CN114994336B - GrB在预测胃癌预后或免疫特征的应用 - Google Patents

GrB在预测胃癌预后或免疫特征的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了GrB在预测胃癌预后或免疫特征的应用，涉及生物技术领域。本发明通过mRNA测序证实患者的肿瘤组织和癌旁组织之间GrB表达存在显著差异后，使用免疫组织化学染色对肿瘤组织和癌旁组织的GrB表达水平进行检测分析，并结合后期对患者随访获得的数据进行分析，证明GrB在胃癌的免疫细胞浸润中发挥重要作用，并在胃癌的发展过程中发挥重要作用，可以作为胃癌预后以及预测患者是否出现免疫细胞浸润的标志物，从而对患者的个性化诊疗做出指导。

Description

GrB在预测胃癌预后或免疫特征的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及GrB在预测胃癌预后或免疫特征的应用。
背景技术
胃癌（Gastric cancer，GC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都很高。超过70%的新患者是在发展中国家确诊的。尽管近年来胃癌的诊断和治疗取得了进展，但其5年总生存率仍不令人满意。因此，发现胃癌发生的分子机制，识别有效的分子生物标志物对胃癌患者至关重要。
颗粒酶（GZMs）是丝氨酸蛋白酶家族的成员，其特征是组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸催化三联体，它能破坏大蛋白质的肽键以合成小蛋白质。到目前为止，已经鉴定出5种人类颗粒酶（A，B，H，K和M）和11种小鼠颗粒酶。这些颗粒酶不仅能在细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和自然杀伤细胞（NKs）中表达，还能在肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞中表达。Grs最初被认为仅限于淋巴细胞，如今被认为表达更广泛。Granase A可以在非淋巴细胞细胞中表达，如卵巢颗粒细胞，还有其他不同于细胞毒性的功能。Granase M在白血病细胞和实体肿瘤细胞系（HeLa）中表达，促进肿瘤生长和转移，诱导癌细胞向上皮间质转化。Granase B（GrB）不仅在一定数量的其他造血细胞中表达，包括白血病细胞，也在正常的非造血细胞中表达，如角化细胞、卵巢颗粒细胞、精母细胞、关节软骨细胞和胎盘滋养细胞。此外，在人类原发性乳腺癌的一个亚群中检测到GrB，提示实体瘤可能产生GrB。GrB也在膀胱癌中表达，并影响上皮-间充质转化和侵袭能力。GrB可能在非造血肿瘤细胞中直接表达，但GrB在胃癌中的作用尚未明确。
目前，胃癌标志物属于研究的热门领域，先后有不少标志物被发现，例如中国专利CN108034722A公开了一种lncRNA SGOL1-AS1在作为胃癌诊断标志物的应用；中国专利CN106319038A公开了用于胃癌早期筛查的基因标志物及其应用，该专利为基因标志物。可见，目前对于基因或RNA标志物的研究较多，但基因或RNA标志物在临床检测中需要较为繁琐的步骤，因此有关蛋白或酶类的标志物以及相关的检测方法还需进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胃癌标志物，用于胃癌预后以及预测胃癌患者是否出现免疫细胞浸润。
为达到上述发明目的，采用如下技术方案。
一种GrB的用途，其特征在于，包括以下至少一种：
作为胃癌的预后标志物；和/或
作为免疫细胞浸润的标志物。
本发明通过实验证实GrB在胃癌的免疫细胞浸润中发挥重要作用，并在胃癌的发展过程中发挥重要作用，因此GrB能够用于胃癌预后以及预测胃癌患者免疫细胞浸润情况。
优选地，一种GrB的用途，包括以下至少一种：
作为胃癌的预后标志物，其中，进行预后判断时，使用患者肿瘤组织及癌旁组织切片阳性细胞数的中位数作为截断值对GrB的表达量进行判断，阳性细胞数≥截断值为GrB高表达；否则认为是GrB低表达；和/或
作为免疫细胞浸润的标志物；其中，免疫细胞浸润包括CD3+T细胞浸润和CD8+T细胞浸润。
优选地，GrB作为胃癌的预后标志物时，预后的判断标准如下：
肿瘤组织中GrB高表达的胃癌患者总生存期延长，癌旁组织中GrB低表达的胃癌患者总生存期延长。
通过mRNA测序证实患者的肿瘤组织和癌旁组织之间GrB表达存在显著差异后，使用免疫组织化学染色对肿瘤组织和癌旁组织的GrB表达水平，发现与正常组织相比，肿瘤组织中GrB表达明显增加。
优选地，总生存期延长的指标包括五年总生存率＞40%。
更优选地，总生存期延长的指标包括五年总生存率＞50%。
优选地，GrB高表达和GrB低表达的评判标准如下：
患者肿瘤组织及癌旁组织切片阳性细胞数的中位数作为截断值，阳性细胞数≥截断值为GrB高表达；否则认为是GrB低表达。
优选地，使用GrB作为胃癌的预后标志物进行预后的具体操作步骤包括：
取患者胃癌和/或癌旁组织用福尔马林固定，石蜡包埋切片，进行免疫组织化学染色和观察。
通过免疫组织化学染色判断GrB阳性细胞数，进而判断GrB的表达量高低，能够对患者五年总生存率直接进行预测，操作简单。
优选地，免疫细胞浸润包括CD3+T细胞浸润和CD8+T细胞浸润。
优选地，GrB作为免疫细胞浸润的标志物，判断患者免疫细胞浸润情况的判断标准如下：
GrB高表达的患者具有发生CD3+T细胞浸润和CD8+T细胞浸润的风险。
优选地，GrB高表达和GrB低表达的评判标准如下：
患者肿瘤组织及癌旁组织切片阳性细胞数的中位数作为截断值，阳性细胞数≥截断值为GrB高表达；否则认为是GrB低表达。
本发明通过实验验证了GrB表达量与CD3+T细胞和CD8+T细胞表达量的关系，因此能够用GrB的表达量判断免疫细胞浸润的情况，尤其是CD3+T细胞和CD8+T细胞浸润的情况。从而预估肿瘤微环境，对胃癌的治疗提供参考。
本发明还公开了一种基于GrB的胃癌预后的方法，包括如下步骤：
取患者肿瘤组织和/或癌旁组织制成石蜡切片；
将石蜡切片进行免疫组化染色；
根据免疫组化染色结果判断GrB表达量；
预测患者总生存率。
优选地，上述预测患者总生存率步骤，判断标准如下：
肿瘤组织中GrB高表达的胃癌患者总生存期延长，癌旁组织中GrB低表达的胃癌患者五年总生存率＞40%。
更优选地，GrB高表达和GrB低表达的评判标准如下：
患者肿瘤组织及癌旁组织切片阳性细胞数的中位数作为截断值，阳性细胞数≥截断值为GrB高表达；否则认为是GrB低表达。
本发明还公开了一种基于GrB的预测免疫细胞浸润的方法，包括如下步骤：
取患者肿瘤组织和/或癌旁组织制成石蜡切片；
将石蜡切片进行免疫组化染色；
根据免疫组化染色结果判断GrB表达量；
预测免疫细胞浸润。
优选地，上述预测免疫浸润步骤，判断患者免疫细胞浸润情况的判断标准如下：
GrB高表达的患者具有发生CD3+T细胞浸润和CD8+T细胞浸润的风险。
更优选地，GrB高表达和GrB低表达的评判标准如下：
患者肿瘤组织及癌旁组织切片阳性细胞数的中位数作为截断值，阳性细胞数≥截断值为GrB高表达；否则认为是GrB低表达。
本发明还公开了一种基于GrB的预测免疫细胞浸润的方法，包括如下步骤：
取患者肿瘤组织和/或癌旁组织提取总RNA；
将总RNA进行逆转录得cDNA；
对cDNA进行测序，判断GrB表达量；
预测免疫细胞浸润。
优选地，上述预测免疫浸润步骤，判断患者免疫细胞浸润情况的判断标准如下：
GrB高表达的患者具有发生CD3+T细胞浸润和CD8+T细胞浸润的风险。
更优选地，GrB高表达和GrB低表达的评判标准如下：
患者肿瘤组织及癌旁组织切片阳性细胞数的中位数作为截断值，阳性细胞数≥截断值为GrB高表达；否则认为是GrB低表达。
本发明还公开了一种基于GrB的预测模型。
优选地，预测模型包括因素输入模块和结果输出模块。
更优选地，因素输入模块包括患者肿瘤组织和/或癌旁组织中GrB的表达量。
更进一步优选地，患者肿瘤组织和/或癌旁组织中GrB的表达量通过分析免疫组化染色结果得到。
更优选地，结果输出模块包括患者的5年总生存率。
更优选地，预测模型使用的计算方法包括Cox回归法。
本发明还公开了一种基于GrB的预测模型在胃癌预后中的用途。
本发明还公开了一种基于GrB的预测模型在预测免疫细胞浸润中的用途。
本发明还公开了一种用于胃癌预后的试剂盒，包括检测肿瘤组织和/或癌旁组织中GrB表达量的试剂。
优选地，检测肿瘤组织和/或癌旁组织中GrB表达量的试剂包括GrB抗体。
更优选地，GrB抗体包括以下至少一种：
B18.1；
GrB7。
更优选地，试剂盒还包括抗原修复液、血清、过氧化氢、生物素化二抗、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、二甲苯、DAB显色液、PBS。
更优选地，试剂盒的检测对象为胃癌患者的肿瘤组织和/或癌旁组织。
优选地，上述试剂盒为免疫组织化学试剂盒。
本发明还公开了GrB在制备检测胃癌的产品中的用途。
本发明还公开了GrB在制备胃癌预后的产品中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过mRNA测序证实患者的肿瘤组织和癌旁组织之间GrB表达存在显著差异后，使用免疫组织化学染色对肿瘤组织和癌旁组织的GrB表达水平进行检测分析，并结合后期对患者随访获得的数据进行分析，证明GrB在胃癌的免疫细胞浸润中发挥重要作用，并在胃癌的发展过程中发挥重要作用。肿瘤组织中GrB高表达的胃癌患者总生存期延长，癌旁组织中GrB低表达的胃癌患者总生存期延长，五年总生存率＞40%。GrB高表达的患者具有发生CD3+T细胞浸润和CD8+T细胞浸润的风险。因此，GrB可以作为胃癌预后以及预测患者免疫细胞浸润情况的标志物，从而对患者的个性化诊疗做出指导。
附图说明
图1为样本HE染色观察结果；
图2为样本免疫组化检测结果；
图3为患者肿瘤组织中GrB表达水平与免疫细胞的相关性分析结果；
图4为患者肿瘤组织中GrB表达水平与总生存期的相关性分析结果。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与本公开的一些方面相一致的方法的例子。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
验证GrB表达在肿瘤组织和癌旁组织中的差异
1、样本来源
肿瘤性和匹配的癌旁组织样本来自153例胃癌患者，这些患者随机从2013年1月至2017年12月在机构审查委员会批准的方案下在中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江肿瘤医院）接受其他治疗前接受手术的患者中选择，并被诊断为胃癌。
2、HE染色观察
通过HE染色观察给胃癌分型样本。
胃癌及癌旁组织标本用福尔马林固定，石蜡包埋切片；
将组织切片使用二甲苯和乙醇对切片进行脱蜡水化：
二甲苯10min两次，无水乙醇2min两次，95％乙醇2min两次，80％乙醇2min，70％乙醇2min，PBS 5min两次；
切片加入Harris苏木精染3-8min，蒸馏水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，蒸馏水洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗；
切片加入伊红染液中染色1-3min；
切片中脱水透明，中性树胶封片后观察。
观察结果如图1所示，图1中a、b、c分别为典型的胃腺癌、胃粘液腺癌、胃印戒细胞癌样本染色结果。
153例胃癌中，肿瘤位于胃近端48例（31.37%），胃远端94例（61.44%），总胃11例（7.19%）。 根据WHO GC分级标准，135例（88.24%）为未明确定义的腺癌（NOS），13例为腺癌合并粘液腺癌，5例为粘液腺癌合并印戒细胞。在组织学分级上，低分化的患者占79.08%，而26例（16.99%）为中度和良好分化，6例（3.92%）为未知。根据胃癌TNM分期系统，IA、IIA、IIIA期138例（90.20%），IV期15例（9.8%）。
3、免疫组织化学染色
胃癌及癌旁组织标本用福尔马林固定，石蜡包埋切片；
将组织切片使用二甲苯和乙醇对切片进行脱蜡水化：
二甲苯10min两次，无水乙醇2min两次，95％乙醇2min两次，80％乙醇2min，70％乙醇2min，PBS 5min两次；
用蒸馏水冲洗，然后修复抗原；PBS冲洗3次，每次5min；
然后，用GrB一抗孵育，4°C，然后用PBS洗涤；
在组织切片中加入山羊抗兔H和LIgG（生物素）（稀释比1：1000）/山羊抗小鼠H和LIgG（生物素）（稀释比1：5000）；孵育30分钟后，用PBS冲洗切片；
用DAB显色试剂盒对细胞核进行DAB染色和苏木精再染色；
最后将组织芯片脱水，用中性凝胶封闭。
免疫组化检测结果如图2所示；代表性图像是使用奥林巴斯BX43显微镜（奥林巴斯，东京，日本）拍摄。
图2的A为肿瘤组织与癌旁组织免疫组化结果的箱线图，可看出与正常组织相比，肿瘤组织中GrB表达明显增加（P<0.001），表明其可作为胃癌预后的生物标志物。
图2的B为免疫组化染色照片，可看出免疫组化染色显示GrB定位于癌细胞胞浆内，阳性染色为棕黄色颗粒。癌旁组织中少量GrB阳性细胞不均匀分布。肿瘤组织中GrB阳性细胞多呈高染色，主要分布于肿瘤巢和间质，呈簇状分布。
经统计（见表1），患者癌旁组织中GrB阳性细胞中位数为3个，癌旁组织中GrB阳性细胞中位数为7个，差异有统计学意义。
表1 Granzyme B在胃癌组织及癌旁组织中的差异表达
N M（P25，P75） M（P25，P75） Z p-value
肿瘤组织 癌旁组织
Granzyme B 153 7.0（2.0，22.5） 3.0（1.0，6.0） 4.869 ＜0.001*
3、mRNA测序差异
取患者胃癌组织细胞以及癌旁组织细胞，使用总RNA提取试剂盒（TRIzol法）（购自深圳辉诺生物科技有限公司），按说明书操作对细胞总RNA进行提取；提取后使用逆转录试剂盒（购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司）进行逆转录，获得cDNA，再使用Realtime-PCR进行扩增，扩增后进行测序（由生工生物工程（上海）股份有限公司完成）。
测序后对测序数据进行通过生物信息学分析，分析结果见图3，图3的A为患者肿瘤组织中Granzyme B表达水平与CD3的相关性结果；B为患者肿瘤组织中Granzyme B表达水平与CD8的相关性结果。患者肿瘤组织及癌旁组织切片阳性细胞数的中位数作为截断值，阳性细胞数≥截断值为GrB高表达，否则认为是GrB低表达。
图3可见，在GrB高表达组和GrB低表达组CD3+T细胞和CD8+T细胞数量有显著差异；GrB高表达组CD3+T细胞和CD8+T细胞数量多。因此，GrB的表达与免疫细胞浸润的发生相关，尤其是与CD3+T细胞浸润和CD8+T细胞浸润相关，可作为预测患者免疫细胞浸润情况的标志物。
实施例2
验证GrB表达差异与生存率的关系
对实施例1中提供样本的患者进行随访，共随访患者153例，其中22例患者平均44.3个月（范围：1-92个月）死于胃癌，胃癌患者的中位总生存期（OS）为39个月。
将随访获得的生存率数据结合实施例1中的实验数据进行统计分析，统计处理采用SPSS 22.0（IBM）统计软件对数据进行统计分析，GraphPad Prism 9绘制图。计量资料用中位数+上、下四分位数表示，计数资料用数值和百分比表示，采用卡方检验和Fisher精确检验进行分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，单因素和多因素风险评估采用Cox回归法。P<0.05为差异有统计学意义。
统计分析结果如图4所示。
Kaplan-Meier生存曲线显示5年总OS率为46.1%（如图4的A所示）。此外，根据GC患者肿瘤组织中GrB高表达水平和低表达水平，5年OS分别为51.7%和35.9%。在胃癌癌旁组织中，以中位表达水平计算，GrB高表达和低表达的5年OS分别为41.4%和49.0%。因此，肿瘤组织中GrB高表达的胃癌患者OS明显延长，癌旁组织中GrB低表达的胃癌患者OS明显延长（如图4的B和C所示）。
由实施例1中所得的结果对患者的生存情况进行预测，与实施例2中对患者实际生存结果分析所得一致。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.GrB在制备胃癌预后试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒包括检测肿瘤组织和/或癌旁组织中GrB表达量的试剂；所述试剂盒的预后判断标准如下：
GrB高表达的患者具有发生CD3+T细胞浸润和CD8+T细胞浸润的风险；
患者肿瘤组织及癌旁组织切片阳性细胞数的中位数作为截断值，阳性细胞数≥截断值为GrB高表达；否则认为是GrB低表达。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测肿瘤组织和/或癌旁组织中GrB表达量的试剂包括GrB抗体。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒为免疫组织化学试剂盒。
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