CN115038337A - 甘蔗秸秆或甘蔗渣的多功能提取物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了甘蔗秸秆或甘蔗渣的提取物、制备该提取物的方法以及该提取物在可用作多功能成分的具有抗氧化活性、抗炎活性和抗微生物活性的组合物中的用途。进一步提供了使用该提取物治疗或改善涉及氧化、炎症、皮肤和食物酶抑制活性能力和微生物生长的病症的方法。
Description
技术领域
本公开涉及甘蔗秸秆或甘蔗渣的多功能提取物、制备所述提取物的方法以及它们作为抗氧化剂、抗炎剂、皮肤和食物酶抑制活性能力和抗微生物剂的用途。
背景技术
甘蔗秸秆和甘蔗渣是制糖和工业发酵的副产品。仅在巴西和印度,甘蔗工业每年就产生8亿公吨这些甘蔗副产品。甘蔗渣和秸秆目前被认为是废物,并且甘蔗生产公司在处理它们时会产生巨大的成本。这些副产品的新型高价值用途将为生产这些副产品的公司带来环境效益和经济收益(来自新用途的额外收入以及减少或消除与处置副产品相关的成本)。
已知甘蔗秸秆和甘蔗渣含有多种商业上感兴趣的化合物,包括纤维素、半纤维素、木质素、糖、淀粉、蜡、氨基酸、有机酸、矿物质和酚类化合物。这些类型的提取物通常被称为抗氧化剂,但它们具有其它特性,并且可用于开发用于化妆品和食品应用的多功能成分。
公开这些事实是为了说明本公开所解决的技术问题。
发明内容
本公开描述了甘蔗秸秆或甘蔗渣的多功能提取物、制备提取物的方法以及使用提取物的方法。具体地,提取物具有多种生物活性,包括抗氧化活性、抗炎活性、皮肤和食物酶抑制活性能力和抗菌活性。
在一个方面,本公开描述了一种从甘蔗渣制备提取物的方法,包括以下步骤:干燥甘蔗渣;碾磨干燥的甘蔗渣;将碾碎的甘蔗渣与包含溶剂的溶液混合;搅拌甘蔗渣溶剂混合物;分离混合物的液体部分和固体部分;和浓缩液体部分并且干燥液体,得到提取物。
在一个实施方式中,甘蔗渣在大于30℃的温度下干燥。在另一个实施方式中,甘蔗渣在约40℃的温度下干燥。在又一个实施方式中,将干燥的甘蔗渣碾磨至约2mm至4mm范围内的平均尺寸。在另外的实施方式中,溶剂选自丙酮、二氯甲烷、乙醇和甲醇或其组合。在优选的实施方式中,包含溶剂的溶液包含乙醇。在本发明的一个实施方式中,将甘蔗渣乙醇混合物搅拌至少24小时。在另一个实施方式中,在室温下,优选在20℃至22℃范围内的温度下搅拌甘蔗渣乙醇混合物。在进一步的实施方式中,通过纱布过滤分离液体和固体部分。在另一个实施方式中,浓缩而不冻干液体部分。
在本公开的另一个方面,描述了一种从甘蔗秸秆制备提取物的方法,包括以下步骤:干燥秸秆;碾磨干燥的秸杆;将碾碎的秸杆与包含溶剂的溶液混合;搅拌秸杆溶剂混合物;分离混合物的液体部分和固体部分;将液体部分冻干以获得提取物。在另一个实施方式中,浓缩而不冻干液体部分。
在一个实施方式中,在大于30℃的温度下干燥秸秆。在另一个实施方式中,在约40℃的温度下干燥秸秆。在另一个实施方式中,将干燥的秸杆碾磨至为约2mm至4mm的平均尺寸。在又一个实施方式中,溶剂选自丙酮、二氯甲烷、乙醇和甲醇或其组合。在优选的实施方式中,溶剂包括乙醇。在进一步的实施方式中,将秸秆溶剂混合物搅拌至少24小时。在另一个实施方式中,在室温下,优选在20℃至22℃范围内的温度下搅拌秸秆乙醇混合物。在其它实施方式中,通过纱布过滤分离液体和固体部分。在另一个实施方式中,浓缩而不冻干液体部分。
在另一方面,本公开描述了通过任何本文公开的方法制备的多功能提取物。在另一个实施方式中,本发明是含有该提取物的化妆品成分。在进一步的实施方式中,化妆品包含至少1.25mg/mL提取物。
在另一方面,本公开描述了一种减少受试者皮肤上的细菌的方法,包括以下步骤:将含有提取物的化妆品施用于受试者的皮肤。在另一个实施方式中,本公开描述了一种包含提取物的抗炎组合物。在又一个实施方式中,抗炎组合物含有至少1.25mg/mL提取物。在进一步的实施方式中,本发明提供了一种减轻受试者炎症的方法,包括以下步骤:向受试者给予抗炎组合物。在另一个实施方式中,给予包含局部施用抗炎组合物。
在另一方面,本公开描述了一种含有提取物的防晒霜。在一个实施方式中,抗衰老成分含有至少1.25mg/mL提取物。在另一个实施方式中,本公开描述了一种保护受试者皮肤免受UV光损伤的方法,包括以下步骤:在暴露于UV光之前,将成分施用到受试者的皮肤。在另一个实施方式中,本公开描述了一种保护皮肤免受衰老迹象的方法。
在又一方面,本公开描述了一种多功能甘蔗渣提取物,其含有约2%至8%的纤维二糖、约2%至10%的葡萄糖、不大于约2%的木糖、不大于1%的半乳糖、不大于0.1%的阿拉伯糖、不大于15%的果糖、不大于6%的甘露醇。在一个实施方式中,甘蔗渣提取物还含有不大于4%的苹果酸、不大于5%的琥珀酸和不大于3%的甲酸。在又一个实施方式中,甘蔗渣提取物含有不大于1%的绿原酸、不大于1%的反式-5-咖啡酰奎宁酸、不大于10%的反式-3-阿魏酰奎宁酸、不大于1%的阿魏酰奎宁酸、不大于1%的阿魏酰葡糖二酸、不大于1%的对香豆酸、不大于1%的反式阿魏酸、不大于1%的香叶木素-6-C-葡萄糖苷、不大于1%的麦黄酮-7-O-葡糖苷酸硫酸酯和不大于1%的松果酸(pinellic acid)。
在进一步的方面,本公开描述了一种多功能甘蔗秸秆提取物,其含有不大于2%的纤维二糖、约1%至8%的葡萄糖、不大于约1%的木糖、不大于2%的阿拉伯糖、不大于12%的果糖和不大于6%的甘露糖醇。在一个实施方式中,甘蔗秸秆提取物还含有约5%至约12%的苹果酸、约3%至20%的琥珀酸和不大于10%的甲酸。在另一个实施方式中,甘蔗秸秆提取物含有不大于1%的绿原酸、不大于1%的反式-5-咖啡酰奎宁酸、不大于1%的反式-3-阿魏酰奎宁酸、不大于1%的阿魏酰奎宁酸、不大于1%的阿魏酰葡糖二酸、不大于1%的对香豆酸、不大于1%的反式阿魏酸、不大于1%的香叶木素-6-C-葡萄糖苷、不大于1%的麦黄酮-7-O-葡糖苷酸硫酸酯和不大于1%的松果酸。
在一个实施方式中,本公开描述了一种含有多功能甘蔗渣或多功能甘蔗秸秆提取物的食品。在进一步的实施方式中,含有甘蔗渣提取物或甘蔗秸秆提取物的食品是动物饲料。
在一个实施方式中,从甘蔗渣或甘蔗秸秆制备提取物的方法包括:
获得干燥的甘蔗渣或干燥的甘蔗秸秆;
碾磨干燥的甘蔗渣或干燥的秸秆;
将碾碎的甘蔗渣或秸秆与包含溶剂的溶液混合以形成混合物;
搅拌混合物;
分离混合物的液体部分和固体部分;
浓缩液体部分以获得提取物;
可选地干燥液体部分以获得干提取物。
在一个实施方式中,甘蔗渣或秸秆在不低于30℃的温度下干燥,优选在约40℃的温度下干燥。
在一个实施方式中,将干燥的甘蔗渣或干燥的秸杆碾磨至2mm至4mm的尺寸。
在一个实施方式中,溶剂选自丙酮、二氯甲烷、乙醇、甲醇或它们的组合。
在一个实施方式中,包含溶剂的溶液包含乙醇。
在一个实施方式中,将混合物搅拌至少24小时。
在一个实施方式中,在20℃至22℃的温度下搅拌混合物。
在一个实施方式中,通过过滤,优选通过纱布过滤分离液体部分和固体部分。
在一个实施方式中,通过如上的从甘蔗渣或甘蔗秸秆制备提取物的方法获得提取物。
在一个实施方式中,提取物用于医药或兽医。
在一个实施方式中,提取物用于治疗或预防炎性疾病或炎性症状,特别是皮肤炎性疾病,如痤疮。
在一个实施方式中,提取物用于抑制或降低皮肤酶活性、作为抗衰老剂、保护皮肤免受UV光损伤、作为抗氧化剂、作为抗微生物剂和/或作为抗痘剂。
在一个实施方式中,提取物包含约2%(wt/wt)至8%(wt/wt)的纤维二糖、约2%(wt/wt)至10%(wt/wt)的葡萄糖、不大于约2%(wt/wt)的木糖、不大于1%(wt/wt)的半乳糖、不大于0.1%(wt/wt)的阿拉伯糖、不大于15%(wt/wt)的果糖和不大于6%(wt/wt)的甘露糖醇。
在一个实施方式中,提取物还包含不大于4%(wt/wt)的苹果酸、不大于5%(wt/wt)的琥珀酸和不大于3%(wt/wt)的甲酸。
在一个实施方式中,提取物进一步包含不大于1%(wt/wt)的绿原酸、不大于1%(wt/wt)的反式-5-咖啡酰奎宁酸、不大于10%(wt/wt)的反式-3-阿魏酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的阿魏酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的阿魏酰葡糖二酸、不大于1%(wt/wt)的对香豆酸、不大于1%(wt/wt)的反式阿魏酸、不大于1%(wt/wt)的香叶木素-6-C-葡萄糖苷、不大于1%(wt/wt)的麦黄酮-7-O-葡糖苷酸硫酸酯和不大于1%(wt/wt)的松果酸。
在一个实施方式中,提取物进一步包含不大于2%(wt/wt)的纤维二糖、约1%(wt/wt)至8%(wt/wt)的葡萄糖、不大于约1%(wt/wt)的木糖、不大于2%(wt/wt)的阿拉伯糖、不大于12%(wt/wt)的果糖和不大于6%(wt/wt)的甘露糖醇。
在一个实施方式中,提取物进一步包含约5%(wt/wt)至12%(wt/wt)的苹果酸、约3%(wt/wt)至约20%(wt/wt)的琥珀酸和不大于10%(wt/wt)的甲酸。
在一个实施方式中,提取物进一步包含不大于1%(wt/wt)的绿原酸、不大于1%(wt/wt)的反式-5-咖啡酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的反式-3-阿魏酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的阿魏酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的阿魏酰葡糖二酸、不大于1%(wt/wt)的对香豆酸、不大于1%(wt/wt)的反式阿魏酸、不大于1%(wt/wt)的香叶木素-6-C-葡萄糖苷、不大于1%(wt/wt)的麦黄酮-7-O-葡糖苷酸硫酸酯和不大于1%(wt/wt)的松果酸。
在一个实施方式中,获得了一种组合物,其包含活性量的如上描述的提取物和合适的赋形剂,特别是药物组合物或化妆品组合物。
在一个实施方式中,组合物中提取物的浓度为至少1.25mg/mL。
在一个实施方式中,组合物用于局部给予,优选局部组合物包含渗透促进剂。
在一个实施方式中,组合物进一步包含活性剂。
在一个实施方式中,提取物用作防腐剂,特别是用作化妆品防腐剂或食品防腐剂。
在一个实施方式中,获得了包含上述提取物的食品或食品组合物。
在一个实施方式中,一种减轻受试者中炎症的方法包含向受试者给予包含提取物的抗炎组合物。
在一个实施方式中,一种减轻受试者中炎症的方法包含将包含提取物的抗炎组合物局部施用于受试者。
在一个实施方式中,一种降低受试者中皮肤酶活性的方法包含向受试者施用包含提取物的组合物。
在一个实施方式中,一种保护受试者的皮肤免受UV光损伤的方法包含在暴露于UV光之前将包含提取物的组合物施用于受试者的皮肤。
在一个实施方式中,一种治疗受试者中痤疮的方法包含向受试者给予包含有效量提取物或其混合物的组合物。
在一个实施方式中,给予步骤包含向受试者局部施用包含有效量提取物的组合物。
附图说明
以下附图提供了用于说明本公开的优选实施方式,并且不应被视为限制本发明的范围。
图1是用于从甘蔗秸秆和甘蔗渣制备提取物的方法的流程图。
图2A和2B是一组图表,显示秸杆和甘蔗渣提取物具有抗氧化活性。图2A显示了在2,2’-次偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基阳离子(ABTS)测定和1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基;2,2-二苯基-1-苦基肼基自由基(DPPH)测定中,与BHT对照相比,秸秆和甘蔗渣提取物的抗氧化活性。图2B显示,与抗坏血酸对照相比,在AAPH测定中,秸杆和甘蔗渣提取物抑制溶血。
图3A-3D是显示甘蔗提取物的抗炎活性的图。图3A显示了提取物抑制TNF-α释放的能力,图3B显示了提取物抑制IL-6释放的能力,图3C显示了提取物抑制酶5-脂氧合酶(5-LOX)的能力,且图3D显示了提取物抑制环氧合酶同工酶COX-1和COX-2的能力。
图4A-4C是显示秸杆和甘蔗渣提取物分别抑制酶酪氨酸酶、胶原酶和弹性蛋白酶的能力的图。图4A显示了以曲酸(KA)作为对照的提取物对酪氨酸酶的抑制,图4B显示了以菲咯啉(Pht)作为对照的提取物对胶原酶的抑制,且图4C显示了以SPCK作为对照物的提取物对弹性蛋白酶的抑制。
图5A、5B、5C和5D是显示秸杆和甘蔗渣提取物的抗微生物活性的图。该图显示了在金黄色葡萄球菌(图5A)、白色念珠菌(图5C)和巴西曲霉(图5D)上由提取物引起的细胞生长的减少。
具体实施方式
如本文所用,“渣”是指从甘蔗或高粱秆中提取汁液后留下的残留物。
如本文所用,“甘蔗秸秆”是指在收获甘蔗秆之后剩余的甘蔗植物部分。
如本文所用,“多功能”和“多功能提取物”是指提取物具有多种生物活性的性质。一组非限制性的生物活性包括抗氧化活性、抗炎活性、皮肤和食物酶抑制活性能力和抗微生物活性。这种多功能提取物具有向其为成分的任何配方赋予多种生物学特性的益处。
如本文所用,“有效量”是指至少部分地获得所需响应、或延迟发作或抑制进展或完全停止所治疗的病症的发作或进展所必需的量。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群、所需的保护程度、组合物的配方、医疗状况的评估以及其它相关因素而变化。预计该量将落入可以通过常规试验确定的较宽范围内。
如本文所用,“受试者”或“患者”是使用本公开的方法之一治疗的生物体。在一些实施方式中,受试者是哺乳动物受试者,例如人类或家畜。
如本文所用,“水溶性的”配方包括或不包括天然亲水性和亲油性化合物、酚类化合物、有机酸、寡糖和多糖、矿物质、作为其它代谢物和组成组分以及水(例如含水液体),但通常不包括有机溶剂(例如乙醇)。在一些实施方式中,水溶性的配方是水溶性配方或粉末。
如本文所用,术语“约”将被本领域普通技术人员理解并且将在一定程度上根据所使用的上下文而变化。如果在给定其使用的上下文的情况下本领域普通技术人员不清楚该术语的使用,则“约”可以表示该术语的至多正负20%。
如本文所用,术语“软膏”可以是任何通常已知的和市售的软膏。
如本文所用,术语“化妆品”或“化妆品组合物”是指旨在与受试者身体的各种外部部分(表皮、头发系统、指甲、嘴唇和外生殖器官)接触或与牙齿和口腔粘膜接触的任何物质或混合物,其主要目的是清洁、加香或改变受试者身体、牙齿或口腔粘膜的外观。
如本文所用,术语“食物”或“食品”是指可以被包括人类在内的动物食用或饮用以获取营养或愉悦的任何物质或组合物。在食物或食品被非人类动物使用的情况下,食物或食品也可以称为饲料。
可以使用任何合适的方法来干燥甘蔗渣和甘蔗秸秆以降低水分含量。在一个实施方式中,甘蔗渣或秸杆在露天干燥,也称为太阳能或被动干燥。甘蔗渣或秸杆可以放在筛上,让气流从材料的两侧流过。在其它实施方式中,甘蔗渣和秸杆可以在干燥器或窑中干燥。干燥器的说明性示例包括逆流干燥器、转鼓干燥器和气动干燥器。
旋转干燥器通常包含大型旋转圆柱形管。甘蔗渣或秸秆进入干燥管,随着干燥器管的旋转,甘蔗渣或秸秆被排列在管内壁上的一系列内部翅片提起。当甘蔗渣或秸杆落回干燥器管底部时,其通过热气体流。在一些实施方式中,气体流是空气和来自燃烧器的燃烧气体的混合物。在其它实施方式中,气体流包含预热的气体。在一个实施方式中,旋转干燥器管以允许干燥材料通过重力穿过管的角度定位。
在一个实施方式中,干燥器是逆流干燥器。逆流干燥器使用与被干燥的甘蔗渣或秸秆材料相反方向流动的干燥气体。在逆流干燥器中,最湿的甘蔗渣或秸杆接触最冷的干燥气体,并将在干燥器的排放端接触最热的气体。该过程提高了甘蔗渣或秸秆干燥过程的热效率。
在一个实施方式中,干燥器是气动干燥器,也称为闪蒸干燥器。在典型的气动干燥器中,由湿料进料器引入甘蔗渣或秸杆。燃烧器或加热单元将经加热的气体引入干燥器,并且经加热的气体与旋风分离器中的甘蔗渣或秸杆组合,旋风分离器是一个大罐,其允许经加热的气体去除甘蔗渣或秸杆中的水分。然后,将干燥的材料从旋风分离器中排出并由过滤袋或捕获室捕获。
甘蔗渣或秸杆可以通过本领域已知的任何方法碾磨。碾磨是分解甘蔗渣和秸秆材料的结构的机械预处理。球磨是将甘蔗渣或秸杆引入含有多个球的中空容器中的方法。中空容器的旋转导致球压碎和研磨甘蔗渣或秸杆并减小粒度。实例性的替代碾磨方法包括使用铣刀和湿盘铣削。
多种溶剂可用于从甘蔗渣或秸杆中制备提取物。合适溶剂的说明性实例包括丙酮、二氯甲烷、乙醇或甲醇。在使用乙醇或甲醇的实施方式中,溶剂可以用水稀释。在一个实施方式中,溶剂是乙醇和水,其包含至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的乙醇。在优选的实施方式中,溶剂包含乙醇和水,包含至少80%的乙醇。在其它实施方式中,溶剂是甲醇和水,包含至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的甲醇。
在提取过程中,可以使用多种甘蔗渣或秸秆生物质与溶剂的比率。在一个实施方式中,提取步骤中甘蔗渣或秸秆生物质与溶剂的比率为或约1:1(w/v)、1:2(w/v)、1:4(w/v)、1:8(w/v)、1:10(w/v)、1:15(w/v)、1:16(w/v)、1:17(w/v)、1:18(w/v)、1:19(w/v)、1:20(w/v)、1:21(w/v)、1:22(w/v)、1:23(w/v)、1:24(w/v)、1:25(w/v)、1:30(w/v)、1:40(w/v)或1:50(w/v)。在一个优选的实施方式中,提取步骤中甘蔗渣或秸秆生物质与溶剂的比率为或约1:20(w/v)。
在一个实施方式中,提取在至少20℃的温度下进行。提取可在约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃下进行。在一个优选实施方式中,提取在23℃下进行。
在一个实施方式中,提取进行至少一小时。提取可以进行1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3.0小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。
提取后,可通过过滤、离心或可用于分离固相与液相的任何其它方法去除固体。然后可以通过除去溶剂来浓缩提取物。在一个优选的实施方式中,通过包括蒸发溶剂的方法除去溶剂。
通过本文公开的方法获得的提取物和组合物可以根据给予方法以多种单位剂型给予。典型的调节化合物的剂量是本领域技术人员熟知的。这种剂量本质上通常是建议性的,并根据治疗环境、患者或器官耐受性等进行调整。提取物中包含的足以实现此目的的试剂量被定义为“治疗有效剂量”。对这种用途有效的剂量方案和量,即“给予方案”,将取决于多种因素,包括心脏状况、损伤发作的预先存在与否、药物配方和活性剂浓度等。在计算器官的给予方案时,给予方式也被考虑在内。给予方案还必须考虑药代动力学,即提取物或组合物的吸收率、生物利用度、代谢、清除率等。(参见例如最新的Remington's;Egleton andDavis 1997Peptides18:1431-1439;Langer 1990Science 249:1527-1533)。
提取物和组合物可以通过任何方便的方式施用,并且当以取决于情况的量施用时,预期表现出有益的活性。可以应用范围广泛的浓度。考虑到受试者,例如,每天每千克体重可以给予约0.1mg至约1mg的提取物。可以调整给予方案以提供最佳的有益响应。例如,可以每天、每周、每月或其它合适的时间间隔施用多个分开的剂量,或者可以根据情况的紧急状态按比例减少剂量。
根据这些方法,根据本发明定义的提取物或组合物可以与一种或多种其它化合物或分子共同给予。“共同给予”是指通过相同或不同途径以相同配方或两种不同配方同时给予,或通过相同或不同途径顺序给予。例如,提取物组合物可以与药剂一起给予以增强其效果。“顺序”给予是指两种组合物给予之间的数秒、数分钟、数小时或数天的时间差。这些组合物可以任何顺序给予。
适合注射使用的形式包括无菌水溶液(水溶性)或分散液以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在优选的实施方式中,提取物或组合物为乳膏形式或适合局部应用的其它形式。其必须在制造和储存条件下保持稳定,并且必须防止如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质,其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油。例如,使用卵磷脂等涂层,通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂,可以保持适当的流动性。可以通过各种抗菌和抗真菌拮抗剂,例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来阻止微生物的作用。在许多情况下,优选包括等渗拮抗剂,例如糖或氯化钠。可通过在提取物或组合物中使用延迟吸收的拮抗剂,例如单硬脂酸铝和明胶,来延长可注射形式的提取物或组合物的吸收。
通过将所需量的提取物或组合物与上面列举的各种其它成分(根据需要)掺入到适当的溶剂中,然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常,分散体是通过将各种无菌提取物或组合物掺入无菌载体中来制备的,该无菌载体含有基本分散介质和来自上述列举的其它所需成分。在用于制备无菌注射溶液的提取物无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术,其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
当提取物的活性成分得到适当保护时,它们可以例如用惰性稀释剂或用可吸收的可食用载体口服给予,或者可以将其封装在硬壳或软壳明胶胶囊中,或者可以将其压制成片剂,或者其可以直接与饮食中的食物结合。对于口服治疗给予,活性化合物可以与赋形剂结合并以可摄取的片剂、含服片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、威化饼等形式使用。这种组合物应含有至少1重量%的活性化合物。当然,组合物的百分比可以变化并且可以方便地为单元重量的约5%至约80%。这种有益的有用组合物中的活性化合物的量使得可以获得合适的剂量。制备根据本发明的组合物使得口服剂量单位形式含有约0.1μg至约2000mg的活性化合物。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等也可以含有下述成分:粘合剂,如胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶;赋形剂,如磷酸二钙;崩解拮抗剂,如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等;润滑剂,如硬脂酸镁;并且可以添加甜味拮抗剂,例如蔗糖、乳糖或糖精,或调味剂拮抗剂,例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当剂量单位形式是胶囊时,除了上述类型的材料外,它还可以含有液体载体。各种其它材料可以作为涂层存在或以其它方式改变剂量单位的物理形式。例如,片剂、丸剂或胶囊剂可以涂覆有虫胶、糖或两者。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、蔗糖作为甜味拮抗剂、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料和调味剂如樱桃或橙味调味剂。当然,用于制备任何剂量单位形式的任何材料应该是药学纯的并且在所使用的量下基本上是无毒的。此外,可以将活性化合物掺入缓释制剂和配方中。
一方面,局部组合物可包含软膏基质、C11-C40醇或C11-C40酸例如羧酸、和聚合物。软膏基质可以占局部组合物重量的至少约50%。聚合物可基本上溶于软膏基质中。
在一些实施方式中,局部组合物可进一步包含活性剂。在其它实施方式中,局部组合物可以包含渗透促进剂。
如本领域技术人员容易理解的,要使用的具体软膏基质是将提供最佳提取物递送并且优选地还将提供其它所需特性(例如润肤性和封闭性)的软膏基质。与其它载体或赋形剂一样,软膏基质通常应该是惰性的、稳定的、无刺激性和无致敏性的。通常,软膏基质可分为四类:油质基质;可乳化基质;乳液基质;和水溶性基质。参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,19th Ed.(Easton,Pa.:Mack Publishing Co.,pp.1301-1306(1985)。油质软膏基质包括例如植物油、羧酸和醇的合成油质酯、得自动物的脂肪、得自石油的半固体烃等。
油质软膏基质的实例包括白软膏、黄软膏、十六烷基酯蜡、石蜡、矿脂、白矿脂、白蜡、黄蜡、蜂蜡等及其混合物。可乳化软膏基质,也称为吸收性软膏基质,几乎不含或不含水,并且包括例如羟基硬脂酸硫酸盐、无水羊毛脂、亲水性矿脂等及其混合物。乳液软膏基质是油包水(W/O)乳液或水包油(O/W)乳液,并且可以包括例如鲸蜡醇、羊毛脂、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸等及其混合物。有用的水溶性软膏基质可以是由二醇醚(例如不同分子量的聚乙二醇、聚山梨醇酯等及其混合物)制备的那些。例如,矿脂的浓度可以大于或等于50%,优选地大于或等于70%。
在一些实施方式中,C11-C40醇或C11-C40羧酸或其组合按重量计可以例如组合物的约0.1%至约20%、优选0.1%至15%、更优选0.1%至10的量存在。在某些实施方式中,例如,C11-C40醇可以是具有11至40个碳原子、优选具有16至40个碳原子、更优选20至40个碳原子的末端官能化烷基醇。
末端官能化烷基醇的通式为:Rn(OH),其中n等于或大于11并且等于或小于40;其中R是饱和或不饱和烃链。适用于制备本实施方式的组合物的饱和和不饱和烷基醇的实例是1-十二烷醇、1-十三烷醇、1-十四烷醇、1-十五烷醇、1-十六烷醇、1-十七烷醇、1-十八烷醇、1-十九烷醇、1-二十烷醇、1-二十一烷醇、1-二十二烷醇、1-二十四烷醇、1-二十六烷醇、1-二十七烷醇、1-二十八烷醇、1-二十九烷醇、1-三十烷醇、1-三十二烷醇、1-三十四烷醇、十三烷醇、棕榈油醇、芥子醇及其组合。羊毛脂醇也是合适的。
在某些实施方式中,C11-C40酸可以是末端官能化的烷基羧酸,其具有通式:Rn(COOH),其中n等于或大于11并且等于或小于40。在一个实施方式中,R可以是饱和或不饱和烃链。
适用于制备本实施方式的提取物和组合物的饱和羧酸的实例是月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五环酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸(heneicosylic acid)、二十二烷酸(benenic acid)、二十三烷酸(tricosylic acid)、二十四烷酸(lignoceric acid)、十二五烷酸(pentacosylic acid)、蜡酸、十二七烷酸(heptacosylic acid)、褐煤酸、二十九烷酸(nonacosylic acid)、蜂花酸、三十一烷酸(henatriacontylic acid)、紫胶蜡酸、木虱酸、葛迪酸(geddic acid)、三十六酸(ceroplastic acid)、三十六烷酸(hexatriacontylic acid)、三十七烷酸(heptatriacontanoic acid)、三十八烷酸(octatriacontanoic acid)以及其组合。
适用于制备本实施方式的组合物的不饱和羧酸的实例为肉豆蔻油酸、棕榈油酸、α-亚麻酸、亚油酸、亚麻油酸(stearidonic acid)、γ-亚麻酸、异油酸、油酸、反油酸、十六碳烯酸、二十碳五烯酸酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十烯酸(paullinic acid)、巨头鲸鱼酸(gondoic acid)、芥酸、二十二碳六烯酸、二十二碳四烯酸、反式亚油酸、二十碳五烯酸、神经酸、沙丁鱼酸、鲱鱼酸、二十碳三烯酸及其组合。
不饱和和饱和羧酸的盐也适用于制备本实施方式的组合物。实例包括硬脂酸钠、硬脂酸镁、山嵛酸钠、油酸钠、油酸钙、油酸镁、亚油酸钠及其组合。
组合物中聚合物的浓度可为约0.1%至约20%,优选约0.1%至约15%,更优选约0.1%至约10%。
聚合物可以是聚α-烯烃、聚芳烃或含氟聚合物。聚α-烯烃的实例包括聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚-1-十六碳烯和聚-1-二十碳烯。聚芳烃的例子包括聚苯乙烯、取代的聚苯乙烯。含氟聚合物的实例包括聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯。
聚合物也可以是共聚物。共聚物中单体的实例包括乙烯基单体、苯乙烯和官能化苯乙烯单体以及α-烯烃。在一个实施方式中,烯烃可以包含具有至少11个碳原子的α-烯烃。可以相信的是,与仅包含相同单体单元的聚合物相比,包含不同单体单元的共聚物因其能够松散和破坏矿脂中烃类密集且有序堆积的能力而通常是优选的。此外,具有不同单体单元的共聚物可有助于活性剂的分散和增溶。因此,优选共聚物。
乙烯基单体的实例包括乙酸乙烯酯、马来酸和乙烯基吡咯烷酮。优选乙烯基单体和α-烯烃的共聚物。根据本实施方式,共聚物需要溶解在包含矿脂的组合物基质中。α-烯烃的疏水性随着链长的增加而增加。由于矿脂基质的高度疏水性,认为长链α-烯烃使共聚物更易溶于包含矿脂的组合物中。因此,乙烯基单体和长链α-烯烃的共聚物是优选的。长链α-烯烃可以具有至少11个碳原子,优选至少16个碳原子,更优选至少20个碳原子。
由于矿脂的封闭、润肤和无刺激特性,希望保持这些理想特性。因此,释放增强剂,例如醇、酸或聚合物,可以以约0.1%至约20%的量存在,优选约0.1%至约15%,更优选约0.1%至约10%,更优选约0.1%至约5%。
美容活性剂的实例包括维生素,例如维生素B、维生素C、生育酚(维生素E)、生育酚衍生物、生育三烯酚、维生素D、维生素K及其衍生物以及例如它们的合适组合。
保湿化合物可包括甘油、尿素、甲基脲、乙基脲、尿囊素、乳酸酯、糖、甲基葡萄糖醚、吡咯烷酮羧酸钠、透明质酸钠、泛醇、透明质酸、α-和β-羟基酸例如乙醇酸、乳酸、扁桃酸或水杨酸,或例如合适的保湿化合物的组合。
含有提取物的组合物可进一步包含渗透促进剂,例如组织渗透促进剂,以增强活性化合物释放和递送至组织,例如皮肤、眼部、鼻部。对于这些组合物,它们可以同时包含本实施方式的释放增强剂和组织渗透促进剂。组织渗透促进剂然后可以增强释放的活性剂的组织吸收和渗透。在本实施方式的组合物中,组织渗透促进剂可以是悬浮固体或溶解形式。
组织渗透促进剂,例如合适的挥发性有机溶剂,包括脂族、脂环族和/或芳族-脂族醇(其各自是一元或多元醇)、醇/水混合物、饱和和/或不饱和脂肪醇(其各自含有约8至约18个碳原子)、饱和和/或不饱和脂肪酸(其各自包含约8至约18个碳原子)和/或其酯等及其混合物。有用的醇是具有1至约20个碳原子的醇,例如乙醇、异丙醇、1-丁醇、1-辛醇等。
本公开涉及发现提取物的其它活性而不仅是化学抗氧化活性,即防止脂肪氧化。本公开描述了提取物的生物抗氧化活性、皮肤和食物酶抑制活性能力、抗炎、UV过滤能力和抗微生物活性,不仅针对腐败微生物而且针对皮肤病原菌,例如痤疮丙酸杆菌。这些生物活性的描述使秸杆和/或甘蔗渣提取物能够在食品、动物饲料和化妆品中的更多应用,而不仅是作为防腐剂。它使这些提取物能够用于开发多功能成分,从而潜在地减少防腐成分的用量。
使用简单的提取方法从甘蔗渣或秸杆制备提取物,如图1所示。该方法由针对秸秆和甘蔗渣优化的乙醇提取组成。提取物可以单独使用或作为其混合物使用以提高性能。
植物衍生的酚类化合物可以中和来自活性氧(ROS)的自由基,这对于避免细胞损伤氧化应激情况很重要。因此,人们对它们作为抗衰老成分的用途非常感兴趣。此外,它们已被证明可以防止或控制降解过程,例如储存期间的氧化,以及提高食品(例如脂肪、油)的质量和营养价值。这些植物衍生的提取物被认为可以替代合成抗氧化剂,例如丁基化羟苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)和叔丁基氢醌(TBHQ),这些物质通常使用并且会对人类健康产生负面影响。这些化合物中的一些在某些国家是被禁止的,例如欧盟禁止BHA。
实施例1:从甘蔗渣和秸秆制备提取物
在巴西新鲜收集甘蔗秸秆和甘蔗渣(Saccharum officinarum),并在冷藏条件(-20℃)下运往波尔图。
使用图1中概述的方法从秸杆和甘蔗渣中制备提取物。将秸秆和甘蔗渣铺在浅盘上,并在40±2℃恒温下干燥过夜。用剪切磨(SM 100,Retsh)将干燥的秸杆和甘蔗渣压碎,直到实现过2-4mm筛。碾磨后,秸秆和甘蔗渣样品分别用两种浓度的乙醇水溶液(50%和80%(v/v))提取,秸秆或甘蔗渣生物质与溶剂的比率为1:20(w:v)。在持续搅拌下在23℃下提取24-48小时。
通过纱布过滤回收提取物,然后在4℃下以4000x g离心10分钟。提取物溶液可以可选地通过反渗透浓缩。可以使用渗滤技术或通过吸附过程从溶液中提取糖。可以浓缩总醇提取物,并通过旋转蒸发器在真空(150mbar,50℃)下蒸发乙醇。提取物以液体形式使用或通过冷冻干燥进行干燥并且在室温下避光储存直至分析。
通过LC-ESI-UHR-QqTOF-MS鉴定酚类化合物,并通过使用与具有50,000全灵敏度分辨率(FSR)的超高分辨率Qq-Time-Of-Flight(UHR-QqTOF)质谱仪连接的UltiMate300Dionex UHPLC实现检查。使用Acclaim RSLC 120C18柱(100mm x 2.1mm,2.2μm)进行生物活性化合物的鉴定。进样量为5μL。流动相为0.1%甲酸水溶液(溶剂A)和含有0.1%甲酸的乙腈(溶剂B)。在以下梯度条件下进行24.5分钟的分离:0min,5%B;22min,31.6%B;23min,100%B;24.6min,100%,流速为0.25mL/min。使用负电离模式设置MS分析的参数,在m/z 20至1000的范围内获取光谱。参数如下:毛细管电压,4.5kV;干燥气体温度,200℃;干燥气体流量,8.0L/min;雾化气体压力,2bar;碰撞RF,300Vpp;传递时间,120μs;和预脉冲存储,4μs。采集后内部质量校准使用甲酸钠簇,在每次色谱分析开始时由注射泵输送甲酸钠。将高分辨率质谱用于鉴定化合物。根据精确质量和指定为mSigma的同位素速率计算确认该化合物的元素组成。测量的准确质量在指定元素组成的5mDa范围内,并且mSigma值<20提供了确认。基于其精确质量[M-H]-鉴定化合物。从四个不同批次的秸秆和甘蔗渣中获得的提取物的组成如表1所示。如表中所示,提取物显示出高度多样性的化合物。、
表1:甘蔗渣和秸秆提取物的组成
实施例2:甘蔗渣和秸秆提取物是抗氧化剂
通过ABTS、DPPH和溶血方法评估了可溶性提取物的抗氧化活性(见图2A和2B)。对于不溶性提取物,使用了测量抗氧化活性的β-胡萝卜素/亚油酸方法。
对于ABTS自由基阳离子脱色测定,通过以1:1(v/v)的比率混合7mmol/L的ABTS溶液和2.45mM过硫酸钾(K2S2O8)的溶液,制备2,2’-次偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基阳离子(ABTS·+)溶液。将该溶液在黑暗中放置16小时,然后用去离子水稀释以获得在734nm下0.700±0.020的初始光密度(OD)。稀释样品以获得五种不同的浓度。在微孔板中,将5样品稀释液各15μL置于两个重复孔中(每个样品稀释液两个孔),并与每孔200μLABTS·+混合,然后在酶标仪中在30℃下温育5分钟。在温育步骤之后,在734nm下测量每个孔的OD。使用Trolox标准溶液制作校准曲线。使用以下公式计算抑制百分比:
如图2A所示,甘蔗渣和秸秆提取物在ABTS测定中均显示出抗氧化活性,与从甘蔗秸秆制备的提取物相比,甘蔗渣提取物具有增加的效力。
DPPH自由基阳离子脱色测定是通过从DPPH和甲醇制备600μM DPPH·储备溶液,然后用甲醇进一步稀释储备溶液以获得在515nm下具有0.600±0.100OD的溶液来进行的。将25μL每种提取物样品与各自的稀释液和175μL DPPH·溶液放入微量滴定板的每个孔中,一式两份。将板在室温下温育30分钟,然后在酶标仪中在515nm下测量OD。使用Trolox标准溶液制备校准曲线。抑制百分比通过以下公式计算:
如图2A所示,使用DPPH测定法,提取物显示出与ABTS测定法中看到的相似的抗氧化行为,两者都具有活性,但与甘蔗秸秆提取物相比,甘蔗渣提取物显示出更高的效力。
进行基于β-胡萝卜素的测定以确定不溶性提取物的抗氧化活性。将β-胡萝卜素以20mg/mL的浓度溶解在氯仿中。通过混合50μL20 mg/mL的β-胡萝卜素溶液、40μL亚油酸和530μL吐温40,制备β-胡萝卜素和亚油酸的混合物。然后,在氮气流下通过蒸发除去氯仿,加入蒸馏水直到溶液的OD在470nm下为0.7。在乙醇中制备提取物样品并调整至50g/mL的浓度,然后以1:1的比率稀释。将24μL提取物样品、对照和标准品置于微孔板的孔中,然后加入276μLβ-胡萝卜素/亚油酸溶液,并将板在45℃下温育2小时。在酶标仪中,在0、60和120分钟时在470nm下测量OD。使用Trolox标准溶液制备校准曲线。根据以下公式计算降解率,其中“a”等于初始吸光度,“b”对应于120分钟后测量得的吸光度:
如Fernandes,JC,et al.(2010)Carbohydrate Polymers,第79卷,第1101-1106页所描述的进行溶血测定。简而言之,在4000rpm下将从同意的健康供体收集的血液离心10分钟,并且去除血浆和血沉棕黄层,获得红细胞。然后,将红细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次并且重新悬浮以获得2%(v/v)的血细胞比容。测定中使用的氧化剂是2,20-偶氮二(2-脒基丙烷)盐酸盐(AAPH),制备的最终浓度为60mM。对每种提取物测试三种不同的浓度,1%、0.1%和0.01%(w/v),用AAPH温育并且分别评估提取物的溶血能力。准备所有对照和样品测试以获得650μL的最终体积并一式两份进行。在摇动下在37℃下温育3小时后,将50μL每个样品稀释在950μL PBS和水中,并在4000rpm下离心6分钟。将上清液转移至微孔板,并在酶标仪中在540nm下测量OD。根据以下公式计算溶血百分比:
如图2B所示,两种提取物均抑制溶血。有趣的是,在溶血测定中,从甘蔗秸秆制备的提取物似乎比从甘蔗渣制备的提取物稍更有效。然而,两者的表现都与抗坏血酸对照相似。
实施例3:甘蔗渣和秸秆提取物具有抗炎作用
据报道,酚类化合物通过细胞功能而具有显著的抗炎活性,例如与多种受体直接相互作用、细胞内信号的调节、基因的转录和酶激活的调节。遵循与Berker et al.(2014),Journal Periodontology,第84卷,第1337-1345页先前描述的相似方法,通过评估每种提取物对脂多糖(LPS;在革兰氏阴性菌外膜中发现的内毒素)刺激的外周血单核细胞(PBMC)分泌促炎细胞因子的影响,研究了从甘蔗制备的提取物的抗炎活性。简而言之,通过静脉穿刺从四名健康志愿者(每个供体形成单次重复的基础)中获得30mL外周静脉血,放置到肝素化(10U/mL)管中。使用Histopaque 1119和Histopaque1077梯度系统分离PBMC;将管在室温下以500×g离心30分钟。收集富含PBMC的层并用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)洗涤两次,计数并悬浮在含有10%胎牛血清(FCS)、L-谷氨酰胺(15mM)和青霉素-链霉素(5000单位/mL青霉素;5mg/mL链霉素)的RPMI 1640(Gibco)中。PBMC(1x106个细胞/mL)在37℃、5%CO2气氛中培养24小时。在所有实验组(n=4)中,使用阴性对照(PBS)。在测定中使用的炎症剂是来自大肠杆菌O111:B4的LPS,浓度为10μg/mL。对每种提取物测试了两种不同的浓度,1.0和0.1mg/mL,并与LPS一起温育,并分别评估提取物的潜在促炎能力。
通过来自BioLegend(London,UK)的市售酶联免疫吸附测定(ELISA)测量TNF-α和IL-6产生的水平。根据制造商的说明进行测定。所有样品和标准品均一式二份运行,并用酶标仪在450nm波长下测定光密度。再次测定高于光密度读数的标准测定范围的样品,并在适当的稀释下读数,以确保水平在标准曲线的线性斜率内。如图3A-3D所示,甘蔗秸秆和甘蔗渣通过调节炎性细胞因子分泌而表现出体外抗炎活性,从而导致促炎反应总体降低(图3A:TNF-α抑制和图3B:IL-6抑制)。这种活性可能是由于LPS诱导的COX-1/2和/或5-LOX酶的提取物抑制所致。
使用市售酶筛选测定试剂盒评估了提取物抑制COX-1、COX-2和5-LOX的能力,如下:
环氧合酶(COX-1和COX-2)抑制测定
使用市售COX抑制剂筛选测定试剂盒,按照制造商推荐的方案,以0.156、0.3125、0.625、1.25和2.5mg/mL对提取物进行一式三次测试。COX抑制剂筛选测定直接测量环氧合酶反应中产生的前列腺素2α的量。SC-560(5-(4-氯苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑;3.14μM)和DuP-697(5-溴-2-(4-氟苯基)-3-(4-(甲基磺酰基)苯基)-噻吩;2.86μM)分别运行作为抑制COX-1和COX-2的阳性对照。用0.1M Tris-HCl pH 8.0将10μL体积各测试提取物和载体稀释至20μL,并在加入COX底物AA之前用酶在37℃下预温育15分钟。加入10μL 10mM AA开始反应,并将管在37℃下再温育2分钟。通过添加50μL 1N HCl和饱和氯化亚锡终止反应。使用100单位的绵羊COX-1和人重组COX-2进行测定。取出等分试样,并通过酶免疫测定对产生的前列腺素类进行分光光度法定量。
脂氧合酶(5-LOX)抑制测定:
使用LOX抑制剂筛选测定试剂盒,按照制造商推荐的方案,以0.156、0.3125、0.625、1.25和2.5mg/mL对提取物进行一式三次测试。该测定法测量由5-LOX酶与其底物AA温育产生的氢过氧化物。槲皮素(MW=302.36)用作阳性对照。在96孔板中用90μL 5-LOX酶预温育10μL体积的各测试提取物和载体。通过添加10μL的1mM AA开始反应,并将板摇动5分钟。然后,加入来自检测试剂盒的100μL色原以停止酶反应并进行显色。将板在振荡器上再放置5分钟,并使用酶标仪测量490nm下的吸光度。
提取物显示出了抑制这三种关键促炎酶的能力:5-脂氧合酶、环氧合酶-1和环氧合酶-2(参见图3C:5-LOX抑制和图3D:COX-1/2抑制)。
实施例4:甘蔗渣和秸秆提取物含有皮肤酶抑制剂
评估了甘蔗渣和秸杆提取物对皮肤中存在的酶(胶原酶、弹性蛋白酶和酪氨酸酶)活性的影响(见图4A、4B和4C)。使用MMP1抑制剂筛选测定试剂盒(比色法)(1b139443)确定提取物对胶原酶活性的影响。制备了MMP抑制剂、MPP底物和MPP1酶。在添加空白(测定缓冲液)、对照、MPP抑制剂和测试样品(甘蔗渣和秸杆提取物的各种稀释液)后,将MMP1酶置于平底微孔板中。然后将板在37℃下温育1小时以允许抑制剂/酶相互作用。在温育步骤之后,通过添加MMP1底物开始反应,并在酶标仪中以10至20分钟的间隔在412nm下测量OD。选择反应呈线性的一系列时间点以获得反应速度(v),并使用以下公式计算抑制剂活性:
使用中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选试剂盒(荧光法)(ab118971)确定甘蔗渣和秸杆提取物对弹性蛋白酶活性的影响。根据说明制备中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)并添加到平底微孔板中。将测试抑制剂、抑制剂对照和空白添加到含有酶的孔中,并将板在37℃下温育5分钟。在这个温育步骤之后,制备底物反应混合物并将其添加到每个孔中。将板在酶标仪中在37℃下温育30分钟,在400/505nm下测量荧光。选取反应呈线性的两个时间点,按照下式计算各试验抑制剂的相对活性,其中RFU为底物水解产生的荧光:
使用酪氨酸酶抑制剂筛选试剂盒(比色法)(ab204715)确定甘蔗渣和秸杆提取物对酪氨酸酶活性的影响。对于每个反应,将20μL样品溶液、酪氨酸酶抑制剂工作溶液(曲酸)和酪氨酸酶测定缓冲液置于平底微孔板的每个孔中。制备酪氨酸酶溶液,并且将50μL加入到含有测试溶液的每个孔中。将板在25℃下温育10分钟。在温育步骤之后,将30μL酪氨酸酶底物溶液添加到每个孔中,将板在25℃下温育1小时,并使用酶标仪在510nm下每2至3分钟测量一次OD。读数后,选择两个时间点以计算所有样品(S)、抑制对照(IC)和酶对照(EC)的斜率,并通过以下公式计算相对抑制:
除了氧化之外,自由基的积累还会通过激活皮肤病相关酶(如酪氨酸酶、胶原酶和弹性蛋白酶)对皮肤造成多种有害影响,从而进一步导致皮肤衰老。因此,这些酶的抑制有望防止一些由自由基产生引起的皮肤损伤。如图4A-C所示,甘蔗渣和秸杆提取物导致相同水平的酶抑制(图4A酪氨酸酶抑制、图4B胶原酶抑制和图4C弹性蛋白酶抑制),如使用用于每种酶的参考对照酶抑制剂所看到的。胶原酶是少数能够降解胶原蛋白的蛋白酶之一。这种胶原酶介导的胶原降解导致皮肤弹性和强度降低。因此,胶原酶的抑制可以饶恕胶原蛋白,从而防止皮肤衰老。此外,弹性蛋白酶降解皮肤弹性蛋白。弹性蛋白酶介导的弹性蛋白损失导致皮肤的可塑性和柔软性。因此,抑制弹性蛋白酶可以防止皮肤出现衰老迹象。酪氨酸酶是一种含铜的酶,可催化黑色素生成的前两个阶段,并能引起黑色素在皮肤特定部位的过度积累。这种异常的酪氨酸酶活性导致皮肤色素沉着过度。因此,抑制酪氨酸酶活性可以防止皮肤色素沉着过度的形成。此外,酪氨酸酶抑制对食品工业很重要,因为它可以防止生水果、蔬菜和饮料的褐变。
实施例5:甘蔗渣和秸秆提取物具有抗菌活性
通过使用临床和实验室标准研究所需氧菌(M07-A9)和厌氧菌(M11-A8)的方法测量提取物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),来评估提取物的抗菌活性。从先前过滤的3%储备溶液,制备一系列提取物稀释液(2%、1.5%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.125%和0.0625%(w/v))。在与阳性对照相同的条件下测试了常用的防腐剂2-苯氧乙醇。
将MHB生长培养基用于需氧微生物并且将Wilkins Chalgren肉汤(WCB)用于厌氧微生物。从具有0.5McFarland标准(约108CFU/mL)的接种物中以2%(v/v)接种微生物,然后进行调整以获得测试溶液中105CFU/mL的最终接种物。使用培养基、提取物母液和接种了每种微生物但没有提取物的培养基进行对照。在96孔微孔板中在37℃下进行温育24小时,但痤疮丙酸杆菌用封口膜覆盖在微孔板上以提供厌氧条件进行48小时的温育。每小时在660nm下测量每个孔(实验和对照)的OD。所有测量一式三份进行。之后,将未检测到生长的浓度相应地接种在MHA和Wilkins Chalgren琼脂(WCA)中,以验证MBC。通过分析记录的最大吸光度、指数期进入的延迟和比生长率的计算来确定MBC和MIC。通过确定OD660在生长曲线的对数期的趋势线的斜率来获得比生长率。如表2所示,甘蔗渣和秸秆提取物对导致食品和化妆品污染和腐败的参考微生物菌株具有良好的抗菌活性。
表2.来自甘蔗渣和秸秆提取物(50%乙醇)和2-苯氧乙醇的污染微生物的MBC和MIC。
ND-未检测到抑制;MBC:最低杀菌浓度;MIC:最低抑制浓度
根据欧洲药典协议7.0对局部产品进行了防腐剂测试挑战,以评估甘蔗渣和/或秸杆提取物在化妆品防腐成分配方中的潜力。使用欧洲药典7.0的协议确定了抗菌防腐的功效。在胶束水中在1%、2%和3%(w/v)下初步测试了提取物。
秸秆和甘蔗渣提取物以不同的方式遵守协议的标准-秸秆是最有效的,并且发现两种提取物的混合物比单独的提取物具有更高的抑制效果(参见图5A-D)。
此外,这些提取物针对导致皮肤传染病痤疮发展的细菌痤疮丙酸杆菌进行了测试,读取光学密度并且发现了秸秆提取物的3%MBC和0.0625%MIC。
防腐效果测定
本公开表明,秸秆提取物还具有0.1%(m/v)的生物抗氧化活性,该水平与抗坏血酸相当(图2)。这是除了具有ABTS和DPPH化学抗氧化活性之外的活性。
UV吸收提取物
本公开显示,甘蔗秸秆和甘蔗渣提取物具有UV辐射吸收能力。UV辐射被认为是对人体皮肤细胞最常见的刺激因素,并且是外源性皮肤衰老中最常见的外部应激诱导因素。在暴露于UV期间会产生氧化应激。即使人体皮肤能够承受105的每日氧化冲击,但ROS仍然会导致细胞成分(例如细胞壁、脂质膜、线粒体和DNA发生氧化损伤,从而引起皮肤结缔组织的损伤。如前,多酚的芳香结构是氧化应激的重要特征,即防止形成和清除ROS和活性氮(RNS),并最大限度地减少UV应激和有害化合物对皮肤衰老的影响。因此,甘蔗秸秆和甘蔗渣提取物在开发抗衰老化妆品方面具有潜在的应用价值。
在一个实施方式中,提取物可以以大于1mg/mL的浓度存在以具有抗氧化活性,大于1mg/mL以具有抗炎活性和大于3mg/mL以抑制皮肤酶(例如弹性蛋白酶、酪氨酸酶和胶原酶)的活性。
本文档中无论何时使用的术语“包含”旨在表示存在特征、整数、步骤、组件,但不排除存在或添加一个或多个其它特征、整数、步骤、组件或其组。
本公开不应被视为以任何方式限制于所描述的实施方式,并且本领域普通技术人员可以预见到对其进行修改的许多可能性。
上述实施方式是可组合的。
Claims (24)
1.一种由甘蔗渣或甘蔗秸秆制备提取物的方法,包括:
获得干燥的甘蔗渣或干燥的甘蔗秸秆;
碾磨干燥的甘蔗渣或干燥的秸秆;
将碾磨的甘蔗渣或秸秆与包含溶剂的溶液混合以形成混合物;
搅拌所述混合物;
分离所述混合物的液体部分和固体部分;
浓缩所述液体部分以获得提取物;
可选地干燥所述液体部分以获得干提取物。
2.根据前述权利要求所述的方法,其中,所述甘蔗渣或所述秸秆在不低于30℃的温度下干燥,优选在约40℃的温度下干燥。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,将所述干燥的甘蔗渣或所述干燥的秸秆碾磨至2mm至4mm范围内的尺寸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述溶剂选自丙酮、二氯甲烷、乙醇、甲醇或它们的组合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述包含溶剂的溶液包含乙醇。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,将所述混合物搅拌至少24小时。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在20℃至22℃范围内的温度下搅拌所述混合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述液体部分和所述固体部分通过过滤分离,优选通过纱布过滤。
9.一种提取物,通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得。
10.根据前述权利要求所述的提取物,用于医药或兽医。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的提取物,用于治疗或预防炎性疾病或炎性症状,特别是皮肤炎性疾病。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的提取物,用于抑制或降低皮肤酶活性、作为抗衰老剂、保护皮肤免受UV光损伤、作为抗氧化剂、作为抗微生物剂和/或作为抗痤疮剂。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的提取物,包含约2%(wt/wt)至8%(wt/wt)的纤维二糖、约2%(wt/wt)至10%(wt/wt)的葡萄糖、不大于约2%(wt/wt)的木糖、不大于1%(wt/wt)的半乳糖、不大于0.1%(wt/wt)的阿拉伯糖、不大于15%(wt/wt)的果糖和不大于6%(wt/wt)的甘露糖醇。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的提取物,进一步包含不大于4%(wt/wt)的苹果酸、不大于5%(wt/wt)的琥珀酸和不大于3%(wt/wt)的甲酸。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的提取物,其中进一步包含不大于1%(wt/wt)的绿原酸、不大于1%(wt/wt)的反式-5-咖啡酰奎宁酸、不大于10%(wt/wt)的反式-3-阿魏酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的阿魏酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的阿魏酰葡糖二酸、不大于1%(wt/wt)的对香豆酸、不大于1%(wt/wt)的反式阿魏酸、不大于1%(wt/wt)的香叶木素-6-C-葡萄糖苷、不大于1%(wt/wt)的麦黄酮-7-O-葡糖苷酸硫酸酯和不大于1%(wt/wt)的松果酸。
16.根据权利要求9-15中任一项所述的提取物,进一步包含不大于2%(wt/wt)的纤维二糖、约1%(wt/wt)至8%(wt/wt)的葡萄糖、不大于约1%(wt/wt)的木糖、不大于2%(wt/wt)的阿拉伯糖、不大于12%(wt/wt)的果糖和不大于6%(wt/wt)的甘露糖醇。
17.根据权利要求9-16中任一项所述的提取物,进一步包含约5%(wt/wt)至12%(wt/wt)的苹果酸、约3%(wt/wt)至约20%(wt/wt)的琥珀酸和不大于10%(wt/wt)的甲酸。
18.根据权利要求9-17中任一项所述的提取物,进一步包含不大于1%(wt/wt)的绿原酸、不大于1%(wt/wt)的反式-5-咖啡酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的反式-3-阿魏酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的阿魏酰奎宁酸、不大于1%(wt/wt)的阿魏酰葡糖二酸、不大于1%(wt/wt)的对香豆酸、不大于1%(wt/wt)的反式阿魏酸、不大于1%(wt/wt)的香叶木素-6-C-葡萄糖苷、不大于1%(wt/wt)的麦黄酮-7-O-葡糖苷酸硫酸酯和不大于1%(wt/wt)的松果酸。
19.一种组合物,特别是药物组合物或化妆品组合物,包含活性量的根据前述权利要求9-18所述的提取物和合适的赋形剂。
20.根据前述权利要求所述的组合物,其中,所述提取物的浓度为至少1.25mg/mL。
21.根据前述权利要求19-20中任一项所述的组合物,用于局部给予,优选地局部组合物包含渗透促进剂。
22.根据前述权利要求19-21中任一项所述的组合物,进一步包含活性剂。
23.根据权利要求9-16所述的提取物作为防腐剂,特别是作为化妆品防腐剂或食品防腐剂的用途。
24.一种食品或食品组合物,包含根据前述权利要求9-16所述的提取物。
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