CN115044573B - 2-羟基对苯二甲酸的生物合成途径及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种2‑羟基对苯二甲酸的生物合成途径，其包括(1)以五碳糖和/或六碳糖为碳源，生成中间体莽草酸，再在3‑羟基苯甲酸合酶的催化作用下生成3‑羟基苯甲酸；(2)在脱羧酶的作用下对3‑羟基苯甲酸的羟基邻位进行羧化，合成2‑羟基对苯二甲酸；所述脱羧酶为芳香酸脱羧酶或芳香酸脱羧酶突变体。本发明还涉及基于上述生物合成途径的2‑羟基对苯二甲酸的生物合成方法，研究结果表明，采用本发明方法生物法生产2‑羟基对苯二甲酸切实可行，为生物基2‑羟基对苯二甲酸替代石油基对苯二甲酸奠定基础。生物合成法生产2‑羟基对苯二甲酸及其中间物具有污染小，反应条件温和，反应特异性高，产品易于分离纯化等优点，极具发展前景。

Description

2-羟基对苯二甲酸的生物合成途径及方法
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，涉及2-羟基对苯二甲酸的生物合成途径及方法。
背景技术
2-羟基对苯二甲酸(2-hydroxyterephthalic acid，缩写2-HTA)，是重要的中间体，用于合成药物和功能材料。相对于广泛采用的对苯二甲酸单体合成的高分子材料PET，2-羟基对苯二甲酸等(多)羟基对苯二甲酸在苯环类直链刚性化合物中引入了羟基类活性侧链基团，使材料具有更好的抗紫外性、复合粘结性、抗压性能。
2-羟基对苯二甲酸的制备方法包括：(1)生物法：Ruppen等采用生物降解对苯二甲酸的菌株，制得1,2-二羟基-3,5-二烯-1,4-环己二甲酸，然后采用化学法，在稀硫酸中加热脱去1位羟基生成2-羟基对苯二甲酸。(2)化学法：Henkel等以间羟基苯甲酸或其钾盐为原料，加入K2CO3和SiO2，通CO2气体，250℃反应。反应过程需要高压高温、能耗高。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种2-羟基对苯二甲酸的生物合成途径，基于该途径可以通过生物法合成2-羟基对苯二甲酸，能够避免化学法合成2-羟基对苯二甲酸的反应过程需要高压高温、能耗高的问题。
本发明的目的之二在于提供一种2-羟基对苯二甲酸的生物合成方法，利用该方法生产2-羟基对苯二甲酸及其中间物具有污染小，反应条件温和，反应特异性高，产品易于分离纯化等优点，极具发展前景。
为此，本发明第一方面提供了一种羟基对苯甲酸类化合物的生物合成途径，其包括：在脱羧酶的作用下对羧化底物的羟基邻位进行羧化，合成羟基对苯甲酸类化合物；其中，所述羧化底物包括3-羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸酯、2,5-二羟基苯甲酸酯、3,5-二羟基苯甲酸酯；所述羟基对苯甲酸类化合物包括2-羟基对苯二甲酸、多羟基对苯二甲酸、多羟基对苯二甲酸酯。
根据本发明的一些优选的实施方式，所述羧化底物为3-羟基苯甲酸，所述羟基对苯甲酸类化合物为2-羟基对苯二甲酸，所述生物合成途径包括：
(1)以五碳糖和/或六碳糖为碳源，生成中间体莽草酸，再在3-羟基苯甲酸合酶的催化作用下生成3-羟基苯甲酸；
(2)在脱羧酶的作用下对3-羟基苯甲酸的羟基邻位进行羧化，合成2-羟基对苯二甲酸；
其中，所述脱羧酶为芳香酸脱羧酶或芳香酸脱羧酶突变体。
在本发明的一些实施例中，所述芳香酸脱羧酶包括来源于米曲霉的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao、来源于尖孢镰刀菌的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo和水杨酸脱羧酶SAD_Tm中的一种或几种。
本发明第二方面提供了一种芳香酸脱羧酶突变体，其由芳香酸脱羧酶突变获得，所述芳香酸脱羧酶包括来源于米曲霉的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao、来源于尖孢镰刀菌的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo。
在本发明的一些实施例中，所述芳香酸脱羧酶突变体为芳香酸脱羧酶的氨基酸序列的第27位、第62位氨基酸中的一个或者两个位点突变获得的突变体；其中，第27位氨基酸突变为甘氨酸，第62位氨基酸突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸。
本发明第三方面提供了一种产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌，其为含有编码芳香酸脱羧酶的基因或编码芳香酸脱羧酶的基因突变子的重组宿主菌。
在本发明的一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因、来源于尖孢镰刀菌的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因、编码水杨酸脱羧酶SAD_Tm的基因，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因。
在本发明的一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因突变子包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因突变子、来源于尖孢镰刀菌的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因突变子，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因突变子。
在本发明的一些优选的实施例中，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明第四方面提供了一种2-羟基对苯二甲酸的生物合成方法，其包括：合成2-羟基对苯二甲酸的步骤，采用芳香酸脱羧酶或芳香酸脱羧酶突变体作为生物催化剂对3-羟基苯甲酸进行生物催化反应，对3-羟基苯甲酸的羟基邻位进行羧化，合成2-羟基对苯二甲酸。
本发明中，所述催化反应包括体外反应、体内反应。
在本发明的一些实施例中，所述体外反应以纯酶、粗酶、细胞提取物、全细胞的方式起着催化作用，优选以全细胞的方式起着催化作用。
在本发明的另一些实施例中，所述体内反应以外源酶形式在基因工程菌活体中表达并起催化作用。
在本发明的一些具体的实施例中，在合成2-羟基对苯二甲酸的步骤中，加入3-羟基苯甲酸，并加入如本发明第三方面所述的产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌，进行反应，获得2-羟基对苯二甲酸产物。
根据本发明，所述3-羟基苯甲酸的制备方法包括生物法合成3-羟基苯甲酸，其包括以五碳糖和/或六碳糖为碳源，在3-羟基苯甲酸合酶的催化作用下生成3-羟基苯甲酸。
在本发明的一些具体的实施例中，生物法合成3-羟基苯甲酸包括以五碳糖和/或六碳糖为碳源，加入产3-羟基苯甲酸合酶的基因工程菌，进行发酵培养，获得3-羟基苯甲酸发酵产物。
本发明第五方面提供了一种产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌，其为含有编码3-羟基苯甲酸合酶的基因，以及编码芳香酸脱羧酶的基因或编码芳香酸脱羧酶的基因突变子的重组宿主菌。
在本发明的一些实施例中，所述编码3-羟基苯甲酸合酶的基因为来源于吸水链霉菌的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因hyg5；
在本发明的一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因、来源于尖孢镰刀菌的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因、编码水杨酸脱羧酶SAD_Tm的基因，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因。
在本发明的另一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因突变子包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因突变子、来源于尖孢镰刀菌的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因突变子，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因突变子。
优选地，所述宿主菌包括酵母菌、大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌。
本发明第六方面提供了如本发明第五方面所述的产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌在合成2-羟基对苯二甲酸中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述应用包括将产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得2-羟基对苯二甲酸。
在本发明的一些优选的实施例中，发酵过程中添加CO2源，其中所述CO2源包括CO2和/或碳酸氢盐；优选地，通入CO2形成CO2饱和溶液；和/或，碳酸氢盐的加入量为0.01-3M。
本发明证明生物法生产2-羟基对苯二甲酸切实可行，为生物基2-羟基对苯二甲酸替代石油基对苯二甲酸奠定基础。生物合成法生产2-羟基对苯二甲酸及其中间物具有污染小，反应条件温和，反应特异性高，产品易于分离纯化等优点，极具发展前景。
附图说明
为使本发明容易理解，下面将结合附图来详细说明本发明。
图1示出2-羟基对苯二甲酸生物合成途径。
图2为产物2-羟基对苯二甲酸LC-MS图(离子对181/93)。
图3为产物3-羟基苯二甲酸LC-MS图(离子对137/93)。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图和具体实施方式来详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
Ⅰ、术语
本发明所述用语“微生物”包括天然存在的野生菌株、突变菌株和经过人工改造的菌株。
本发明中所述用语“菌体”是指细菌或真菌的活细胞和/或死细胞。
本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的微生物，如大肠杆菌、酿酒酵母菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为为重组微生物。
本发明所述用语“生物催化剂”是利用酶或微生物细胞作为生物催化剂进行催化反应。其中酶可存在于胞内和胞外，生物细胞可是存活的活细胞，也可是失活的死细胞。
本发明所述用语“全细胞催化”是指利用完整的生物有机体(即完整的细胞、组织、甚至个体)作为催化剂催化反应进行，其本质是利用细胞内的酶进行催化。
本发明所述用语“62A”表示第62位氨基酸突变为A丙氨酸，以此类推。
Ⅱ、实施方案
如前所述，目前化学法合成2-羟基对苯二甲酸的反应过程需要高压高温、能耗高。鉴于此，本发明人对于2-羟基对苯二甲酸的生物合成途径及方法进行了大量的研究。
为此，本发明人第一方面研究发现并设计了一种羟基对苯甲酸类化合物的生物合成途径，其包括：在脱羧酶的作用下对羧化底物的羟基邻位进行羧化，合成羧化产物-羟基对苯甲酸类化合物；其中，所述脱羧酶为芳香酸脱羧酶或芳香酸脱羧酶突变体；所述羧化底物包括3-羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸酯、2,5-二羟基苯甲酸酯、3,5-二羟基苯甲酸酯，优选为3-羟基苯甲酸；相应地，作为羧化产物的羟基对苯甲酸类化合物包括2-羟基对苯二甲酸、多羟基对苯二甲酸、多羟基对苯二甲酸酯，优选为2-羟基对苯二甲酸。
根据本发明的一些具体优选的实施方式，所述羧化底物为3-羟基苯甲酸，作为羧化产物的羟基对苯甲酸类化合物为2-羟基对苯二甲酸，图1示出羧化底物为3-羟基苯甲酸，羧化产物(羟基对苯甲酸类化合物)为2-羟基对苯二甲酸的生物合成途径。从图1可以看出，所述2-羟基对苯二甲酸的生物合成途径包括：
(1)以五碳糖和/或六碳糖为碳源，生成中间体莽草酸，再在3-羟基苯甲酸合酶的催化作用下生成3-羟基苯甲酸；
(2)在脱羧酶的作用下对3-羟基苯甲酸的羟基邻位进行羧化，合成2-羟基对苯二甲酸；
其中，所述脱羧酶为芳香酸脱羧酶或芳香酸脱羧酶突变体。
本领域技术人员应该了解的是，在途径(1)中，碳源(例如，葡萄糖)在宿主菌株中由糖酵解途径合成磷酸烯醇式丙酮酸，同时通过戊糖磷酸途径合成赤藓糖-4-磷酸，两者缩合形成3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)、DAHP经过3-脱氢奎尼酸(DHQ)合酶的催化作用生成3-脱氢奎尼酸，DHQ在3-脱氢奎尼酸脱水酶的作用下生成3-脱氢莽草酸(DHS)。DHS在莽草酸脱氢酶的作用下生成中间体莽草酸(SA)。中间体莽草酸在一系列酶的催化下生成分支酸(CHA)，分支酸在3-羟基苯甲酸合酶作用下转化成3-羟基苯甲酸。
本发明中，所述的芳香酸脱羧酶，可以形成C-C键，在芳烃环上引入羧基，此类酶对3-羟基苯甲酸具有催化活性，生成产物2-羟基对苯二甲酸。
优选地，所述芳香酸脱羧酶包括来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao[其编码基因2,3-dhbd-ao(NCBI:XM_001817461.3，基因序列如SED NO：1所示)]、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Fo[其编码基因2,3-dhbd-fo(NCBI:XM_031202969.1，基因序列如SED NO：2所示)]和水杨酸脱羧酶(salicylic acid decarboxylase)SAD_Tm[其编码基因sad_tm(GenBank:DM040453.1，基因序列如SED NO：3所示)]中的一种或几种，优选为来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao。
本发明第二方面涉及一种芳香酸脱羧酶突变体，其由芳香酸脱羧酶突变获得。
本发明中，所述芳香酸脱羧酶包括来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoicacid decarboxylase)2,3-DHBD_Fo、水杨酸脱羧酶(salicylic acid decarboxylase)SAD_Tm。
在本发明的一些实施例中，所述芳香酸脱羧酶突变体为芳香酸脱羧酶的氨基酸序列的第27位、第62位氨基酸中的一个或者两个位点突变获得的突变体；其中，第27位氨基酸突变为甘氨酸，第62位氨基酸突变为丙氨酸A、甘氨酸G、缬氨酸V。
优选地，所述芳香酸脱羧酶为来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao(其编码基因NCBI:XM_001817461.3)，其氨基酸序列如SED NO：4所示。
相应地，所述芳香酸脱羧酶突变体为来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体。
具体地，2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体为2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第62位氨基酸突变为缬氨酸V(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-62V)，其氨基酸序列如SED NO：5所示。
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体为2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第62位氨基酸突变为丙氨酸A(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-62A)，其氨基酸序列如SED NO：6所示。
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体为2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第62位氨基酸突变为甘氨酸G(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-62G)，其氨基酸序列如SED NO：7所示。
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体为2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-27G)，其氨基酸序列如SED NO：8所示。
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体为2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸，第62位氨基酸突变为缬氨酸V(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62V)，其氨基酸序列如SED NO：9所示。
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体为2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸，第62位氨基酸突变为丙氨酸A(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62A)，其氨基酸序列如SED NO：10所示。
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体为2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸，第62位氨基酸突变为甘氨酸G(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62G)，其氨基酸序列如SED NO：11所示。
本发明第三方面涉及一种产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌，其为含有编码芳香酸脱羧酶的基因或编码芳香酸脱羧酶的基因突变子的重组大肠杆菌。
在本发明的一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao基因(其基因序列如SED NO：1所示)、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Fo的基因(其基因序列如SED NO：2所示)、编码水杨酸脱羧酶(salicylic acid decarboxylase)SAD_Tm的基因(其基因序列如SED NO：3所示)，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因。
在本发明的一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因突变子包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因突变子、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Fo的基因突变子、编码水杨酸脱羧酶(salicylic acid decarboxylase)SAD_Tm的基因突变子，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的的基因突变子。
具体优选地，所述编码芳香酸脱羧酶的基因为来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因(简称为基因2,3-dhbd-ao)，其核苷酸序列如SED NO：1所示。
相应地，所述编码芳香酸脱羧酶的基因突变子为来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao(编码基因NCBI:XM_001817461.3，其基因序列如SED NO：1所示)的基因突变子。
具体地，编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因突变子为编码其氨基酸序列的第62位氨基酸突变为缬氨酸V的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-62V)的基因突变子(简称为基因2,3-dhbd-ao-62V)，其核苷酸序列如SED NO：12所示。
编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因突变子为编码其第62位氨基酸突变为丙氨酸A的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-62A)的基因突变子(简称为基因2,3-dhbd-ao-62A)，其核苷酸序列如SED NO：13所示。
编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因突变子为编码其氨基酸序列的第62位氨基酸突变为甘氨酸G的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-62G)的基因突变子(简称为基因2,3-dhbd-ao-62G)，其核苷酸序列如SED NO：14所示。
编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因突变子为编码其氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸G的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-27G)的基因突变子(简称为基因2,3-dhbd-ao-27G)，其核苷酸序列如SED NO：15所示。
编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因突变子为编码其氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸G，第62位氨基酸突变为丙氨酸A的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic aciddecarboxylase)2,3-DHBD_Ao的突变体(简称为突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62A)的基因突变子(简称为基因2,3-dhbd-ao-27G+62A)，其核苷酸序列如SED NO：16所示。
在本发明的一些优选的实施例中，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明第四方面，基于本发明第一方面所提供的羟基对苯甲酸类化合物的生物合成途径，本发明还提供了羟基对苯甲酸类化合物的生物合成方法，其包括：合成羟基对苯甲酸类化合物的步骤，采用芳香酸脱羧酶或芳香酸脱羧酶突变体作为生物催化剂对羧化底物进行生物催化反应，对羧化底物的羟基邻位进行羧化，合成羟基对苯甲酸类化合物；所述脱羧酶为芳香酸脱羧酶或芳香酸脱羧酶突变体；所述羧化底物包括3-羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸酯、2,5-二羟基苯甲酸酯、3,5-二羟基苯甲酸酯；相应地，作为羧化产物的羟基对苯甲酸类化合物包括多羟基对苯二甲酸、多羟基对苯二甲酸酯、2-羟基对苯二甲酸。
所述羧化底物可以通过化学合成法或生物合成法制得，也可以通过商购获得。
在本发明的一些具体优选的实施方式中，所述羧化底物为3-羟基苯甲酸，作为羧化产物的羟基对苯甲酸类化合物为2-羟基对苯二甲酸，所述羟基对苯甲酸类化合物的生物合成方法可以理解为一种2-羟基对苯二甲酸的生物合成方法，其包括：合成2-羟基对苯二甲酸的步骤，采用芳香酸脱羧酶或芳香酸脱羧酶突变体作为生物催化剂对3-羟基苯甲酸进行生物催化反应，对3-羟基苯甲酸的羟基邻位进行羧化，合成2-羟基对苯二甲酸。
本发明中，所述生物催化反应可以为体内反应或体外反应；其中，所述体外反应是以纯酶、粗酶、细胞提取物、全细胞的方式起着催化作用，优选以全细胞的方式起着催化作用；所述体内反应是以外源酶形式在基因工程菌活体中表达并起催化作用。
在本发明的一些具体的实施例中，在合成2-羟基对苯二甲酸的步骤中，加入3-羟基苯甲酸，并加入如本发明第三方面所述的产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌的菌体(例如干燥的菌粉)，进行反应，获得2-羟基对苯二甲酸产物。
具体地，所述产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌为含有编码芳香酸脱羧酶的基因或编码芳香酸脱羧酶的基因突变子的重组大肠杆菌BL21(DE3)；因此，产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌的发酵培养可以理解为芳香酸脱羧酶或其突变体在大肠杆菌BL21(CD3)中发酵诱导表达，并由此获得产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌的菌体(包括湿菌体或干燥的菌体)；优选地，所述诱导的条件为：诱导剂为IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)，诱导的浓度为0.1-2.0mM，优选为0.2mM；诱导的温度20-28℃，优选为20℃，发酵培养的时间为12-48h，优选16h。
优选地，所述的芳香酸脱羧酶采用全细胞催化方法，以芳香酸脱羧酶或其突变体在大肠杆菌BL21(CD3)的干燥菌粉(即干燥的菌体)作为生物催化剂，催化羧化。菌粉重量10-200mg，进一步优选为30mg。催化底物浓度10-200mM，进一步优选为20mM。反应中作为CO2源的KHCO3的加入量为0.2-3M，优选采用3M。反应温度为20-37℃，优选30℃。反应时间24-96小时，优选72h。
根据本发明，所述3-羟基苯甲酸的制备方法包括生物法合成3-羟基苯甲酸，其包括以五碳糖和/或六碳糖为碳源，在3-羟基苯甲酸合酶的催化作用下生成3-羟基苯甲酸。
本领域技术人员应该了解的是，本发明中所述碳源为生物基原料，其包括木质素纤维素和/或可发酵糖，优选为五碳糖和/或六碳糖。
在本发明的一些具体的实施例中，生物法合成3-羟基苯甲酸包括以五碳糖和/或六碳糖为碳源，加入产3-羟基苯甲酸合酶的基因工程菌，进行发酵培养，获得3-羟基苯甲酸发酵产物。
上述发酵培养条件为：所述发酵培养的温度为20-37℃，优选为37℃；发酵培养的时间为12-96h，优选48-96h，进一步优选为48h；诱导剂为IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)，诱导浓度为0.1-2.0mM，优选为0.2mM。
本发明中，所述产3-羟基苯甲酸合酶的基因工程菌为含有编码3-羟基苯甲酸合酶的基因Hyg5或经过密码子优化的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因Hyg5的重组宿主菌；所述编码3-羟基苯甲酸合酶的基因hyg5的GenBank登录号为AF007101.1，经过密码子优化的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因Hyg5(简称为密码子优化基因Hyg5)的核苷酸序列如SED NO：17所示。
在本发明的一些优选的实施例中，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
本领域技术人员应该了解的是，上述生物法合成3-羟基苯甲酸的过程中，以五碳糖和/或六碳糖(例如葡萄糖)为碳源，加入产3-羟基苯甲酸合酶的基因工程菌，进行发酵培养，获得3-羟基苯甲酸发酵产物，是在产3-羟基苯甲酸合酶的基因工程菌中实现上述途径(1)的过程，如图1中所示。
本发明中，所述3-羟基苯甲酸的制备方法还包括化学法合成3-羟基苯甲酸，本发明中对于化学法合成3-羟基苯甲酸没有特别的限制，可以采用现有的化学法合成3-羟基苯甲酸的任何方法，只要能够高效合成3-羟基苯甲酸即可，当然也可以采用商购的成品3-羟基苯甲酸，以低成本为最优选择。
本发明第五方面提供了一种产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌，其为含有编码3-羟基苯甲酸合酶的基因，以及编码芳香酸脱羧酶的基因或编码芳香酸脱羧酶的基因突变子的重组宿主菌。
在本发明的一些实施例中，所述编码3-羟基苯甲酸合酶的基因为来源于吸水链霉菌的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因hyg5(GenBank:AF007101.1)或来源于吸水链霉菌且经过密码子优化的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因Hyg5(其核苷酸序列如SED NO：17所示)。
在本发明的一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因、来源于尖孢镰刀菌的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因、编码水杨酸脱羧酶SAD_Tm的基因，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因。
在本发明的一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因(SED NO：1)、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Fo的基因(SED NO：2)、编码水杨酸脱羧酶(salicylic acid decarboxylase)SAD_Tm的基因(SED NO：3)，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因。
在本发明的一些实施例中，所述编码芳香酸脱羧酶的基因突变子包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Ao的基因突变子、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase)2,3-DHBD_Fo的基因突变子子，优选为源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的的基因突变子。
优选地，所述宿主菌包括酵母菌、大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌，优选为酿酒酵母菌，更优选为酿酒酵母S.cerevisiae BY4741(北纳生物)。
本发明第六方面涉及如本发明第五方面所述的产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌在合成2-羟基对苯二甲酸中的应用，其可以理解为利用本发明第五方面所述的产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌合成2-羟基对苯二甲酸的方法，其为一步发酵法。
在本发明的一些实施例中，上述利用产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌合成2-羟基对苯二甲酸的方法包括将产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得2-羟基对苯二甲酸。
在本发明的一些优选的实施例中，发酵过程中添加CO2源，其中所述CO2源包括CO2和/或碳酸氢盐；优选地，通入CO2形成CO2饱和溶液；和/或，碳酸氢盐的加入量为0.01-3M。
优选地，所述产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌为含有编码3-羟基苯甲酸合酶的基因hyg5(GenBank:AF007101.1)或经过密码子优化的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因Hyg5(其核苷酸序列如SED NO：17所示)，以及编码芳香酸脱羧酶的基因或编码芳香酸脱羧酶的基因突变子的重组酿酒酵母S.cerevisiae BY4741。因此，所述的发酵培养可以理解为在酿酒酵母S.cerevisiae BY4741中异源表达编码3-羟基苯甲酸合酶的基因hyg5和芳香酸脱羧酶基因2,3-dhbd-ao，体内构建2-羟基对苯二甲酸途径，经过基因工程菌发酵生产2-羟基对苯二甲酸。
具体地，上述利用产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌合成2-羟基对苯二甲酸的方法包括往缺Ura的营养缺陷型培养基中通入CO2，初始OD600为0.01-0.4，优选的0.3。温度28-30℃，进一步优选为30℃。发酵培养时间为24-96h，优选48h，生产2-羟基对苯二甲酸。
本领域技术人员应该了解的是，上述一步发酵过程中，以五碳糖、六碳糖和芳烃中的一种或几种(例如葡萄糖)为碳源，接入产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌，进行发酵培养，获得2-羟基对苯二甲酸发酵产物，是在产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌中实现上述途径(1)和(2)的过程，如图1中所示。
从上述可以看出，本发明提出了一条2-羟基对苯二甲酸的合成途径，同时提供了实现该合成途径的工艺技术，分别采用两段式生产法和一步发酵法生产2-羟基对苯二甲酸。
采用两段式生产法合成2-羟基对苯二甲酸的方法包括：
第一步，大肠杆菌BL21(DE3)(北京全式金生物技术股份有限公司)中外源表达编码3-羟基苯甲酸合酶的基因hyg5，构建基因工程菌大肠杆菌BL21-hyg5重组菌株，大肠杆菌BL21-hyg5重组菌株发酵产3-羟基苯甲酸；第二步，芳香酸脱羧酶羧化，大肠杆菌BL21(DE3)表达芳香酸脱羧酶，催化3-羟基苯甲酸进行羧化生成2-羟基对苯二甲酸；
第二步，通过将编码3-羟基苯甲酸合酶基因，导入基因工程菌株中发酵生产3-羟基苯甲酸，偶联芳香酸脱羧酶体外催化将3-羟基苯甲酸转化为2-羟基对苯二甲酸。
采用一步发酵法生产法合成2-羟基对苯二甲酸的方法包括：通过将3-羟基苯甲酸合酶基因，香酸脱羧酶基因导入中基因工程菌株中，构建了一条生产2-羟基对苯甲酸的新途径，实现发酵法生产2-羟基对苯二甲酸。
本发明证明生物法生产2-羟基对苯二甲酸切实可行，为生物基2-羟基对苯二甲酸替代石油基对苯二甲酸奠定基础。生物合成法生产2-羟基对苯二甲酸及其中间物具有污染小，反应条件温和，反应特异性高，产品易于分离纯化等优点，极具发展前景。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1：构建芳香酸脱羧酶重组菌株
所述芳香酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao、2,3-DHBD_Fo、SAD_Tm的编码基因(SED NO:1-3)，进行全基因合成，分别以BamHⅠ-SalⅠ，EcoRⅠ-XhoⅠ，BamHⅠ-HindⅢ作为双酶切位点，连接到pET-28a(+)质粒，获得重组质粒(委托华大基因完成)。将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建大肠杆菌重组菌株BL-A0，BL-F0，BL-T0。
实施例2：构建芳香酸脱羧酶突变体
构建突变体2,3-DHBD-Ao-62V(氨基酸序列SED NO:5)，以BL-A1-F/R上下游引物，以上述芳香酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的重组质粒pET-28a(+)-2,3-dhbd-ao为模板进行PCR，PCR产物采用Gibson组装成环型质粒。将获得的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建大肠杆菌重组菌株BL-A1。以此类推构建大肠杆菌重组菌株BL-A2，BL-A3，BL-A4，引物见表1。
表1构建芳香酸脱羧酶突变体的相关引物
引物名称 序列(5’-3’)
BL-A1-F CTCATACGTTGCACCCGGTGTACAAGACA
BL-A1-R CGGGTGCAACGTATGAGAGGATTTGGTAGCCGA
BL-A2-F TCATACGCTGCACCCGGTGTACAAGACA
BL-A2-R CGGGTGCAGCGTATGAGAGGATTTGGTAGCCGA
BL-A3-F TCTCATACGGTGCACCCGGTGTACAAGACA
BL-A3-R GGGTGCACCGTATGAGAGGATTTGGTAGCCGA
BL-A4-F GCAAGTCTCGGTTCCACGGACGCCGAAACCCACGTCA
BL-A4-F CGTGGAACCGAGACTTGCCCACCAGCGG
构建突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62A(氨基酸序列SED NO:10)，对其基因2,3-dhbd-ao-27G+62A(核苷酸序列SED NO:16)进行全基因合成，BamHⅠ-HindⅢ作为双酶切位点，连接到pET-28a(+)质粒，获得重组质粒pET-28a(+)-2,3-dhbd_ao-27G+62A(委托华大基因完成)，将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建大肠杆菌重组菌株BL-A5。
实施例3：芳香酸脱羧酶体外羧化反应
采用芳香酸脱羧酶重组菌株包括BL-A0，BL-F0，BL-T0，反应体系为1ml，加入20mM底物3-羟基苯甲酸浓度，30mg菌粉，3M的KHCO3，30℃摇床反应72h。加入200μl浓HCl终止反应，反应生成2-羟基对苯二甲酸，液相色谱-质谱联用仪进行检测(见图2)，检测结果见表2。
表2芳香酸脱羧酶体外羧化反应
重组菌 酶 序列 2-羟基对苯二甲酸浓度(mg/L)
BL-A0 2,3-DHBD_Ao SED NO：1 0.82
BL-F0 2,3-DHBD_Fo SED NO：2 0.52
BL-T0 SAD_Tm SED NO：3 0.19
采用芳香酸脱羧酶突变体包括BL-A1，BL-A2，BL-A3，BL-A4，BL-A5。反应体系为1ml，加入10mM底物3-羟基苯甲酸浓度，30mg菌粉，3M的KHCO3，30℃摇床反应72h。加入200μl浓HCl终止反应，液相色谱-质谱联用仪进行检测。检测结果见表3。
表3芳香酸脱羧酶突变体体外羧化反应
实施例4：两段式生产法生产2-羟基对苯甲酸
该实施例中所用到的引物及限制性内切酶酶切位点如表4示。
(1)构建大肠杆菌重组菌株BL-H
全基因合成来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)3-羟基苯甲酸合酶基因hyg5(基因序列SED NO：16)，以BamHⅠ-HindⅢ作为双酶切位点，连接到pET-28a(+)质粒，获得重组质粒pET-28a(+)-hyg5(委托华大基因完成)。将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建大肠杆菌重组菌株BL-H。作为对照组将空质粒pET-28a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得大肠杆菌重组菌株BL-0。
表4构建重组质粒pET-28a(+)的相关引物(基因hyg5)
引物名称 序列(5’-3’)
pET-hyg5-BamHI-F CGCGGATCCATGAACCCGTCATCGCTTG
pET-hyg5-HindIII-R CGCAAGCTTCTACATGACCACGCCCTCG
(2)大肠杆菌重组菌株BL-H发酵产3-羟基苯甲酸
LB培养基：5％酵母提取物，10％胰蛋白胨，5％NaCl。
M9Y培养基：20g葡萄糖，0.5g NaCl，17.1g Na2HPO4·12H2O，3g KH2PO4，2gNH4Cl，246mg MgSO4·7H2O，14.7mg CaCl2·2H2O，2.78mg FeSO4·7H2O,10mg维生素B1，0.1％酵母提取物。
分别将大肠杆菌重组菌株BL-H和大肠杆菌重组菌株BL-0的甘油菌液接种到4mL的带有抗性的LB试管中，过夜培养之后，以2％的接种量转接到50mL M9Y培养基中。在37℃摇床培养，当OD600达0.4左右，加入0.2mMIPTG诱导，反应48h取样，液相色谱-质谱联用仪进行检测(见图3)。检测结果显示，大肠杆菌BL-H在M9Y培养基中，3-羟基苯甲酸的产量为120.40mg/L。大肠杆菌BL-0中未检测到3-羟基苯甲酸。
(3)3-羟基苯甲酸羧化
反应体系为1ml，添加10mM底物3-羟基苯甲酸，30mgBL-A5菌粉，3M KHCO3，30℃摇床反应72h。加入200μl浓HCl终止反应，液相色谱-质谱联用仪进行检测，2-羟基对苯二甲酸产量为25.84mg/L。
实施例5：酿酒酵母S.cerevisiae BY4741生产2-羟基苯甲酸
(1)构建酿酒酵母重组菌株
以pSP-Hyg5-BamHI-F为上游引物，pSP-Hyg5-HindIII-R为下游引物，以质粒pET-28a(+)-hyg5为模板，对基因片段hyg5(SED NO：16)进行PCR扩增，以BamHⅠ-HindⅢ作为双酶切位点，将片段连接到pSP-GM1质粒上，获得重组质粒pSP-GM1-hyg5。
以pSP-2,3-dhbd-A-BamHI-F为上游引物，pSP-2,3-dhbd-A-SalI-R为下游引物，以质粒pET-28a(+)-2,3-dhbd_ao-27G+62A为模板，对基因片段2,3-dhbd_ao-27G+62A进行PCR扩增，以SpeⅠ和PacⅠ作为酶切位点，将PCR产物片段连接到pSP-GM1-hyg5质粒上，获得重组质粒pSP-GM1-hyg5-2,3-dhbd-ao。构建重组质粒pSPGM1的相关引物(见表5)。
表5构建重组质粒pSPGM1的相关引物(基因hyg5和2,3-dhbd-ao)
引物名称 序列(5’-3’)
pSP-Hyg5-BamHI-F CAAGGATCCATGAACCCGTCATCG
pSP-Hyg5-HindIII-R ACCAAGCTTCTACATGACCACGCC
pSP-2,3-dhbd-A-BamHI-F CGCACTAGTATGCTCGGTAAGATCGCTCTC
pSP-2,3-dhbd-A-SalI-R TTGTTAATTAACTAAGCTGAACTATCCTTGTAAGAATCAAGC
将重组质粒pSP-GM1-hyg5导入酿酒酵母BY4741中，构建酿酒酵母重组菌株DH。
将重组质粒pSP-GM1-hyg5-2,3-dhbd-ao导入酿酒酵母BY4741中，构建酿酒酵母重组菌株DHA。
(2)酿酒酵母菌株DH和菌株DHA发酵产2-羟基对苯甲酸
SC-Ura液体培养基(1L为例)：200g葡萄糖，1.7g无氨基酵母氮源(YNB)，5g硫酸铵，2g全氨基酸混合物。
SC-Ura固体培养基(1L为例):SD-Ura液体培养基，20g琼脂。
SC-Ura固体培养基上挑取单菌落到5mlSC-Ura液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。转接到装有30mlSC-Ura液体培养基的100ml摇瓶中，通入CO2，使溶液中CO2饱和。初始OD600为0.3-0.4，30℃，200rpm发酵陪养。48h取样，菌株DH的OD600为9.58，3-羟基苯甲酸产量为330.42mg/L。菌株DHA的OD600为9.43，3-羟基苯甲酸产量为250.37mg/L，2-羟基对苯二甲酸含量1.22mg/L。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 2-羟基对苯二甲酸的生物合成途径及方法
<130> RB2201371-FF
<141> 2022-04-25
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> （基因2,3-dhbd-ao）
<400> 1
atgctcggta agatcgctct cgaggaagcc ttcgcgcttc cccgcttcga agaaaagacc 60
cgctggtggg caagtctctt ctccacggac gccgaaaccc acgtcaaaga aatcaccgac 120
atcaacaaga tccgtatcga gcacgcagac aagcacggtg tcggctacca aatcctctca 180
tacacagcac ccggtgtaca agacatctgg gaccccgtag aagcgcaagc gctcgccgtc 240
gagatcaatg actacatcgc cgaacaggtg cgcgtgaacc ccgaccgatt cggcgctttc 300
gccacactat caatgcacaa ccccaaagaa gcagccgacg aactccgccg ctgcgtcgag 360
aaatacggct ttaaaggcgc cctagtaaac gatacccaac gcgctggccc agacggcgac 420
gacatgatct tctacgacaa cgcagactgg gatatcttct ggcaaacctg cacagagctc 480
gacgtcccct tctacatgca cccccggaac cccacaggca caatctacga gaagctctgg 540
gctgaccgca aatggctcgt gggtccacct cttagcttcg cgcatggcgt cagtctacac 600
gtgctcggaa tggtcacaaa tggtgtcttc gaccgtcatc ccaagctgca gattattatg 660
ggccatttgg gtgaacatgt tccgtttgat atgtggcgga ttaaccactg gttcgaggat 720
cggaagaagc tgctgggtct tgcggagacg tgtaagaaga cgattcggga ttattttgcg 780
gagaatattt ggattactac ttctgggcac ttttcgacga cgacgctgaa cttctgtatg 840
gcagaggttg ggtcggatcg gattttgttc tcgattgatt atccgtttga gactttctcg 900
gatgcttgtg agtggttcga taatgcggag cttaatggga cggatcggtt gaagattgga 960
agggaaaatg cgaagaagtt gtttaagctt gattcttaca aggatagttc agcttag 1017
<210> 2
<211> 1011
<212> DNA
<213> （基因2,3-dhbd-fo）
<400> 2
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atcacagagc agcgcatcaa gtacatgaac gagcatggtg ttggctacac aattctttca 180
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gaggttaacg actatatcgc cgatgctatc aaggctcacc ctgatcgtct cggtgctttt 300
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gccaagcgca gctggctcat tggtcctcct ctgagcttcg cccaaggcgt cagtcttcac 600
gcactgggta tggttaccaa cggtgtcttt gacagacatc ccaagctcca gattgttctt 660
ggccatctcg gcgaacatat tcctttcgat atgtggcgaa tcaaccattg gttcgaggat 720
atcaagaagc ctcttggtct gtcttgcaag ctgaccatcc gagagtactt tgcccgaaac 780
ctgtggatta caaccagtgg acacttctct acctcgacac tacagttctg cctgggagag 840
gttggagccg atcgcattct gttctctatc gattatcctt tcgagaactt ttcagatgct 900
tgcacgtggt atgacggtct ggctattaat gatgttgata agagaaagat tggaaaggat 960
aacgctaaga agctgtttaa gcttcctcag ttctaccaga gcgaggatta a 1011
<210> 3
<211> 1053
<212> DNA
<213> （基因sad_tm）
<400> 3
atgcgcggaa aggtttctct cgaggaggcg ttcgagcttc ccaagttcgc tgcccagacc 60
aaggagaagg ccgagctcta catcgccccc aacaaccgcg accggtactt tgaggagatt 120
ctcaacccgt gcggcaaccg tctcgagctt tcgaacaagc acggtatcgg ctacaccatc 180
tactctatct actcgcctgg tccgcaggga tggaccgagc gcgccgagtg tgaggagtac 240
gcgcgcgagt gcaacgacta catctcgggc gagattgcca atcacaagga ccggatgggt 300
gcctttgccg ctctgtcgat gcacgacccc aagcaggcgt ccgaggagct tacccgctgc 360
gttaaagagc tcggtttcct cggcgcgctc gtcaacgacg tgcagcacgc cggacccgaa 420
ggcgagaccc acatcttcta cgaccagccc gagtgggaca tcttctggca gacttgcgtc 480
gatctcgacg ttccattcta cctccacccc gagcctccct tcggctcgta cctccgcaac 540
cagtacgagg gacgcaagta ccttattggt cctcccgtgt cttttgccaa cggcgtctcg 600
ctccacgtcc tcggcatgat cgtcaacggt gtctttgacc gcttccccaa gctcaaggtc 660
atcctcggcc accttggcga gcacattccc ggagacttct ggcgcatcga gcactggttc 720
gagcactgct cccgccctct cgccaagtcg cgcggagacg tcttcgctga gaagcccctc 780
ctccactact tccgcaacaa catctggctc accacctcgg gcaacttctc caccgagact 840
ctcaagttct gcgtcgagca cgtcggcgcc gagcgcatcc tcttctccgt cgactcgcct 900
tacgagcaca tcgacgtcgg atgcggatgg tacgacgaca acgccaaggc tatcatggag 960
gccgttggcg gtgagaaggc ctacaaggac attggccgtg acaacgccaa gaagctcttc 1020
aagctcggca agttctacga ctcggaggct tag 1053
<210> 4
<211> 338
<212> PRT
<213> （酶2,3-DHBD-Ao）
<400> 4
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Glu Glu Lys Thr Arg Trp Trp Ala Ser Leu Phe Ser Thr Asp Ala Glu
20 25 30
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50 55 60
Gly Val Gln Asp Ile Trp Asp Pro Val Glu Ala Gln Ala Leu Ala Val
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Glu Ile Asn Asp Tyr Ile Ala Glu Gln Val Arg Val Asn Pro Asp Arg
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Glu His Val Pro Phe Asp Met Trp Arg Ile Asn His Trp Phe Glu Asp
225 230 235 240
Arg Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Cys Lys Lys Thr Ile Arg
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Lys Lys Leu Phe Lys Leu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser
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Ser Ala
<210> 5
<211> 338
<212> PRT
<213> （突变体2,3-DHBD-Ao-62V）
<400> 5
Met Leu Gly Lys Ile Ala Leu Glu Glu Ala Phe Ala Leu Pro Arg Phe
1 5 10 15
Glu Glu Lys Thr Arg Trp Trp Ala Ser Leu Phe Ser Thr Asp Ala Glu
20 25 30
Thr His Val Lys Glu Ile Thr Asp Ile Asn Lys Ile Arg Ile Glu His
35 40 45
Ala Asp Lys His Gly Val Gly Tyr Gln Ile Leu Ser Tyr Val Ala Pro
50 55 60
Gly Val Gln Asp Ile Trp Asp Pro Val Glu Ala Gln Ala Leu Ala Val
65 70 75 80
Glu Ile Asn Asp Tyr Ile Ala Glu Gln Val Arg Val Asn Pro Asp Arg
85 90 95
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100 105 110
Asp Glu Leu Arg Arg Cys Val Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Leu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Asp Val Pro Phe Tyr Met His Pro Arg Asn Pro Thr Gly Thr Ile Tyr
165 170 175
Glu Lys Leu Trp Ala Asp Arg Lys Trp Leu Val Gly Pro Pro Leu Ser
180 185 190
Phe Ala His Gly Val Ser Leu His Val Leu Gly Met Val Thr Asn Gly
195 200 205
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210 215 220
Glu His Val Pro Phe Asp Met Trp Arg Ile Asn His Trp Phe Glu Asp
225 230 235 240
Arg Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Cys Lys Lys Thr Ile Arg
245 250 255
Asp Tyr Phe Ala Glu Asn Ile Trp Ile Thr Thr Ser Gly His Phe Ser
260 265 270
Thr Thr Thr Leu Asn Phe Cys Met Ala Glu Val Gly Ser Asp Arg Ile
275 280 285
Leu Phe Ser Ile Asp Tyr Pro Phe Glu Thr Phe Ser Asp Ala Cys Glu
290 295 300
Trp Phe Asp Asn Ala Glu Leu Asn Gly Thr Asp Arg Leu Lys Ile Gly
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Lys Lys Leu Phe Lys Leu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser
325 330 335
Ser Ala
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<211> 338
<212> PRT
<213> （突变体2,3-DHBD-Ao-62A）
<400> 6
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1 5 10 15
Glu Glu Lys Thr Arg Trp Trp Ala Ser Leu Phe Ser Thr Asp Ala Glu
20 25 30
Thr His Val Lys Glu Ile Thr Asp Ile Asn Lys Ile Arg Ile Glu His
35 40 45
Ala Asp Lys His Gly Val Gly Tyr Gln Ile Leu Ser Tyr Ala Ala Pro
50 55 60
Gly Val Gln Asp Ile Trp Asp Pro Val Glu Ala Gln Ala Leu Ala Val
65 70 75 80
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100 105 110
Asp Glu Leu Arg Arg Cys Val Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Leu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Arg Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Cys Lys Lys Thr Ile Arg
245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Lys Lys Leu Phe Lys Leu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser
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Ser Ala
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<211> 338
<212> PRT
<213> （突变体2,3-DHBD-Ao-62G）
<400> 7
Met Leu Gly Lys Ile Ala Leu Glu Glu Ala Phe Ala Leu Pro Arg Phe
1 5 10 15
Glu Glu Lys Thr Arg Trp Trp Ala Ser Leu Phe Ser Thr Asp Ala Glu
20 25 30
Thr His Val Lys Glu Ile Thr Asp Ile Asn Lys Ile Arg Ile Glu His
35 40 45
Ala Asp Lys His Gly Val Gly Tyr Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Pro
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Gly Val Gln Asp Ile Trp Asp Pro Val Glu Ala Gln Ala Leu Ala Val
65 70 75 80
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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Arg Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Cys Lys Lys Thr Ile Arg
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<210> 8
<211> 338
<212> PRT
<213> （突变体2,3-DHBD-Ao-27G）
<400> 8
Met Leu Gly Lys Ile Ala Leu Glu Glu Ala Phe Ala Leu Pro Arg Phe
1 5 10 15
Glu Glu Lys Thr Arg Trp Trp Ala Ser Leu Gly Ser Thr Asp Ala Glu
20 25 30
Thr His Val Lys Glu Ile Thr Asp Ile Asn Lys Ile Arg Ile Glu His
35 40 45
Ala Asp Lys His Gly Val Gly Tyr Gln Ile Leu Ser Tyr Thr Ala Pro
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Gly Val Gln Asp Ile Trp Asp Pro Val Glu Ala Gln Ala Leu Ala Val
65 70 75 80
Glu Ile Asn Asp Tyr Ile Ala Glu Gln Val Arg Val Asn Pro Asp Arg
85 90 95
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100 105 110
Asp Glu Leu Arg Arg Cys Val Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Leu
115 120 125
Val Asn Asp Thr Gln Arg Ala Gly Pro Asp Gly Asp Asp Met Ile Phe
130 135 140
Tyr Asp Asn Ala Asp Trp Asp Ile Phe Trp Gln Thr Cys Thr Glu Leu
145 150 155 160
Asp Val Pro Phe Tyr Met His Pro Arg Asn Pro Thr Gly Thr Ile Tyr
165 170 175
Glu Lys Leu Trp Ala Asp Arg Lys Trp Leu Val Gly Pro Pro Leu Ser
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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275 280 285
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<211> 338
<212> PRT
<213> （突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62V）
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1 5 10 15
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20 25 30
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<211> 338
<212> PRT
<213> （突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62A）
<400> 10
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1 5 10 15
Glu Glu Lys Thr Arg Trp Trp Ala Ser Leu Gly Ser Thr Asp Ala Glu
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Thr His Val Lys Glu Ile Thr Asp Ile Asn Lys Ile Arg Ile Glu His
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Ala Asp Lys His Gly Val Gly Tyr Gln Ile Leu Ser Tyr Ala Ala Pro
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Asp Val Pro Phe Tyr Met His Pro Arg Asn Pro Thr Gly Thr Ile Tyr
165 170 175
Glu Lys Leu Trp Ala Asp Arg Lys Trp Leu Val Gly Pro Pro Leu Ser
180 185 190
Phe Ala His Gly Val Ser Leu His Val Leu Gly Met Val Thr Asn Gly
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Arg Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Cys Lys Lys Thr Ile Arg
245 250 255
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<211> 338
<212> PRT
<213> （突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62G）
<400> 11
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130 135 140
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145 150 155 160
Asp Val Pro Phe Tyr Met His Pro Arg Asn Pro Thr Gly Thr Ile Tyr
165 170 175
Glu Lys Leu Trp Ala Asp Arg Lys Trp Leu Val Gly Pro Pro Leu Ser
180 185 190
Phe Ala His Gly Val Ser Leu His Val Leu Gly Met Val Thr Asn Gly
195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
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<211> 1017
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agggaaaatg cgaagaagtt gtttaagctt gattcttaca aggatagttc agcttag 1017
<210> 13
<211> 1017
<212> DNA
<213> （基因2,3-dhbd-ao-62A）
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atgctcggta agatcgctct cgaggaagcc ttcgcgcttc cccgcttcga agaaaagacc 60
cgctggtggg caagtctctt ctccacggac gccgaaaccc acgtcaaaga aatcaccgac 120
atcaacaaga tccgtatcga gcacgcagac aagcacggtg tcggctacca aatcctctca 180
tacgctgcac ccggtgtaca agacatctgg gaccccgtag aagcgcaagc gctcgccgtc 240
gagatcaatg actacatcgc cgaacaggtg cgcgtgaacc ccgaccgatt cggcgctttc 300
gccacactat caatgcacaa ccccaaagaa gcagccgacg aactccgccg ctgcgtcgag 360
aaatacggct ttaaaggcgc cctagtaaac gatacccaac gcgctggccc agacggcgac 420
gacatgatct tctacgacaa cgcagactgg gatatcttct ggcaaacctg cacagagctc 480
gacgtcccct tctacatgca cccccggaac cccacaggca caatctacga gaagctctgg 540
gctgaccgca aatggctcgt gggtccacct cttagcttcg cgcatggcgt cagtctacac 600
gtgctcggaa tggtcacaaa tggtgtcttc gaccgtcatc ccaagctgca gattattatg 660
ggccatttgg gtgaacatgt tccgtttgat atgtggcgga ttaaccactg gttcgaggat 720
cggaagaagc tgctgggtct tgcggagacg tgtaagaaga cgattcggga ttattttgcg 780
gagaatattt ggattactac ttctgggcac ttttcgacga cgacgctgaa cttctgtatg 840
gcagaggttg ggtcggatcg gattttgttc tcgattgatt atccgtttga gactttctcg 900
gatgcttgtg agtggttcga taatgcggag cttaatggga cggatcggtt gaagattgga 960
agggaaaatg cgaagaagtt gtttaagctt gattcttaca aggatagttc agcttag 1017
<210> 14
<211> 1017
<212> DNA
<213> （基因2,3-dhbd-ao-62G）
<400> 14
atgctcggta agatcgctct cgaggaagcc ttcgcgcttc cccgcttcga agaaaagacc 60
cgctggtggg caagtctctt ctccacggac gccgaaaccc acgtcaaaga aatcaccgac 120
atcaacaaga tccgtatcga gcacgcagac aagcacggtg tcggctacca aatcctctca 180
tacggtgcac ccggtgtaca agacatctgg gaccccgtag aagcgcaagc gctcgccgtc 240
gagatcaatg actacatcgc cgaacaggtg cgcgtgaacc ccgaccgatt cggcgctttc 300
gccacactat caatgcacaa ccccaaagaa gcagccgacg aactccgccg ctgcgtcgag 360
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gacatgatct tctacgacaa cgcagactgg gatatcttct ggcaaacctg cacagagctc 480
gacgtcccct tctacatgca cccccggaac cccacaggca caatctacga gaagctctgg 540
gctgaccgca aatggctcgt gggtccacct cttagcttcg cgcatggcgt cagtctacac 600
gtgctcggaa tggtcacaaa tggtgtcttc gaccgtcatc ccaagctgca gattattatg 660
ggccatttgg gtgaacatgt tccgtttgat atgtggcgga ttaaccactg gttcgaggat 720
cggaagaagc tgctgggtct tgcggagacg tgtaagaaga cgattcggga ttattttgcg 780
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gcagaggttg ggtcggatcg gattttgttc tcgattgatt atccgtttga gactttctcg 900
gatgcttgtg agtggttcga taatgcggag cttaatggga cggatcggtt gaagattgga 960
agggaaaatg cgaagaagtt gtttaagctt gattcttaca aggatagttc agcttag 1017
<210> 15
<211> 1017
<212> DNA
<213> （基因2,3-dhbd-ao-27G）
<400> 15
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cgctggtggg caagtctcgg ttccacggac gccgaaaccc acgtcaaaga aatcaccgac 120
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gacatgatct tctacgacaa cgcagactgg gatatcttct ggcaaacctg cacagagctc 480
gacgtcccct tctacatgca cccccggaac cccacaggca caatctacga gaagctctgg 540
gctgaccgca aatggctcgt gggtccacct cttagcttcg cgcatggcgt cagtctacac 600
gtgctcggaa tggtcacaaa tggtgtcttc gaccgtcatc ccaagctgca gattattatg 660
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gagaatattt ggattactac ttctgggcac ttttcgacga cgacgctgaa cttctgtatg 840
gcagaggttg ggtcggatcg gattttgttc tcgattgatt atccgtttga gactttctcg 900
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agggaaaatg cgaagaagtt gtttaagctt gattcttaca aggatagttc agcttag 1017
<210> 16
<211> 1017
<212> DNA
<213> （基因2,3-dhbd-ao-27G+62A）
<400> 16
atgctcggta agatcgctct cgaggaagcc ttcgcgcttc cccgcttcga agaaaagacc 60
cgctggtggg caagtctcgg ttccacggac gccgaaaccc acgtcaaaga aatcaccgac 120
atcaacaaga tccgtatcga gcacgcagac aagcacggtg tcggctacca aatcctctca 180
tacgctgcac ccggtgtaca agacatctgg gaccccgtag aagcgcaagc gctcgccgtc 240
gagatcaatg actacatcgc cgaacaggtg cgcgtgaacc ccgaccgatt cggcgctttc 300
gccacactat caatgcacaa ccccaaagaa gcagccgacg aactccgccg ctgcgtcgag 360
aaatacggct ttaaaggcgc cctagtaaac gatacccaac gcgctggccc agacggcgac 420
gacatgatct tctacgacaa cgcagactgg gatatcttct ggcaaacctg cacagagctc 480
gacgtcccct tctacatgca cccccggaac cccacaggca caatctacga gaagctctgg 540
gctgaccgca aatggctcgt gggtccacct cttagcttcg cgcatggcgt cagtctacac 600
gtgctcggaa tggtcacaaa tggtgtcttc gaccgtcatc ccaagctgca gattattatg 660
ggccatttgg gtgaacatgt tccgtttgat atgtggcgga ttaaccactg gttcgaggat 720
cggaagaagc tgctgggtct tgcggagacg tgtaagaaga cgattcggga ttattttgcg 780
gagaatattt ggattactac ttctgggcac ttttcgacga cgacgctgaa cttctgtatg 840
gcagaggttg ggtcggatcg gattttgttc tcgattgatt atccgtttga gactttctcg 900
gatgcttgtg agtggttcga taatgcggag cttaatggga cggatcggtt gaagattgga 960
agggaaaatg cgaagaagtt gtttaagctt gattcttaca aggatagttc agcttag 1017
<210> 17
<211> 1023
<212> DNA
<213> （密码子优化基因Hyg5）
<400> 17
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gaatacccga ccctcgacca cggctatcca gaactcgaaa tcaacatggt cgccccgacc 180
gcggagccct tcgccgaggt gtgggtgacg gacgccgaat cggagcacgg cgaacgcgac 240
ggaatcacct acgcgcacga cggcgagtat tttttctgcg ccggtcgtgt accacccacc 300
gggcggtaca cggaagccac cagagcggcg tacgtcacca tgttcgagct gctggaggaa 360
ttcggctact ccagtgtgtt ccgcatgtgg aacttcatcg gtgacatcaa tcgcgacaac 420
gcggagggca tggaggtcta ccgcgacttc tgccgcggcc gggccgaggc gttcgagcag 480
tgccggctgg agttcgacca gttcccggcg gccacgggga tcggctcccg gggcggcggc 540
atcgccttct atctgctggc ctgccggtcc ggcgggcatg tgcacatcga gaacccccgg 600
caggtgccgg cctaccacta cccgaagcgg tacggcccgc gcgcgccgcg cttcgcccgc 660
gccacctacc ttccgtccag ggccgcggat ggggtcggcg gccaggtctt cgtgtccggc 720
accgccagcg tgctcggcca tgagacggcc cacgagggcg acctggtcaa gcagtgccga 780
ctggcgctgg agaacatcga actcgtcatc agtggcggga acctggccgc gcacggcata 840
tccgccggcc acgggctgac tgcgctgcgc aatatcaagg tgtacgtccg caggtccgag 900
gatgtgcccg cggtgcgcga gatctgccgg gaggcgttct caccggacgc cgacatcgtg 960
tacctgacgg tggacgtctg ccgctccgat ctgctggtgg agatcgaggg cgtggtcatg 1020
tag 1023
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> （引物BL-A1-F）
<400> 18
ctcatacgtt gcacccggtg tacaagaca 29
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> （引物BL-A1-R）
<400> 19
cgggtgcaac gtatgagagg atttggtagc cga 33
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> （引物BL-A2-F）
<400> 20
tcatacgctg cacccggtgt acaagaca 28
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> （引物BL-A2-R）
<400> 21
cgggtgcagc gtatgagagg atttggtagc cga 33
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> （引物BL-A3-F）
<400> 22
tctcatacgg tgcacccggt gtacaagaca 30
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> （引物BL-A3-R）
<400> 23
gggtgcaccg tatgagagga tttggtagcc ga 32
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> （引物BL-A4-F）
<400> 24
gcaagtctcg gttccacgga cgccgaaacc cacgtca 37
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> （引物BL-A4-F）
<400> 25
cgtggaaccg agacttgccc accagcgg 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> （引物pET-hyg5-BamHI-F）
<400> 26
cgcggatcca tgaacccgtc atcgcttg 28
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> （引物pET-hyg5-HindIII-R）
<400> 27
cgcaagcttc tacatgacca cgccctcg 28
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> （引物pSP -Hyg5-BamHI-F）
<400> 28
caaggatcca tgaacccgtc atcg 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> （引物pSP -Hyg5-HindIII-R）
<400> 29
accaagcttc tacatgacca cgcc 24
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> （引物pSP -2,3-dhbd-A-BamHI-F）
<400> 30
cgcactagta tgctcggtaa gatcgctctc 30
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物pSP -2,3-dhbd-A-SalI-R）
<400> 31
ttgttaatta actaagctga actatccttg taagaatcaa gc 42

Claims (13)

1.一种芳香酸脱羧酶突变体，其由芳香酸脱羧酶突变获得，所述芳香酸脱羧酶为来源于米曲霉的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao，其氨基酸序列如SED NO：4所示；
所述芳香酸脱羧酶突变体为来源于米曲霉的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体；
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶的突变体为：
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第62位氨基酸突变为缬氨酸V，记为突变体2,3-DHBD-Ao-62V，其氨基酸序列如SED NO：5所示；
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第62位氨基酸突变为丙氨酸A，记为突变体2,3-DHBD-Ao-62A，其氨基酸序列如SED NO：6所示；
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第62位氨基酸突变为甘氨酸G，记为突变体2,3-DHBD-Ao-62G，其氨基酸序列如SED NO：7所示；
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸，记为突变体2,3-DHBD-Ao-27G，其氨基酸序列如SED NO：8所示；
2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸，第62位氨基酸突变为丙氨酸A，记为突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62A，其氨基酸序列如SED NO：10所示。
2.一种产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌，其为含有编码芳香酸脱羧酶的基因或编码芳香酸脱羧酶的基因突变子的重组宿主菌；
所述编码芳香酸脱羧酶的基因包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因2,3-dhbd-ao、来源于尖孢镰刀菌的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因2,3-dhbd-fo、编码水杨酸脱羧酶SAD_Tm的基因sad-tm；
所述基因2,3-dhbd-ao的核苷酸序列如SED NO：1所示；
所述基因2,3-dhbd-fo的核苷酸序列如SED NO：2所示；
所述基因sad-tm的核苷酸序列如SED NO：3所示；
所述编码芳香酸脱羧酶的基因突变子为来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因突变子；
编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因突变子为：
编码其氨基酸序列的第62位氨基酸突变为缬氨酸V的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-62V的基因突变子2,3-dhbd-ao-62V，其核苷酸序列如SEDNO：12所示；
编码其第62位氨基酸突变为丙氨酸A的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-62A的基因突变子2,3-dhbd-ao-62A，其核苷酸序列如SED NO：13所示；
编码其氨基酸序列的第62位氨基酸突变为甘氨酸G的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-62G的基因突变子2,3-dhbd-ao-62G，其核苷酸序列如SEDNO：14所示；
编码其氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸G的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-27G的基因突变子2,3-dhbd-ao-27G，其核苷酸序列如SEDNO：15所示；
编码其氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸G，第62位氨基酸突变为丙氨酸A的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62A的基因突变子2,3-dhbd-ao-27G+62A，其核苷酸序列如SED NO：16所示；
所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
3.一种羟基对苯甲酸类化合物的生物合成方法，其包括：在脱羧酶的作用下对羧化底物的羟基邻位进行羧化，合成羟基对苯甲酸类化合物；其中，所述羧化底物包括3-羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸酯、2,5-二羟基苯甲酸酯、3,5-二羟基苯甲酸酯；所述羟基对苯甲酸类化合物包括2-羟基对苯二甲酸、多羟基对苯二甲酸、多羟基对苯二甲酸酯；所述脱羧酶为芳香酸脱羧酶或如权利要求1所述的芳香酸脱羧酶突变体；
所述芳香酸脱羧酶包括来源于米曲霉的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao、来源于尖孢镰刀菌的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo和水杨酸脱羧酶SAD_Tm中的一种或几种；
所述2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列如SED NO：4所示；
编码所述2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因2,3-dhbd-fo的核苷酸序列如SED NO：2所示；
编码所述水杨酸脱羧酶SAD_Tm的基因sad-tm的核苷酸序列如SED NO：3所示。
4.一种2-羟基对苯二甲酸的生物合成方法，其包括：合成2-羟基对苯二甲酸的步骤，采用芳香酸脱羧酶或如权利要求1所述的芳香酸脱羧酶突变体作为生物催化剂对3-羟基苯甲酸进行生物催化反应，对3-羟基苯甲酸的羟基邻位进行羧化，合成2-羟基对苯二甲酸；
所述芳香酸脱羧酶包括来源于米曲霉的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao、来源于尖孢镰刀菌的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo和水杨酸脱羧酶SAD_Tm；
所述2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的氨基酸序列如SED NO：4所示；
编码所述2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因2,3-dhbd-fo的核苷酸序列如SED NO：2所示；
编码所述水杨酸脱羧酶SAD_Tm的基因sad-tm的核苷酸序列如SED NO：3所示。
5.根据权利要求4所述的生物合成方法，其特征在于，
所述生物催化反应包括体外反应、体内反应；
所述体外反应以纯酶、粗酶、细胞提取物、全细胞的方式起着催化作用；
或者，所述体内反应以外源酶形式在基因工程菌活体中表达并起催化作用。
6.根据权利要求5所述的生物合成方法，其特征在于，在合成2-羟基对苯二甲酸的步骤中，加入3-羟基苯甲酸，并加入如权利要求2所述的产芳香酸脱羧酶或其突变体的基因工程菌，进行反应，获得2-羟基对苯二甲酸。
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的生物合成方法，其特征在于，所述3-羟基苯甲酸的制备方法包括生物法合成3-羟基苯甲酸，其包括以五碳糖和/或六碳糖为碳源，在3-羟基苯甲酸合酶的催化作用下生成3-羟基苯甲酸。
8.根据权利要求7所述的生物合成方法，其特征在于，生物法合成3-羟基苯甲酸包括以五碳糖和/或六碳糖为碳源，加入产3-羟基苯甲酸合酶的基因工程菌，进行发酵培养，获得3-羟基苯甲酸发酵产物。
9.一种产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌，其为含有编码3-羟基苯甲酸合酶的基因，以及编码芳香酸脱羧酶的基因或编码芳香酸脱羧酶的基因突变子的重组宿主菌；
所述编码3-羟基苯甲酸合酶的基因为来源于吸水链霉菌的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因hyg5或来源于吸水链霉菌且经过密码子优化的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因Hyg5；其中，来源于吸水链霉菌的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因hyg5的GenBank为AF007101.1；或，来源于吸水链霉菌且经过密码子优化的编码3-羟基苯甲酸合酶的基因Hyg5的核苷酸序列如SED NO：17所示；
所述编码芳香酸脱羧酶的基因包括来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因2,3-dhbd-ao、来源于尖孢镰刀菌的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Fo的基因2,3-dhbd-fo、编码水杨酸脱羧酶SAD_Tm的基因sad-tm；
所述基因2,3-dhbd-ao的核苷酸序列如SED NO：1所示；
所述基因2,3-dhbd-fo的核苷酸序列如SED NO：2所示；
所述基因sad-tm的核苷酸序列如SED NO：3所示；
所述编码芳香酸脱羧酶的基因突变子为来源于米曲霉的编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因突变子；
所述编码2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的基因突变子为：
编码其氨基酸序列的第62位氨基酸突变为缬氨酸V的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-62V的基因突变子2,3-dhbd-ao-62V，其核苷酸序列如SEDNO：12所示；
编码其第62位氨基酸突变为丙氨酸A的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-62A的基因突变子2,3-dhbd-ao-62A，其核苷酸序列如SED NO：13所示；
编码其氨基酸序列的第62位氨基酸突变为甘氨酸G的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-62G的基因突变子2,3-dhbd-ao-62G，其核苷酸序列如SEDNO：14所示；
编码其氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸G的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-27G的基因突变子2,3-dhbd-ao-27G，其核苷酸序列如SEDNO：15所示；
编码其氨基酸序列的第27位氨基酸突变为甘氨酸G，第62位氨基酸突变为丙氨酸A的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-DHBD_Ao的突变体2,3-DHBD-Ao-27G+62A的基因突变子2,3-dhbd-ao-27G+62A，其核苷酸序列如SED NO：16所示；
所述宿主菌为酿酒酵母。
10.如权利要求9所述的产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌在合成2-羟基对苯二甲酸中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用包括将产2-羟基对苯二甲酸的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得2-羟基对苯二甲酸。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，发酵过程中添加CO2源，其中所述CO2源包括CO2和/或碳酸氢盐。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，通入CO2形成CO2饱和溶液；和/或，碳酸氢盐的加入量为0.01-3M。
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