CN115058361A

CN115058361A - 一种拜氏梭菌及其生产丁醇的方法

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Publication number: CN115058361A
Application number: CN202210684914.9A
Authority: CN
Inventors: 刘亚君; 陈朝阳; 崔球
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2042-06-14
Also published as: CN115058361B

Abstract

本发明提供了一种可高产丁醇的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）MT1106，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏编号为CCTCC NO：M 2022665，保藏日期2022年5月19日。所述菌株MT1106具有抗逆性高的特点，在pH=5.5‑7.5的较宽pH条件和25‑37℃的温度条件下均能获得较高的生物量和丁醇产量。此外，通过在发酵体系中添加铁离子，可以进一步大幅提升丁醇产量，使得丁醇产量超过23 g/L，丁醇与丙酮的总产量超过25 g/L。本申请还提供了与纤维素降解高温菌热纤梭菌以木质纤维素为底物联合发酵生产丁醇的方法。由于拜氏梭菌MT1106的最适pH与热纤梭菌发酵获得的糖液一致，因此无需额外调节pH、且不需添加成本较高的营养成分，即可直接用于MT1106的发酵，从而极大降低了生产成本，具有重要的实际应用价值。

Description

一种拜氏梭菌及其生产丁醇的方法

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一株可以用于生产丁醇的拜式梭菌Clostridium beijerinckii MT1106，以及采用所述菌株偶联热纤梭菌，以木质纤维素为底物生产丁醇的方法。

背景技术

生物丁醇是一种可持续的新型生物燃料，与生物乙醇相比，其能量值更高，吸湿性和腐蚀性更小，且与现有的油气管道和汽车发动机更兼容，因此被看作是替代化石燃料的最佳选择之一。生物丁醇通常是通过丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵途径，由产溶剂梭状芽孢杆菌产生。丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetobutylicum)是工业上最常用的产生物丁醇的微生物，它可以将单糖或寡糖转化为丙酮、丁醇和乙醇等生物产品，并伴随着少量乙酸和丁酸的产生；其中，发酵产物中丙酮-丁醇-乙醇(ABE)的比例一般接近3:6:1。除了丙酮丁酸梭菌，能够用于或潜在的可用于工业发酵生产生物丁醇的梭状芽胞杆菌主要有：乙酰丁酸梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、嗜糖双丁酸梭菌(Clostridium sacharoperbutylacetonicum)和嗜糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)等。

目前，发酵生产生物丁醇的技术面临着原料成本高、丁醇产率低以及过多的副产物产生等问题。这主要是由于丁醇对菌体具有毒害作用，从而影响了产量和产率。目前，野生型梭菌的丁醇产量通常不超过14g/L，基因工程菌则不超过21g/L。此外，除发酵产物的终浓度低外，丁醇在总产物中的比例也较低，一般只占了60％，其余30％为丙酮，10％为乙醇。在这二者的叠加影响下，丁醇回收、分离、蒸馏消耗的设备和能源成本高，从而增加了发酵生产丁醇的成本。此外，传统的丁醇发酵普遍采用淀粉来源的葡萄糖为碳源进行生产，存在成本受粮食价格波动以及与人争粮、与粮争地的问题。随着粮食价格的上涨及世界粮食资源的匮乏，丁醇的发展必将处于劣势。众所周知，世界上储量最大的潜在碳源是木质纤维素生物质，因此，如果能够实现木质纤维素到丁醇的生产，则从根本上解决了丁醇生产中碳源成本高的问题。

目前，研究人员已经开发了木质纤维素原料到糖的转化方法，以实现非粮原料对淀粉糖的替代，但主要利用真菌来源的商业化纤维素酶、半纤维素酶将预处理的农业秸秆等木质纤维素原料进行水解，获得含糖水解液，再以水解液作为糖源进行下游发酵培养。例如，发明专利201610193266.1、201210197741.4、201710808876.2、201210089406.2等均先采用真菌来源的商业化酶制剂将木质纤维素底物水解成糖后再发酵产丁醇。然而，采用真菌来源的酶制剂成本高昂，使得木质纤维素来源的可发酵糖不具有与淀粉糖相比的市场竞争力，进而导致木质纤维素生产丁醇的发酵技术难以真正实现应用。发明人前期提出了不依赖于游离酶的木质纤维素生物糖化技术，主要利用热纤梭菌等高温纤维素降解菌为全菌催化剂，并利用该技术与下游发酵技术配合实现木质纤维素到葡萄糖酸钠、油脂类、色素类、生物燃料等产品的转化。然而，用于木质纤维素产丁醇的菌株以及相关应用技术仍然十分缺乏。

因此，具备丁醇耐受性、产量高等特点的丁醇发酵生产菌株对于工业生产十分重要，目前还未见相关报道。

发明内容

针对现有技术中以木质纤维素为原料生产丁醇所存在的问题，本发明提供了一种可高产丁醇的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)MT1106，所述菌株MT1106具有抗逆性高的特点，在pH＝5.5-7.5的较宽pH条件和25-37℃的温度条件下均能获得较高的生物量和丁醇产量。本申请还提供了与纤维素降解高温菌热纤梭菌以木质纤维素为底物联合发酵生产丁醇的方法，具有重要的实际应用价值。

本发明的技术方案：

发明人从河道淤泥中筛选得到了一株可高产丁醇的拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)MT1106，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC M2022665，保藏日期2022年5月19日。所述拜氏梭菌MT1106是厌氧中温菌株，在pH5.5-7.5较宽的pH条件和25-37℃的温度条件下均能正常生长，并且能获得较高的丁醇产量。此外，所述拜氏梭菌MT1106能够同时利用五碳糖、六碳糖或寡糖，厌氧发酵产生物丁醇，且在铁离子的促进下可以大幅提升丁醇的产量至超过23g/L。

一种所述的拜氏梭菌株MT1106的菌剂。

如前所述的拜氏梭菌株的应用，将其用于发酵生产丁醇。具体为：将所述的拜氏梭菌株接入发酵培养基进行发酵生长，发酵完成后，从发酵液中分离得到丁醇。所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖或纤维二糖中的一种或多种的组合；所述发酵培养基中有含铁化合物。所述拜氏梭菌MT1106的接种量为体积比1-10％；所述的发酵生长的温度为25-37℃；所述发酵生长的初始pH为5.5-7.5。其中，所述发酵培养基的组份为：碳源30-100g/L，含铁化合物0.1-4.0g/L，碳酸氢钠2.5g/L，酵母提取物10g/L，硫化钠0.05g/L，氯化钠1g/L，六水合氯化镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，氯化铵0.3g/L，氯化钾0.3g/L，二水合氯化钙0.015g/L，六水合氯化钴0.2mg/L，四水合氯化锰0.1mg/L，氯化锌0.07mg/L，硼酸0.006mg/L，二水合钼酸钠0.03mg/L，六水合氯化镍0.02mg/L，二水合氯化铜0.002mg/L。采用所述的拜氏梭菌MT1106发酵生产丁醇，不但产量高，而且副产物少，几乎没有乙醇的合成，丁醇在产出溶剂中的比例可超过90％。此外，通过在发酵体系中添加铁离子，可以进一步大幅提升丁醇产量，使得丁醇产量超过23g/L，丁醇与丙酮的总产量超过25g/L。

优选的是，所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖；所述含铁化合物为硫酸铁或者硫酸亚铁。

更优选的是，所述的葡萄糖为木质纤维素糖化后获得的含有葡萄糖的糖液。

如前所述的拜氏梭菌株的应用，具体为将所述拜氏梭菌MT1106与热纤梭菌串联生产丁醇。这是由于，所述菌株MT1106发酵生产丁醇的最适pH条件与热纤梭菌发酵液的pH条件相匹配。因此，热纤梭菌发酵获得的糖液无需额外调节pH、且不需添加成本较高的营养成分，即可直接用于MT1106的发酵，从而极大降低了生产成本。具体包括以下步骤：

(1)木质纤维素糖化：向发酵罐中添加糖化培养基和预处理后的木质纤维素底物，混合均匀；接种热纤梭菌菌株进行糖化，得到木质纤维素发酵液。其中，所述的木质纤维素底物为秸秆或木糖渣，所述糖化温度为55-65℃；所述的糖化培养基的组份为：磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸铵1.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆5.0g/L，pH 7.5；所述热纤梭菌的接种比例为5-10％。

(2)发酵生产丁醇：，在pH＝5.5-7.5的条件下，向步骤(1)得到的木质纤维素发酵液中，按照体积比1-10％接种拜氏梭菌MT1106，加入含铁化合物0.1-4.0g/L和微量金属盐；发酵1-6天或当木质纤维素发酵液中葡萄糖浓度为零时，结束发酵，得到丁醇。所述的木质纤维素发酵液作为发酵培养基，其中的葡萄糖作为初始碳源。其中，发酵生产丁醇的温度为30-35℃，所述含铁化合物为硫酸铁或硫酸亚铁，所述微量金属盐具体为：每升含六水合氯化钴0.2mg，四水合氯化锰0.1mg，氯化锌0.07mg，硼酸0.006mg，二水合钼酸钠0.03mg，六水合氯化镍0.02mg，二水合氯化铜0.002mg。

本发明的有益效果：

1)本发明提供了一株拜氏梭菌MT1106，所述菌株能够在pH 5.5-7.5较宽的pH条件下均能正常生长，不但能够获得较高的丁醇产量，而且副产物少，几乎没有乙醇的合成，丁醇在产出溶剂中的比例可超过90％。

2)通过向所述拜氏梭菌MT1106的发酵体系中添加铁离子，可以进一步大幅提升丁醇产量，丁醇产量超过23g/L，丁醇与丙酮的总产量超过25g/L。

3)所述拜氏梭菌MT1106的最适pH为6.0-6.5，与以热纤梭菌为生物催化剂进行木质纤维素糖化所获得的糖液pH条件一致。因此，将所述拜氏梭菌MT1106与热纤梭菌串联生产丁醇，实现了采用木质纤维素生产丁醇的目标，在保证丁醇产量的前提下，极大降低了生产成本，具有重要的产业化应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1.菌株MT1106的分离筛选

1)初筛：

从海南省海口市河口淤泥中取泥样，在超净工作台中，取2克土壤加入48mL无菌水中充分振荡混匀，然后取5mL悬液加入20mL初筛培养基(每升磷酸氢二钾2.9g，磷酸二氢钾1.5g，尿素2.1g，氯化钙150mg，氯化镁1.0g，硫酸亚铁1.25mg，半胱氨酸1g，刃天青1.0mg，盐酸吡哆胺2g，生物素0.2g，对氨基苯甲酸0.4g，维生素B12 0.2g，纤维素5g，pH 6.0)中充分振荡混匀，获得土壤悬液。用初筛培养基将土壤悬液梯度稀释10²-10⁵倍，均匀涂布于0.8％质量体积比琼脂的筛选培养基平板上。将平板正置于厌氧盒中，放于30℃恒温培养箱厌氧条件培养7天。

2)复筛：

挑取较大的菌落在96孔深孔板2mL复筛培养基(每升碳酸氢钠2.52g，酵母提取物10g，2-(N-吗啉基)乙磺酸2.132g，硫化钠0.0484g，L-半胱氨酸0.0242g，二硫苏糖醇0.077g，刃天青1mg，氯化钠1g，六水合氯化镁0.5g，磷酸二氢钾0.2g，氯化铵0.3g，氯化钾0.3g，二水合氯化钙0.015g，四水合氯化亚铁0.0015g，六水合氯化钴0.00019g，四水合氯化锰0.0001g，氯化锌0.00007g，硼酸0.000006g，二水合钼酸钠0.000036g，六水合氯化镍0.000024g，二水合氯化铜0.000002g，葡萄糖5g，纤维素5g，pH 6.0)中扩大培养，30℃下200rpm水平振荡培养24小时。

分析每个培养物的OD600作为生物量标准，同时利用气相色谱分析是否有丁醇产生以及产生量，用丁醇产量除于相应OD600，选择OD600大于1.5且计算得到比值最大的10个培养物，取0.05mL再接种到5mL复筛培养基中连续传代培养20次。

实施例2.菌株的鉴定

对不同培养物的菌体形貌，OD600以及丁醇产量进行分析，选择OD600较大、丁醇产量最高的菌株，进行以27F/1492R为引物对的16S rRNA基因扩增。其中一株菌的16S rRNA基因序列，通过NCBI的Blast序列比对分析，属于拜氏梭菌，菌株名称为MT1106。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC M 2022665，保藏日期2022年5月19日。

实施例3.菌株MT1106的丁醇批次发酵

对菌株MT1106的最适生长条件进行了分析，确定该菌能够以葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖和纤维二糖为碳源生长，在pH＝5.5-7.5和25-37℃的较宽条件下均能正常生长。

接种量为1％(体积比)，初始pH＝7.0，温度为30℃，初始碳源为葡萄糖60g/L，在发酵培养基(碳酸氢钠2.5g/L，酵母提取物10g/L，硫化钠0.05g/L，氯化钠1g/L，六水合氯化镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，氯化铵0.3g/L，氯化钾0.3g/L，，二水合氯化钙0.015g/L，六水合氯化钴0.2mg/L，四水合氯化锰0.1mg/L，氯化锌0.07mg/L，硼酸0.006mg/L，二水合钼酸钠0.03mg/L，六水合氯化镍0.02mg/L，二水合氯化铜0.002mg/L)中，添加硫酸亚铁0.1g/L，发酵48小时。检测得到葡萄糖没有剩余，丁醇产量为16.3g/L，丙酮产量为4.7g/L，未检测到乙醇，溶剂中丁醇占比为77.6％，丁醇和丙酮总产量超过20g/L。

实施例4.菌株MT1106的丁醇批次发酵

与实施例3不同的是，接种量为5％(体积比)，初始pH＝7.5，温度为25℃，初始碳源为80g/L葡萄糖，发酵培养基中添加2g/L的硫酸铁，发酵3天得到最大丁醇产量19.2g/L，丙酮2.6g/L，葡萄糖剩余3.9％；溶剂中丁醇占比为88.1％。

实施例5.菌株MT1106的丁醇批次发酵

与实施例3不同的是，接种量为10％(体积比)，初始pH＝5.5，温度为37℃，初始碳源为100g/L葡萄糖，发酵培养基中添加4g/L的硫酸铁，发酵6天得到最大丁醇产量21.3g/L，丙酮5.1g/L，葡萄糖剩余6.1％；溶剂中丁醇占比为80.7％。

实施例6.菌株MT1106的丁醇补料发酵

与实施例3不同的是，在1L发酵罐中开展连续葡萄糖补料实验，过程中将pH控制在6.0，初始葡萄糖浓度为30g/L，初始添加硫酸亚铁0.1g/L，随后使葡萄糖浓度控制在10g/L，并每12小时补充0.25g/L硫酸铁。发酵6天后，产生丁醇23.2克每升，丙酮产量从发酵1天开始保持在4g/L不变；溶剂中丁醇占比为85.3％。

实施例7菌株MT1106的丁醇补料发酵

与实施例6不同的是，发酵过程中不进行pH控制。发酵6天后，产生丁醇22.9克每升，丙酮产量从发酵2天开始保持在4.3g/L不变。溶剂中丁醇占比为84.2％。与实施例6相比，丁醇产量和溶剂产量差异不大，说明菌株MT1106具有发酵自动调节pH的特性，连续补料发酵体系不需要进行pH控制。

实施例8.热纤梭菌的木质纤维素全菌催化糖化

利用表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌菌株进行碱预处理木质纤维素底物的全菌糖化，具体操作为：在初始pH7.4条件下，将表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株预先在以5克每升微晶纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，然后按照10％(体积比)的接种量接种到80克每升干重的预处理秸秆或木糖渣(木糖渣为酸水解提取木糖后的玉米芯废弃物)作为碳源的GS-2培养基中，在60℃、170r/min的摇床中进行培养，直到水解液中的还原糖浓度不再变化。其中，以秸秆为底物(纤维素含量为59％)，水解液中葡萄糖为42.5克每升，糖得率为90％；以木糖渣为底物(纤维素含量为76％)，水解液中葡萄糖为54.1克每升，糖得率为89％。(详见参考文献。)

实施例9.热纤梭菌秸秆糖化偶联菌株MT1106发酵产丁醇

将实施例8获得的水解液进行浓缩，使还原糖浓度提高到80克每升。与实施例4所述不同的是，采用浓缩后的水解液作为发酵培养基，同时添加2g/L硫酸铁。发酵4天后，产生丁醇20.6克每升，丙酮产量为3.0g/L，丁醇在溶剂中的比例为87.3％。与实施例4相比，丁醇产量有提升且碳源无剩余，因此本申请所述的菌株MT1106采用木质纤维素来源的葡萄糖等可发酵糖为碳源生产丁醇是可行的。

实施例10.热纤梭菌秸秆糖化偶联菌株MT1106发酵产丁醇

将实施例8获得的水解液进行浓缩，使还原糖浓度提高到300克每升。在1L发酵体系中按照实施例7所述的连续补料发酵实验，接种量为10％(体积比)，初始pH＝6.5，温度为30℃，初始碳源浓度为30g/L还原糖，通过补加浓缩后的水解液使葡萄糖浓度控制在10g/L。发酵6天后，产生丁醇23.8克每升，丙酮产量为2.4g/L。与实施例7相比，丁醇产量提升且在溶剂中的比例提高到90.8％。由此可知，本申请所述的菌株MT1106采用木质纤维素来源的葡萄糖等可发酵糖为碳源，在相同条件下得到丁醇的产量与实施例7相比，获得了更高的产量和纯度。这说明，该菌株采用木质纤维素来源的葡萄糖为碳源发酵生产丁醇是可行的。

实施例11.热纤梭菌秸秆糖化偶联菌株MT1106发酵产丁醇

与实施例10不同的是，接种量为1％(体积比)，初始pH＝5.5，温度为37℃。发酵6天后，产生丁醇19.9克每升，丙酮产量为1.2g/L。与实施例7相比，丁醇产量略有下降但在溶剂中的比例提高到94.3％。由此可知，本申请所述的菌株MT1106采用木质纤维素来源的葡萄糖等可发酵糖为碳源，在相同条件下得到丁醇的产量与实施例7相比，获得了更高的纯度。这说明，该菌株采用木质纤维素来源的葡萄糖为碳源发酵生产丁醇是可行的。

综上可知，本发明所述的拜氏梭菌MT1106，所述菌株能够在pH 5.5-7.5较宽的pH条件和25-37℃的温度条件下均能正常生长，并且能获得较高的丁醇产量。此外，在铁离子的促进下可以大幅提升丁醇的产量至超过23g/L；且副产物少，几乎没有乙醇的合成，丁醇在产出溶剂中的比例可超过90％。通过将所述拜氏梭菌MT1106与热纤梭菌串联生产丁醇，实现了采用木质纤维素生产丁醇的目标，在保证丁醇产量的前提下，极大降低了生产成本，具有重要的产业化应用前景。

Claims

1.一株产丁醇的拜氏梭菌株，其特征在于：所述拜氏梭菌株命名为拜氏梭菌MT1106（Clostridium beijerinckii），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏编号为CCTCC NO：M 2022665，保藏日期2022年5月19日。

2.一种包含权利要求 1 所述的拜氏梭菌株MT1106的菌剂。

3.如权利要求1所述的拜氏梭菌株的应用，其特征在于：将所述的拜氏梭菌株用于发酵生产丁醇。

4.根据权利要求3所述的拜氏梭菌株的应用，其特征在于：将权利要求1所述的拜氏梭菌株接入发酵培养基进行发酵生长，发酵完成后，从发酵液中分离得到丁醇；所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖和纤维二糖中一种或者多种的组合；所述发酵培养基中有含铁化合物。

5.根据权利要求4所述的拜氏梭菌株的应用，其特征在于：所述拜氏梭菌MT1106的接种量为体积比1-10%；所述发酵培养基中的碳源浓度为30-100g/L，含铁化合物的含量为0.1-4.0 g/L；所述的发酵生长的温度为25-37℃；所述发酵生长的初始pH为5.5-7.5。

6.根据权利要求5所述的拜氏梭菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖；所述含铁化合物为硫酸铁或者硫酸亚铁。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的拜氏梭菌株的应用，其特征在于：所述的葡萄糖为木质纤维素糖化后获得的含有葡萄糖的糖液；所述发酵培养基的组份为：碳源30-100g/L，含铁化合物0.1-4.0 g/L，碳酸氢钠2.5 g/L，酵母提取物10 g/L，硫化钠0.05 g/L，氯化钠1 g/L，六水合氯化镁 0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，氯化铵0.3 g/L，氯化钾0.3 g/L，二水合氯化钙0.015 g/L，六水合氯化钴0.2 mg/L，四水合氯化锰0.1 mg/L，氯化锌0.07 mg/L，硼酸0.006 mg/L，二水合钼酸钠0.03 mg/L，六水合氯化镍0.02 mg/L，二水合氯化铜0.002 mg/L。

8.根据权利要求3所述的拜氏梭菌株的应用，其特征在于：将所述拜氏梭菌MT1106与热纤梭菌偶联生产丁醇，具体包括以下步骤：

（1）木质纤维素糖化：向发酵罐中添加糖化培养基和预处理后的木质纤维素底物，混合均匀；接种热纤梭菌菌株进行糖化，得到木质纤维素发酵液；

（2）发酵生产丁醇：在pH=5.5-7.5的条件下，向步骤（1）得到的木质纤维素发酵液中，按照体积比1-10%接种拜氏梭菌MT1106，加入含铁化合物0.1-4.0 g/L和微量金属盐；发酵1-6天或当木质纤维素发酵液中葡萄糖浓度为零时，结束发酵，得到丁醇。

9.根据权利要求8所述的拜氏梭菌株的应用，其特征在于：步骤（2）所述发酵生产丁醇的温度为30-35℃，所述含铁化合物为硫酸铁或硫酸亚铁，所述微量金属盐具体为：每升含六水合氯化钴0.2 mg，四水合氯化锰0.1 mg，氯化锌0.07 mg，硼酸0.006 mg，二水合钼酸钠0.03 mg，六水合氯化镍0.02 mg，二水合氯化铜0.002 mg。

10.根据权利要求8或9所述的拜氏梭菌株的应用，其特征在于：步骤（1）所述的木质纤维素底物为秸秆或木糖渣，所述糖化温度为55-65℃；所述的糖化培养基的组份为：磷酸氢二钾0.6 g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L、硫酸铵1.1 g/L、氯化钙0.1 g/L、氯化镁0.5 g/L、硫酸亚铁0.5 mg/L、硫化钠0.2 g/L、玉米浆5.0 g/L，pH 7.5；所述热纤梭菌的接种比例为5-10%。