CN115058022A - 一种从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，属于富里酸技术领域。其包括如下步骤：步骤1：样品的前处理；步骤2：胡敏酸的分离；步骤3：富里酸的沉淀分离；步骤4：沉淀样品中富里酸的提取。本发明的方法可以从任何给定的地表水和/或土壤中实现富里酸的分离和提取，得到的富里酸可用作相关地球化学实验的原始样品，分析这些富里酸样品的物理、光化学和微生物转化特征，并进而确定其降解产物，包括营养物质、CO2、溶解无机碳(DIC)和CH4等，进而描述待测地表水和/或土壤中的DOM特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，属于富里酸技术领域。
背景技术
富里酸(Fulvic Acid)根据其在不同溶剂中的溶解度可分为黄腐酸、黑色富里酸和棕色富里酸。富里酸是土壤腐殖质(Humic Substances)的主要成分之一，它是一种黄色物质，具有生物活性且分子量低的优点，所有生物被分解之后的最终产物都是富里酸。同时，富里酸具有低芳香度、多官能团和良好的水溶性等特点，易溶于多种有机溶剂。由于含有较高的含氧官能团，其具有参与吸收、络合和交换金属离子等土壤物质的功能，在医药、环保、农业和工业中得到广泛应用。
源自陆生植物材料的土壤腐殖质可以产生不同的腐殖质组分，这些组分是物理、光化学和微生物呼吸/降解等环境作用的结果，因此可以成为土壤质量(如肥力、土壤退化能力或毒性)的有用指标。此外，土壤腐殖质通过雨水/地下水排放浸入周围的水环境后，在物理、光化学和微生物作用下会发生很大的改变，这反过来又会影响水质。富里酸也由浮游初级生产者(如浮游植物、藻类)产生，在地表水中经历物理、光化学和微生物降解等过程，进而对水质产生重要影响。
由于结构复杂，富里酸自身不能直接用一些检测方法进行分析，而必须将其分离成分子量分布较窄的成分，然后用色谱法分析其结构。目前，常用的分类方法是根据其酸度、分子大小、电荷性质分类和根据吸附性质分类等而采取的，通常有凝胶过滤法、超滤杯、电泳法、色谱柱法等。上述方法通常实施成本较为昂贵，或者分类步骤复杂、耗时长，也因分离用的溶剂无法回收，造成二次污染等问题。
由于缺乏一定的方法标准，在过去的实验探索中，富里酸的提取和分离的方法差异很大，提取剂的种类、提取液加入量、提取次数的确定均存在不同，使得获取的数据的可比性较低。在现有技术中，土壤和水中的富里酸通常采用国际腐殖质协会(IHAS)开发的基于树脂的方法而分离和提取的，其具体步骤如图1所示。
这种方法确实可以适用于多种土壤和水中腐殖质的提取，但是，并不是标准方法，比如所需要的吸附树脂(XAD-8)较难获取。虽然也可以替换为透析的方法，但是透析方法的提取效果远低于此方法。此外，由于所得到的富里酸产物被有机树脂中的有机物污染，以及树脂本身在提取过程中对富里酸的消耗，用吸附树脂法得到的富里酸产物不是由单个成分组成的，也缺乏原生性。同时，应该指出的是，通过沉淀和吸附作用在DAX-8树脂上回收的有机碳的百分比约为45-63％，这表明通过此方法失去了大部分的富里酸[1],此外，使用DAX-8树脂吸附富里酸操作需要经过繁琐的预处理，即DAX-8树脂的装填、反洗、自然沉降、浸泡活化等，完成预处理后才能上样，仅浸泡活化这一步就需要使用10％氯化钠浸泡20h以及乙醇浸泡12h以上，需要花费大量的时间。
鉴于此，有必要开发一种新的分离和提取富里酸的方法，特别是在土壤和地表水中，以克服现有技术的不足之处。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，包括如下步骤：
步骤1：样品的前处理
采集土壤样品和/或地表水样品，将土壤样品依次进行水提取和碱溶液提取，分别得到土壤溶解性有机质水提取液和土壤溶解性有机质碱提取液；
将土壤溶解性有机质水提取液、土壤溶解性有机质碱提取液和/或地表水样品过滤，得到前处理后的样品，并置于4℃保存；
步骤2：胡敏酸的分离
将步骤1得到的前处理后的样品调节pH值至2.0±0.2，置于4℃保存24h后，离心，分离得到第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用纯水冲洗，然后冷冻干燥，得到纯净的腐殖酸固体样品，保存于干燥皿中；
步骤3：富里酸的沉淀分离
将步骤2得到的第一上清液调节pH值至7.5-8.5，测量三维荧光，记录富里酸的特征峰M的位置和原始荧光强度；
在第一上清液中，缓慢地逐滴加入FeCl3溶液，同时缓慢地逐滴加入NaOH溶液，并保持缓慢搅拌，使溶液的pH值保持在7.5-8.5，当溶液出现沉淀时，停止加入FeCl3溶液，保持缓慢搅拌5-10分钟以稳定pH值为7.5-8.5，离心，得到第二上清液和第二沉淀物；
将第二上清液的pH值调节至7.5-8.5，测量三维荧光，以第二上清液中富里酸的特征峰M的位置和原始荧光强度为监测指标，重复上述沉淀操作5-10次，合并第二沉淀物；
步骤4：沉淀样品中富里酸的提取
将步骤3合并的第二沉淀物用纯水冲洗，并根据三维荧光结果，判断沉淀物中含有的富里酸的含量，按照质量比为1:10-1:50，加入超纯水，充入N2置于摇床中，震荡，离心，得到第三上清液和第三沉淀物，测量第三上清液的三维荧光，以富里酸的特征峰M的荧光强度作为监测指标，重复上述提取操作5-10次，当荧光强度不再下降时，停止提取，合并第三上清液，置于4℃保存；
根据三维荧光结果，判断第三沉淀物中含有的富里酸的含量，按照质量比为1:10-1:50，加入pH值为10的水溶液，震荡，离心，得到第四上清液和第四沉淀物，测量第四上清液的三维荧光，以富里酸的特征峰M的荧光强度作为监测指标，重复提取操作5-10次，当荧光强度不再下降时，停止提取，合并第四上清液，置于4℃保存；
按照相同的提取条件，并根据三维荧光结果，判断沉淀物中含有的富里酸的含量，按照质量比为1:10-1:50，向第四沉淀物中加入pH值为12的水溶液重复提取5-10次，离心，合并第五上清液，置于4℃下保存；
将合并的第三上清液、合并的第四上清液和合并的第五上清液分别进行冷冻干燥，得到三种由不同pH溶液提取得到的富里酸固体样品。
本发明的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法遵循的原理概述如下：
本发明使用氯化铁(FeCl3)从地表水和/或土壤提取富里酸，由于自身含有不同类型和比例的官能团，可以与土壤矿物表面的多价金属离子如Fe3+、Al3+等产生较强的络合作用。同时，由于所加入的提取剂种类的不同以及溶液pH环境差异(比如超纯水、和不同pH的水溶液)，可以促使腐殖质分子的不同官能团发生解离，从而大大改变腐殖质分子的溶解状态，进而实现对三种不同分子量组成的富里酸组分的分离和提取。
溶解性有机质(DOM)的官能团，如羧酸(-COO-)、羟基(-O-)和硫醇(-S-)，在碱性条件下迅速去质子化，因此步骤3中的第二沉淀物(即Fe-富里酸沉淀物)的形成主要包括通过将电子从富里酸的去质子化过程中的富电子官能团贡献给Fe3+的未配对d轨道而形成强或弱π电子键系统。此外，步骤3中的第二沉淀物(即Fe-富里酸沉淀物)中的π电子键系统由于其更大的电子核吸引力而被高自旋态的低能量所稳定。第二上清液中，含有富里酸和类蛋白质物质(Protein Like Substances，PLS)。
在Fe3+和溶解性有机质(DOM)之间形成的π电子键系统可以在以下两个反应中概述：
FeCl3+NaOH+DOM-COOH→Fe3++DOM-COO-+NaCl+H2O
Fe3++DOM-COO-→Fe-OOC-DOM
最后，不同的DOM官能团对Fe3+的非配对d-轨道的电子贡献能力/效率将成为在各种Fe-DOM沉淀物样品中发生的强或弱的复合作用的决定因素。
本发明的方法可以从任何给定的地表水和/或土壤中实现富里酸的分离和提取，得到的富里酸可以通过测定其光学(荧光和吸光度)特性、金属络合特性和分子组成来描述待测地表水和/或土壤中的DOM特性。
在本发明的步骤1中，地表水是指地表的动水和静水的总称，也叫“陆地水”，包括各种液体和固体水体，主要有河流、湖泊、沼泽、冰川、冰盖等。
本发明的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法的有益效果是：
1.本发明的方法可以从任何给定的地表水和/或土壤中实现富里酸的分离和提取，得到的富里酸可用作相关地球化学实验的原始样品，分析这些富里酸样品的物理、光化学和微生物转化特征，并进而确定其降解产物，包括营养物质、CO2、溶解无机碳(DIC)和CH4等，进而描述待测地表水和/或土壤中的DOM特性。
2.本发明富里酸的提取速度远远快于现有的树脂基技术，对于分离胡敏酸后的DOM溶液，单次提取富里酸的时间约为1小时20分钟(1小时震荡和20分钟离心)。同时，基于本发明的方法，可以实现单次大量样品中富里酸的提取。
3.本发明的方法，操作简便，成本低廉，市场前景广阔，适合大规模推广应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述土壤溶解性有机质水提取液和所述地表水样品的过滤是采用孔径为0.45μm的玻璃纤维滤膜，所述土壤溶解性有机质碱提取液的过滤是采用孔径为0.45μm的聚四氟乙烯滤膜。
采用上述进一步的有益效果是：经过上述操作，可以得到符合要求的前处理样品，更有利于后续富里酸的提取；此外，由于玻璃纤维滤膜不耐酸碱，因此使用具有良好耐酸碱特性的聚四氟乙烯滤膜对土壤溶解性有机质碱提取液进行过滤。
进一步，步骤1中，所述水提取的具体方法是：将研磨过筛后的土壤样品与超纯水按质量比为1:10进行混合，并置于摇床中，第一次震荡，离心，得到一次溶解性有机质水提液和一次土壤沉淀物；
在N2氛围中，将一次土壤沉淀物与超纯水按质量比为1:10进行混合，并置于摇床中，第二次震荡，离心，得到二次溶解性有机质水提物和二次土壤沉淀物；
合并一次溶解性有机质水提液和二次溶解性有机质水提液，置于4℃保存；
所述碱溶液提取的具体方法是：
合并一次土壤沉淀物和二次土壤沉淀物，按质量比为1:10，与浓度为0.1M的NaOH溶液进行混合，并充入N2，置于摇床中，第三次震荡，离心，得到一次溶解性有机质碱提取液和三次土壤沉淀物；
将三次土壤沉淀物按质量比为1:10，与浓度为0.1M的NaOH溶液进行混合，并充入N2，并置于摇床中，第四次震荡，离心，得到二次溶解性有机质碱提取液和四次土壤沉淀物；
合并一次溶解性有机质碱提取液和二次溶解性有机质碱提取液，置于4℃保存。
采用上述进一步的有益效果是：通过使用两种提取剂(超纯水和浓度为0.1M的NaOH溶液)的顺序多次提取，可以实现土壤中的溶解性有机质最大程度以及最高效率的获取。
更进一步，所述研磨过筛的方法是：将土壤样品风干后，粉碎，过孔径为0.2mm的筛网；所述第一次震荡的时间为6h，所述第二次振荡的时间为1h，所述第三次振荡的时间为3h，所述第四次振荡的时间为3h，速度均为200r/min；所述离心的速度均为4000r/min，时间均为20min。
采用上述更进一步的有益效果是：顺序多次提取，可以实现土壤中的溶解性有机质最大程度以及最高效率的获取。
进一步，步骤2中，所述调节pH值采用浓度为2M的盐酸；所述离心的速度为4000r/min，时间为20min；所述纯水冲洗的次数为3次；所述冷冻干燥的温度为-60℃，时间为24h。
采用上述进一步的有益效果是：腐殖酸(HA)在pH<2的调节下析出；冷冻干燥不会改变和破坏所提取物质的性质而实现样品的干燥。
进一步，步骤3中，所述调节pH值均采用0.1M的NaOH溶液；所述FeCl3溶液的浓度为30g/L；所述离心的速度为4000r/min，时间为20min。
采用上述进一步的有益效果是：弱碱性的溶液环境，有利于Fe-富里酸沉淀物的生成以及保持沉淀的稳定。
进一步，步骤4中，所述震荡的速度均为200r/min，时间均为1h；所述离心的速度均为4000r/min，时间均为20min；所述pH值为10的水溶液是指在超纯水中加入浓度为0.1M的NaOH溶液；所述pH值为12的水溶液是指在超纯水中加入浓度为0.1M的NaOH溶液；所述冷冻干燥的温度为-60℃，时间为24h-48h。
采用上述进一步的有益效果是：不同pH的水溶液可以提取出不同分子量的富里酸组分，从而实现富里酸从Fe-富里酸沉淀物中的高效提取回收；冷冻干燥可以实现不改变和破坏样品性质的前提下而达到干燥的目的。
附图说明
图1为现有技术中，地表水和/或土壤中富里酸的分离和提取方法流程图。
图2为本发明中，地表水和/或土壤中富里酸的分离和提取方法流程图。
图3为沉淀分离前的白沟河样品中由平行因子分析识别的富里酸的荧光峰位置。
图4为沉淀分离后的白沟河样品中由平行因子分析识别的富里酸的荧光峰位置。
图5为沉淀分离前的敬业湖样品中由平行因子分析识别的富里酸的荧光峰位置。
图6为沉淀分离后的敬业湖样品中由平行因子分析识别的富里酸的荧光峰位置。
图7为沉淀分离前的土壤溶解性有机质水提液样品中由平行因子分析识别的富里酸的荧光峰位置。
图8为沉淀分离后的土壤溶解性有机质水提液样品中由平行因子分析识别的富里酸的荧光峰位置。
图9为沉淀分离前的土壤溶解性有机质碱提液样品中由平行因子分析识别的富里酸的荧光峰位置。
图10为沉淀分离后的土壤溶解性有机质碱提液样品中由平行因子分析识别的富里酸的荧光峰位置。
图11为白沟河样品沉淀分离前溶液冷冻干燥后固体以及该样品沉淀分离得到的Fe-FA沉淀的FTIR光谱。
图12为敬业湖样品沉淀分离前溶液冷冻干燥后固体以及该样品沉淀分离得到的Fe-FA沉淀的FTIR光谱。
图13为土壤溶解性有机质水提液和碱提液样品沉淀分离前溶液冷冻干燥后固体以及该样品沉淀分离得到的Fe-FA沉淀的FTIR光谱。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例
本实施例的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，包括如下步骤：
步骤1：样品的前处理
采集土壤样品和/或地表水样品，将土壤样品依次进行水提取和碱溶液提取，分别得到土壤溶解性有机质水提取液和土壤溶解性有机质碱提取液。
其中，所述水提取的具体方法是：将土壤样品风干后，粉碎，过孔径为0.2mm的筛网，与超纯水按质量比为1:10进行混合，并置于摇床中，第一次速度为200r/min震荡6h，速度为4000r/min离心20min，得到一次溶解性有机质水提液和一次土壤沉淀物；
在N2氛围中，将一次土壤沉淀物与超纯水按质量比为1:10进行混合，并置于摇床中，速度为200r/min第二次震荡1h，速度为4000r/min离心20min，得到二次溶解性有机质水提物和二次土壤沉淀物；
合并一次溶解性有机质水提液和二次溶解性有机质水提液，置于4℃保存；
所述碱溶液提取的具体方法是：
合并一次土壤沉淀物和二次土壤沉淀物，按质量比为1:10，与浓度为0.1M的NaOH溶液进行混合，并充入N2，置于摇床中，速度为200r/min第三次震荡3h，速度为4000r/min离心20min，得到一次溶解性有机质碱提取液和三次土壤沉淀物；
将三次土壤沉淀物按质量比为1:10，与浓度为0.1M的NaOH溶液进行混合，并充入N2，并置于摇床中，速度为200r/min第四次震荡3h，速度为4000r/min离心20min，得到二次溶解性有机质碱提取液和四次土壤沉淀物；
合并一次溶解性有机质碱提取液和二次溶解性有机质碱提取液，置于4℃保存。
将土壤溶解性有机质水提取液和地表水样品采用孔径为0.45μm的玻璃纤维滤膜过滤，将土壤溶解性有机质碱提取液采用孔径为0.45μm的聚四氟乙烯滤膜过滤，得到前处理后的样品，并置于4℃保存。
步骤2：胡敏酸的分离
将步骤1得到的前处理后的样品采用浓度为2M的盐酸调节pH值至2.0±0.2，置于4℃保存24h后，速度为4000r/min离心20min，分离得到第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用纯水冲洗3次，然后-60℃冷冻干燥24h，得到纯净的腐殖酸固体样品，保存于干燥皿中。
步骤3：富里酸的沉淀分离
将步骤2得到的第一上清液采用0.1M的NaOH溶液调节pH值至7.5-8.5，测量三维荧光，记录富里酸的特征峰M的位置和原始荧光强度；
在第一上清液中，缓慢地逐滴加入浓度为30g/L的FeCl3溶液，同时缓慢地逐滴加入NaOH溶液，并保持缓慢搅拌，使溶液的pH值保持在7.5-8.5，当溶液出现沉淀时，停止加入FeCl3溶液，保持缓慢搅拌5-10分钟以稳定pH值为7.5-8.5，速度为4000r/min离心20min，得到第二上清液和第二沉淀物；
将第二上清液的pH值调节至7.5-8.5，测量三维荧光，以第二上清液中富里酸的特征峰M的位置和原始荧光强度为监测指标，重复上述沉淀操作5-10次，合并第二沉淀物。
步骤4：沉淀样品中富里酸的提取
将步骤3合并的第二沉淀物用纯水冲洗，按照质量比为1:10-1:50，加入超纯水，充入N2置于摇床中，速度为200r/min震荡1h，速度为4000r/min离心20min，得到第三上清液和第三沉淀物，测量第三上清液的三维荧光，以富里酸的特征峰M的荧光强度作为监测指标，重复上述提取操作5-10次，当荧光强度不再下降时，停止提取，合并第三上清液，置于4℃保存；
在第三沉淀物中，按质量比为1:10-1:50，加入pH值为10的水溶液，所述pH值为10的水溶液是指在超纯水中加入浓度为0.1M的NaOH溶液，速度为200r/min震荡1h，速度为4000r/min离心20min，得到第四上清液和第四沉淀物，测量第四上清液的三维荧光，以富里酸的特征峰M的荧光强度作为监测指标，重复提取操作5-10次，当荧光强度不再下降时，停止提取，合并第四上清液，置于4℃保存；
按照相同的提取条件，按质量比为1:10-1:50，向第四沉淀物中加入pH值为12的水溶液重复提取5-10次，所述pH值为12的水溶液是指在超纯水中加入浓度为0.1M的NaOH溶液，速度为4000r/min离心20min，合并第五上清液，置于4℃下保存；
将合并的第三上清液、合并的第四上清液和合并的第五上清液分别进行-60℃冷冻干燥24h-48h，得到三种由不同pH溶液提取得到的富里酸固体样品。
实验例1：
在实施例1的步骤3中，每一次添加FeCl3溶液分离富里酸后，通过测量样品离心后上清液的三维荧光，荧光峰M的强度用于监测富里酸的提取效果，荧光峰M的变化范围是：土壤溶解性有机质水提液和土壤溶解性有机质碱提液分别为295-310/394-416nm和300-310/392-412nm；河水中荧光峰M变化为315/400-411nm；湖水中荧光峰M变化为285-305/402-415nm。
通过数据我们发现，随着FeCl3添加次数的增加(即分离次数的增加)，富里酸特征峰M的荧光强度在所有样品中总体呈现明显的下降趋势，因此，我们认为，样品溶液中的FA以Fe-FAP的形式被分离出来，此外，在进行第10次沉淀分离后，荧光强度下降并不显著，因此，推荐沉淀分离的次数控制在10次以内。
土壤和地表水样品中以Fe-FA沉淀分离富里酸(FA)后样品溶液中的原始三维荧光光谱图中荧光峰M的波长及荧光强度，如表1所示。
表1
*pH2下分离胡敏酸(HA)后的河水和湖水样品调整pH～7.5；
**pH2下分离胡敏酸(HA)后的土壤DOM碱提溶液调整pH～7.5。
实验例2
通过测量沉淀分离前后各个样品溶液的三维荧光光谱，我们可以从EEM光谱图中发现以下结果：
白沟河样品：由图3和图4的富里酸(FA-M type)荧光峰M的位置变化，发现在该样品沉淀分离后的溶液中峰M发生了蓝移(即向短波长方向移动)，由305/412nm变化至300/449nm；
敬业湖样品：由图5和图6的富里酸(FA-M type)荧光峰M的位置变化，发现该样品沉淀分离后的溶液中峰M发生了蓝移(即向短波长方向移动)，由310/440nm变化至315/431nm；
土壤溶解性有机质水提液样品：由图7和图8的富里酸(FA-C type)荧光峰C的位置变化，发现该样品沉淀分离后的溶液中峰M发生了蓝移(即向短波长方向移动)，由320/478nm变化至300/458nm；
土壤溶解性有机质碱提液样品：由图9和图10的富里酸(FA-M type)荧光峰M的位置变化，发现该样品沉淀分离后的溶液中峰M发生了蓝移(即向短波长方向移动)，由365/442nm变化至305/418nm；
综上，各样品沉淀分离前后溶液中的富里酸特征峰均发生了不同程度的蓝移(即向短波长方向移动)或消失，这代表富里酸已经以Fe-FA沉淀的形式从溶液中实现了不同程度的分离。
实验例3
不同样品沉淀分离得到的Fe-富里酸沉淀物及其剩余溶液冷冻干燥后固体的红外吸收特征及其差异总结如下：
(1)如图11、图12和图13所示，同一类样品对应的Fe-FA沉淀和沉淀分离后的溶液的红外光谱曲线具有特定的吸收带，即在河水和湖水、土壤溶解性有机质水提液和碱提液的Fe-FA沉淀以及沉淀分离后的溶液中，在3884-3857cm-1处存在两个弱带，这可能是由于单个芳香环结构中的芳香C-H拉伸。
(2)由图11，图12和图13中样品沉淀分离后的溶液的红外光谱曲线可知，在河水和湖水、土壤溶解性有机质水提液和碱提液沉淀分离后的溶液样品中，3400-3450cm-1的频带显示出较强/中等的相对强度，而在对应的Fe-FA沉淀样品中，其相对强度下降。这些结果表明，FA中的芳香族OH可以有效地向Fe3+的d-轨道贡献电子，从而在Fe-O-FA中形成一个强π电子键系统，这又导致红外吸收下降或完全消失。此外，土壤溶解性有机质碱提液Fe-FA沉淀的强度相对较高，这表明与来自湖水、河水的FA相比，土壤FA中的贡献电子的官能团更为丰富，而土壤FA中的许多官能团可能由于分子间的相互作用而无法向Fe3+的d轨道贡献电子。
(3)由图11，图12和图13中样品沉淀分离后的溶液的红外光谱曲线可知，在河水和湖水以及土壤溶解性有机质水提液和碱提液沉淀分离后的溶液样品中，1685-1662cm-1范围内的峰的相对强度略低于相应的Fe-FA沉淀，并且可以被分配到芳香族C＝C伸展和/或COOH基团。这些结果表明，这些基团可以向Fe3+的d轨道捐献电子，形成一个强大的π电子键系统Fe-OOC-FA。
(4)由图11和图13中Fe-FA沉淀的红外光谱图可知，在1523-1500nm-1处的峰可以被归类为酰胺Ⅱ带，并且在Fe-FAP中比对应来自河水、土壤DOM水提液沉淀分离后的溶液样品中更强烈，而在湖泊和土壤DOM碱提液中则相反。这些结果表明，从酰胺ⅡN向Fe的d轨道捐赠非键电子将在Fe←:N-FAP中形成一个强或弱的键系。
(5)由图13中的Fe-FA沉淀的红外光谱图可知，土壤中的Fe-FAP出现了1400cm-1左右的分配给酰胺Ⅰ的C＝N伸展的弱峰，这意味着在酰胺ⅠN的非结合电子和Fe的d轨道之间形成了类似于酰胺Ⅱ的弱π电子键系统。
(6)由图11，图12和图13中样品沉淀分离后的溶液的红外光谱曲线可知，在河水、湖水以及土壤DOM碱提液沉淀分离后的溶液样品中存在一个1150cm-1左右的微弱峰，该峰被指定为含S官能团的S＝O和C-O-S拉伸，而在相应的Fe-FA沉淀中则消失了。这些结果表明，含S的官能团也可以向Fe3+的d轨道捐赠电子，在Fe-S-FAP中形成π-d电子键系统。
(7)由图13中的Fe-FA沉淀的红外光谱曲线可知，在1100-1000cm-1处的弱带是多糖或类似多糖的成分的C-O伸展，它存在于土壤DOM水提液和碱提液的Fe-FA沉淀中，而在其他样品未发现，这也表明这些结构也部分参与了Fe3+络合。
总之，上面讨论的FTIR结果表明，在Fe-FA沉淀中可以通过从相应的原始样品的官能团中贡献电子而形成强或弱的π-d电子键系统，进而实现富里酸(FA)的分离。
参考文献：
[1].Karim S,Aoyama M(2013)Fractionation of soil humic acids bypreparative polyacrylamide gel electrophoresis in the presence ofconcentrated urea,Soil Science and Plant Nutrition,59:6,827-839.
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：样品的前处理
采集土壤样品和/或地表水样品，将土壤样品依次进行水提取和碱溶液提取，分别得到土壤溶解性有机质水提取液和土壤溶解性有机质碱提取液；
将土壤溶解性有机质水提取液、土壤溶解性有机质碱提取液和/或地表水样品过滤，得到前处理后的样品，并置于4℃保存；
步骤2：胡敏酸的分离
将步骤1得到的前处理后的样品的pH值调节至2.0±0.2，置于4℃保存24h后，离心，分离得到第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用纯水冲洗，然后冷冻干燥，得到纯净的腐殖酸固体样品，保存于干燥皿中；
步骤3：富里酸的沉淀分离
将步骤2得到的第一上清液的pH值调节至7.5-8.5，测量三维荧光，记录富里酸的特征峰M的位置和原始荧光强度；
在第一上清液中，缓慢地逐滴加入FeCl 3溶液，同时缓慢地逐滴加入NaOH溶液，并保持缓慢搅拌，使溶液的pH值保持在7.5-8.5，当溶液出现沉淀时，停止加入FeCl 3溶液，保持缓慢搅拌5-10分钟以稳定pH值为7.5-8.5，离心，得到第二上清液和第二沉淀物；
将第二上清液的pH值调节至7.5-8.5，测量三维荧光，以第二上清液中富里酸的特征峰M的位置和原始荧光强度为监测指标，重复上述沉淀操作5-10次，合并第二沉淀物；
步骤4：沉淀样品中富里酸的提取
将步骤3合并的第二沉淀物用纯水冲洗，并根据三维荧光结果，判断沉淀物中含有的富里酸的含量，按照质量比为1:10-1:50，加入超纯水，充入N2置于摇床中，震荡，离心，得到第三上清液和第三沉淀物，测量第三上清液的三维荧光，以富里酸的特征峰M的荧光强度作为监测指标，重复上述提取操作5-10次，当荧光强度不再下降时，停止提取，合并第三上清液，置于4℃保存；
根据三维荧光结果，判断第三沉淀物中含有的富里酸的含量，按照质量比为1:10-1:50，加入pH值为10的水溶液，震荡，离心，得到第四上清液和第四沉淀物，测量第四上清液的三维荧光，以富里酸的特征峰M的荧光强度作为监测指标，重复提取操作5-10次，当荧光强度不再下降时，停止提取，合并第四上清液，置于4℃保存；
按照相同的提取条件，并根据三维荧光结果，判断沉淀物中含有的富里酸的含量，按照质量比为1:10-1:50，向第四沉淀物中加入pH值为12的水溶液重复提取5-10次，离心，合并第五上清液，置于4℃下保存；
将合并的第三上清液、合并的第四上清液和合并的第五上清液分别进行冷冻干燥，得到三种由不同pH溶液提取得到的富里酸固体样品。
2.根据权利要求1所述的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，其特征在于，步骤1中，所述土壤溶解性有机质水提取液和所述地表水样品的过滤是采用孔径为0.45μm的玻璃纤维滤膜，所述土壤溶解性有机质碱提取液的过滤是采用孔径为0.45μm的聚四氟乙烯滤膜。
3.根据权利要求1所述的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，其特征在于，步骤1中，所述水提取的具体方法是：将研磨过筛后的土壤样品与超纯水按质量比为1:10进行混合，并置于摇床中，第一次震荡，离心，得到一次溶解性有机质水提液和一次土壤沉淀物；
在N2氛围中，将一次土壤沉淀物与超纯水按质量比为1:10进行混合，并置于摇床中，第二次震荡，离心，得到二次溶解性有机质水提物和二次土壤沉淀物；
合并一次溶解性有机质水提液和二次溶解性有机质水提液，置于4℃保存；
所述碱溶液提取的具体方法是：
合并一次土壤沉淀物和二次土壤沉淀物，按质量比为1:10，与浓度为0.1M的NaOH溶液进行混合，并充入N2，置于摇床中，第三次震荡，离心，得到一次溶解性有机质碱提取液和三次土壤沉淀物；
将三次土壤沉淀物按质量比为1:10，与浓度为0.1M的NaOH溶液进行混合，并充入N2，并置于摇床中，第四次震荡，离心，得到二次溶解性有机质碱提取液和四次土壤沉淀物；
合并一次溶解性有机质碱提取液和二次溶解性有机质碱提取液，置于4℃保存。
4.根据权利要求3所述的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，其特征在于，所述研磨过筛的方法是：将土壤样品风干后，粉碎，过孔径为0.2mm的筛网；所述第一次震荡的时间为6h，所述第二次振荡的时间为1h，所述第三次振荡的时间为3h，所述第四次振荡的时间为3h，速度均为200r/min；所述离心的速度均为4000r/min，时间均为20min。
5.根据权利要求1所述的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，其特征在于，步骤2中，所述调节pH值采用浓度为2M的盐酸；所述离心的速度为4000r/min，时间为20min；所述纯水冲洗的次数为3次；所述冷冻干燥的温度为-60℃，时间为24h。
6.根据权利要求1所述的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，其特征在于，步骤3中，所述调节pH值均采用0.1M的NaOH溶液；所述FeCl 3溶液的浓度为30g/L；所述离心的速度为4000r/min，时间为20min。
7.根据权利要求1所述的从地表水和/或土壤中分离和提取富里酸的方法，其特征在于，步骤4中，所述震荡的速度均为200r/min，时间均为1h；所述离心的速度均为4000r/min，时间均为20min；所述pH值为10的水溶液是指在超纯水中加入浓度为0.1M的NaOH溶液；所述pH值为12的水溶液是指在超纯水中加入浓度为0.1M的NaOH溶液；所述冷冻干燥的温度为-60℃，时间为24h-48h。
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| 王璐: ""污泥堆肥富里酸的提取与分离研究"" * |
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