优选的，所述弱酸性环境的pH为5.5。
本发明的第二方面，提供绿原酸-钙纳米缓释剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将钙盐溶于双蒸水中得到钙盐溶液；将绿原酸溶于乙醇中得到绿原酸溶液；
(2)将绿原酸溶液滴加到钙盐溶液中得到混合液，调整混合液的pH值至9.0，加热并搅拌至产物不再析出，收集析出产物后依次进行洗涤、真空冷冻干燥，得到绿原酸-钙纳米缓释剂。
优选的，步骤(1)中，所述钙盐为醋酸钙；所述钙盐溶液的浓度为17.6g/L；所述乙醇的体积浓度为90％，所述绿原酸溶液的浓度为11.8～23.6g/L。
优选的，步骤(2)中，所述混合液中绿原酸和钙盐的摩尔比为(2～1):1。
优选的，步骤(2)中，采用浓度为0.1M的HCl调节pH值至9.0；所述加热为水浴加热，加热的温度为40℃；所述搅拌的速度为600rpm。
优选的，步骤(2)中，通过离心收集析出产物，离心的转速为10000rpm、时间为10min；所述洗涤为依次用无水乙醇和双蒸水洗涤2～5次。
本发明的第三方面，提供绿原酸-钙纳米缓释剂在促进干细胞的定向分化或制备促进干细胞定向分化的培养基中的应用。
优选的，所述促进干细胞的定向分化为促进间充质干细胞定向成骨细胞分化。
本发明的第四方面，提供一种促进干细胞定向分化的培养体系，所述培养体系以绿原酸-钙纳米缓释剂材料为有效成分，对干细胞进行诱导分化处理。
本发明的第四方面，提供一种促进干细胞定向分化的方法，包括以下步骤：将干细胞接种于促进干细胞定向分化的培养体系中，对干细胞进行诱导分化。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次利用绿原酸小分子与钙离子的络合反应，构建具有pH响应的缓释功能纳米粒子，制备的绿原酸-钙纳米材料形态可控，在弱酸性条件下可释放绿原酸小分子和钙离子。合成过程方法简单、成本低廉、绿色无害，可实现绿原酸-钙纳米缓释剂的重复、稳定、批量生产。
(2)本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂具有良好的细胞相容性，经胞吞进入细胞能够促进干细胞的定向分化，采用本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂作用骨髓间充质干细胞，绿原酸和Ca2+之间协同作用，有利于骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向的分化。为干细胞定向分化提供了一种创新性的思路和方法，对开发基于干细胞疗法的骨缺损疾病的治疗具有重要临床应用价值和社会意义。
附图说明
图1：本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂的SEM形貌。
图2：本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂的FTIR光谱图。
图3：本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂的pH模拟释放曲线，A为当体系pH值由7.0降为5.5时，绿原酸分子释放率；B为当体系pH值由7.0降为5.5时，钙离子释放率。
图4：本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂在不同质量浓度下对骨髓间充质干细胞的生物相容性。A为CCK8测定的细胞活率；B为细胞死活染色成像。
图5：本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂与绿原酸、Ca2+、绿原酸+Ca2+组对骨髓间充质干细胞活性的比较。
图6：本发明的绿原酸-钙纳米缓释剂促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化(成骨细胞相关蛋白OCN的定量分析)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，干细胞存在自发分化缓慢，且分化方向不可控等问题，现有分化方法和技术很难实现干细胞的快速、精准分化，这限制了其骨修复应用的安全性和有效性。小分子化合物作为调控干细胞分化的一种有效方法，其应用往往是被溶解或添加到培养基中进行细胞处理，加之小分子化合物存在稳定性差、靶向性低、半衰期短、作用机制不明确等问题，这使得小分子化合物在干预干细胞分化过程中生物利用度较低。
基于此，本发明的目的是提供一种新型的能够促进干细胞定向分化的培养方法。本发明在基于绿原酸固有物化特性的前提下，首次将绿原酸小分子与无机金属粒子Ca2+相结合，制备具有pH响应性的绿原酸-钙纳米缓释剂。目前，利用有机酸钙盐调控干细胞成骨分化的研究未见报道。绿原酸-钙纳米粒子经胞吞进入细胞后，在溶酶体弱酸性微环境作用下可发生缓慢降解进而释放绿原酸小分子和Ca2+。最终，细胞内有效组分的释放可在时间和空间维度上对干细胞的分化进行调控。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
说明：绿原酸购自Sigma-Aldrich LLC。
实施例1
(1)将0.176g醋酸钙溶于10ml ddH2O，搅拌使其充分溶解，记为溶液A，测定溶液pH值。将0.708g绿原酸溶于30ml乙醇(90％v)，搅拌使其充分溶解，记为溶液B，测定溶液pH值。
(2)将溶液B以2mL/min的滴加速度加入溶液A中(边滴加边搅拌)，混合液中绿原酸和醋酸钙的摩尔比为2:1，用0.1M HCl调整混合溶液的pH值为9.0。
(3)将混合液置于40℃水浴中，600rpm搅拌进行络合反应，观察产物析出情况，4h后反应结束。离心收集产物，用无水乙醇清洗三次，再用双蒸水洗涤三次，经真空冷冻干燥24h后(冷阱温度为-40℃，真空度为8Pa)，获得绿原酸-钙纳米缓释剂材料。
实施例2
(1)将0.176g醋酸钙溶于10ml ddH2O，搅拌使其充分溶解，记为溶液A，测定溶液pH值。将0.354g绿原酸溶于30ml乙醇(90％v)，搅拌使其充分溶解，记为溶液B，测定溶液pH值。
(2)将溶液B以2mL/min的滴加速度加入溶液A中(边滴加边搅拌)，混合液中绿原酸和醋酸钙的摩尔比为1:1，用0.1M HCl调整混合溶液的pH值为9.0。
(3)将混合液置于40℃水浴中，600rpm搅拌进行络合反应，观察产物析出情况，4h后反应结束。离心收集产物，用无水乙醇清洗三次，再用双蒸水洗涤三次，经真空冷冻干燥24h后(冷阱温度为-40℃，真空度为8Pa)，获得绿原酸-钙纳米缓释剂材料。
对比例1
与实施例1的区别在于：步骤(2)中，将A溶液滴加到B溶液中。
对比例2
与实施例1的区别在于：步骤(2)中，调整混合溶液的pH值为7.0。
对比例3
与实施例1的区别在于：步骤(3)中，将混合液置于室温下。
以上实施例为两种不同摩尔比(绿原酸和醋酸钙的摩尔比为2:1，1:1)条件下，制备绿原酸-钙纳米缓释剂材料。对比例1与实施例1的区别在于将溶液A缓慢滴加入溶液B中，对比例2与实施例1的区别在于调整混合溶液的pH值为7.0，对比例3与实施例1的区别在于反应混合液置于室温。对比例1，对比例2，对比例3均未有固体产物析出；实施例1和实施例2均有固体产物析出。
对实施例1的样品进行分析表征(形貌、化学结构和pH响应性)。如图1，SEM成像显示绿原酸-钙纳米粒子的尺寸为200-300nm，呈现棒状形貌。如图2，FTIR光谱显示绿原酸-钙纳米粒子出现了绿原酸化学官能团的特征吸收峰，并且羧基官能团中-OH的伸缩振动峰减弱和消失，这暗示Ca2+与羟基发生了结合。图3结果表明，当体系pH值由7.0降为5.5时，绿原酸-钙纳米粒子可以在弱酸性条件下缓慢释放绿原酸分子和钙离子。
试验例
1、提取大鼠来源骨髓间充质干细胞，具体步骤如下：
a、取4周龄Wistar大鼠，经乙醚麻醉后引颈处死，浸泡在75％的医用酒精中进行消毒处理。用无菌剪和无菌镊解剖暴露大鼠的股骨和胫骨，将后肢剪下浸泡在75％的医用酒精中消毒处理10min，随后转移至无菌PBS缓冲液中。
b、用剪刀将大腿周围的肌肉剔除干净，去掉大腿股骨和胫骨末端的骨骺。用医用无菌注射器，将股骨和胫骨中的骨髓冲入含有细胞培养基的离心管中，吹打分散均匀后接种于T型瓶中进行培养获得骨髓间充质干细胞。
2、将骨髓间充质干细胞分别接种于含有1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL实施例1所制备材料的增殖培养基中(增殖培养基主要成分包括：低糖DMEM培养基、20ng/mL bFGF、10％FBS、1％双抗)，并以增殖培养基作为空白对照组。分别培养1、3、5天后，检测细胞活率，并对细胞进行死活染色成像。如图4A所示，CCK8检测结果发现，不同浓度材料处理组的细胞活性与空白对照组无显著性差异。细胞死活染色结果显示(图4B)，细胞贴壁状态良好，且无明显死细胞，说明材料具有很好的生物相容性。
3、将骨髓间充质干细胞分别接种于含有80μg/mL实施例1所制备材料(实施例1组)、对比1组(等量绿原酸，CA)、对比2组(等量Ca2+)、对比3组(等量CA+Ca2+，其中绿原酸和Ca2+的摩尔比为2:1)的增殖培养基中，并以增殖培养基作为空白对照组。在培养第3天，检测细胞活性。如图5所示，CCK8结果表明，绿原酸-钙纳米材料组与空白对照组无显著性差异，而绿原酸组、Ca2+组、绿原酸+Ca2+组的细胞活性显著低于空白对照组。该结果说明在等质量浓度条件下，绿原酸-钙纳米材料因缓释能力对细胞活性并未造成影响，而绿原酸组、Ca2+组、绿原酸+Ca2+组不具备胞内缓释能力，瞬时高质量浓度组份的暴露造成细胞死亡，显著降低了细胞的活性。
4、分别用含有20μg/mL实施例1所制备材料(实施例1组)、对比1组(等量绿原酸，CA)、对比2组(等量Ca2+)、对比3组(等量CA+Ca2+，其中绿原酸和Ca2+的摩尔比为2:1)的分化培养基处理骨髓间充质干细胞(分化培养基主要成分包括：低糖DMEM培养基、10％FBS、50μmol/L维生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、100nmol/L地塞米松、1％双抗)，并以分化培养基作为空白对照组。分别在诱导分化的第7天和第14天，对成骨细胞相关蛋白OCN进行了定量分析(表1)。如图6所示，绿原酸-钙纳米粒子组的OCN含量，在分化第7天和第14天均显著高于绿原酸+Ca2+组，表明所制备的绿原酸-钙缓释纳米粒子加速促进了骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化。
表1：各组处理对骨髓间充质干细胞成骨分化作用的比较
Figure BDA0003725405050000061
由表1可知，实施例1所制备材料促进成骨细胞相关蛋白OCN的提高，即促进间充质干细胞成骨分化效果显著高于对比1～3组，并且实施例1在分化7d和14d后，促进间充质干细胞成骨分化的效果远高于对比1组+对比2组之和。说明绿原酸-钙纳米缓释剂具有良好的细胞相容性和缓释性，绿原酸和钙离子之间还具有协同促进间充质干细胞成骨分化的作用。
综上所述，本发明制备的绿原酸-钙纳米缓释剂材料对骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性，绿原酸和钙离子之间协同促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种绿原酸-钙纳米缓释剂，其特征在于，所述绿原酸-钙纳米缓释剂材料的粒径为200-300nm；在弱酸性环境中，绿原酸-钙纳米缓释剂可释放绿原酸分子和钙离子。
2.根据权利要求1所述的绿原酸-钙纳米缓释剂材料，其特征在于，所述弱酸性环境的pH为5.5。
3.权利要求1或2所述的绿原酸-钙纳米缓释剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将钙盐溶于双蒸水中得到钙盐溶液；将绿原酸溶于乙醇中得到绿原酸溶液；
(2)将绿原酸溶液滴加到钙盐溶液中得到混合液，调整混合液的pH值至9.0，加热并搅拌至产物不再析出，收集析出产物后依次进行洗涤、真空冷冻干燥，得到绿原酸-钙纳米缓释剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述钙盐为醋酸钙；所述钙盐溶液的浓度为17.6g/L；所述乙醇的体积浓度为90％，所述绿原酸溶液的浓度为11.8～23.6g/L。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合液中绿原酸和钙盐的摩尔比为(2～1):1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用浓度为0.1M的HCl调节pH值至9.0；所述加热为水浴加热，加热的温度为40℃；所述搅拌的速度为600rpm。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，通过离心收集析出产物，离心的转速为10000rpm、时间为10min；所述洗涤为依次用无水乙醇和双蒸水洗涤2～5次。
8.权利要求1或2所述的绿原酸-钙纳米缓释剂在促进干细胞的定向分化或制备促进干细胞定向分化的培养基中的应用。
9.一种促进干细胞定向分化的培养体系，其特征在于，所述培养体系以权利要求1或2所述的绿原酸-钙纳米缓释剂为有效成分。
10.一种促进干细胞定向分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：将干细胞接种于权利要求9所述的促进干细胞定向分化的培养体系中，对干细胞进行诱导分化。
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