CN115043851B - 一种噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种噻吩[2,3‑d]嘧啶类杂环化合物及其制备方法和应用，噻吩[2,3‑d]嘧啶类杂环化合物如式(Ⅰ)所示，

；或其药学上接受的盐、水合物、溶剂合物、前药。本发明为伤口修复、维持血管完整性和稳定动脉粥样硬化斑块等提供了一种新的治疗手段。

Description

一种噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物及其制备方法和应用。

背景技术

C-C趋化因子受体5(CCR5)是一种来自G蛋白偶联受体(GPCR)家族的细胞膜蛋白，是白细胞活化和动员的重要调节剂，也是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)入侵机体细胞的主要辅助受体之一。目前，大部分国内外研究集中于抑制CCR5表达所带来的影响，而缺少对于促进CCR5表达方面的报道，更是没有一种公认的CCR5激动类药物。近年来，随着研究深入发现，CCR5作为辅助受体不仅参与了HIV的感染过程，还与伤口修复、肿瘤血管新生和稳定动脉粥样硬化斑块等密切相关。

CCR5不仅表达于单核/巨噬细胞，在内皮/内皮祖细胞中也有表达。内皮祖细胞作为一种来源于骨髓的前体细胞，可以分化为内皮细胞，在组织修复过程中的新生血管形成中发挥重要作用(Zhang z, et al. Stem Cell Res Ther, 2015, 6: 36)。在小鼠皮肤损伤模型中，CCR5基因的缺失减少了血管内皮祖细胞的积累和新生血管的形成，并最终延缓了受损皮肤的愈合。当携带CCR5基因的内皮祖细胞被转移到CCR5小鼠体内时，内皮祖细胞在损伤部位聚集并恢复正常的新生血管(Ishida Y, et al. J Clin Invest, 2012, 122:711)。CCL5含有NF-kB结合基序，在受到炎症刺激时上调，其表达增加通过与其受体CCR5结合，介导骨髓来源的内皮祖细胞动员和募集到受损的内皮细胞中。此外，CCL5可以直接刺激损伤细胞，增加一氧化氮的产生，促进内皮细胞向损伤部位迁移和增殖(Zhang z, et al.Front Pharmacol, 2020, 11: 146)。前期研究显示：在高胆固醇血症ApoE小鼠模型中，CCR5的过度表达有助于内皮祖细胞归巢至受损的内皮细胞，促进内皮修复，改善内皮功能障碍，最终稳定动脉粥样硬化斑块(Zhang z, et al. Stem Cell Res Ther, 2015, 6:36)。以上结果表明：CCR5在伤口修复、维持血管完整性和稳定动脉粥样硬化斑块中发挥着重要作用。

最近研究还发现CCL5通过增加内皮细胞的迁移、扩散、新生血管的形成和血管内皮生长因子(VEGF)的分泌来支持促血管生成活性。肿瘤细胞在CCL5刺激下产生VEGF。通过分泌CCL5，肿瘤细胞招募CCR5+的单核/巨噬细胞，通过分泌VEGF诱导血管生成。因此，对抗肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的招募，现在被认为是调节肿瘤血管生成的主要参与者，可能是一种有效的治疗策略，CCL5还可以促进淋巴管生成。综上所述，CCR5与肿瘤血管新生也有着密切联系。

发明内容

针对现阶段缺乏促进CCR5表达方面的研究的技术问题，本发明提供一种噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物及其制备方法和应用，该化合物能够有效促进CCR5表达，对于促进祖细胞募集和内皮修复，稳定动脉粥样硬化斑块和促肿瘤血管生成具有积极效果。

第一方面，本发明提供一种噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物，如式Ⅰ所示，

；

或其药学上接受的盐、水合物、溶剂合物、前药。

第二方面，本发明提供一种上述噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物的制备方法，合成路线如下：

；

具体包括如下步骤：

用溶剂溶解式(Ⅱ)化合物，随后加入催化剂及式(Ⅲ)化合物，室温搅拌过夜；反应结束后，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取；合并有机相，浓缩，硅胶色谱分离纯化得到式(Ⅰ)化合物。

进一步的，反应温度为80~140℃，反应时间为1~12小时。

进一步的，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜、1,4-二氧六环、四氢呋喃、甲醇、乙醇、吡啶、水中的至少一种。

进一步的，所述催化剂为碳酸钾、碳酸钠、碳酸锂，氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、三乙胺、二异丙基乙胺、二异丙胺、四丁基溴化铵、四丁基氟化铵中的至少一种。

第三方面，本发明提供一种上述噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物在制备促进祖细胞募集和内皮修复药物上的应用。

第四方面，本发明提供一种上述噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物上的应用。

第五方面，本发明提供一种上述噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物在制备促肿瘤血管生成药物上的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明发现式(Ⅰ)化合物能够有效促进CCR5表达，CCR5过表达对于促进祖细胞募集和内皮修复，稳定动脉粥样硬化斑块和促肿瘤血管生成具有积极效果，因此本发明提供的式(Ⅰ)化合物为伤口修复、维持血管完整性和稳定动脉粥样硬化斑块等提供了一种新的治疗手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例2的Western Blot检测结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

按照如下合成路线制备噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物。

；

具体包括如下步骤：

用2mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解0.5mmol的式(Ⅱ)化合物，随后加入1mmol的无水碳酸钾及1mmol的式(Ⅲ)化合物，室温搅拌过夜；反应结束后，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取；合并有机相，浓缩，硅胶色谱分离纯化得到白色固体，即为式(Ⅰ)化合物，计算产率为64.5%。

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 8.03 (s, 1H), 7.49 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.44(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 18.5 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 3.0 Hz, 1H),6.75 (dd, J = 8.8, 3.0 Hz, 2H), 5.24 (s, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.75 (s, 4H),3.18 (s, 2H), 2.93 (s, 2H)。

ESI-MS m/z: 504 [M+H]⁺。

实施例2

采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western Blot)检测CCR5的表达，具体方法如下：

一、配置式(Ⅰ)化合物母液

称取1mg实施例1制备的式(Ⅰ)化合物粉末，加入165.2μL的DMSO配成10mM浓度的式(Ⅰ)化合物母液，保存于-20℃环境中。

二、细胞培养

将稳定表达CCR5的HEK293细胞接种于两个中皿中，培养过夜，吸去种有细胞的孔内的培养基，分别加入2mL现配培养基(2%血清+98%DMEM)，其中一个中皿加入4μL式(Ⅰ)化合物工作液，式(Ⅰ)化合物工作液由式(Ⅰ)化合物母液得到，浓度为20μM，记为20μM 24h组；另一个中皿不加任何刺激，其浓度为0μM，培养24小时，记为0μM 24h组。

三、实时荧光定量PCR

1、RNA抽提：

将细胞用PBS洗一遍，加入1mL Trizol，冰上孵育5分钟，加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖，涡旋混匀管体15秒，冰上孵育3分钟；4℃下12000g离心15分钟。离心后混合液体分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。用200μL移液枪将水相上层转移到无RNA酶的离心管中，大约400μL；加400μL异丙醇以沉淀RNA，混匀后冰上孵育10分钟；4℃下12000g离心10分钟；移去上清液，用1mL的75%乙醇清洗RNA沉淀。涡旋混匀后，4℃下12000g离心5分钟，此过程重复3次；小心吸去大部分乙醇溶液，倒扣在干净的滤纸上，使RNA沉淀在空气中干燥10分钟；加入无RNA酶的水20μL用枪反复吹打几次，使RNA沉淀完全溶解；用无水乙醇擦洗酶标仪，加1μL DEPC水调零，加1μL待测RNA样本，记录A260/A280、A260/A230及浓度。

2、反转录反应

将反转录试剂加入200μL EP管中反应，反应条件为37℃，15分钟；85℃，5秒。待降温至4℃时取出，于-20℃保存。

反转录试剂共20μL，包含：4μL 5X Evo M-MLV RT Master Mix，1000ng待测RNA样本和RNase free water。

3、QPCR反应

将QPCR试剂加入8联排中反应，反应条件为95℃，30秒，1循环；95℃，5秒，60℃，30秒，40循环；65℃，5秒，95℃，1分钟。

QPCR试剂共20μL，包含：10μL 2X SYBR® Green Pro Taq HS Premix，2μL cDNA，0.4μL引物F，0.4μL引物R和RNase free water。

4、计算基因表达量

△CT=CT(目的基因)-CT(β-actin)，△△CT=△CT(实验组)-△CT均值(对照组)，实验组相对于对照组基因表达量为2^-△△CT。

5、检测结果

两种细胞的实时荧光定量PCR结果如表1所示，与不加任何刺激培养的细胞(0μM24h组)相比，20μM 24h组的CCR5基因的mRNA表达水平显著上调(*p<0.05)，说明式(Ⅰ)化合物能够促进CCR5的表达。

表1 CCR5基因mRNA的表达水平

项目	0μM 24h组	20μM 24h组
			2<sup>-△△CT</sup>	1	9.096±2.034*

四、Western Blot

用预冷的PBS清洗细胞三次，按比例加入RIRA、PMSF、蛋白酶抑制剂A和蛋白酶抑制剂B配置裂解液，加入裂解液并对细胞进行超声处理，使其充分裂解，蛋白质浓度测定选用塞维尔BCA蛋白浓度测定试剂盒。然后将样品置于10% sds-page凝胶上，转移到PVDF膜上，用5% BSA封闭90min。一抗选用CCR5(1：500)，4℃条件下孵育过夜。次日，每隔5分钟用TBST清洗膜3次，并与过氧化物酶结合的二级抗体(1：10000)孵育1小时，将ECL检测试剂均匀滴在膜上，用图像实验室软件对膜上的条带进行定量分析。每种蛋白质的最终报告值被归一化为tubulin。

两种细胞的检测结果图1、表2所示，与不加任何刺激培养的细胞(0μM 24h组)相比，20μM 24h组的CCR5的蛋白表达水平显著上调(*p<0.05)，说明式(Ⅰ)化合物能够促进CCR5的蛋白表达水平。

表2 CCR5蛋白表达水平

项目	0μM 24h组	20μM 24h组
			CCR5	0.7071±0.02961	0.8400±0.03397*

综上所述，本发明提供的化合物能够促进CCR5的表达，可作为CCR5激动类药物使用；更进一步的，可用于制备以CCR5过表达手段促进祖细胞募集和内皮修复，稳定动脉粥样硬化斑块和促肿瘤血管生成的新治疗药物。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物，其特征在于，如式(Ⅰ)所示，

或其药学上接受的盐。

2.一种如权利要求1所述的噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物的制备方法，其特征在于，合成路线如下：

具体包括如下步骤：

用溶剂溶解式(Ⅱ)化合物，随后加入碳酸钾及式(Ⅲ)化合物反应；反应结束后，过滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取；合并有机相，浓缩，硅胶色谱分离纯化得到式(Ⅰ)化合物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应温度为80～140℃，反应时间为1～12小时。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜、1,4-二氧六环、四氢呋喃、甲醇、乙醇、吡啶、水中的至少一种。

5.一种如权利要求1所述的噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物在制备促进祖细胞募集和内皮修复药物上的应用。

6.一种如权利要求1所述的噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物上的应用。

7.一种如权利要求1所述的噻吩[2,3-d]嘧啶类杂环化合物在制备促肿瘤血管生成药物上的应用。

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