CN115040662B - 一种抗菌磁纳米粒子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，通过采用共沉淀法制备Fe3O4，利用超声波共振分散来获得Fe3O4纳米颗粒，采用乙醇和水进行冲洗；用浓度为8％～12％盐酸处理制备的Fe3O4，添加到5：1～3：1的乙醇水溶液中，加入NH3·H2O和TEOS，搅拌4～5h，得到Fe3O4@SiO2粒子；将Fe3O4@SiO2浸泡在0.01g/mL～0.03g/mL SA溶液中，得到Fe3O4@SiO2@SA纳米颗粒；将该纳米颗粒浸入10％～30％PHMB溶液中，得到抗菌磁纳米粒子Fe3O4@SiO2@SA@PHMB。该抗菌磁纳米粒子通过简易的化学方法构建，能够彻底清除牙周致病菌，具有循环使用、靶向治疗的作用，探究了抗菌磁纳米粒子的抗菌机理，并且能够清除牙周致病菌生物膜，具有低细胞毒性和良好的血液相容性，构建了大鼠丝线结扎牙周炎动物模型，为牙周炎的治疗探索新的方法，具有良好的应用前景。

Description

一种抗菌磁纳米粒子的制备方法
技术领域
本发明涉及牙周炎抗菌药物研究领域，具体是一种抗菌磁纳米粒子的制备方法。
背景技术
牙周炎是一种以菌斑为始动因子的牙周支持组织的慢性炎症性疾病，会导致牙龈炎症、牙槽骨吸收、牙周袋形成，最终牙齿松动、脱落。全球重度牙周炎的患病率高达10.59％，是仅次于龋病的全球第二大失牙原因，严重影响患者的生活质量。因此防治牙周炎对改善口腔健康、提高生活质量具有重要意义。目前认为牙周炎的发病机制在于：(1)口腔微生态环境的改变；(2)随后的宿主免疫反应；(3)环境和遗传危险因素的参与。牙周炎的治疗重点在于牙周病原体以及菌斑生物膜的清除，治疗方法包括机械治疗、药物治疗、手术治疗、激光治疗等。药物治疗中，局部使用缓释抗菌药物可以避免全身用药的诸多副作用，并能以较高浓度的药物直接作用于病变部位且能存在较长时间。
临床可应用的局部缓释抗菌药物包括米诺环素、甲硝唑、氯己定等，通过抑制细菌细胞壁合成、作用于细菌细胞膜、抑制RNA/DNA合成、干扰代谢途径、抑制蛋白质合成来发挥抗菌作用。目前临床最常用的是盐酸米诺环素软膏(商品名：派丽奥)，属于四环素类抗生素。然而抗生素的滥用导致细菌的耐药性不断增强，牙周缓释抗菌药物可能诱导袋内耐药菌株的产生，同时广谱抗生素对牙周致病菌的靶向清除效果并不理想。因此开发具有高效抗菌能力的新型制剂成为牙周炎药物治疗的研究重点。具有生物活性的聚合物因其低成本、通用性和可加工性，同时可满足药理学和生物学的需求，越来越多被用来代替抗生素，在治疗牙周炎方面具有很大的潜力。天然聚合物包括壳聚糖，通过改变细菌细胞壁的通透性导致细菌细胞死亡。人工合成抗菌药物中纳米材料因其粒径小，能进入窄而深的牙周袋和根分叉区，同时稳定性好，在溶剂中易分散的优点，受到广泛的研究。L.Gabrielyand等人的研究表明Fe3O4纳米粒子可以在革兰氏阴性菌细胞壁的外膜和内膜之间富集，相比于革兰阳性菌抗菌作用更明显[Gabrielyan,L.,et al.,Antibacterial effects of iron oxide(Fe3O4)nanoparticles:distinguishing concentration-dependent effects withdifferent bacterial cells growth and membrane-associated mechanisms.AppliedMicrobiology and Biotechnology,2019.103(6):p.2773-2782]。同时Fe3O4纳米粒子在哺乳动物中没有明显的生物毒性，可运用于人体组织[Zhang,L.,et al.,Magneticferroferric oxide nanoparticles induce vascular endothelial cell dysfunctionand inflammation by disturbing autophagy.Journal of Hazardous Materials,2016.304:p.186-195]。P.J.Alves等人的体外实验证明PHMB对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和白色念珠菌的有效性，尤其是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌效果显著[Alves,P.J.,etal.,Update on the role of antiseptics in the management of chronic woundswith critical colonisation and/or biofilm.Int Wound J,2021.18(3):p.342-358]
目前现有技术中，Fe3O4纳米粒子的制备工艺复杂，而且达不到需求。
发明内容
本发明的目的在于克服上述背景技术中的关键问题，提供了一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，该制备方法工艺简单，制备得到的抗菌磁纳米粒子能够彻底清除牙周致病菌，具有循环使用、靶向治疗的作用，进一步探究了抗菌磁纳米粒子的抗菌机理，并且能够清除细菌生物膜，具有低细胞毒性和良好的血液相容性。
本发明的目的主要通过以下技术方案实现：
一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用共沉淀法制备Fe3O4，利用超声波共振分散来获得Fe3O4纳米颗粒，并且采用乙醇和水进行冲洗；
(2)用浓度为8％～12％盐酸处理制备的Fe3O4，添加到质量比为5：1～3：1的乙醇水溶液中，加入NH3·H2O和TEOS，搅拌4～5h，得到Fe3O4@SiO2粒子；
(3)将Fe3O4@SiO2浸泡在0.01g/mL～0.03g/mL SA溶液中，得到Fe3O4@SiO2@SA纳米颗粒；
(4)将该纳米颗粒浸入10％～30％PHMB溶液中，得到抗菌磁纳米粒子Fe3O4@SiO2@SA@PHMB(即MNPS)。
目前，Fe3O4纳米粒子的制备方法分为物理方法和化学方法。物理方法以研磨为主，得到的粒子粒径不够细、分布不够均匀，在操作过程中还可能造成污染。化学方法包括溶胶-凝胶法、水热合成法、热分解法以及共沉淀法，然而溶胶-凝胶法和热分解法以有机物为原料，成本高，且生物安全性不高，水热合成法得到的粒子性能差异大，受到反应时的温度、升温速度、搅拌速度以及反应时间的影响。综上考虑，共沉淀法原料易得、价格低廉、条件简单，是制备纳米粒子的理想方法。
SiO2无毒无害，具有高度生物相容性，制备方法分为气相法和液相法。气相法是指直接利用气体或通过各种手段将物质变成气体，使之在气体状态下发生物理变化或化学反应，最后在冷却过程中凝聚长大形成纳米微粒的方法，但是反应温度高，对设备要求高，投资大且操作条件苛刻。在液相法中，相比于溶胶种子法、微乳液法和沉淀法，溶胶-凝胶法得到的纳米颗粒均匀，粒径较小，且经济效益高。
将具有抗菌作用的PHMB与具有磁性的Fe3O4结合，可以更高效清除牙周袋内的致病菌，从而达到控制牙周炎的临床目的。目前的研究中仅有将PHMB溶液和Fe3O4溶液混合净化水质的实验，两者通过物理混合即可破坏藻细胞，在本方案中将两者形成更稳定的化学结合，增强对细菌细胞的杀伤力。通过本方案的制备方法得到磁纳米粒子，其组成成分由磁性成分Fe3O4、抗菌成分PHMB、交联剂SiO2、SA组成，通过破坏细菌细胞壁和细胞膜，导致细胞内容物流出，细胞裂解死亡。该抗菌磁纳米粒子可应用于临床牙周炎的药物治疗，与甘油混合后注射入牙周袋内，现配现用。该抗菌磁纳米粒子通过简易的化学方法构建，能够彻底清除牙周致病菌，具有循环使用、靶向治疗的作用，进一步探究了抗菌磁纳米粒子的抗菌机理，并且能够清除细菌生物膜，具有低细胞毒性和良好的血液相容性，构建了大鼠丝线结扎牙周炎动物模型，为牙周炎的治疗探索新的方法，具有良好的应用前景。
进一步地，通过共沉淀法制备Fe3O4，Fe3O4中Fe2+与Fe3+的摩尔比为1:1，步骤(1)中将FeSO4·7H2O和FeCl3溶解在8～12mL水中，将含Fe3+的混合溶液滴入4mol/L～6mol/L的NaOH溶液中，并同时加以超声进行分散，最终Fe3+摩尔质量浓度为0.2mol/L～0.3mol/L。
进一步地，盐酸的浓度为10％。采用盐酸处理制备的Fe3O4是为了引入更多羟基，加入NH3·H2O是为了提供弱碱性环境。TEOS需缓慢滴加，便于在Fe3O4表面充分反应。浓度为10％的盐酸是最佳的浓度。
进一步地，乙醇水溶液的质量比为4：1。在这个数值下处理效果最佳。
进一步地，SA溶液的摩尔质量浓度为0.02g/mL。将Fe3O4@SiO2浸泡在SA溶液中，是为了利用磁纳米粒子比表面吸附作用和纳米粒子与SA之间的氢键作用，将SA分散在表面Fe3O4@SiO2纳米粒子，从而获得Fe3O4@SiO2@SA纳米颗粒。摩尔质量浓度为0.02g/mL的SA溶液是最佳的浓度。
进一步地，PHMB溶液的浓度为20％。将Fe3O4@SiO2@SA纳米粒浸入10％～30％PHMB溶液中的目的是利用SA在纳米粒子表面的负电荷，通过静电相互作用将带正电的PHMB结合起来，从而获得Fe3O4@SiO2@SA@PHMB。浓度为20％的PHMB溶液是最佳的浓度。
综上，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：该抗菌磁纳米粒子通过简易的化学方法构建，能够彻底清除牙周致病菌，具有循环使用、靶向治疗的作用，进一步探究了抗菌磁纳米粒子的抗菌机理，并且能够清除细菌生物膜，具有低细胞毒性和良好的血液相容性，构建了大鼠丝线结扎牙周炎动物模型，为牙周炎的治疗探索新的方法，具有良好的应用前景。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为SEM观察细菌形貌示意图。
图2为活/死细菌荧光染色示意图。
图3为SEM&CLSM观察生物膜清除示意图。
图4为细胞毒性实验示意图。
图5为microCT三维图像示意图。
图6为microCT定量分析示意图。
图7为HE染色示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
本发明的目的是针对现有牙周炎抗菌药物的不足，解决现有牙周炎局部缓释抗菌药物细菌耐药性、抗菌效果不佳的问题，提供一种新型抗菌磁纳米粒子的制备方法。该抗菌磁纳米粒子通过简易的化学方式构建，能够彻底清除牙周致病菌，具有循环使用、靶向治疗的价值，进一步探究了抗菌磁纳米粒子的抗菌机理，并且能够清除细菌生物膜，具有低细胞毒性和良好的血液相容性，构建了牙周炎动物模型，为牙周炎的治疗探索新的方法，具有良好的应用前景。这种抗菌磁纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用共沉淀法制备Fe3O4，利用超声波共振分散来获得Fe3O4纳米颗粒，并且采用乙醇和水进行冲洗；
(2)用浓度为8％～12％盐酸处理制备的Fe3O4，添加到5：1～3：1的乙醇水溶液中，加入NH3·H2O和TEOS，搅拌4～5h，得到Fe3O4@SiO2粒子；
(3)将Fe3O4@SiO2浸泡在0.01g/mL～0.03g/mL SA溶液中，得到Fe3O4@SiO2@SA纳米颗粒；
(4)将该纳米颗粒浸入10％～30％PHMB溶液中，得到抗菌磁纳米粒子Fe3O4@SiO2@SA@PHMB(即MNPS)。
通过共沉淀法制备Fe3O4，设计Fe2+与Fe3+的摩尔比为1:1，将FeSO4·7H2O和FeCl3溶解在8～12mL水中。将含铁离子的混合溶液滴入4mol/L～6mol/L的NaOH溶液中，并同时加以超声进行分散，最终铁离子摩尔质量浓度为0.2mol/L～0.3mol/L。
盐酸的最佳浓度为10％。乙醇水溶液的最佳质量比为4：1。SA溶液的最佳摩尔质量浓度为0.02g/mL。PHMB溶液的最佳浓度为20％。
下面将说明本发明的性能测试过程及结果。
一、将抗菌磁纳米粒子进行抗菌实验，具体步骤如下：
所有用于实验的样品、实验耗材、PBS和培养基在抗菌实验前均在121℃灭菌15min。
1.扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察细菌形貌
传代后的细菌母液培养后活化计数，然后将细菌母液用PBS缓冲液稀释至约105CFU/mL的浓度。将制备好的1mg MNPS样品与稀释后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌溶液在37℃下进行共培养12h。随后取出MNPS，将离心后的细菌沉淀物用2.5％戊二醛水溶液在4℃下固定过夜，然后用各酒精浓度梯度(30％、50％、70％、90％和100％)依次脱水30min。最后，将细菌沉淀置于载玻片上，通过SEM观察。如图1所示。
2.活/死细菌荧光染色
菌液准备过程同上。在1.5mL微型离心管中充分混合等量的SYTO 9和PI。然后将3μL/mL染料溶液添加到处理过的细菌溶液中，并在37℃的黑暗中充分混合15min。然后通过共焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)获得荧光图像，如图2所示。SYTO 9染料的激发/发射波长为480/500nm，PI染料的激发/发射波长为490/635nm。
3.SEM观察生物膜清除
将无菌玻片置于孔板底部，在孔板中分别加入100μL(2*108CFU/mL)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌液于37℃培养1h形成单菌种生物膜，加入100μL(2*108CFU/mL)牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、戈登链球菌菌液于37℃培养24h形成多菌种生物膜。接着用无菌PBS洗去未粘附的细菌，并置于液体培养基中在37℃培育24h，然后用PBS再接着培育24h。最后用PBS清洗玻片3次。用MNPS处理过(12h)的玻片作为样品组，未经MNPS处理的作为对照组。用2.5％的戊二醛固定，30％、50％、70％、90％、100％乙醇浓度梯度洗脱，自然干燥，用于SEM观察，如图3所示。
4.CLSM观察生物膜清除
生物膜形成过程同上，用MNPS处理过(12h)的玻片作为样品组，未经MNPS处理的作为对照组。随后用Styo 9和PI染液进行荧光染色，将30μL Styo 9和20μL PI染料溶液添加到玻片上，并在37℃的黑暗中充分接触30min。然后通过CLSM获得荧光图像。
二、将抗菌磁纳米粒子进行细胞毒性实验，具体步骤如下：
按照GB/T16886.5-2003标准，用小鼠骨骼肌L929细胞和细胞计数试剂盒(CCK-8)检测MNPS对细胞增殖的细胞毒性。L929细胞以每孔5×103个细胞的密度储存在96孔板中，并在37℃含有5％增湿CO2的培养箱中，在含有10％胎牛血清(Fatal bovine serun，FBS)和1％青霉素链霉素的DMEM中培养。培养24h等细胞完全贴壁生长后，将经过紫外灭菌的Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@SA、MNPS浸入细胞培养液中，选择浓度梯度为250μg/mL、500μg/mL、和1000μg/mL，与L929细胞共培养24h，并设置不加材料的空白对照组，每组5个平行样本。在预定培养时间结束后，添加CCK-8试剂并混合3h，然后使用微孔板读取器测定每个孔板的吸光度，从而测得磁性纳米粒子的细胞毒性。如图4所示。
三、将抗菌磁纳米粒子进行动物实验，具体步骤如下：
给雄性SD大鼠提供营养物质、饲料和水。动物饲养条件保持在21℃，50％的湿度和12h/12h的光-暗循环。设置3只正常组，3只牙周炎组，3只派丽奥组，3只MNPS组。首先，通过丝线结扎的方式进行牙周炎动物模型构建，将大鼠右上颌第一磨牙用4-0丝线结扎，每隔两天进行一次检查，如有脱落则重新结扎。造模成功后，把MNPS分散到甘油中，通过注射的方式，将样品注射到大鼠右上颌第一磨牙牙周袋内，每周进行一次给药，四周后注射过量麻药处死大鼠，取出大鼠右侧上颌骨，进行microCT、HE染色分析。如图5、图6、图7所示。
通过上述实验，得到如下结果：
1、本发明所使用的抗菌磁纳米粒子可导致牙周致病菌菌体的破坏。由SEM的微观形貌可见，对照组的大肠杆菌、金色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌形态良好，而与MNPS接触后的细菌发生了严重的破损和收缩。MNPS负载的PHMB分子会对细菌有破坏作用，PHMB是阳离子聚合物，首先通过带正电的双胍结构吸附在带负电的细菌的细胞膜上，随后PHMB脂溶性部分插入细胞膜，使细胞膜结构破坏，最终导致细菌死亡。
2、本发明所使用的抗菌磁纳米粒子具有优良的抗菌效果。SYTO 9可以透过细胞膜而PI是不可以透过细胞膜的，死菌一般认为细胞膜是不完整的，因此死菌可以被SYTO 9和PI同时染色因此死菌有两种荧光，而活菌只有SYTO 9的绿荧光。由CLSM结果可看出，加入MNPS组死菌明显多于对照组，说明MNPS的抗菌能力强。
3、本发明所使用的抗菌磁纳米粒子具有清除生物膜的功能。由SEM结果和CLSM结果可看出，将细菌的生物被膜与MNPS接触后，细菌分泌的胞外多糖和胞外蛋白与细菌形成的生物被膜都被清除，生物膜生物量明显减少。
4、本发明所使用的抗菌磁纳米粒子在低浓度时细胞毒性小、生物安全性好。通过细胞毒性测试结果看出，Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@SA、MNPS的细胞毒性随着质量浓度的增加而增大，MNPS中的SA是多糖，具有良好的生物相容性，并能提供一定的养分，从而提高了该抗菌磁纳米粒子的细胞相容性。
5、本发明所使用的抗菌磁纳米粒子具有抗菌消炎，促进牙槽骨再生的作用。从microCT三维重建图可看出，牙周炎组牙槽骨吸收明显，根分叉区域可见贯通，派丽奥组和MNPS组的骨量相比牙周炎组有所增加，近似于正常组。从microCT的定量分析结果来看，MNPS组与牙周炎组相比有显著差异，说明该磁纳米粒子可促进牙槽骨的生长，且效果明显。HE染色从组织学的角度可见MNPS组比牙周炎组牙槽嵴顶高度增加、骨量增多、炎症因子浸润减少，可以进一步证明该磁纳米粒子对牙周炎的治疗作用。
以上的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用共沉淀法制备四氧化三铁（Triiron tetraoxide, Fe3O4），利用超声波共振分散来获得Fe3O4纳米颗粒，并且采用乙醇和水进行冲洗，将FeSO4·7H2O和FeCl3溶解在8~12mL水中，将含铁离子的混合溶液滴入4 mol/L~6 mol/L的NaOH溶液中，并同时加以超声进行分散，最终铁离子摩尔质量浓度为0.2 mol/L~0.3 mol/L；
（2）用浓度为8%~12%盐酸处理制备的Fe3O4，添加到质量比为5：1~3：1的乙醇水溶液中，加入NH3·H2O和硅酸乙酯（Tetraethoxysilane，TEOS），搅拌4~5 h，得到Fe3O4@SiO2粒子；
（3）将Fe3O4@SiO2浸泡在0.01 g/mL~0.03 g/mL海藻酸钠（Sodium alginate, SA）溶液中，得到Fe3O4@SiO2@SA纳米颗粒；
（4）将该纳米颗粒浸入10%~30%聚六亚甲基双胍盐酸盐（Polyhexamethylenebiguanidehydrochloride , PHMB）溶液中，得到抗菌磁纳米粒子Fe3O4@SiO2@SA@PHMB（即MNPS）。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中Fe3O4中Fe2+与Fe3+的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为10%。
4.根据权利要求1所述的一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的质量比为4：1。
5.根据权利要求1所述的一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述SA溶液的摩尔质量浓度为0.02 g/mL。
6.根据权利要求1所述的一种抗菌磁纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述PHMB溶液的浓度为20%。
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