CN115040099A - 高分辨激光散斑血管血流成像方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高分辨激光散斑血管血流成像方法及系统，方法包括使用激光透射式照明的方式照射待测组织，分别以短曝光时间拍摄采集一组待测组织的激光散斑图像和以长曝光时间拍摄采集一组待测组织的激光散斑图像，然后将两组图像进行融合处理，获得血流灌注指数图像和血管造影图像。分别获取了短时间曝光下和长时间曝光下共两组激光散斑图像，其中，短曝光时间下的激光散斑图像可以将待测组织中的散射程度和组织中散射粒子的运动速度均考虑进来，与长时间曝光下的激光散斑图像同和处理后，分离了透射光中散射和非散射光子的贡献，可以大幅降低估计误差，不仅可以解析出微血管的流速信息，还可以同时实现精细微血管结构的高分辨成像。
Description
技术领域
本发明属于激光散斑成像领域，更具体地，涉及高分辨激光散斑血管血流成像方法及系统。
背景技术
提高激光散斑衬比成像的探测深度和空间分辨率一直是人们关注的问题。经典的激光散斑衬比成像系统通常采用反射式的宽场成像结构，此时，大部分反射信号来自于浅层生物组织。利用生物组织在近红外波段吸收和散射系数低的特点，利用785nm的波长作为照明光源可提升反射式激光散斑衬比成像的探测深度，但依旧难以探测超过700um深的血流信号。此外，组织中微小血管的散射信号往往被周围组织的散射信号掩盖，在不引入深度分辨机制的情况下，反射式系统获得的散斑图像中，来自微小血管的信号比例很低。这导致了反射式激光散斑衬比成像系统缺乏对微小血管的分辨能力。
当采用透射式的成像结构，即照明光源和图像传感器设置在待测组织的对侧时，入射光穿透了待测组织，携带了传播路径上所有的血流信息。因此，透射式成像结构为探测组织深部血流信号、实现高分辨的血流速度成像提供了可能。然而，根据组织光学原理，若生物组织厚度在百微米乃至毫米量级时，采用透射式照明得到的前向散射光中，除了多次散射的扩散光子以外，还包括大量直接透射的弹道光子和散射次数较少的蛇形光子。对于这样散射光和非散射光混合的前向散射情况，若直接采用反射式探测结构对应的传统激光散斑衬比理论模型来估计与流速有关的光场去相关时间，将会带来严重的估计误差，甚至无法解析微小血管的血流信息。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了高分辨激光散斑血管血流成像方法及系统，其目的在于解决现有技术中透射式照明下散射光成分复杂且散射程度差异大而导致血流信息估计误差大的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了高分辨激光散斑血管血流成像方法，包括以下步骤：
使用激光透射式照明的方式，分别以短曝光时间拍摄采集一组激光散斑图像和以长曝光时间拍摄采集一组激光散斑图像，然后将两组激光散斑图像进行融合处理，获得血流灌注指数图像和血管造影图像。
通过上述技术方案，分别获取了短时间曝光下和长时间曝光下共两组激光散斑图像，其中，短曝光时间下的激光散斑图像可以将待测组织中的散射程度和组织中散射粒子的运动速度均考虑进来，与长时间曝光下的激光散斑图像融合处理后，分离了透射光中散射和非散射光子的贡献，可以大幅降低估计误差，不仅可以解析出微血管的流速信息，还可以同时实现精细微血管结构的高分辨成像。
本发明还提出一种高分辨激光散斑血管血流成像系统，包括有激光器、激光调制器、样品台和成像装置，所述样品台用于放置待测组织，所述激光器用于向所述待测组织提供入射光并产生透射光，所述成像装置用于采集所述透射光，所述激光调制器用于调节所述入射光的光强，所述入射光与所述透射光分别位于所述样品台的对侧。
该成像系统可用于实现上述成像方法中的光路，通过激光调制器来调节入射光的光强，从而使得上述成像方法中短曝光时间下和长曝光时间下的两组散斑图像强度相近。
附图说明
图1是本发明方法的原理示意图；
图2是本发明系统的结构示意图；
图3中(a)是实施例一获得的血流灌注指数图像；
图3中(b)是实施例一获得的血管造影图像；
图3中(c)是对比例一获得的血管荧光造影图像；
图3中(d)是对比例二获得的透射式照明下的传统时间衬比图像；
图3中(e)是对比例三获得的透射式照明下的空间衬比图像；
图3中(f)是对比例四获得的反射式照明下的传统时间衬比图像；
图3中(g)是实施例一和对比例一至四的LOI归一化强度分布图；
图4是对比例五至八中的血流灌注指数图像、血管造影图像、透射式照明下的传统时间衬比图像、透射式照明下的空间衬比图像、反射式照明下的传统时间衬比图像。
图中，1、激光器；2、准直透镜；3、中性密度滤光片；4、反射镜；5、样品台；6、物镜；7、镜筒；8、相机。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
如图1所示，本发明提出高分辨激光散斑血管血流成像方法，包括以下步骤：
使用激光透射式照明的方式照射待测组织，分别以短曝光时间拍摄采集一组待测组织的激光散斑图像和以长曝光时间拍摄采集一组待测组织的激光散斑图像，然后将两组激光散斑图像进行融合处理，获得血流灌注指数图像和血管造影图像。
现有技术中的透射式散斑成像只获得一组激光散斑图像进行处理，采用的是传统的时间衬比计算，会错误地估计组织中的血流速度，具体原因背景技术中已进行说明。而本方法在透射式散斑成像的基础上，获取了短曝光和长曝光下的两组激光散斑图像，将待测组织中的散射程度和组织中散射粒子的运动速度均考虑进来，因此，将两组图像融合处理后，分离了透射光中散射和非散射光子的贡献，不仅可以解析出微血管的流速信息，即血流指数，还可以同时实现精细微血管结构的高分辨成像，即血管造影图像。
具体地，短曝光时间和长曝光时间均是指的拍摄采集一帧激光散斑图像的曝光时间，即一次曝光时间，因此，在获取两组不同曝光时间的激光散斑图像可以先以短曝光时间进行N次曝光，来拍摄采集N帧激光散斑图像，形成一组；然后再以长曝光时间进行N次曝光，拍摄采集N帧激光散斑图像，形成另一组。也可以以短曝光时间-长曝光时间交替循环N次，每一次均分别获得一帧短曝光时间下的激光散斑图像和一帧长曝光时间下的激光散斑图像，交替循环N次后共获得N帧短曝光时间下的激光散斑图像作为一组和N帧长曝光时间下的激光散斑图像作为另一组。此外，短曝光与长曝光无论先后均可，两组图像至少需要各拍摄采集一帧，且帧数可以根据待测组织的不同或应用场景的不同进行调整。
进一步地，融合处理的具体过程为：根据短曝光时间拍摄下的一组激光散斑图像获得其时间衬比Kt，short；根据长曝光时间拍摄下的一组激光散斑图像获得其时间衬比Kt，log；然后根据
计算电场去相关时间τc，其中，Tlong表示长曝光时间，
表示所得血流灌注指数图像。
更具体地，时间衬比定义为图像序列的标准差和均值之比，即
根据该公知定义可以获得出本方法下的短曝光时间衬比Kt，short与长曝光时间衬比Kt，long，即：
其中，σt，short为短曝光时间拍摄获得的激光散斑图像在时间邻域上的像素标准差，＜I＞t，short为短曝光时间拍摄获得的激光散斑图像在时间邻域上的像素均值；
其中，σt，long为长曝光时间拍摄获得的激光散斑图像在时间邻域上的像素标准差，<I>t，long为长曝光时间拍摄获得的激光散斑图像在时间邻域上的像素均值。因此，拍摄获得一组激光散斑图像后就可以根据该组散斑图像计算出其时间衬比K。
透射式散斑成像下的激光散斑表达式为
因此，在短时间曝光下，T非常小，根据洛必达法则，可知
所以
其中，β表示…，ξ表示组织散射程度系数，βξ2表示所得的血管造影图像，而通过时间衬比的公知定义计算出Kt，short与Kt，long两个值后，将两个不同曝光时间的时间衬比代入至上述的透射式散斑成像下的激光散斑表达式中，从而获得
该式中，两个不同曝光时间的时间衬比为已知参数，长曝光时间也为已知参数，最后可通过牛顿迭代法求解出电场去相关时间τc。
βξ2反映了散射光占总光强的比例，即待测组织的散射强弱，因此，本方法中利用了短时间曝光下的时间衬比近似等于βξ2，将短时间曝光下的时间衬比替代βξ2代入至透射式散斑成像下的激光散斑表达式中，可以减小估计误差，获得的
能同时展示大血管和微小血管的血流速度信息，校正了直接使用时间衬比计算带来的估计误差。
进一步地，短曝光时间为Tshort，Tshort≤100us，Tlong≥1ms。待测组织的厚度为百微米级别。因此，当采用透射式照明的方式进行激光散斑成像时，透射光中除了扩散光子，还包含了弹道光子和蛇形光子，若直接采用传统的时间衬比算法，产生的估计误差将使得大血管区域的1/K2高于无血流组织，而小血管对应的1/K2显著低于无血流组织，呈现出血流图中的“血管反色”现象，这种现象不仅错误解析了生物组织的血流分布，也对血管形态参数的分割与提出造成了困难。
进一步地，在拍摄采集两组激光散斑图像时，分别对照射到待测组织的激光功率进行调节，以调节不同曝光时间下所得的激光散斑图像的光强，该步骤的目的是使短曝光时间下和长曝光时间下的两组散斑图像强度相近。
如图2所示，本发明还提出一种高分辨激光散斑血管血流成像系统，包括有激光器1、激光调制器3、样品台5和成像装置，样品台5用于放置待测组织，激光器1用于向待测组织提供入射光并产生透射光，成像装置用于采集透射光，激光调制器3用于调节入射光的光强，入射光与透射光分别位于样品台5的对侧。
通过激光调制器3对入射光光强进行调节，可以保障两个不同曝光时间下采集的图像光强相当。
进一步地，还包括图像采集控制模块：根据激光调制器3调节后的光强控制成像装置分别以短曝光时间拍摄采集一组待测组织的激光散斑图像，以长曝光时间拍摄采集一组待测组织的激光散斑图像。该模块根据激光调制器3调节后的光强来控制曝光时间，
进一步地，还包括：血管造影图像生成模块，用于将短曝光时间采集的一组激光散斑图像通过时间衬比的平方生成组织血管造影图像。
进一步地，还包括：血流灌注指数图像生成模块，用于将短曝光时间采集的一组激光散斑图像，以及长曝光时间拍摄采集的一组激光散斑图像，通过融合处理生成血流灌注指数图像。
在一些实施例中，激光调制器3为对激光器输出光脉冲的幅度、脉宽和频率进行调节的电流驱动器或声光调制器。
在另一些实施例中，所述激光调制器为在激光器与所述样品台之间设置的可移入/移出所述入射光光路的中性密度滤光片，短时间曝光时，中性密度滤光片不位于入射光的光路上，长时间曝光时，中性密度滤光片位于入射光的光路上。在进行短时间曝光时将中性密度滤光片3移出入射光光路，进行长时间曝光时，将中性密度滤光片3移入入射光的光路上，对入射光的光强进行衰减，降低照射到样品台5内待测组织上的光强，从而保障两个不同曝光时间下采集的图像光强相当。
在一些实施例中，激光器1与样品台5之间安装有转动装置，中性密度滤光片安装在转动装置内，转动装置带动中性密度滤光片转动，以移入/移出入射光光路。当然，中性密度滤光片也可以通过可拆卸设置等方式移入/移出入射光光路，只要能实现对中性密度滤光片位置进行调整的结构均可。
在一些实施例中，激光器1与激光调制器3之间的光路上还设置有扩束镜、准直透镜2。准直透镜2可选焦距30mm。
进一步地，成像装置包括物镜6、镜筒7和采集相机8，透射光依次经过物镜6、镜筒7后被采集相机8采集，成像装置的总体成像倍率在0.4倍～4.0倍范围内可调节。在一些实施例中，激光器1为波长785nm、光功率90mW的半导体激光器，采集相机8为CMOS相机，采集帧率为50fps。而根据样品台5与激光器1之间的设置位置，可以在二者之间进一步设置一些反射镜4等光学镜片，能优化各零件的位置结构且能调整入射光的方向，使得入射光能精准入射至样品台5的待测组织上。
为对本发明的技术效果进行验证说明，进行以下实施例与对比例：
选用C57小鼠，腹腔注射2％水合氯醛和10％乌拉坦(0.01ml/g)溶液麻醉后。
实施例一、对比例一至四的待测组织为小鼠耳部，厚度为百微米级别。
实施例一
Tshort＝21us，Tlong＝20ms，以短曝光时间-长曝光时间交替循环50次的方式分别获得短曝光时间下的50帧激光散斑图像和长曝光时间下的50帧激光散斑图像。在本发明的系统下，拍摄采集过程中，每一次短曝光时间下，旋转装置带动中性密度滤光片移出入射光的光路路径上，然后长曝光时间下，再带动中性密度滤光片移入入射光的光路路径上，如此交替循环50次共获得两组图像。
然后对两组图像进行融合处理，以
获得血流指数，也即血流灌注指数图像，如图3中(a)所示；以βξ2获得血管造影图像，如图3中(b)所示。
对比例一
进一步对小鼠尾静脉注射浓度为1％的四甲基若丹明异硫氰酸盐-葡聚糖溶液(TRITC-Dextran 70,注射剂量7.5uL/g)，随后利用独立的荧光显微镜进行荧光血管造影成像(激发光波长540nm，发射荧光波长605nm)，获得待测组织的血管荧光造影图像，如图3中(c)所示。
对比例二
在与实施例一相同的透射式照明情况下，以20ms的统一曝光时间拍摄采集50帧激光散斑图像，然后直接利用时间衬比的定义获得该组图像的时间衬比Kt1，以
表示其透射式照明下的传统时间衬比图像，如图3中(d)所示。
对比例三
与对比例二的不同之处在于，使用空间衬比的定义，即滑动窗中图像在空间领域上的像素标准差与像素均值的比值，在5×5的滑动窗口中计算，获得该组图像的空间衬比Ks，以
表示其透射式照明下的空间衬比图像，如图3中(e)所示。
对比例四
与对比例二的不同之处在于，使用的是反射式照明，即入射光照射至待测组织上后，在入射光的同侧进行采集反射光。以与对比例二相同的方式获得其时间衬比Kt2，以
表示其反射式照明下的传统时间衬比图像，如图3中(f)所示。
结合实施例一与对比例一至四的图像进行比较，可以从图3中(f)里发现，采用反射式照明时，在小血管区域，会存在血管区域
低于背景组织区域的现象；从图3中(e)里发现，透射式照明下，传统的空间衬比算法仅能得到少数粗血管的流速信息，不能获得微血管的血流速度；从图3中(d)里可以发现，透射式照明下，传统的时间衬比算法会出现前文所述的“血管反色”现象。从图3中(a)-(c)中发现，透射式照明下，采用本发明获得的血流指数能同时展示大血管和微小血管的血流速度信息，也即是校正了图3中(d)里的估计误差，本申请的空间分辨率高于对比例二、三、四；此外，透射式照明下，本发明获得的血管造影图像展示了组织中有血管区域和无血管区域的散射程度差异，实现了微小血管结构信息的无标记成像，其空间分辨能力与荧光血管造影图像相当。
为进一步验证本发明的技术效果，将实施例一、对比例一-四中获得的图像结果中选择一条感兴趣的线型区域LOI，分析归一化强度分布，分析结果如图3中(g)所示。可以发现，实施例一种的两个图像可分辨直径达到20um的微小血管，而同样是采用时间衬比的对比例二、四中，强度分布曲线在血管处出现“凹陷”，说明了传统激光散斑时间衬比解析透射式照明光场存在问题。
对比例五
待测组织为小鼠皮肤，然后按照实施例一、对比例二、三、四中的方法依次获取小鼠皮肤的血流灌注指数图像、血管造影图像、透射式照明下的传统时间衬比图像、透射式照明下的空间衬比图像、反射式照明下的传统时间衬比图像。
对比例六
与对比例五的不同之处在于，待测组织为小鼠后爪，依次获取小鼠后爪的血流灌注指数图像、血管造影图像、透射式照明下的传统时间衬比图像、透射式照明下的空间衬比图像、反射式照明下的传统时间衬比图像。
对比例七
与对比例五的不同之处在于，待测组织为小鼠后肢，依次获取小鼠后肢的血流灌注指数图像、血管造影图像、透射式照明下的传统时间衬比图像、透射式照明下的空间衬比图像、反射式照明下的传统时间衬比图像。
对比例八
与对比例五的不同之处在于，待测组织为小鼠前爪，依次获取小鼠前爪的血流灌注指数图像、血管造影图像、透射式照明下的传统时间衬比图像、透射式照明下的空间衬比图像、反射式照明下的传统时间衬比图像。
如图4所示，展示了对比例五、六、七、八中的各5张图像。可以发现，对比例六、七、八中，透射式照明下的传统时间衬比图像、透射式照明下的空间衬比图像均与采用本发明内容获得的血流灌注指数图像具有同等的分辨能力，而对比例五中展示出的验证结果与实施例一、对比例二、三、四对比后的验证结果一致。这是因为，对比例五中的待测组织厚度与实施例一相同，均是百微米级别，而对比例六、七、八中的待测组织厚度约为毫米级别，对于这样的厚组织，当采用透射式照明时，入射光几乎被完全散射，所以透射式照明下的传统时间衬比图像、透射式照明下的空间衬比图像均与采用本发明内容获得的血流灌注指数图像具有同等的分辨能力，并且，由于入射光被完全散射，成像视场内的组织不存在散射程度的差异，故对比例六、七、八的血管造影图像不能分辨血管结构，只有较薄的待测组织在透射式照明下才会存在散射程度的差异，故本发明更适用于百微米级别的待测样本。此外，还可以发现，无论是何种厚度级别的待测组织，采用透射式照明所得的血流灌注指数图像对血管细节的分辨能力依旧优于采用反射式照明所得的血流灌注指数图像。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.高分辨激光散斑血管血流成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用激光透射式照明的方式，分别以短曝光时间拍摄采集一组激光散斑图像和以长曝光时间拍摄采集一组激光散斑图像，然后将两组激光散斑图像进行融合处理，获得血流灌注指数图像和血管造影图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，图像融合处理的具体过程为：根据短曝光时间拍摄下的一组激光散斑图像获得其时间衬比Kt，short；根据长曝光时间拍摄下的一组激光散斑图像获得其时间衬比Kt，long；
然后根据
计算电场去相关时间τc，
表示所得血管造影图像，Tlong表示长曝光时间，
表示所得血流灌注指数图像。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，短曝光时间为Tshort，Tshort≤100us，Tlong≥1ms。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在拍摄采集两组激光散斑图像时，分别对激光透射式照明下的激光功率进行调节，以调节不同曝光时间下所得的激光散斑图像的光强。
5.高分辨激光散斑血管血流成像系统，其特征在于，包括有激光器、激光调制器、样品台和成像装置，所述样品台用于放置待测组织，所述激光器用于向所述待测组织提供入射光并产生透射光，所述成像装置用于采集所述透射光，所述激光调制器用于调节所述入射光的光强，所述入射光与所述透射光分别位于所述样品台的对侧。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，还包括图像采集控制模块：根据所述激光调制器调节后的光强控制所述成像装置分别以短曝光时间拍摄采集一组待测组织的激光散斑图像，以长曝光时间拍摄采集一组待测组织的激光散斑图像。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，还包括：血管造影图像生成模块，用于将短曝光时间采集的一组激光散斑图像通过时间衬比的平方生成组织血管造影图像。
8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，还包括：血流灌注指数图像生成模块，用于将短曝光时间采集的一组激光散斑图像，以及长曝光时间拍摄采集的一组激光散斑图像，通过融合处理生成血流灌注指数图像。
9.根据权利要求6-8任一项所述的系统，其特征在于，所述激光调制器为对激光器输出光脉冲的幅度、脉宽和频率进行调节的电流驱动器或声光调制器。
10.根据权利要求6-8任一项所述的系统，其特征在于，所述激光调制器为在激光器与所述样品台之间设置的可移入/移出所述入射光光路的中性密度滤光片，短时间曝光时，中性密度滤光片不位于入射光的光路上，长时间曝光时，中性密度滤光片位于入射光的光路上。
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