CN115038798A

CN115038798A - 预测生物疗法需求的方法

Info

Publication number: CN115038798A
Application number: CN202080078746.8A
Authority: CN
Inventors: C.皮察利斯; M.J.刘易斯; F.C.亨比
Original assignee: Queen Mary University of London
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-09-09
Also published as: WO2021064371A1; US20220340974A1; AU2020358799A1; JP2022549935A; BR112022010472A2; MX2022003856A; GB201914079D0; KR20220080124A; CA3152722A1; IL291776A; EP4038201A1

Abstract

用于识别需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗的受试者的方法，该方法包括以下步骤：(a)确定从受试者获得的一个或多个样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中该一种或多种生物标志物是选自表1；和(b)将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应的参考值进行比较；其中与相应参考值相比的一种或多种生物标志物的水平指示需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗。

Description

预测生物疗法需求的方法

发明领域

本发明涉及用于预测受试者是否需要类风湿性关节炎的生物疗法的方法。本发明还涉及治疗类风湿性关节炎受试者的方法。

发明背景

炎症性关节炎是多种自身免疫性病症中的突出临床表现，自身免疫性病症包括类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PsA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征和多发性肌炎。

RA是慢性炎症性疾病，其影响北欧和北美约0.5％至1％的成年人口。它是全身性炎症性疾病，其特征是受影响关节滑膜中的慢性炎症，最终由于慢性疼痛和疲劳导致日常功能丧失。大多数患者还会经历受影响关节中的软骨和骨进行性退化，最终可能导致永久性残疾。RA的长期预后很差，约50％的患者在诊断后10年内经历严重的功能障碍。预期寿命平均减少3-10年。

由于破骨细胞吸收增加，炎症性骨病，如RA，伴随着受影响关节周围的骨流失。该过程主要由促炎细胞因子的局部产生增加来介导，其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是主要的效应物。

特别是在RA中，免疫应答被认为是由一种或几种存在于滑膜室中的抗原引发/维持的，从而导致急性炎症细胞和淋巴细胞流入关节。连续的炎症波导致形成称为血管翳(pannus)的侵入性和糜烂性组织。这含有增殖的成纤维细胞样滑膜细胞和巨噬细胞，它们产生促炎细胞因子，如TNF-α和白细胞介素-1(IL-1)。蛋白水解酶、各种炎性介导物和破骨细胞活化的局部释放导致大部分组织损伤。存在关节软骨丧失和骨糜烂形成。周围的肌腱和囊可能会受到炎症过程的影响。最终，关节结构的完整性受到损害，导致残疾。

B细胞被认为造成了RA的免疫病理，主要通过作为自身抗体产生细胞的前体，但也作为抗原呈递细胞(APC)和促炎细胞因子产生细胞。已经识别了许多自身抗体特异性，包括针对II型胶原蛋白和蛋白聚糖以及类风湿因子的抗体和最重要的抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)。大量抗体的产生导致免疫复合物的形成和补体级联的活化。这反过来会放大免疫应答，并可能最终导致局部细胞溶解。

当前用于改变疾病过程和延迟关节破坏的RA标准疗法被称为改善病情抗风湿药(DMARD)。甲氨蝶呤、来氟米特和柳氮磺胺吡啶是传统的DMARD，通常作为一线治疗有效。

设计用于靶向在RA中发挥作用的免疫系统特定组分的生物剂也被用作治疗剂。有多组RA的生物治疗，包括TNF-α抑制剂(依那西普、英夫利昔单抗和阿达木单抗)、人IL-1受体拮抗剂(阿那白滞素)和选择性共刺激调节剂(阿巴西普)。

ACR/EULAR RA分类标准的引入对RA的早期诊断和治疗产生了积极影响，从而带来了更好的结果。出于同样的原因，更广泛的标准导致纳入患有更轻微和更异质性疾病的患者。这一点，再加上无法在个体专利层面准确预测疾病预后和治疗响应，强调需要识别有加速结构损伤进展风险的患者，并对预后不良的患者进行快速的进取/生物疗法。

在疾病发作时识别不太可能对csDMARD有响应的患者仍然是未满足的主要需求。改进早期临床分类标准的能力和识别随后在疾病发作时需要生物疗法的患者的能力将为最需要的患者提供分层治疗干预的机会。

因此，需要预测受试者是否需要类风湿性关节炎的生物疗法的方法，特别是在疾病发作时。还需要治疗类风湿性关节炎受试者的方法。

发明内容

本发明通过提供用于识别需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗的受试者的方法以及用于治疗如此识别的受试者的方法，如权利要求中所述，来解决上述现有技术问题。

本发明人研究了迄今为止最大的活检驱动的早期炎症性关节炎队列(200名患者)，并通过详细的滑膜细胞和分子表征，改进了ACR/EULAR疾病分类。此外，发明人已经识别了与淋巴髓样病理型相关的滑膜病理生物学标志物以及12个月时的生物疗法需求。值得注意的是，这些发现独立于症状开始的前12个月内的诊断时间，这表明所谓的“机会之窗”比6个月更宽，并且根据疾病发作时预后不良的滑膜病理生物学亚型对生物疗法进行早期分层可能会改善这些患者的结果。滑膜病理生物学标志物与逻辑回归模型的整合将预测准确性从78.8％提高到89-90％，并能够在疾病发作时识别随后需要生物疗法的患者。本发明人的方法使生物疗法能够在预后不良的患者中早开始。

在一个方面，本发明提供了用于识别需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗的受试者的方法，该方法包括以下步骤：(a)确定从受试者获得的一个或多个样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中该一种或多种生物标志物选自表1；和(b)将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应的参考值进行比较；其中与相应参考值相比的一种或多种生物标志物的水平指示需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗。

在另一个方面，本发明提供了用于识别需要用不同于改善病情抗风湿药(DMARD)或除此之外的类风湿性关节炎疗法治疗的受试者的方法，该方法包括以下步骤：(a)确定从受试者获得的一个或多个样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1；和(b)将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应的参考值进行比较；其中与相应参考值相比的一种或多种生物标志物的水平指示需要用不同于DMARD外或除DMARD之外的类风湿性关节炎的疗法进行治疗。

在另一个方面，本发明提供了用于识别可能是DMARD难治性受试者的方法，该方法包括以下步骤：(a)确定从受试者获得的一个或多个样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物选自表1；和(b)将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应的参考值进行比较；其中与相应参考值相比的一种或多种生物标志物的水平指示受试者是DMARD难治的。

在一个方面，本发明提供了为患有或怀疑患有类风湿性关节炎的受试者选择疗法的方法，该方法包括以下步骤：(a)确定从受试者获得的一个或多个样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1；(b)将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应的参考值进行比较；其中与相应参考值相比的一种或多种生物标志物的水平指示需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗。

在另一个方面，本发明提供了用于识别单独使用改善病情抗风湿药(DMARD)治疗类风湿性关节炎可能无效的受试者的方法，该方法包括以下步骤：(a)确定从受试者获得的一个或多个样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1；和(b)将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应的参考值进行比较；其中与相应参考值相比的一种或多种生物标志物的水平指示单独用DMARD治疗类风湿性关节炎无效。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表1的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71种或所有72种生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表1的所有生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表1的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71种或所有72种生物标志物组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表1的所有生物标志物组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物选自表2，并且与相应的参考值相比，一种或多种生物标志物的水平增加。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表2的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48种或所有49种生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表2的所有生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表2的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48种或所有49种生物标志物组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表2的所有生物标志物组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物选自表3，并且一种或多种生物标志物的水平与相应的参考值相比降低。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表3的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22种或所有23种生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表3的所有生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表3的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22种或所有23种生物标志物组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表3的所有生物标志物组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、CSF1、MMP3、IL20和MMP10中的一种或多种。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、CSF1、MMP3、IL20和MMP10。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、CSF1、MMP3、IL20、MMP10和NOG中的一种或多种。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、CSF1、MMP3、IL20、MMP10和NOG。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、LTB、HIVEP1、IL20、UBASH3A和MMP10中的一种或多种。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、LTB、HIVEP1、IL20、UBASH3A和MMP10。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、HIVEP1、IL20、MMP10、NOG和IFNB1中的一种或多种。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、HIVEP1、IL20、MMP10、NOG和IFNB1。

在一些实施方案中，该方法进一步包括确定受试者的一个或多个临床协变量并将一个或多个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。临床协变量可以例如选自由疾病活动评分(DAS)、DAS28、基线病理型、C-反应蛋白和触痛关节计数(TJC)组成的组。

在一些实施方案中，该方法进一步包括确定受试者的C反应蛋白和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定受试者的病理型、C反应蛋白、TJC和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、CSF1、MMP3、IL20和MMP10中的一种或多种，并且该方法进一步包括确定受试者的C反应蛋白和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、CSF1、MMP3、IL20和MMP10，该方法进一步包括确定受试者的C反应蛋白和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、CSF1、MMP3、IL20、MMP10和NOG中的一种或多种，并且该方法进一步包括确定受试者的病理型、C反应蛋白、TJC和DAS28临床协变量并比较每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、CSF1、MMP3、IL20、MMP10和NOG，并且该方法进一步包括确定受试者的病理型、C反应蛋白、TJC和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、LTB、HIVEP1、IL20、UBASH3A和MMP10中的一种或多种，并且该方法进一步包括确定受试者的C反应蛋白和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、LTB、HIVEP1、IL20、UBASH3A和MMP10，并且该方法进一步包括确定受试者的C反应蛋白和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、HIVEP1、IL20、MMP10、NOG和IFNB1中的一种或多种，并且该方法进一步包括确定受试者的病理型、C反应蛋白、TJC和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、HIVEP1、IL20、MMP10、NOG和IFNB1，并且该方法进一步包括确定受试者的病理型、C反应蛋白、TJC和DAS28临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、LTB、HIVEP1、IL20、UBASH3A、MMP10、NOG和IFNB1中的一种或多种。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包括含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、LTB、HIVEP1、IL20、UBASH3A、MMP10、NOG和IFNB1。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含GPR114、IL8、CSF1、MMP3、LTB、HIVEP1、IL20、UBASH3A、MMP10、NOG和IFNB1，并且该方法进一步包括确定受试者的病理型、C反应蛋白和TJC(以及任选地DAS28)临床协变量并将每个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。

用于本文所述方法的示例性生物标志物和/或临床协变量是实施例1和/或图6B中描述的那些。

在一些实施方案中，确定一种或多种生物标志物水平的步骤包括确定一种或多种生物标志物的基因表达水平。

在一些实施方案中，该水平是核酸水平。在一些实施方案中，核酸水平是mRNA水平。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平通过核酸的直接数字计数、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析或其组合来确定。

在一些实施方案中，该水平是蛋白质水平。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平通过免疫测定法、液相色谱质谱法(LC-MS)、比浊法、适体技术或其组合来确定。

在优选的实施方案中，受试者先前没有接受过类风湿性关节炎的治疗。在优选的实施方案中，受试者没有接受过改善病情抗风湿药(DMARD)和/或类固醇的治疗。

在一些实施方案中，受试者先前没有接受过改善病情抗风湿药(DMARD)的治疗。在一些实施方案中，受试者先前没有接受过类风湿性关节炎的生物疗法的治疗。在优选的实施方案中，受试者先前没有接受过改善病情抗风湿药(DMARD)或类风湿性关节炎的生物疗法的治疗。

在一些实施方案中，受试者被怀疑患有类风湿性关节炎。

在一些实施方案中，受试者已经出现类风湿性关节炎的一种或多种症状少于1年(例如少于9、8、7、6、5、4、3、2或1个月)。

在一些实施方案中，样品是滑膜样品。在一些实施方案中，样品是滑膜组织样品或滑液样品。

在一些实施方案中，样品通过滑膜活检，优选超声引导的滑膜活检获得。

在一些实施方案中，该方法进一步包括当识别受试者需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗时；受试者需要用不同于改善病情抗风湿药(DMARD)或除DMARD之外的类风湿性关节炎的疗法来治疗时；或者受试者是DMARD难治时，向受试者施用类风湿性关节炎的生物疗法。

在一些实施方案中，该方法进一步包括当识别受试者需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗时；受试者需要用不同于改善病情抗风湿药(DMARD)或除DMARD之外的类风湿性关节炎的疗法来治疗时；或者受试者是DMARD难治时，向受试者施用不同于改善病情抗风湿药(DMARD)或除DMARD之外的治疗剂。

在一些实施方案中，生物疗法是B细胞拮抗剂、Janus激酶(JAK)拮抗剂、肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂、诱饵TNF受体、T细胞共刺激信号拮抗剂、IL-1受体拮抗剂、IL-6受体拮抗剂或其组合。

在一些实施方案中，生物疗法是抗TNF-α疗法或抗CD20疗法。

在一些实施方案中，抗TNF-α疗法包含抗TNF-α抗体，优选阿达木单抗。

在一些实施方案中，抗CD20疗法包含抗CD20抗体，优选利妥昔单抗。

在一些实施方案中，生物疗法选自由阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、利妥昔单抗(rituximab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托珠单抗(tocilizumab)和托法替尼(tofacitinib)或其组合组成的组。

在一些实施方案中，DMARD选自由甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺吡啶、来氟米特、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素和麦考酚酸酯或其组合组成的的组。

在一些实施方案中，该方法进一步包括确定受试者是否展示出淋巴髓样病理型的步骤。

在另一个方面，本发明提供治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括通过前述权利要求中任一项的方法向受试者施用有效量的类风湿性关节炎的生物疗法，其中通过前述权利要求中任一项的方法已经识别该受试者需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗；需要用不同于改善病情抗风湿药(DMARD)或除DMARD之外的类风湿性关节炎的疗法来治疗；或者是DMARD难治的。

附图说明

图1

基线患者人口统计。(A)患者的基线分类。200名患者被分类为RA1987与未分类关节炎(UA)。然后将RA 2010ACR/EULAR标准应用于UA患者。获得的最终3组显示47名患者UA(RA 1987-/RA2010-)、RA 2010(RA1987-/RA2010+)、RA 1987(RA1987+/RA2010+)。(B)根据分类标准的人口统计。数据表示为连续变量的平均值(SD，标准偏差)以及分类变量的频率和百分比。适当使用Kruskal-Wallis或Fisher精确检验比较3组之间的基线特征。对于事后比较，运行了Dunn检验，并在表的最后3列中报告了成对比较的p值。ESR：红细胞沉降率；CRP：C反应蛋白；28TJC：28个触痛关节计数；28SJC：28个肿胀关节计数；DAS28：28个关节疾病活动评分；RF滴度：类风湿因子滴度(IU/ml)；ACPA滴度：抗瓜氨酸蛋白抗体滴度(IU/L)；RF+ve：类风湿因子血清阳性(>15IU/L)；ACPA +ve：抗瓜氨酸蛋白抗体(>20IU/L)。

图2

患者人口统计和疾病活动：病理型之间的比较。(A)每个关节MCP(掌指)、MTP(跖趾)、PIP(近端指间)的活检规程的数目。(B)滑膜病理型的代表性图像。H&E：苏木精和伊红。对切片进行免疫组织化学染色和半定量评分(0-4)以确定CD20+B细胞、CD3+ T细胞、CD68+衬里(l)和亚衬里(sl)巨噬细胞和CD138+浆细胞浸润的程度。切片分为三种病理型：(i)寡免疫(CD68 SL<2和或CD3、CD20、CD138<1)，(ii)弥漫性髓样：(CD68SL>2、CD20<1和或CD3>1)，和(iii)淋巴髓样：(2-3级CD20+聚集体，CD20>2)。箭头表示阳性染色细胞。空箭头表示B细胞聚集体。(C)病理型的人口统计分析。数据表示为数值变量的平均值和标准差(SD)，分类变量的频率和百分比。适当使用Kruskall-Wallis检验和Fisher检验(RF和ACPA阳性)比较3种病理型之间的基线特征。使用Dunn检验进行多重比较来进行显著差异的事后分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。(D)根据诊断时疾病持续时间(月)的病理型。绝对值(N)和百分比。P值<0.05被认为具有统计学意义。

图3

根据患者的临床分类，滑膜病理生物学的变化。(A)与病理型相比的基线临床分类。基线亚组(RA 1987、RA2010和UA)与病理型进行了比较。Fisher检验用于分析。(B)每个临床亚组的免疫细胞浸润。Kruskal-Wallis检验用于3组之间的比较。使用Dunn检验进行多重比较来进行显著差异的事后分析。(CE)用于亚组间比较的基因表达分析。用于比较的T检验和用于代表性图像的火山图。正值代表上调，负值代表下调。绿色水平线上方的绿色圆圈表示组间多分析表达基因的未校正。红线上方的红色圆圈表示用于多重分析的校正p值(Benjamini-Hochberg方法)。(C)火山图RA 1987与RA 2010：满足RA1987ACR标准和RA2010ACR/EULAR标准的患者之间的基因表达差异。(D)火山图RA 1987与UA：满足RA 1987ACR标准的患者与未分类关节炎之间的基因表达差异。(E)火山图RA 2010与UA：满足RA 2010ACR/EULAR标准的患者与UA之间的基因表达差异。

图4

疾病演变。(A)12个月随访后的患者分类。每个初始基线亚组(RA1987/RA2010/UA)随访12个月后的疾病结果。疾病演变分类为自限性或持续性疾病。对于1年后从UA队列重新分类的人所描述的其他诊断。(B)亚组的疾病演变。疾病演变与基线亚组(RA 1987、RA2010和UA)进行了比较。Fisher检验用于分析。(C)病理型的疾病演变。将疾病演变与病理型进行比较(寡免疫vs弥漫性髓样vs淋巴髓样。Fisher检验用于分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。

图5

(A)12个月随访时诊断亚组和治疗结果之间的比较。所需治疗分为3组：(i)不治疗；(ii)仅csDMARD，(iii)csDMARD+/-生物制剂。Fisher检验用于分析。(B)12个月时的病理型和治疗结果之间的比较。(C)基因表达分析，其在需要生物制剂的患者与非生物制剂组之间的火山图比较中表示。组间基因差异表达的T检验比较。正值代表上调，负值代表下调。调整后的(用于多重分析的Benjamini-Hochberg校正)P值<0.01认为具有统计学意义，表示为红线上方的点。多重分析未进行校正时，绿线上方的绿点表示基因表达显著性(P值<0.05)。(D)根据基线疾病持续时间的治疗结果。Fisher检验用于分析。(E)根据生物学患者队列基线疾病持续时间的病理型。Fisher检验用于分析。除非另有说明，否则P值<0.05认为具有统计学意义。

图6

预测模型。(A-B)临床和基因表达特点的识别可预测1年时生物疗法的使用。逻辑回归，再加上反向和逐步模型选择，在12个月时针对使用或不使用生物疗法的因变量应用于基线临床参数，以选择对预测贡献最大的临床协变量。将选定的协变量(119个基因+4个临床协变量)同时输入到带有L1正则化罚分(LASSO)的逻辑模型中，以确定最佳稀疏预测模型。当结果受到惩罚时(蓝色虚线，图6A)与未受到惩罚时(红色虚线，图6A)相比，模型在临床上的预测表现相似，但所选协变量集略有不同(图6B)。图6B显示了与LASSO回归选择的最终变量相关的非零权重。灰色空间表示模型未选择的变量。(C-D)来自最终glmnet拟合模型的λ训练曲线。红点表示使用10倍交叉验证的平均二项式偏差。误差线代表二项式偏差的标准误差。垂直虚线表示最小二项式偏差(λmin)和更正则化的模型，其中二项式偏差误差在最小二项式偏差(λ1se)的一个标准误差内。选择了λmin，其对应于LASSO最终模型中的11个非零系数，其中临床受到惩罚(图6C)以及LASSO最终模型中的13个非零系数，其中临床未受到惩罚(图6D)。

发明详述

如本文所用，术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“由...组成(comprised of)”与“包括(including)”或“包括(includes)”同义；或与“含有(containing)”或“含有(contains)”同义，并且是包容性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的成员、元素或步骤。术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“由...组成(comprised of)”还包括术语“由...组成(consisting of)”。

类风湿性关节炎(RA)

类风湿性关节炎(RA)是慢性全身性炎症性病症，可能影响许多组织和器官，但主要攻击滑膜关节。这是致残和痛苦的病况，如果没有得到充分治疗，可能会导致功能和活动能力的严重丧失。

该疾病过程涉及滑膜的炎症反应，继发于大量免疫细胞浸润和滑膜细胞增殖，滑液过多，以及攻击软骨和软骨下骨的滑膜中纤维组织(血管翳)的发育。这通常导致关节软骨的破坏和骨侵蚀的形成以及关节的继发性强直(融合)。RA还可以在肺、心包、胸膜、巩膜和结节性病变中产生弥漫性炎症，最常见于皮下组织。RA被认为是全身性自身免疫性疾病，因为自身免疫在其慢性和进展中起关键作用。

许多细胞类型与RA的病因有关，细胞类型包括T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和滑膜成纤维细胞。已知与RA相关的自身抗体包括靶向类风湿因子(RF)和抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)的抗体。

RA疗法

典型的新诊断RA的患者最初通常单独或组合使用非甾体抗炎药和疾病改变的抗风湿药(DMARD)，例如氢氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特或甲氨蝶呤(MTX)，来治疗。对一般DMARD无响应的患者可以称为DMARD难治性。

传统上，DMARD难治性患者通常进展为生物治疗剂，例如TNF-α拮抗剂，如阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗和英夫利昔单抗。对TNF-α拮抗剂疗法无响应的患者可称为TNF-α拮抗剂难治性或响应不足者(ir)。

本发明提供的细化早期临床分类标准的能力和识别在疾病发作时将需要生物疗法的患者的能力提供了对最需要的患者进行治疗干预分层的机会，并使生物疗法能够及早在预后不良的患者中开始。

如本文所用，术语“生物疗法”可以指能够治疗类风湿性关节炎的蛋白质药剂。用于类风湿性关节炎的示例性生物疗法在本领域是众所周知的，并且技术人员可以容易地选择合适的生物疗法。

在一些实施方案中，用于类风湿性关节炎的生物疗法是抗体。

在一些实施方案中，生物疗法是抗TNF-α疗法或抗CD20疗法。

在一些实施方案中，抗TNF-α疗法包括抗TNF-α抗体，优选阿达木单抗。

在一些实施方案中，生物疗法选自由阿达木单抗、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、托珠单抗和托法替尼或其组合组成的组。

抗TNF-α疗法

如本文所用，术语“抗TNF-α疗法”旨在涵盖其作用机制涉及抑制对TNF-α的生理响应的治疗物质的用途。

具体而言，抗TNF-α疗法包括TNF-抑制剂，其可以通过与TNF-α结合并抑制其与其受体结合的能力而起作用。TNF-抑制剂的实例包括抗TNF-α抗体和融合蛋白依那西普。

抗TNF-α抗体的实例包括阿达木单抗(Humira)、英夫利昔单抗(Remicade)、赛妥珠单抗(Cimzia)和戈利木单抗(Simponi)。

阿达木单抗是以商品名Humira销售的单克隆抗体，并用于治疗包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、慢性银屑病、化脓性汗腺炎和幼年特发性关节炎的病况。

赛妥珠单抗是单克隆抗体的片段，以商品名Cimzia作为certolizumab pegol出售。用于治疗克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎。

抗CD20疗法

如本文所用，术语“抗CD20疗法”旨在涵盖其作用机制涉及与CD20结合的治疗物质的用途。抗CD20疗法可能会干扰或抑制B细胞的发育和/或功能。抗CD20疗法可能导致B细胞消减或B细胞发育和成熟的抑制。

在一些实施方案中，抗CD20疗法包括抗CD20抗体(例如抗CD20单克隆抗体)，例如利妥昔单抗。

针对CD20的抗体可以与靶抗原结合，并通过引发细胞凋亡、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的混合物杀死在表面上表达它的细胞。

在一些实施方案中，抗CD20疗法选自由利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗和奥法木单抗组成的组。

在优选的实施方案中，抗CD20疗法是利妥昔单抗。

利妥昔单抗是针对CD20的嵌合小鼠/人免疫球蛋白G1(IgG1)单克隆抗体，可在与CD20结合后刺激B细胞破坏。利妥昔单抗经由包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)的机制从血液、骨髓和淋巴结中消减CD20表面阳性初始和记忆B细胞。它不影响骨髓中CD20阴性的早期B细胞谱系前体细胞和晚期B谱系浆细胞。

奥瑞珠单抗是人源化抗CD20单克隆抗体，经由包括ADCC和CDC的机制与CD20结合后导致CD20+B细胞消减。

维妥珠单抗是人源化的第二代抗CD20单克隆抗体，经由包括ADCC和CDC的机制在与CD20结合后导致CD20+B细胞消减。

奥法木单抗是针对CD20的人单克隆IgG1抗体，并且可以抑制早期B淋巴细胞活化。与利妥昔单抗靶向的表位相比，奥法木单抗靶向位于更靠近CD20的N端的不同表位，并且包括细胞外环，因为它与CD20分子的小环和大环结合。奥法木单抗通过ADCC和CDC途径刺激B细胞破坏。

B细胞

B细胞在RA的发病机制中起核心作用。

未成熟的B细胞在骨髓中产生。在骨髓中达到IgM⁺未成熟阶段后，这些未成熟B细胞迁移到次级淋巴组织(如脾脏、淋巴结)，在那里它们被称为过渡B细胞，并且其中一些细胞分化成成熟B淋巴细胞以及可能浆细胞。

B细胞可以由在B细胞发育和成熟的不同阶段表达的一系列细胞表面标志物定义(见下表)。这些B细胞标志物可以包括CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD27、CD38、CD40、CD72、CD79a和CD79b、CD138和免疫球蛋白(Ig)。

免疫球蛋白(Ig)是属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白，可识别外来抗原并促进免疫系统的体液应答。Ig可能以两种物理形式出现，一种是从细胞分泌的可溶形式，另一种是附着在B细胞表面的膜结合形式，其称为B细胞受体(BCR)。哺乳动物Ig可根据其拥有的重链分为五类(同种型)。从未接触过抗原的未成熟B细胞被称为初始B细胞，仅表达以细胞表面结合形式的IgM同种型。B细胞在成熟时开始表达IgM和IgD——这两种免疫球蛋白同种型的共表达使B细胞“成熟”并准备好对抗原作出应答。B细胞活化跟随细胞结合的抗体分子与抗原的结合，导致细胞分裂并分化成产生抗体的浆细胞。在这种活化形式中，B细胞开始以分泌形式而不是膜结合形式产生抗体。激活的B细胞的一些子细胞经历同种型转换，从IgM或IgD转变为在免疫系统中具有定义的作用的其他抗体同种型IgE、IgA或IgG。

CD19基本上由所有B谱系细胞表达，并通过放大Src家族激酶活性来调节细胞内信号转导。

CD20是成熟的B细胞特异性分子，作为嵌入膜的Ca²⁺通道发挥作用。CD20的表达限于从前B细胞阶段到最终分化为浆细胞的B细胞谱系。

CD22作为α2,6连接的唾液酸的哺乳动物凝集素发挥作用，其调节滤泡B细胞存活并负调节信号传导。

CD23是低亲和力的IgE受体，其在活化的B细胞上表达，影响IgE的产生。

CD24是GPI锚定糖蛋白，其是最早被识别的泛B细胞分子之一。

CD27是TNF受体超家族的成员。它与其配体CD70结合，在调节B细胞活化和免疫球蛋白合成中起关键作用。该受体转导导致NF-κB和MAPK8/JNK活化的信号。

CD38也称为环状ADP核糖水解酶。它是糖蛋白，在细胞粘附、信号转导和钙信号传导中也发挥作用，并且其通常是细胞活化的标志物。

CD40是生发中心(GC)B细胞的关键存活因子，并且是T细胞表达的CD154的配体。

CD72作为信号转导的负调节物和作为轴突导向因子(Semaphorin)4D(CD100)的B细胞配体发挥作用。

CD79a/CD79b二聚体与B细胞抗原受体密切相关，使细胞能够对其表面存在的抗原作出应答。CD79a/CD79b二聚体在B细胞的整个生命周期中都存在于其表面，而在所有其他健康细胞中均不存在。

CD138也称为联合蛋白聚糖(Syndecan)1。联合蛋白聚糖介导细胞结合、细胞信号传导和细胞骨架组织。CD138可用作浆细胞的细胞表面标志物。

RA患者对疗法的响应

评估受试者对类风湿性关节炎疗法的响应的方法是本领域已知的并且对于技术人员来说是熟悉的。

举例来说，RA中疾病活动的众所周知的测量包括疾病活动评分(DAS)、修改版DAS28和基于DAS的EULAR响应标准。

生物标志物

本发明提供了用于识别需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗的受试者的方法，该方法包括以下步骤：

(a)确定从受试者获得的一种或多种样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中一种或多种生物标志物选自表1；和

(b)将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应的参考值进行比较；

其中与相应参考值相比的一种或多种生物标志物的水平指示需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表1的所有72种生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表1的所有72种生物标志物组成。

表1.具有显著差异调节基因表达的生物标志物(在12m时，生物治疗与无生物治疗)。

本发明的进一步的生物标志物的各个示例性NCBI基因ID和核酸序列(NCBI登录号)包括：IL8(NCBI基因ID 3576；示例性NCBI登录号NM_000584.4)、LTB(NCBI基因ID 4050；示例性NCBI登录号NM_002341.2)、HIVEP1(NCBI基因ID 3096；示例性NCBI登录号NM_002114.4)、UBASH3A(NCBI基因ID 53347；示例性NCBI登录号NM_001001895.3)和IFNB1(NCBI基因ID 3456；示例性NCBI登录号NM_002176.4)。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表2的所有49种生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表2的所有49种生物标志物组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表2的一种或多种与B和T细胞增殖、分化和活化相关的基因(例如TNFRSF13C、CD79A、CD2和CD3E)。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含一种或多种选自TNFRSF13C、CD79A、CD2和CD3E的生物标志物。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含TNFRSF13C、CD79A、CD2和CD3E。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由一种或多种选自TNFRSF13C、CD79A、CD2和CD3E的生物标志物组成。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由TNFRSF13C、CD79A、CD2和CD3E组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表2的一种或多种与基质金属肽酶产生/调节相关的基因(例如MMP1)。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含MMP1。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由MMP1组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表2的一种或多种与细胞因子介导的细胞活化相关的基因(例如TNFA和TRAF3IP3)。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含一种或多种选自TNFA和TRAF3IP3的生物标志物。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含TNFA和TRAF3IP3。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由一种或多种选自TNFA和TRAF3IP3的生物标志物组成。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由TNFA和TRAF3IP3组成。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表2的一种或多种与破骨细胞生成抑制相关的基因(例如DEF6)。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含DEF6。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由DEF6组成。

表2.表1中上调的生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物包含来自表3的所有23种生物标志物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物由来自表3的所有23种生物标志物组成。

表3.表1中下调的生物标志物。

基因名
	DKK3
CSF1
	TMEM43
WNT11
	FGF9
IL17D
	MXRA7
FMOD
	PDGFA
CDC14B
	COMMD2
FKBP9
	PTPRZ1
NOG
	SERTAD4
SNCAIP
	SLC37A3
IGFBP6
	LHFP
CAV2
	GK5
IL20
	CILP

与对应的参考值相比，一种或多种生物标志物的水平增加可以例如是相对于参考值水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大。与对应的参考值相比，一种或多种生物标志物的水平增加可以例如是相对于参考值水平增加至少约1.1x、1.2x、1.3x、1.4x、1.5x、1.6x、1.7x、1.8x、1.9x、2x、2.1x、2.2x、2.3x、2.4x、2.5x、2.6x、2.7x、2.8x、2.9x、3x、3.5x、4x、4.5x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、30x、40x、50x、100x、500x或1000x。

与对应的参考值相比，一种或多种生物标志物的水平降低可以例如是相对于参考值水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含选自由以下项组成的组的生物标志物：CCL19、MMP1、TNFRSF17、PIM2、CXCL1、FCRL5、CD19、MMP10、SEL1L3、SIRPG、CD40LG、XBP1、SLAMF6、BTK、BTLA、TRAF3IP3、MAP4K1、SLC31A1、TNFA、TIGIT、CD180、DKK3、FGF9、NOG和CILP。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含CCL19。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含MMP1。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含TNFRSF17。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含PIM2。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含CXCL1。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含FCRL5。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含CD19。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含MMP10。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含SEL1L3。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含SIRPG。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含CD40LG。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含XBP1。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含SLAMF6。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含BTK。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含BTLA。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含TRAF3IP3。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含MAP4K1。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含SLC31A1。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含TNFA。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含TIGIT。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含CD180。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含DKK3。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含FGF9。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含NOG。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含CILP。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物不包含CCL19、MMP1、TNFRSF17、PIM2、CXCL1、FCRL5、CD19、MMP10、SEL1L3、SIRPG、CD40LG、XBP1、SLAMF6、BTK、BTLA、TRAF3IP3、MAP4K1、SLC31A1、TNFA、TIGIT、CD180、DKK3、FGF9、NOG和CILP。

额外临床协变量

本文公开的方法进一步可包括确定受试者的一个或多个临床协变量。或者或额外地，可能已经为受试者确定了一个或多个临床协变量。该方法可以包括将一个或多个临床协变量与一个或多个参考值进行比较。实例临床协变量包括疾病活动评分(DAS)、DAS28、基线病理型、C反应蛋白和触痛关节计数(TJC)。

在一些实施方案中，一种或多种临床协变量选自由疾病活动评分(DAS)、DAS28、基线病理型、C反应蛋白和触痛关节计数(TJC)组成的组。

在一些实施方案中，该方法进一步包括确定受试者的基线病例型的步骤。在一些实施方案中，已经确定了受试者的基线病例型。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定受试者是否展示出淋巴髓样病理型的步骤。

在一些实施方案中，淋巴髓样病理型指示需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗。

如本文所用，术语“病理型”可指以RA的病理、组织学和/或临床特点表征的RA亚型。此类的病理型包括但不限于淋巴病理型(例如以富含B细胞的聚集物表征)、髓样病理型(例如以主要的巨噬细胞浸润表征)和寡免疫纤维瘤病理型(例如以少量浸润的免疫细胞表征，但仍会在亚衬里层和衬里层中扩展成纤维细胞谱系细胞)。

确定一种或多种生物标志物的水平

用于确定生物标志物水平的方法是本领域众所周知的并且对于技术人员来说是熟悉的。

例如，生物标志物的水平可以通过测量生物标志物基因的基因表达(例如，使用RTPCR)或通过检测生物标志物基因的蛋白质产物(例如，使用免疫测定)来确定。

在一些实施方案中，该水平是核酸水平。在一些实施方案中，该核酸水平是mRNA水平。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平通过核酸的直接数字计数(例如通过纳米串，例如如本文实施例中所公开的)、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析或其组合来确定。

在一些实施方案中，该水平是蛋白质水平。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平通过免疫测定法、液相色谱-质谱法(LC-MS)、比浊法、适体技术或其组合来确定。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平是一种或多种生物标志物水平的平均值。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物水平的平均值是一种或多种生物标志物的标准化水平的平均值。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平是一种或多种生物标志物水平的中数。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物水平的中数是一种或多种生物标志物的标准化水平的中数。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的水平是一种或多种生物标志物对参考基因(例如ACTB、GAPDH、GUSB、HPRT 1、PGK1、RPL19、TUBB、TMEM55B或其组合)标准化的水平。

样品

本发明的方法在从受试者，例如疑似患有RA的患者，获得的一个或多个样品上进行。

样品可以从受试者的关节获得，例如从活检中获得。样品可以从受试者的滑膜组织样品中获得。

如本文所用，术语“滑膜样品”是指衍生自滑膜关节的样品。通常，滑膜样品衍生自RA患者的滑膜关节。滑膜样品可以是滑膜组织活检，并且在采集样品时滑膜关节可能展示出活性炎症。

用于获得样品，如滑膜组织样品的方法在本领域中是众所周知的并且对于技术人员来说是熟悉的。例如，可以使用如超声(US)引导的活检技术来获得组织样品。

参考值

本发明的方法包括将一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应参考值进行比较的步骤。

如本文所用，术语“参考值”可以指与另一表达水平(例如本文公开的一种或多种生物标志物的水平)进行比较的表达水平(例如以进行诊断(例如预测和/或预后)和/或治疗的决定)。

例如，参考值可以衍生自参考群体中的表达水平(例如参考群体中的中数表达水平)，例如尚未接受RA疗法治疗的患有RA的患者群体；参考样品；和/或预先指定的值(例如，预先确定的临界值以显著区分需要类风湿性关节炎生物疗法的第一子集个体和不需要生物疗法的第二子集个体)。

在一些实施方案中，临界值可以是参考群体中的中数或平均表达水平。在一些实施方案中，参考水平可以是参考群体中表达水平的前40％、前30％、前20％、前10％、前5％或前1％。

相应的参考值可以衍生自没有RA的受试者，例如患有骨关节炎(OA)的受试者。

参考值可以，例如基于受试者对照群体,例如5、10、100、1000或更多受试者(他们可以与测试受试者是年龄和/或性别匹配的或不匹配)中生物标志物的平均或中数水平。

在某些实施例中，参考值可能已经预先确定，或者可以计算或外推而不必针对获得的每个测试样品对对照样品进行相应的确定。

受试者

在优选的实施方案中，受试者是人。

在优选的实施方案中，受试者是成年人。在一些实施方案中，受试者可以是儿童或婴儿。

在优选的实施方案中，受试者先前没有接受过类风湿性关节炎的治疗。优选地，受试者未接受过疾病改变的抗风湿药(DMARD)和/或类固醇的治疗。

在一些实施方案中，受试者先前没有接受过疾病改变的抗风湿药(DMARD)的治疗。在一些实施方案中，受试者先前没有接受过类风湿性关节炎的生物疗法治疗。在优选的实施方案中，受试者先前没有接受过疾病改变的抗风湿药(DMARD)或类风湿性关节炎的生物疗法治疗。

在一些实施方案中，受试者被怀疑患有类风湿性关节炎。在一些实施方案中，受试者已经出现与RA相关的一种或多种症状。在一些实施方案中，已被诊断患有类风湿性关节炎(RA)。

在一些实施方案中，受试者已经出现类风湿性关节炎的一种或多种症状少于1年，例如少于11、10、9、8、7、6、5、4或3个月。

抗体

本文使用的术语“抗体”是指抗体或其功能片段。功能性片段是指抗体的任何部分，其保留与亲本抗体结合相同抗原靶的能力。

如本文所用，“抗体”是指具有包含至少一个互补决定区(CDR)的抗原结合位点的多肽。该抗体可以包含3个CDR并且具有与结构域抗体(dAb)等效的抗原结合位点。该抗体可以包含6个CDR并且具有与经典抗体分子等效的抗原结合位点。多肽的其余部分可以是为抗原结合位点提供合适的支架并以合适的方式展示它以结合抗原的任何序列。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其部分，如Fab、F(ab)'2、Fv、单链Fv(ScFv)片段或纳米抗体。抗体可以是抗体和另一种药剂或抗体的缀合物，例如抗体可以缀合至聚合物(例如PEG)、毒素或标记物。抗体可以是双功能抗体。抗体可以是非人的、嵌合的、人源化的或完全人的。

治疗方法

本发明还提供了治疗类风湿性关节炎受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的类风湿性关节炎生物疗法，其中该受试者通过本文所公开的本发明的方法已被识别为需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗。

类风湿性关节炎的生物疗法可以是如本文所公开的生物疗法。

试剂盒

本发明还提供了适用于进行本文所公开的方法的试剂盒。特别地，该试剂盒可包含适用于检测本文所公开的生物标志物或如本文所公开的生物标志物组合的试剂。

本领域技术人员将理解，他们可以组合本文所公开的本发明的所有特点而不背离所公开的本发明的范围。

现在将通过非限制性实例来描述本发明的优选特点和实施方案。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中进行了解释。参见例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements)Current Protocols inMolecular Biology,Ch.9,13and 16,John Wiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.and Kahn,A.(1996)DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；Polak,J.M.and McGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,Oxford University Press；Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach,IRL Press；和Lilley,D.M.and Dahlberg,J.E.(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press。这些通用文本中的每一篇都通过引用并入本文。

实施例

实施例1

方法

患者

在Barts Health NHS Trust招募的连续200名炎性关节炎患者作为早期关节炎队列的多中心病理学的一部分(http://www.peac-mrc.mds.qmul.ac.uk)被纳入研究。患者未接受过治疗(csDMARD和类固醇)并且症状<1年。

在基线时，患者经历了常规人口统计数据的收集，并根据以下标准进行分类：(i)RA1987(Arnett FC et al.(1987)THE AMERICAN RHEUMATISM ASSOCIATION 1987REVISEDCRITERIA FOR THE CLASSIFICATION OF RHEUMATOID ARTHRITIS)或(ii)UA。然后应用2010年ACR/EULAR RA标准(Aletaha D et al.(2010)Rheumatoid arthritis classificationcriteria :an American College of Rheumatology/European League AgainstRheumatismcollaborative initiative 1580–8)对UA患者进行进一步分类，导致三个组：(i)RA1987(RA1987+/RA2010+)，(ii)RA2010(RA1987-/RA2010+)和(iii)UA(RA1987-/RA2010-)。对临床活动关节进行了超声(US)引导的滑膜活检(Kelly S et al.(2013)AnnRheum Dis 74:611–7)。然后，患者开始接受标准的常规合成(cs)DMARD疗法，并用达标(treat-to-target)治疗方法进行治疗升级(DAS28<3.2)。csDMARD疗法失败的患者如果在疗法6个月后继续具有DAS28>5.1，则根据现行的英国国家临床卓越研究所(NICE)处方算法开始生物疗法(抗TNF、托珠单抗或利妥昔单抗)(Overview|Rheumatoid arthritis inadults:management|Guidance|NICE.https://www.nice.org.uk/guidance/ng100(accessed 2Jul 2019))。在12个月的随访中，患者按如下分类：i.自限性(SL)疾病(DAS28<3.2和关闭csDMARD/类固醇疗法)与持续性疾病(PD)(DAS28>3.2和/或csDMARD)和ii.对症治疗(非甾体抗炎药)治疗与csDMARD疗法与生物制剂+/-csDMARD疗法。

滑膜活检采集和处理

为每位患者收集至少6份活检组织用于石蜡包埋，如果识别完整的衬里层，则进行组织病理学评估。滑膜炎评分使用先前验证的评分系统确定(Krenn V et al.(2006)Histopathology 49:358–64)。在使用先前报道的B细胞(CD20)、T细胞(CD3)、巨噬细胞(CD68)和浆细胞(CD138)的方案对顺序切割的载玻片进行免疫组织化学染色后，半定量评估免疫细胞浸润程度(0-4)(Humby F et al.(2009)PLoS Med 6:0059-75)。根据以下标准将活检组织分为3种滑膜病理型中的1种：i)淋巴髓样存在2-3级CD20+聚集物，(CD20≥2)和/或CD138>2ii)弥漫性髓样CD68 SL≥2、CD20≤1和/或CD3≥1、CD138≤2和iii)寡免疫CD68 SL<2和CD3、CD20、CD138<1

纳米串分析

立即将每位患者至少6个滑膜样品浸入RNA-Later中，并如所述进行RNA提取(Humby F et al.(2019)Ann Rheum Dis annrheumdis-2018-214539,doi:10.1136/annrheumdis-2018-214539)。RNA样品随后进行了238个基因的表达谱分析，这些基因是基于先前对已确诊RA患者滑膜组织的微阵列分析预先选择的(Dennis G et al.(2014)Arthritis Res Ther 16:R90)和/或与RA发病机制的相关性进行了预选。使用R 3.2.0中的纳米串QCPro包处理原始纳米串计数。通过全局基因计数归一化将计数对于RNA含量进行归一化，然后进行对数转换(base 2)。然后经由归一化计数的箱形图和散点图检查归一化的有效性。Benjamini-Hochberg方法用于调整多重测试，如果基因展示FDR调整的p值<0.01，则认为基因存在差异表达。

统计分析

使用R.3.0.2进行统计分析。对于三向比较，Kruskal-Wallis检验用于连续和卡方检验，或者适当地对分类变量使用Fisher精确检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。适当使用Dunn检验或Bonferroni校正进行事后比较检验。

线性回归模型：使用R中的glm函数采用使用前向、后向和双向逐步选择的逻辑回归。

使用R包glmnet通过L1(LASSO)稀疏逻辑回归选择基因表达预测因子。惩罚参数λ使用10倍交叉验证进行优化。对应于最小平均交叉验证误差的λ被保留为模型中的最终惩罚参数。

预测性能评估：使用95％CI的表观和内部验证通过计算接受者操作特征曲线(AUC)下的面积来评估最终预测模型的预测性能。使用自举方法进行内部验证(Smith GCSet al.(2014)Am J Epidemiol 180:318–24；Efron B et al.An introduction to thebootstrap.Chapman&Hall 1994.https://www.crcpress.com/An-Introduction-to-the-Bootstrap/Efron-Tibshirani/p/book/9780412042317(accessed 27Feb 2019))(使用R包引导版本1.3-18进行)用于校正过度拟合，以产生具有低绝对误差的C统计量(AUC)的无偏见优化调整估量。AUC统计量的自举估量是通过随机抽样和替换500次计算的，以实现对优化校正AUC的估量。

结果

患者人口统计学和临床相关性

纳入了200名PEAC患者，128/200(64％)的患者被归类为RA1987(RA1987+/RA2010+)，72/200(36％)的患者被归类为UA。在UA患者中，25名进一步分类为RA2010(RA1987-/RA2010+)(25/200，12.5％)，47名仍为UA(RA1987-/RA2010-)(47/200，23.5％)(图1A)。组间的平均年龄、疾病持续时间或ESR没有展示出显著差异。然而，与RA2010或UA组相比，RA1987组的CRP、TJC、SJC、DAS28、RF、ACPA和VAS水平显著升高，RF和ACPA血清阳性的患者数量显著增加(图1B)。SJC和ACPA滴度是RA2010和UA组之间唯一具有显著差异的临床参数，表明就疾病活动的临床测量而言，这两组相对同质。

滑膜病理型区分临床表型，与疾病持续时间无关

滑膜活检主要来自小关节(81.5％)(图2A)。滑膜组织适合组织学分析(166/200)的患者根据基线滑膜病理型(图2B)和评估的临床参数差异进行隔离。与弥漫性髓样或寡免疫组相比，我们展示了淋巴髓样内的平均DAS28显著更高(5.82与4.93与4.86，p<0.001)。与寡免疫组相比，淋巴髓样和弥漫性髓样组的平均CRP显著更高(16.86与15.52与9.55，p<0.001)，并且在淋巴髓样组内RF(p＝0.012)或ACPA血清阳性的患者数量显著增加(p＝0.011)(图2C)。为了评估疾病持续时间是否影响滑膜病理型的患病率，根据在基线时的疾病持续时间(1-3m、4-6m、7-9m和10-12m)和确定的滑膜病理型的频率将患者分为四组。在每个时间点滑膜病理型频率没有显著差异(p＝0.65)(图2D)。

与RA2010和UA患者相比，RA1987患者显示滑膜免疫细胞浸润水平显著升高

患者根据病理型进行分离，并进一步分为RA1987、RA2010和UA类别。RA1987组中较高比例的患者被归类为淋巴髓样(相对于弥漫性髓样或寡免疫)(43.5％与33％与23.5％)(图3A)。我们还证明了RA1987组与RA2010和UA组之间的平均滑膜炎、CD3+ T细胞、CD20+B细胞、CD138+浆细胞和CD68+SL/L巨噬细胞评分显著更高(p<0.001)(图3B)。我们发现RA2010和UA组之间的滑膜炎评分、平均CD3+ T、CD20+B、CD68+L或SL巨噬细胞或CD138+浆细胞数量没有显著差异(图3B)，表明这两组在组织病理学方面相对同质。

与RA2010/UA组相比，RA1987患者中调节B细胞活化和功能的滑膜基因显著上调。

145/200名患者的RNA可用于纳米串分析(95/128的RA1987、12/25的RA2010和38/47的UA患者)，并分析了组间差异基因表达(238个基因)。

比较RA1987与RA2010组，我们展示了53个基因的显著差异表达(图3C)。与组织学分析一致，RA1987队列中的许多差异上调基因参与介导B细胞活化/功能(例如CD79A、CD38、IGJ、CXCL13、IRF4、CCL19、CD38、TNFA和IL6)。在评估RA1987和UA组之间的基因表达时，我们发现了RA1987队列中许多基因的差异上调介导B细胞活化/功能的类似的趋势，尽管在多重比较校正后只有CXCL13仍然显著(图3D)。相反，在评估RA2010和UA队列之间的基因表达时，只有7个基因表现出显著性，在RA2010队列介导软骨生物学(COMP、DKK3、INHBA)中差异上调基因占优势，并且在多重比较校正后没有一个保持显著性(图3E)。

疾病发作时分类为RA1987标准预测12个月时疾病持续存在

190/200名患者有12个月的随访数据可用，我们检查了基线滑膜病理型是否与疾病演变相关。119/121(99％)的RA1987患者和19/22(90％)的RA2010患者患有PD(图4A)。在UA队列中，11/47(23％)有其他诊断。在其余36名患者中，26/36(72.2％)名患有PD，10/36(27.8％)患有SL。4/26(15.3％)患有PD的UA患者在12个月时进展到满足2010ACR/EULAR标准RA。结果展示，与RA2010或RA1987组相比，UA组中患有SL疾病的患者比例显著更高，并且RA1987组中患有PD的患者数量显著更高(图4B)。在评估基线病理型的影响时，我们展示了患有PD的有淋巴髓样相比弥漫性髓样或寡免疫病理型的患者比例(39％与32％与13％)更高，并且患SL的有弥漫性髓样相比淋巴髓样或寡免疫病理型的患者比例(54％与18％与27％)更高(图4C)。

基线淋巴髓样病变与12个月的生物疗法需求显著相关。

根据诊断组或病理型分层的患者根据12个月的治疗需求进一步分类：i.对症治疗，ii.csDMARD或iii.生物制剂+/-csDMARD。与RA2010和UA相比，需要生物制剂的RA1987患者比例显著更高(27.82％与20.83％与10.63％)(p<0.001)(图5A)，重要的是，淋巴髓样(与弥漫性髓样或寡免疫)病理型与需要12个月的生物疗法显著相关(57％与21％与21％p＝0.02)(图5B)。

然后，我们比较了需要生物疗法的患者(n＝34)或不需要的患者(n＝106)的纳米串板中238个基因的表达，发现了119个差异表达的基因。需要生物疗法的患者对调节B和T细胞增殖的基因、分化和活化的基因(例如TNFRSF13C、CD79A、CD2、CD3E和CD38)、参与基质金属肽酶产生/调节的基因(例如MMP1和TIMP1)、参与细胞因子介导的细胞活化的基因(TNFA、TRAF3IP3、IFNA1)和破骨细胞生成抑制的基因(DEF6)具有显著更高的差异上调。不需要生物疗法的患者表达了一些B和T细胞调节基因和B增殖标志物，但主要是成纤维细胞增殖和软骨更新的标志物(图5C)。

为了确定疾病持续时间是否影响结果，我们根据12个月的治疗(生物疗法与否)将患者分离，并进一步分为疾病持续时间四分位数(图5D)，并且在诊断时的疾病持续时间方面没有展示显著差异。接下来，我们根据疾病持续时间的四分位数和滑膜病理型对接受生物疗法的患者(n＝39)进行分离。我们发现每个四分位数的患者人数没有显著差异(P＝0.3)(图5E)。这些结果强烈表明滑膜病理型而不是疾病持续时间会影响12个月的治疗结果。

滑膜基因表达签名提高了生物需求临床预测模型的性能

为了确定基线临床和基因表达数据是否可以组合成预测生物疗法需求的模型，我们使用了两种互补方法：逻辑回归模型来识别预测性临床协变量，以及基于逻辑回归和L1正则化罚分(LASSO)方法惩罚来识别改善临床模型的基因。

9个基线临床协变量被认为是回归模型中的候选者：疾病持续时间、ESR、CRP、RF、ACPA、TJC、SJC、DAS28和病理型(两类，淋巴髓样与寡免疫/弥漫性髓样)。使用向后向前和双向逐步选择的逻辑回归模型导致选择同一组临床协变量：DAS28、病理型、CRP和TJC。通过AUC评估的模型的表观预测性能为0.78(95％CI＝0.70-0.87)。

选择基因以使用逻辑回归改善临床模型，并将L1正则化罚分(LASSO)应用于由先前逻辑回归选择的4个临床协变量，以及被确定为在生物制剂组和非生物制剂组之间显著差异表达的119个基因。比较了临床预测因子受到惩罚或进行强制纳入的模型。当所有预测因子都受到惩罚时，最终模型中保留了11个预测因子，当临床协变量未受到惩罚时，保留了13个预测因子(图6A)。在惩罚和未惩罚的临床模型中，表观预测性能都得到了改善(表观AUC＝0.89,95％CI＝0.83-0.95和AUC＝0.90,95％CI＝0.84-0.95)(图6B)。我们额外地进行了内部验证，通过自举抽样计算每个模型的AUC的优化，并从原始数据集中进行替换，从而校正过度拟合的AUC性能测量。纯临床模型的优化校正的AUC为0.75，临床和基因模型(LASSO)为0.81(图6C和6D)，这表明在模型中包括临床协变量和基因改善模型的预测能力。

模型中使用的基因如下表所示。

表4.基因表达的显著差异调节(在12m时进行生物治疗与未进行生物治疗)。

讨论

这些结果强烈表明，不符合RA1987标准的早期炎症性关节炎患者显示出相似的临床、滑膜组织学和分子特征，而不管根据RA2010或UA标准的进一步分类。这些数据还表明，无论临床分类如何，疾病发作时的淋巴髓样病理型预测患者随后需要生物疗法的不良结果，最后将组织学和分子特征整合到临床预测模型中提高了预测患者是否需要生物疗法的敏感性/特异性。

数据显示RA2010+/RA1987-组中需要生物疗法的患者比例较低，符合ACR/EULAR2010标准，能够早期诊断并因此获得有效治疗。但是，也有可能该组从一开始就具有较温和的病理学。

尽管滑膜病理型本身似乎不能区分有发展为PD而不是SL疾病风险的患者。然而，当应用12个月的生物学要求作为预后结果时，我们展示在疾病发作时具有富含B细胞的致密滑膜浸润和T/B细胞基因显著上调的淋巴髓样病理型的患者预测了后续生物学疗法的要求，并且关键这与疾病持续时间无关。目前的研究表明，在12个月的随访中，被归类为淋巴髓样病理型的患者需要生物疗法的比例显著增加。该研究还质疑当前围绕所有RA患者的“早期机会窗口”的教条，这表明病理型而不是简单的疾病持续时间会影响结果，并且强化治疗方案应该针对预后不良的病理型。这一观点得到了以下展示的支持：将滑膜组织学和分子标志物整合到用于生物制剂的临床预测模型中，独立于疾病持续时间将敏感性/特异性从78.8％提高到89-90％。

与先前报道的数据不一致，表明滑膜异质性与临床表型无关，这可能是因为在我们的研究中，大多数活检是在小关节上进行的，而在该队列中，关节镜活检仅限于主要是大关节受累的患者，因此，有潜在的选择偏差。额外地，迄今为止报告的最大的活检驱动的早期关节炎队列中的配对组织学和分子数据确保了内部验证和高分类准确性。

我们的结果是稳健的，并表明与1987年标准相比，新的RA2010分类标准的引入为早期患者分类带来了额外的临床和生物学异质性，仅RA2010标准预测不良结果的能力有限。滑膜病理生物学标志物整合到临床算法中预测不良结果(生物疗法要求)与疾病持续时间无关的展示表明，“机会之窗”大于6个月，并且在疾病发作时根据预后不良的滑膜病理生物学的亚型对生物疗法进行早期分层可能会改善这些患者的预后。

上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明公开的方法的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管本发明已经结合具体的优选实施方案进行了公开，但应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体实施方案。实际上，对本领域技术人员来说显而易见的用于实施本发明的公开模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.用于识别需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)确定从所述受试者获得的一种或多种样品中的一种或多种生物标志物的水平，其中所述一种或多种生物标志物选自表1；和

(b)将所述一种或多种生物标志物的水平与一种或多种相应的参考值进行比较；

其中与所述相应参考值相比的所述一种或多种生物标志物的水平指示需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包含来自表1的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71种或所有72种生物标志物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自表2并且所述一种或多种生物标志物的水平与所述相应的参考值相比增加，任选地，其中所述一种或多种生物标志物包含来自表2的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48种或所有49种生物标志物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自表3并且所述一种或多种生物标志物的水平与所述相应的参考值相比降低，任选地，其中所述一种或多种生物标志物包含来自表3的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22种或所有23种生物标志物。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中确定所述一种或多种生物标志物水平的步骤包括确定所述一种或多种生物标志物的基因表达水平。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水平是核酸水平，任选地，其中所述核酸水平是mRNA水平。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物的水平通过核酸的直接数字计数、RNA-seq、RT-qPCR、qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析或其组合来确定。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者先前没有接受过改善病情抗风湿药(Disease-Modifying Anti-Rheumatic Drug，DMARD)或类风湿性关节炎的生物疗法的治疗。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者已经出现一种或多种类风湿性关节炎症状少于1年。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是滑膜样品，任选地其中所述样品是滑膜组织样品或滑液样品。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括当所述受试者被识别为需要用类风湿性关节炎的生物疗法进行治疗时，向所述受试者施用类风湿性关节炎的生物疗法。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物疗法是B细胞拮抗剂、Janus激酶(JAK)拮抗剂、肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂、诱饵TNF受体、T细胞共刺激信号拮抗剂、IL-1受体拮抗剂、IL-6受体拮抗剂或其组合。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物疗法是抗TNF-α疗法或抗CD20疗法。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物疗法选自由阿达木单抗、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、托珠单抗和托法替尼或其组合组成的组。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述受试者是否展示出淋巴-髓样病理型的步骤。

16.治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的类风湿性关节炎的生物疗法，其中通过前述权利要求中任一项的方法已识别所述受试者需要用类风湿性关节炎的生物疗法治疗。