CN115040664B - 一种激活型近红外二区荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种激活型近红外二区荧光探针及其制备方法和应用，将近红外二区具有荧光功能的稀土下转换纳米颗粒DCNPs与在近红外二区附近具有较强吸收的缺氧氧化钼MoO3‑x通过氨基‑羧基缩合反应的共价方式自组装在一起，再在其表面修饰靶向试剂HA，最终制得可用于近红外二区荧光肿瘤微环境激活的水溶性纳米探针。该探针解决了纳米材料在肿瘤部位富集差、不能特异性响应肿瘤微环境的问题，实现了肿瘤靶向的近红外二区荧光成像。
Description
技术领域
本发明属于生物医学纳米材料技术领域，具体涉及一种激活型近红外二区荧光探针及其制备方法和应用；更具体地，涉及一种DCNP-MoO3-x肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针的制备以及其在肿瘤靶向的近红外二区荧光成像等领域的应用。
背景技术
众所周知，荧光成像具有高灵敏度、无创可视化和实时监测的特点，尤其是位于近红外二区(NIR-II，1000-1700nm)的荧光成像具有更深的组织穿透、更高的分辨率和更少的背景干扰特点，因而得到了迅速发展。目前，基于NIR-II区的各种荧光探针被成功构建，然而，它们中的大多数都是“常亮式(always on)”探针，无论它们是否到达目标位置，都会持续产生荧光信号，缺乏了疾病的特异性激活性能，从而阻碍了对肿瘤地精准诊断。另外，大部分的荧光探针由于缺乏肿瘤靶向基团，存在肿瘤部位低富集效率的问题。因此，构建具有肿瘤靶向、肿瘤微环境(TME)特异性激活、生物相容性好且制备简单的近红外二区荧光探针成为目前研究热点。
发明内容
本发明的目的是针对以上不足，提供一种激活型近红外二区荧光探针及其制备方法和应用，该探针为水溶性探针，可用于近红外二区荧光肿瘤微环境激活，解决了纳米材料在肿瘤部位富集差、不能特异性响应肿瘤微环境的问题，实现了肿瘤靶向的近红外二区荧光成像。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种激活型近红外二区荧光探针，该荧光探针为DCNP-MoO3-x，是由带羧基的稀土下转换纳米颗粒DCNPs-COOH与带氨基的缺氧氧化钼纳米颗粒MoO3-x-NH2 NPs耦合而成。该探针能够在肿瘤微环境激活，特异性响应肿瘤微环境。
本发明还提供了上述的激活型近红外二区荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
合成稀土下转换纳米颗粒DCNPs和带氨基的缺氧氧化钼纳米颗粒MoO3-x-NH2 NPs；
通过DSPE-PEG-COOH修饰DCNPs，得到DCNPs-COOH；
将DCNPs-COOH与MoO3-x-NH2 NPs通过氨基-羧基缩合反应形成共价键的方式进行耦合，制得DCNP-MoO3-x。
本发明还提供了上述的激活型近红外二区荧光探针在特异性激活的近红外二区荧光成像试剂中的应用。
本发明还提供了一种激活型近红外二区荧光探针，该荧光探针为DCNP-MoO3-x@HA，是在上述DCNP-MoO3-x探针表面修饰HA(透明质酸钠)制得。该探针能够在肿瘤微环境激活，特异性响应肿瘤微环境，而且具有肿瘤靶向功能。
本发明还提供了上述的激活型近红外二区荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
合成稀土下转换纳米颗粒DCNPs和带氨基的缺氧氧化钼纳米颗粒MoO3-x-NH2 NPs；
通过DSPE-PEG-COOH修饰DCNPs，得到DCNPs-COOH；
将DCNPs-COOH与MoO3-x-NH2 NPs通过氨基-羧基缩合反应形成共价键的方式进行耦合，得到DCNP-MoO3-x；
在DCNP-MoO3-x表面修饰HA，制得DCNP-MoO3-x@HA。
优选的，具体包括以下步骤：
将稀土氯化物使用氯化物溶剂热法合成DCNPs，清洗后，将其分散于环己烷溶液中，制得含有DCNPs的氯仿溶液；
将含有DCNPs的氯仿溶液逐滴加入到DSPE-PEG-COOH的水溶液中，并在超声下10min，随后，在60℃下搅拌1h，水洗并超滤洗涤，得到含有DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液；
通过溶剂热法在水热反应釜中合成MoO3-x纳米颗粒，依次使用聚乙烯醇、甘氨酸来修饰MoO3-x纳米颗粒，水洗后，得到含有MoO3-x-NH2纳米颗粒的水溶液；
在DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温避光搅拌2～4h进行活化，将活化后的DCNPs-COOH溶液加入到MoO3-x-NH2溶液中，避光搅拌过夜，水洗除去未反应的MoO3-x-NH2，收集得到含有DCNP-MoO3-x纳米颗粒的水溶液；
在DCNP-MoO3-x纳米颗粒的水溶液中加入HA的水溶液，室温搅拌2～4h，水洗后得到DCNP-MoO3-x@HA自组装纳米颗粒。
优选的，上述方法中，所述DCNPs与DSPE-PEG-COOH的质量比为1:3～1:4。
优选的，上述方法中，所述DSPE-PEG-COOH的可用的分子量为2000～5000。
优选的，上述方法中，，所述MoO3-x-NH2 NPs与DCNPs-COOH的质量比为1:3～1:5，DCNPs-COOH与EDC的质量比为1:3～1:5；加入的DMAP与EDC的摩尔比为1:1～1:2。
优选的，上述方法中，超滤洗涤时截留分子量为10KDa，转速为5000～6000rpm。
优选的，上述方法中，所述DCNP-MoO3-x与HA的质量比为1:2～1:4。
本发明还提供了上述的激活型近红外二区荧光探针在制备肿瘤靶向的近红外二区荧光成像试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明将近红外二区具有荧光功能的稀土下转换纳米颗粒DCNPs与在近红外二区附近具有较强吸收的缺氧氧化钼MoO3-x通过氨基-羧基缩合反应的共价方式自组装在一起，制得能够特异性激活的可用于近红外二区荧光纳米探针；
本发明在能够特异性激活的DCNP-MoO3-x探针表面修饰靶向试剂HA，最终制得可用于近红外二区荧光肿瘤微环境激活的水溶性纳米探针，该探针解决了纳米材料在肿瘤部位富集差、不能特异性响应肿瘤微环境的问题，实现了肿瘤靶向的近红外二区荧光成像。
附图说明
图1为实施例1所述的MoO3-xNPs的吸收光谱图和DCNPs的荧光光谱图；
图2为实施例1所述的DCNP-MoO3-x纳米颗粒在加入不同浓度H2O2后，240min时的近红外二区荧光恢复曲线图；
图3为实施例1所述的DCNP-MoO3-x纳米颗粒在加入200μM H2O2前后的吸收光谱图；
图4为实施例1所述的DCNP-MoO3-x纳米颗粒在加入H2O2后，DCNPs荧光恢复的近红外二区荧光成像及其强度-浓度关系图；
图5为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针的制备示意图；
图6为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒的动态光散射图；
图7为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒的透射电子显微镜图；
图8为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒的能量色散X射线图；
图9为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒及其中间产物的紫外-可见光谱吸收图；
图10为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒及其中间产物的傅立叶变换红外吸收图；
图11为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒在加入H2O2后，不同时间节点的近红外二区荧光恢复曲线图；
图12为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒在加入H2O2后，对应于图11中1067nm处的荧光信号线性图；
图13为实施例2所述的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒在加入H2O2后，DCNPs荧光恢复的近红外二区荧光成像及其强度-浓度关系图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施例更详细地描述本发明的优选实施方式。
实施例1
1.本实施例提供一种DCNP-MoO3-x激活型近红外二区荧光探针，其制备方法包括：
A、DCNPs稀土下转换纳米颗粒的合成：
A1、将六水氯化钇(0.143g，0.47mmol)、六水氯化钆(0.149g，0.40mmol)、六水氯化钕(0.01g，0.03mmol)、油酸钙(0.06g，0.1mmol)分散在6mL油酸(OA)和15mL的1-十八烯(ODE)的溶剂中，并搅拌加热至150℃，反应0.5h，形成淡黄色的OA配体形式的金属盐。将混合溶液冷却至50℃，缓慢滴加含有氟化铵(0.1482g，4mmol)和氢氧化钠(0.1g，2.5mmol)的甲醇溶液10mL，将上述混合溶液加热至120℃，反应0.5h后，进行抽真空和通N2三次，最后在N2气氛中290℃下搅拌反应1.5h。所得产物用乙醇和环己烷溶剂清洗三次，得到稀土纳米颗粒，分散于5mL环己烷溶液中(20mg/mL，6mL)。
A2、将六水氯化钆(0.186g，0.5mmol)分散在6mL油酸(OA)和15mL的1-十八烯(ODE)的溶剂中，并加热至150℃，反应0.5h，形成OA配体形式的金属盐。将混合溶液冷却至50℃，随后缓慢滴加含有上述A1稀土下转换纳米颗粒的环己烷溶液3mL和含有氟化铵(0.1482g，4mmol)和氢氧化钠(0.1g，2.5mmol)的甲醇溶液10mL。接着将上述混合溶液加热至120℃，反应0.5h，进行抽真空和通N2三次，最后在在N2气氛中280℃下搅拌反应1.5h。所得产物用乙醇和氯仿溶剂清洗三次，将其分散于5mL氯仿溶液中，最终得到含有DCNPs的氯仿溶液(20mg/mL，6mL)。
B、DSPE-PEG-COOH修饰的DCNPs纳米颗粒的制备：将含有DCNPs的氯仿溶液(10mg，0.5mL)逐滴加入到DSPE-PEG5000-COOH的水溶液(6mg/mL，5mL)，并在超声下10min形成乳化溶液，随后，将上述乳化溶液在60℃水浴下搅拌1h，除去氯仿溶剂，水洗并超滤洗涤(截留分子量10KDa，6000rpm)，得到DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液。
C、MoO3-x-NH2纳米颗粒的制备：首先，通过溶剂热法在水热反应釜中合成MoO3-x纳米颗粒，随后，依次使用聚乙烯醇(PVA)、甘氨酸(Gly)来修饰MoO3-x纳米颗粒，最后，水洗得到MoO3-x-NH2纳米颗粒的水溶液(10mg/mL，10mL)。
D、DCNPs-COOH与MoO3-x-NH2的缩合反应共价耦合：在DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液(2.5mg/mL，4mL)中，加入30mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和19mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)室温避光匀速搅拌2h；
将活化后的DCNPs-COOH溶液加入到MoO3-x-NH2溶液(3mg，0.3mL)中，避光25℃下轻轻搅拌过夜，水洗三次除去未反应的MoO3-x-NH2，收集得到DCNP-MoO3-x纳米颗粒，分散于5mL水溶液中。
上述方法中，制备得到的MoO3-xNPs的吸收光谱图和DCNPs纳米颗粒的荧光光谱图如图1所示，从图中可看出，MoO3-x NPs在近红外二区附近具有较强的吸收，DCNPs纳米颗粒的荧光发射峰位于近红外二区的1067nm处，两者的光谱能够完全重叠。
2.荧光恢复性能测试
多次取1mL的DCNP-MoO3-x溶液分别加入到含有H2O2的比色皿中，使得比色皿中H2O2的浓度分别为0，25，50，100，150和200μM。240分钟后，在808nm激光器(功率为1.0W/cm2)的照射下，通过使用二窗荧光光谱仪测试其荧光恢复的强度信号。如图2所示，没有加H2O2的DCNP-MoO3-x水溶液的荧光几乎没有发生改变，而加入H2O2后，DCNP-MoO3-x荧光逐渐恢复，加入的H2O2浓度越高，其荧光恢复越快，恢复效果也越好。这主要归因于MoO3-xNPs随着时间推移被H2O2作用而逐渐降解，并最终以离子形式存在，其原先具有的紫外吸收也逐渐消失掉，从图3中可以证实。
3.DCNP-MoO3-x肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针的应用：
本发明制备的DCNP-MoO3-x肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针可用于荧光成像。
分别配制含有不同DCNPs浓度的DCNP-MoO3-x水溶液500μL于小离心管中，并分别加入H2O2，使得小离心管中H2O2浓度为200μM。随后震荡均匀，在240分钟后使用活体二窗成像仪对其荧光信号进行检测。如图4所示，该探针在H2O2作用下，MoO3-x会被逐渐降解，阻断FRET效应，从而使得DCNPs的近红外二区荧光恢复。另外，探针中DCNPs的浓度越高，其恢复后的荧光成像信号越强，表明该纳米探针具有良好的荧光成像效果。
实施例2
1、本实施例提供一种DCNP-MoO3-x@HA肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针，其制备方法如图2所示，具体步骤包括：
A、DCNPs稀土下转换纳米颗粒的合成：
A1、将六水氯化钇(0.143g，0.47mmol)、六水氯化钆(0.149g，0.40mmol)、六水氯化钕(0.01g，0.03mmol)、油酸钙(0.06g，0.1mmol)分散在6mL油酸(OA)和15mL的1-十八烯(ODE)的溶剂中，并搅拌加热至150℃，反应0.5h，形成淡黄色的OA配体形式的金属盐。将混合溶液冷却至50℃，缓慢滴加含有氟化铵(0.1482g，4mmol)和氢氧化钠(0.1g，2.5mmol)的甲醇溶液10mL，将上述混合溶液加热至120℃，反应0.5h后，进行抽真空和通N2三次，最后在N2气氛中290℃下搅拌反应1.5h。所得产物用乙醇和环己烷溶剂清洗三次，得到稀土纳米颗粒，分散于5mL环己烷溶液中(20mg/mL，6mL)。
A2、将六水氯化钆(0.186g，0.5mmol)分散在6mL油酸(OA)和15mL的1-十八烯(ODE)的溶剂中，并加热至150℃，反应0.5h，形成OA配体形式的金属盐。将混合溶液冷却至50℃，随后缓慢滴加含有上述A1稀土下转换纳米颗粒的环己烷溶液3mL和含有氟化铵(0.1482g，4mmol)和氢氧化钠(0.1g，2.5mmol)的甲醇溶液10mL。接着将上述混合溶液加热至120℃，反应0.5h，进行抽真空和通N2三次，最后在在N2气氛中280℃下搅拌反应1.5h。所得产物用乙醇和氯仿溶剂清洗三次，将其分散于5mL氯仿溶液中，最终得到含有DCNPs的氯仿溶液(20mg/mL，6mL)。
B、DSPE-PEG-COOH修饰的DCNPs纳米颗粒的制备：将含有DCNPs的氯仿溶液(10mg，0.5mL)逐滴加入到DSPE-PEG5000-COOH的水溶液(6mg/mL，5mL)，并在超声下10min形成乳化溶液，随后，将上述乳化溶液在60℃水浴下搅拌1h，除去氯仿溶剂，水洗并超滤洗涤(截留分子量10KDa，6000rpm)，得到DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液。
C、MoO3-x-NH2纳米颗粒的制备：首先，通过溶剂热法在水热反应釜中合成MoO3-x纳米颗粒。随后，依次使用聚乙烯醇(PVA)、甘氨酸(Gly)来修饰MoO3-x纳米颗粒。最后，水洗得到MoO3-x-NH2纳米颗粒的水溶液(10mg/mL，10mL)。
D、DCNPs-COOH与MoO3-x-NH2的缩合反应共价耦合：在DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液(2.5mg/mL，4mL)中，加入30mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和19mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)室温避光匀速搅拌2h。
将活化后的DCNPs-COOH溶液加入到MoO3-x-NH2溶液(3mg，0.3mL)中，避光25℃下轻轻搅拌过夜，水洗三次除去未反应的MoO3-x-NH2，收集得到DCNP-MoO3-x纳米颗粒，分散于5mL水溶液中。
E、HA修饰DCNP-MoO3-x纳米颗粒：在上述D所得到的DCNP-MoO3-x纳米颗粒水溶液中加入25mg的HA，室温搅拌3h，水洗三次后得到自组装纳米颗粒DCNP-MoO3-x@HA，其透射电子显微镜图以及动态光散射图如图3所示，其能量色散X射线图谱如图4所示，从图中可以看出，DCNP-COOH纳米颗粒和MoO3-x-NH2 NP确实组装结合在一起，尺寸在200nm左右，表现出良好的分散性。另外，从EDS能谱中发现Na、Y、F、Gd、Nd、Ca、Mo和O元素确实存在于纳米复合探针中，进一步验证了该探针的构成。
本实施例所述制得的DCNP-MoO3-x@HA纳米颗粒及其制备过程中的中间产物的紫外-可见光谱吸收图和傅立叶变换红外吸收图如图5和图6所示。从图中可以看出，DCNP-COOH几乎没有吸收光谱，而MoO3-x-NH2在300-1200nm范围内存在较宽的吸收光谱，由于DCNP-MoO3-x和DCNP-MoO3-x@HA结合了DCNP-COOH和MoO3-x-NH2两者的吸收特性，在800nm处仍然具有很宽的吸收光谱。另外，DCNP-MoO3-x和DCNP-MoO3-x@HA的红外吸收曲线上特征峰的出现证实了-NH2和-COOH通过缩合反应共价结合形成酰胺键(-CO-NH-，1647cm-1)。
2、荧光恢复性能测试
在含有H2O2的比色皿中加入1mL的DCNP-MoO3-x@HA水溶液，比色皿中H2O2浓度为200μM。震荡均匀后，在808nm激光器(功率为1.0W/cm2)的照射下，通过使用二窗荧光光谱仪记录不同的时间节点(0min、10min、30min、60min、120min、180min、240min、300min、360min)的荧光恢复情况。如图7所示，随着时间的推移，其荧光信号逐渐恢复，在240min处的荧光强度基本达到最大。随后接着在300min和360min处又测试其荧光强度，从图8中可以发现，其荧光强度基本保持不变。表明该纳米探针能够响应H2O2进而实现近红外二区荧光恢复的性能。
3、DCNP-MoO3-x@HA肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针的应用：
本发明制备的DCNP-MoO3-x@HA肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针可用于荧光成像。
分别配制含有不同DCNPs浓度的DCNP-MoO3-x@HA水溶液500μL于小离心管中，并分别加入H2O2，使得小离心管中H2O2浓度为200μM。随后震荡均匀，在4h后使用活体二窗成像仪对其荧光信号进行检测。如图9所示，该探针在H2O2作用下，MoO3-x会被逐渐降解，阻断FRET效应，从而使得DCNPs的近红外二区荧光恢复。另外，探针中DCNPs的浓度越高，其恢复后的荧光成像信号越强，表明该纳米探针具有良好的荧光成像效果。
实施例3
本实施例提供一种DCNP-MoO3-x@HA肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针，其制备方法包括：
A、DCNPs稀土下转换纳米颗粒的合成：
A1、将六水氯化钇(0.143g，0.47mmol)、六水氯化钆(0.149g，0.40mmol)、六水氯化钕(0.01g，0.03mmol)、油酸钙(0.06g，0.1mmol)分散在6mL油酸(OA)和15mL的1-十八烯(ODE)的溶剂中，并搅拌加热至150℃，反应0.5h，形成淡黄色的OA配体形式的金属盐。将混合溶液冷却至50℃，缓慢滴加含有氟化铵(0.1482g，4mmol)和氢氧化钠(0.1g，2.5mmol)的甲醇溶液10mL，将上述混合溶液加热至120℃，反应0.5h后，进行抽真空和通N2三次，最后在N2气氛中290℃下搅拌反应1.5h。所得产物用乙醇和环己烷溶剂清洗三次，得到稀土纳米颗粒，分散于5mL环己烷溶液中(20mg/mL，6mL)。
A2、将六水氯化钆(0.186g，0.5mmol)分散在6mL油酸(OA)和15mL的1-十八烯(ODE)的溶剂中，并加热至150℃，反应0.5h，形成OA配体形式的金属盐。将混合溶液冷却至50℃，随后缓慢滴加含有上述A1稀土下转换纳米颗粒的环己烷溶液3mL和含有氟化铵(0.1482g，4mmol)和氢氧化钠(0.1g，2.5mmol)的甲醇溶液10mL。接着将上述混合溶液加热至120℃，反应0.5h，进行抽真空和通N2三次，最后在在N2气氛中280℃下搅拌反应1.5h。所得产物用乙醇和氯仿溶剂清洗三次，将其分散于5mL氯仿溶液中，最终得到含有DCNPs的氯仿溶液(20mg/mL，6mL)。
B、DSPE-PEG-COOH修饰的DCNPs纳米颗粒的制备：将含有DCNPs的氯仿溶液(10mg，0.5mL)逐滴加入到DSPE-PEG5000-COOH的水溶液(8mg/mL，5mL)，并在超声下10min形成乳化溶液，随后，将上述乳化溶液在60℃水浴下搅拌1h，除去氯仿溶剂，水洗并超滤洗涤(截留分子量10KDa，6000rpm)，得到DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液。
C、MoO3-x-NH2纳米颗粒的制备：首先，通过溶剂热法在水热反应釜中合成MoO3-x纳米颗粒。随后，依次使用聚乙烯醇(PVA)、甘氨酸(Gly)来修饰MoO3-x纳米颗粒。最后，水洗得到MoO3-x-NH2纳米颗粒的水溶液(10mg/mL，10mL)。
D、DCNPs-COOH与MoO3-x-NH2的缩合反应共价耦合：在DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液(2.5mg/mL，4mL)中，加入40mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和13mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)室温避光匀速搅拌2h。
将活化后的DCNPs-COOH溶液加入到MoO3-x-NH2溶液(2mg，0.2mL)中，避光25℃下轻轻搅拌过夜，水洗三次除去未反应的MoO3-x-NH2，收集得到DCNP-MoO3-x纳米颗粒，分散于5mL水溶液中。
E、HA修饰DCNP-MoO3-x纳米颗粒：在上述D所得到的DCNP-MoO3-x纳米颗粒水溶液中加入48mg的HA，室温搅拌3h，水洗三次后得到自组装纳米颗粒DCNP-MoO3-x@HA。
实施例4
本实施例提供一种DCNP-MoO3-x@HA肿瘤微环境激活型近红外二区荧光探针，其制备方法包括：
A、DCNPs稀土下转换纳米颗粒的合成：
A1、将六水氯化钇(0.143g，0.47mmol)、六水氯化钆(0.149g，0.40mmol)、六水氯化钕(0.01g，0.03mmol)、油酸钙(0.06g，0.1mmol)分散在6mL油酸(OA)和15mL的1-十八烯(ODE)的溶剂中，并搅拌加热至150℃，反应0.5h，形成淡黄色的OA配体形式的金属盐。将混合溶液冷却至50℃，缓慢滴加含有氟化铵(0.1482g，4mmol)和氢氧化钠(0.1g，2.5mmol)的甲醇溶液10mL，将上述混合溶液加热至120℃，反应0.5h后，进行抽真空和通N2三次，最后在N2气氛中290℃下搅拌反应1.5h。所得产物用乙醇和环己烷溶剂清洗三次，得到稀土纳米颗粒，分散于5mL环己烷溶液中(20mg/mL，6mL)。
A2、将六水氯化钆(0.186g，0.5mmol)分散在6mL油酸(OA)和15mL的1-十八烯(ODE)的溶剂中，并加热至150℃，反应0.5h，形成OA配体形式的金属盐。将混合溶液冷却至50℃，随后缓慢滴加含有上述A1稀土下转换纳米颗粒的环己烷溶液3mL和含有氟化铵(0.1482g，4mmol)和氢氧化钠(0.1g，2.5mmol)的甲醇溶液10mL。接着将上述混合溶液加热至120℃，反应0.5h，进行抽真空和通N2三次，最后在在N2气氛中280℃下搅拌反应1.5h。所得产物用乙醇和氯仿溶剂清洗三次，将其分散于5mL氯仿溶液中，最终得到含有DCNPs的氯仿溶液(20mg/mL，6mL)。
B、DSPE-PEG-COOH修饰的DCNPs纳米颗粒的制备：将含有DCNPs的氯仿溶液(10mg，0.5mL)逐滴加入到DSPE-PEG2000-COOH的水溶液(7mg/mL，5mL)，并在超声下10min形成乳化溶液，随后，将上述乳化溶液在60℃水浴下搅拌1h，除去氯仿溶剂，水洗并超滤洗涤(截留分子量10KDa，5000rpm)，得到DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液。
C、MoO3-x-NH2纳米颗粒的制备：首先，通过溶剂热法在水热反应釜中合成MoO3-x纳米颗粒。随后，依次使用聚乙烯醇(PVA)、甘氨酸(Gly)来修饰MoO3-x纳米颗粒。最后，水洗得到MoO3-x-NH2纳米颗粒的水溶液(10mg/mL，10mL)。
D、DCNPs-COOH与MoO3-x-NH2的缩合反应共价耦合：在DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液(2.5mg/mL，4mL)中，加入40mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和17mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)室温避光匀速搅拌2h。
将活化后的DCNPs-COOH溶液加入到MoO3-x-NH2溶液(2.5mg，0.25mL)中，避光25℃下轻轻搅拌过夜，水洗三次除去未反应的MoO3-x-NH2，收集得到DCNP-MoO3-x纳米颗粒，分散于5mL水溶液中。
E、HA修饰DCNP-MoO3-x纳米颗粒：在上述D所得到的DCNP-MoO3-x纳米颗粒水溶液中加入35mg的HA，室温搅拌3h，水洗三次后得到自组装纳米颗粒DCNP-MoO3-x@HA。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和技术原理的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的，这些修改和变更也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种激活型近红外二区荧光探针，其特征在于，该荧光探针为DCNP-MoO3-x，是由带羧基的稀土下转换纳米颗粒DCNPs-COOH与带氨基的缺氧氧化钼纳米颗粒MoO3-x-NH2 NPs通过氨基-羧基缩合反应形成共价键的方式耦合而成。
2.一种激活型近红外二区荧光探针，其特征在于，该荧光探针为DCNP-MoO3-x@HA，是在权利要求1所述的DCNP-MoO3-x表面修饰HA制得。
3.一种权利要求2所述的激活型近红外二区荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
合成稀土下转换纳米颗粒DCNPs和带氨基的缺氧氧化钼纳米颗粒MoO3-x-NH2 NPs；
通过DSPE-PEG-COOH修饰DCNPs，得到DCNPs-COOH；
将DCNPs-COOH与MoO3-x-NH2 NPs通过氨基-羧基缩合反应形成共价键的方式进行耦合，得到DCNP-MoO3-x；
在DCNP-MoO3-x表面修饰HA，制得DCNP-MoO3-x@HA。
4.根据权利要求3所述的激活型近红外二区荧光探针的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
将稀土氯化物使用氯化物溶剂热法合成DCNPs，清洗后，将其分散于环己烷溶液中，制得含有DCNPs的氯仿溶液；
将含有DCNPs的氯仿溶液逐滴加入到DSPE-PEG-COOH的水溶液中，并在超声下10min，随后，在60℃下搅拌1h，水洗并超滤洗涤，得到含有DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液；
通过溶剂热法在水热反应釜中合成MoO3-x纳米颗粒，依次使用聚乙烯醇、甘氨酸来修饰MoO3-x纳米颗粒，水洗后，得到含有MoO3-x-NH2纳米颗粒的水溶液；
在DCNPs-COOH纳米颗粒的水溶液中，加入EDC和DMAP，室温避光搅拌2～4h进行活化，将活化后的DCNPs-COOH溶液加入到MoO3-x-NH2溶液中，避光搅拌过夜，水洗除去未反应的MoO3-x-NH2，收集得到含有DCNP-MoO3-x纳米颗粒的水溶液；
在DCNP-MoO3-x纳米颗粒的水溶液中加入HA的水溶液，室温搅拌2～4h，水洗后得到DCNP-MoO3-x@HA自组装纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的激活型近红外二区荧光探针的制备方法，其特征在于，所述DCNPs与DSPE-PEG-COOH的质量比为1:3～1:4。
6.根据权利要求4所述的激活型近红外二区荧光探针的制备方法，其特征在于，所述DSPE-PEG-COOH的分子量为2000～5000。
7.根据权利要求4所述的激活型近红外二区荧光探针的制备方法，其特征在于，所述MoO3-x-NH2 NPs与DCNPs-COOH的质量比为1:3～1:5，DCNPs-COOH与EDC的质量比为1:3～1:5；加入的DMAP与EDC的摩尔比为1:1～1:2。
8.根据权利要求4所述的激活型近红外二区荧光探针的制备方法，其特征在于，所述DCNP-MoO3-x与HA的质量比为1:2～1:4。
9.权利要求2所述的激活型近红外二区荧光探针在制备肿瘤靶向的近红外二区荧光成像试剂中的应用。
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| Progress in light-responsive lanthanide nanoparticles toward deep tumor theranostics;Jie Yan等;Advanced functional materials;第31卷(第42期);第1-26页，尤其是第6页3.2部分 * |
| Upconversion-based nanosystems for fluorescence sensing of pH and H2O2;Chunning Sun等;Nanoscale Adv.;第2538–2546页，尤其是第2539页左侧第3-8行，第2540页左侧倒数第1-7行，右侧第1-12行，第2539页右侧倒数第12-25行 * |
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