CN114990100A - 一种乳糖酶微胶囊制备方法及利用其制备低乳糖液态羊乳 - Google Patents

一种乳糖酶微胶囊制备方法及利用其制备低乳糖液态羊乳 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳糖酶微胶囊制备方法及利用其制备低乳糖液态羊乳，步骤1：制备壳聚糖溶液：取壳聚糖溶于冰乙酸，充分溶解后利用NaOH或HCl调节pH值，得到壳聚糖溶液；步骤2：制备不同材料乳糖酶微胶囊制备：本发明以黄原胶‑结冷胶/壳聚糖为材料包埋乳糖酶，以绵羊乳和山羊乳为原料，利用乳糖酶将羊乳中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，降低了液态乳中的乳糖含量，缓解乳糖不耐受。

Description

一种乳糖酶微胶囊制备方法及利用其制备低乳糖液态羊乳
技术领域
本发明涉及乳糖酶微胶囊及应用技术领域，具体涉及一种乳糖酶微胶囊制备方法及利用其制备低乳糖液态羊乳。
背景技术
固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生物工程技术，是使生物酶得到广泛而有效利用的重要手段。酶固定化(Immobilization of enzymes)是一种利用固体材料将酶包裹在特定区域内进行独特的催化反应，而且可回收再利用的技术(参见李彦峰，李军荣，伏莲娣.固定化酶的制备及应用[J].高分子通报,2001,l3-23.)。与游离酶相比，固定化酶保持了酶催化反应的高效、特异性和温和性，同时又克服了游离酶的缺点，表现出储存稳定性高，易于分离和回收，重现性好、操作连续可控、使用和操作易于处理等优点(参见陈冬梅. 固定化酶及其在食品工业中的应用[A].现代农业科技,2010(19):330)。固定化酶的研究在化学生物学、生物工程技术、生命科学等领域非常活跃，因为可以节约能源，减少污染对环境影响，符合可持续发展的要求(参见胡和兵，王牧野，吴勇民，等.酶的固定化技术及应用 [J].中国酿造,2006(7):4-7.)。
微胶囊是固定化酶常用的一种方法。微胶囊技术(参见A.Santillo, M.Albenzio,A.Bevilacqua,et al.Encapsulation of probiotic bacteria in lamb rennet paste:Effects on the quality of Pecorino cheese[J].Journal of Food Engineering,2012,95(7):3489-3500.和许时婴，张晓鸣，夏书芹，等.微胶囊技术-原理与应用[M].北京：化学工业出版社，2006:188-189.) 是指采用一定的方法在固体微粒、液体微滴或气体外形成一层连续而薄的微小致密膜结构的技术。作为微胶囊一部分的壁材，其选择在微胶囊的制备过程中非常重要。利用海藻酸钠，通过挤压法制备出了酵母细胞微胶囊，此微胶囊可进行反复发酵生产(参见DanYang Ying, Stephanie Schwander,Rangika Weerakkody,etal.Microencapsulated Lactobacillus rhamnosus GG in whey protein and resistantstarch matrices: Probiotic survival in fruit juice[J].Journal of FunctionalFoods, 2013,5(1):98-105.)。将未加工的牛乳糖和酵母细胞与海藻酸钠溶液混合然后用挤压法将混合液在4℃条件下逐滴滴入氯化钙溶液中制备出了酵母细胞微胶囊,可用来反复发酵生产(参见DanYang Ying, Stephanie Schwander,Rangika Weerakkody,etal.Microencapsulated Lactobacillus rhamnosus GG in whey protein and resistantstarch matrices: Probiotic survival in fruit juice[J].Journal of FunctionalFoods,2013, 5(1):98-105.)。利用海藻酸钠/壳聚糖作为壁材对乳酸菌进行微胶囊化，得到了经模拟胃肠液处理后活菌数仍在107cfu/g以上的微胶囊(参见李晓岩.基于海藻酸钠的微胶囊构建技术及其在干态乳酸菌中的应用 [D].青岛：中国海洋大学，2009.)。将嗜酸乳杆菌与海藻糖、菊粉等物质混合，利用挤压法制备嗜酸乳杆菌微胶囊，之后利用壳聚糖进行涂层，提高了嗜酸乳杆菌的耐受性(参见Paulraj Kanmani,R.Satish Kumar,N.Yuvaraj,et al.Effect of cryopre-servation and microencapsulation of lactic acidbacterium Enterococcus faecium MC13 for long-term storage[J].BiochemicalEngineering Journal,2011,58:140- 147.)。将双歧杆菌与海藻酸盐的混合液用注射器针头注入CaCl2固化液制得双歧杆菌微胶囊，发现微胶囊化效果较好(参见Krasaehoopt W,Bhandarib,Deeth H.Evaluation of encapsulate on techniques of probiotics foryoghurt；a review[J].International Dairy Journal,2003, 13(1):3-13.)。
微胶囊壁材的选择对微胶囊产品的特性起着非常重要的作用，不同的壁材制作的微胶囊的包埋效果及内容物的释放效果均有所差异。目前乳糖酶固定化时很多研究采用海藻酸钠和钙盐通过反应形成海藻酸钙凝胶来实现包埋，但反应对乳糖酶活性有一定的影响，此外，还有研究是采用戊二醛交联固定乳糖酶，但戊二醛不能用于食品，限制了其在食品中的使用，因此开发适用于食品的乳糖酶微胶囊壁材很有必要。
发明内容
为了克服以上技术问题，本发明的目的在于提供一种乳糖酶微胶囊制备方法及利用其制备低乳糖液态羊乳，能够提高水解乳糖的乳糖酶的利用率。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种乳糖酶微胶囊制备方法，包括以下步骤；
步骤1：制备壳聚糖溶液：
取壳聚糖溶于冰乙酸，充分溶解后利用NaOH或HCl调节pH值，得到壳聚糖溶液；
步骤2：制备不同材料乳糖酶微胶囊制备：
1)将1％的海藻酸钠、1％的海藻酸钠加0.1％的黄原胶、1％海藻酸钠加0.1％黄原胶溶液加0.5％β环糊精分别与1％的β-半乳糖苷酶混合均匀；
利用转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌CaCl2 溶液中，搅拌，静置，得到海藻酸钙微胶囊(Alg)、海藻酸钙-黄原胶微胶囊(Alg-XG)、海藻酸钙-黄原胶-β-环糊精微胶囊(Alg-XG-β-CD)；
2)步骤1)得到Alg、Alg-XG、Alg-XG-β-CD三种微胶囊后，将其分别放置到壳聚糖溶液中，静置，即得到海藻酸钙-壳聚糖微胶囊 (Alg-CS)、海藻酸钙-黄原胶-壳聚糖微胶囊(Alg-XG-CS)、海藻酸钙-黄原胶-β-环糊精-壳聚糖微胶囊(Alg-XG-β-CD-CS)；
3)将1％的黄原胶溶液、1％的结冷胶溶液、0.5％黄原胶溶液加0.5％结冷胶溶液分别与1％的β-半乳糖苷酶混合均匀；利用转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌的壳聚糖溶液中，搅拌，得到黄原胶-壳聚糖微胶囊(XG-CS)、结冷胶-壳聚糖微胶囊(GG-CS)、黄原胶-结冷胶-壳聚糖微胶囊(XG-GG-CS)。
所述步骤1具体为：取壳聚糖溶于1％的冰乙酸，充分溶解后利用NaOH或HCl调节pH值，得到pH为6的1％的壳聚糖溶液。
所述步骤1)中，利用恒流泵以300-600r/min的转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌的2％的CaCl2溶液中，滴入的高度离液面的高度大约为5cm，搅拌一定时间后，静置30min，待湿胶囊充分络合，筛网过滤。
所述步骤2)分别放置到1％的壳聚糖溶液中，静置30min，待湿胶囊小球充分络合，筛网过滤。
所述步骤3)利用恒流泵以300-600r/min的转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌的1％壳聚糖溶液中，滴入的高度离溶液液面的高度大约为5cm，搅拌一定时间后，待湿胶囊充分络合，筛网过滤。
所述黄原胶-结冷胶-壳聚糖乳糖酶微胶囊单位酶活范围为4.0- 5.056U/g、包埋率范围为80-94.6％时，酶浓度为0.7-1.21％、壳聚糖浓度为0.81-1.18％、混合胶总量为0.84-1.37％，当单位酶活为 4.49983U/g、包埋率为94.044％时，酶浓度为1.02％、壳聚糖浓度为0.83％、混合胶总量为1.17％，当静置时间为30-50min，混合胶中结冷胶和黄原胶比例在0.8：0.2到0.4：0.6范围之间时，生产的乳糖酶微胶囊的单位酶活及包埋率较高。
所述黄原胶-结冷胶-壳聚糖最适pH为7.0；最适温度为50℃， 60℃和70℃基本失活，80℃彻底失活。
一种利用乳糖酶微胶囊制备方法制备低乳糖液态羊乳的方法，包括以下步骤；
将绵羊乳和山羊乳分别置于无菌容器中，添加质量比为2‰-8‰的乳糖酶微胶囊，在45-55℃下恒温酶解3-5h，过滤即得低乳糖绵羊乳和山羊乳，其乳糖水解率分别为75.49％-92.68％和78.61％-93.52％，乳糖酶微胶囊回收利用，采用绵羊乳粉和山羊乳粉为原料时，需将绵羊乳粉和山羊乳粉分别加水至浓度为18％(w/v)和12.5％(w/v)，即得复原绵羊乳和山羊乳，乳糖酶微胶囊重复利用10次后，其酶活性下降到50％。
本发明的有益效果：
本发明以黄原胶-结冷胶/壳聚糖为材料包埋乳糖酶，以绵羊乳和山羊乳为原料，利用乳糖酶将羊乳中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，降低了液态乳中的乳糖含量，缓解乳糖不耐受，同时水解生成的葡萄糖赋予液态乳一定的甜味，提升口感；
本发明的微胶囊材料黄原胶-结冷胶/壳聚糖均为天然多糖，通过黄原胶-结冷胶带负电，壳聚糖带正电通过正负电荷吸引和络合形成聚电解质凝胶，提高了乳糖酶的稳定性和容易回收重复利用，从而降低成本；
进一步的，利用乳糖酶微胶囊制备的低乳糖液态绵羊乳和山羊乳避免了消费者饮用后发生乳糖不耐症，适宜乳糖不耐症的消费者饮用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例：
材料与方法
1初筛
1.1乳糖酶：采用诺维信生物技术有限公司的β-半乳糖苷酶(中性)。
1.2壳聚糖溶液：取壳聚糖溶于1％的冰乙酸，充分溶解后利用 NaOH或HCl调节pH值，得到pH为6的1％的壳聚糖溶液。
1.3不同材料乳糖酶微胶囊制备
β-半乳糖苷酶微胶囊通过挤压法制备，具体操作为：将1％的海藻酸钠、1％的海藻酸钠加0.1％的黄原胶、1％海藻酸钠加0.1％黄原胶溶液加0.5％β环糊精分别与1％的β-半乳糖苷酶混合均匀；利用恒流泵以300-600r/min的转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌的2％的CaCl2溶液中，滴入的高度离液面的高度大约为5cm，搅拌一定时间后，静置30min，待湿胶囊充分络合，筛网过滤，得到海藻酸钙微胶囊(Alg)、海藻酸钙-黄原胶微胶囊(Alg-XG)、海藻酸钙-黄原胶-β-环糊精微胶囊(Alg-XG-β-CD)。
得到Alg、Alg-XG、Alg-XG-β-CD三种微胶囊后，将其分别放置到1％的壳聚糖溶液中，静置30min，待湿胶囊小球充分络合，筛网过滤，即得到海藻酸钙-壳聚糖微胶囊(Alg-CS)、海藻酸钙-黄原胶- 壳聚糖微胶囊(Alg-XG-CS)、海藻酸钙-黄原胶-β-环糊精-壳聚糖微胶囊(Alg-XG-β-CD-CS)。
将1％的黄原胶溶液、1％的结冷胶溶液、0.5％黄原胶溶液加0.5％结冷胶溶液分别与1％的β-半乳糖苷酶混合均匀；利用恒流泵以300- 600r/min的转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌的1％壳聚糖溶液中，滴入的高度离溶液液面的高度大约为5cm，搅拌一定时间后，待湿胶囊充分络合，筛网过滤，得到黄原胶-壳聚糖微胶囊 (XG-CS)、结冷胶-壳聚糖微胶囊(GG-CS)、黄原胶-结冷胶-壳聚糖微胶囊(XG-GG-CS)。
1.4邻硝基苯酚(ONP)标准曲线的绘制
分别移取2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL和14mL 的邻硝基苯酚溶液于100mL容量瓶，各自加入25mL碳酸钠溶液，并用反应缓冲液定容至刻度，并摇匀。用去离子水作空白对照，使用玻璃比色皿，在420nm处测定每个样品的吸光度，以邻硝基苯酚的物质的量为横坐标，稀释液的吸光度为纵坐标做标准曲线，得出回归方程。标准曲线方程为y＝3.3923x+0.0127，相关系数 R2＝0.991，在0-0.16mmol/mL范围内ONP浓度和吸光度有着良好的线性关系。
1.5乳糖酶活力测定
原理：β-半乳糖苷酶可以快速地催化邻硝基酚-β-D-半乳糖苷 (ONPG)转化生成邻硝基苯酚(ONP)和半乳糖。ONP在碱性介质中呈黄色，其颜色深度用分光光度计测定，通过吸光度值的变化得出邻硝基苯酚的生成量计算出乳糖酶活性。
测定时，先测定绘制ONP标准曲线，再按照以下操作及计算公式获得乳糖酶活力。
取1.0mL待测酶液或1.0g乳糖酶微胶囊加入10mL的具塞比色管中，于37.0℃±0.5℃恒温水浴槽中平衡15min，接着快速加入5.0 mL ONPG底物溶液(使用前需要在37.0℃±0.5℃平衡)，加盖颠倒混匀。在37.0℃±0.5℃恒温条件下，精确反应10min后，迅速加入2.0mL碳酸钠溶液，晃动混合，静置。颠倒添加ONPG和碳酸钠的顺序，其余步骤一致，作为空白对照。在30min之内，用1cm的玻璃比色皿，在420nm处测定样品和空白液的吸光度。所得样品和空白液的吸光度之差即△A，将△A带入标准曲线线性回归方程中，计算样品中邻硝基苯酚的浓度。
计算公式为:
Figure RE-GDA0003778506480000091
式中：
c——试验液中邻硝基苯酚的浓度，单位为毫摩尔每升 (mmol/L)，从标准曲线中得出；
8——反应试剂的总体积，单位为毫升(mL)；
D——稀释倍数；
1——参与反应酶液的体积，单位为毫升(mL)；
10——反应时间，单位为分钟(min)；
计算结果保留3位有效数字。
1.6不同材料乳糖酶微胶囊包埋率
从所做微胶囊中取1g的凝胶，采用乳糖酶活力测定所示的方法，进行单位酶活的测定，得到单位酶活，然后用凝胶总量乘以单位凝胶的酶活就可以得到被包埋的总酶活，用被包埋的总酶活除以添加的总酶活即得包埋产量。
1.7不同材料乳糖酶微胶囊产量
将9种乳糖酶微胶囊制备完成后，过滤并用滤纸吸干表面水分，进行称重并记录，得到不同材料乳糖微胶囊产量。
1.8不同材料乳糖酶微胶囊含水率
不同材料乳糖酶微胶囊制备完成后，分别取1g九种乳糖酶微胶囊置于培养皿当中，置于120℃的烘箱进行烘干，每隔一个小时称量一下重量并记录，直至恒重，根据公式计算含水率。
计算公式为：
Figure RE-GDA0003778506480000101
式中：
W1——烘干前微胶囊小球质量；
W2——烘干后微胶囊小球质量。
2结冷胶-黄原胶-壳聚糖乳糖酶微胶囊工艺优化
2.1时间对乳糖酶微胶囊的影响
准确称取5份乳糖酶微胶囊，每份1g，分别加入到100mL pH值为6，浓度为1％的壳聚糖溶液中，于25℃下分别吸附20、40、60、 80、100min，然后分别测定微胶囊的单位酶活，并计算包埋率。
2.2酶浓度对乳糖酶微胶囊的影响
准确称取5份乳糖酶浓度分别为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％的乳糖酶微胶囊，每份1g，分别加入到100mL pH值为6的壳聚糖溶液中，25℃吸附30min，然后测定微胶囊的酶活。
2.3壳聚糖浓度对乳糖酶微胶囊的影响
准确称取5份乳糖酶微胶囊，每份1g，分别加入到100mL pH 值为6，浓度分别为0.25％、0.5％、0.75％、1.0％、1.25％的壳聚糖溶液中，25℃吸附30min，然后测定乳糖酶微胶囊的单位酶活。
2.4结冷胶与黄原胶体积比对乳糖酶微胶囊的影响
准确分别称取5份结冷胶与黄原胶体积比分别为1:0、0.8:0.2、 0.6:0.4、0.4:0.6、0.2:0.8、0:1的乳糖酶微胶囊，每份1g，分别加入到 100mL pH值为6的壳聚糖溶液中，25℃吸附30min，然后测定乳糖酶微胶囊的单位酶活。
2.5混合胶总量对乳糖酶微胶囊的影响
准确分别称取5份混合胶量为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％的乳糖酶微胶囊，每份1g，分别加入到100mL pH值为6的壳聚糖溶液中，于25℃下吸附30min，然后测定乳糖酶微胶囊的单位酶活。
2.6响应面优化乳糖酶微胶囊制备条件
通过对各单因素试验结果分析，发现壳聚糖浓度、加酶量、混合胶总量对XG-GG-CS乳糖酶微胶囊有显著影响。因此选择壳聚糖浓度、加酶量、混合胶总量三个主要因素，以XG-GG-CS乳糖酶微胶囊的产量、单位酶活和包埋率为响应值，采用Box-Behnken试验分析，确定制备XG-GG-CS乳糖酶微胶囊的最佳工艺条件。
3.结冷胶-黄原胶-壳聚糖乳糖酶微胶囊的应用及性质研究
3.1pH值对XG-GG-CS乳糖酶微胶囊酶活的影响
准确称取XG-GG-CS乳糖酶微胶囊1g和1mL液体乳糖酶溶液各5份，分别于pH值为5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的ONPG底物反应，测定固定化酶和游离酶的活力。
3.2温度对XG-GG-CS乳糖酶微胶囊的影响
准确称取XG-GG-CS乳糖酶微胶囊1g和1mL液体乳糖酶溶液各5份，分别于25℃、30℃、40℃、50℃和60℃下与底物ONPG反应10min，测定固定化酶和游离酶的活力。
3.3XG-GG-CS乳糖酶微胶囊的热稳定性
准确称取3份XG-GG-CS乳糖酶微胶囊，每份1g，分别置于 60℃、70℃和80℃的热水中20min，用常温水冷却。然后测定固定化酶活力。
3.4乳糖酶微胶囊在羊乳中的应用
将绵羊乳和山羊乳分别以100mL的加样量分装在100mL奶瓶中，添加一定量的乳糖酶微胶囊在50℃下恒温酶解3-4.5h，过滤回收乳糖酶重复利用，滤液即为到低乳糖绵羊乳和山羊乳。以按1:8的比例复水得到复原牛乳、山羊乳为原料；将绵羊乳以9：50的比例复水得到复原绵羊乳为原料。将液态绵羊乳和
4.结果与讨论
4.1九种乳糖酶微胶囊产量、包埋率、含水率对比
测定并计算不同材料的乳糖酶微胶囊的产量、包埋率、含水率。九种乳糖酶微胶囊产量在35-75g之间，其中用Alg-XG和Alg- XG-β-CD两种材料所做的微胶囊产量最高，XG-CS材料做的微胶囊产量最低。包埋率在5-65％之间，其中用XG-GG-CS材料所做的微胶囊包埋率最高，XG-CS材料做的微胶囊包埋率最低。含水率在 95-98％之间，其中用GG-CS材料所做的微胶囊含水率最高，XG- GG-CS材料做的微胶囊含水率最低。
4.2九种乳糖酶微胶囊溶胀后胶团酶活
分别取1g九种乳糖酶微胶囊溶胀结束后的胶团，采用乳糖酶活力测定测定的方法，进行酶活的测定。溶胀后的胶团酶活最高的是 XG-GG-CS材料所做的微胶囊，Alg-XG-β-CD和Alg材料所做的微胶囊溶胀后酶活基本丧失，猜测可能是冷冻干燥过程中，结构发生改变导致酶活丧失。
4.3时间对乳糖酶微胶囊的影响
随着静置时间的增加，乳糖酶微胶囊的单位酶活和包埋率均先升高后降低，静置时间为40min时，对应的单位酶活和包埋率分别为 4.348U/g和73.43％。
4.4酶浓度对乳糖酶微胶囊的影响
随着乳糖酶添加量的增加，乳糖酶微胶囊的单位酶活先升高后降低，而包埋率变化较小，最适添加量为1.0％，对应的单位酶活和包埋率分别为4.932U/g和85.59％。
4.5壳聚糖浓度对乳糖酶微胶囊的影响
随着壳聚糖浓度的变化，乳糖酶微胶囊的单位酶活和包埋率均先升高后降低，其最适浓度为1.0％，对应的单位酶活和包埋率分别为 4.816U/g和92.35％。
4.6结冷胶与黄原胶体积比对乳糖酶微胶囊的影响
随着结冷胶与黄原胶体积比的变化，乳糖酶微胶囊的单位酶活和包埋率均先升高后降低，其最适体积比为0.6:0.4％，对应的单位酶活和包埋率分别为3.512U/g和40.08％。
4.7混合胶总量对乳糖酶微胶囊的影响
随着混合胶添加量的增加，乳糖酶微胶囊的单位酶活和包埋率均先升高后降低，其最适添加量为1.0％，对应的单位酶活和包埋率分别为3.756U/g和83.4％。
4.8响应面优化乳糖酶微胶囊制备条件
根据单因素试验结果，建立三因素三水平的Box-Behnken模型，优化XG-GG-CS乳糖酶微胶囊的工艺，以酶浓度(X1)、壳聚糖浓度 (X2)和混合胶总量(X3)为自变量，重量(Y1)、单位酶活(Y2)、包埋率(Y3)3个指标为响应值。
通过Design-Expert 8.0.6对试验结果进行二次回归拟合，得到酶浓度(X1)、壳聚糖浓度(X2)和混合胶总量(X3)三个因素对乳糖酶固定化组分中产量(Y1)、单位酶活(Y2)、包埋率(Y3)这三个指标的二次回归方程如下：
Y1＝9.13+0.34A-1.03B+1.32C-0.72AB-0.025AC-0.15BC-0.64A2-
0.19B2-0.47C2；Y2＝4.6+0.3A+0.22B-0.098C-0.019AB+0.032AC- 0.42BC-0.79A2+0.074B2-0.49C2；
Y3＝84.62-15.61A-4.67B+12.77C-3.79AB-9.57AC-7.19BC- 14.3A2+2.02B2-15.97C2；
4.9pH值对XG-GG-CS乳糖酶微胶囊酶活的影响
随着体系pH的升高，游离和微胶囊的乳糖酶活力均先升高后降低，最适pH都为7.0，低于或者高于该pH，其酶活均降低，这是由于随着pH升高，逐渐接近其最适pH值，所以酶反应速度加快，但是pH超过7.0，对酶的结构有一定的破坏作用，导致其活力下降。
4.10温度对XG-GG-CS乳糖酶微胶囊的影响
随着反应温度的升高，游离和微胶囊的乳糖酶活力均先升高后降低，最适温度都为50℃，低于或者高于该温度，其酶活均降低，这是由于随着温度升高，酶反应速度加快，但是温度超过50℃，对酶的结构有一定的破坏作用，导致其活力下降。
4.11XG-GG-CS乳糖酶微胶囊的热稳定性
结果显示60℃和70℃基本失活，80℃彻底失活。主要原因是酶受高温时间过长，酶分子结构发生不可逆变化。
5.结论
本发明开发了一种乳糖酶微胶囊的制备及应用的方法。利用不同材料及组合生产乳糖酶微胶囊，通过比较微胶囊的产量、包埋率、单位酶活、含水率等，筛选出结冷胶-黄原胶-壳聚糖制备的乳糖酶微胶囊。
对其混合胶添加量、壳聚糖浓度、乳糖酶添加量、静置时间等进行单因素研究，通过响应面法优化确定了结冷胶-黄原胶-壳聚糖乳糖酶微胶囊的最佳制备工艺参数为混合胶添加量为1％(黄原胶：结冷胶＝0.4：0.6)，壳聚糖浓度为1％，乳糖酶添加量为1％，静置40min，制备的乳糖酶微胶囊包埋率和单位酶活分别为89.9％和 4.264U/g，与预测值无显著性差异。其最适的pH和温度与游离酶一致，均为7.0和50℃。
本发明目的之一提供多种乳糖酶微胶囊的制备技术，研究了食品允许使用的几种材料(海藻酸钙、壳聚糖、结冷胶、黄原胶、β- 环糊精)制备乳糖酶微胶囊的方法。
本发明目的之二提供了一种最佳乳糖酶微胶囊制备材料、技术方法，该方法通过不同材料及组合对乳糖酶微胶囊的产量、包埋率、单位酶活、含水率、外观形貌等方面比较，九种乳糖酶微胶囊产量在35-75g之间，其中用海藻酸钙-黄原胶(Alg-XG)和海藻酸钙-黄原胶-β-环糊精(Alg-XG-β-CD)两种材料所做的微胶囊产量最高，黄原胶-壳聚糖(XG-CS)材料做的微胶囊产量最低。包埋率在 5-65％之间，其中用黄原胶-结冷胶-壳聚糖(XG-GG-CS)材料所做的微胶囊包埋率最高，黄原胶-壳聚糖(XG-CS)材料做的微胶囊包埋率最低。含水率在95-98％之间，其中用结冷胶-壳聚糖(GG- CS)材料所做的微胶囊含水率最高，黄原胶-结冷胶-壳聚糖(XG- GG-CS)材料做的微胶囊含水率最低。综合考虑，选出了一种最佳乳糖酶微胶囊，即结冷胶-黄原胶-壳聚糖(XG-GG-CS)乳糖酶微胶囊。
本发明目的之三对结冷胶-黄原胶-壳聚糖乳糖酶微胶囊的制备工艺进行单因素试验，再进行响应面优化，确定最优工艺条件范围。通过采用Box-Behnken试验分析，单位酶活范围为4.0-5.056 U/g、包埋率范围为80-94.6％时，酶浓度为0.7-1.21％、壳聚糖浓度为0.81-1.18％、混合胶总量为0.84-1.37％。当单位酶活为4.49983 U/g、包埋率为94.044％时，酶浓度为1.02％、壳聚糖浓度为 0.83％、混合胶总量为1.17％。当静置时间为30-50min，混合胶中结冷胶和黄原胶比例在0.8：0.2到0.4：0.6范围之间时，生产的乳糖酶微胶囊的单位酶活及包埋率较高。
本发明目的之四研究了结冷胶-黄原胶-壳聚糖乳糖酶微胶囊的性质，主要将乳糖酶微胶囊与游离酶酶解反应时的pH、反应温度进行对比。乳糖酶微胶囊酶解的最适pH为7.0；最适温度为50℃。另外，研究了结冷胶-黄原胶-壳聚糖乳糖酶微胶囊的热稳定性，结果显示60℃和70℃基本失活，80℃彻底失活。
本发明目的之五提供了利用乳糖酶微胶囊生产低乳糖液态羊乳的方法，将绵羊乳和山羊乳分别置于无菌容器中，添加2‰-8‰的乳糖酶微胶囊在45-55℃下恒温酶解3-5h，过滤即得低乳糖绵羊乳和山羊乳，其乳糖水解率分别为75.49％-92.68％和78.61％-93.52％，乳糖酶微胶囊回收利用。采用绵羊乳粉和山羊乳粉为原料时，需将绵羊乳粉和山羊乳粉分别加水至浓度为18％(w/v)和12.5％(w/v)，即得复原绵羊乳和山羊乳，乳糖酶微胶囊重复利用10次后，其酶活性下降到50％。

Claims (8)

1.一种乳糖酶微胶囊制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
步骤1：制备壳聚糖溶液：
取壳聚糖溶于冰乙酸，充分溶解后利用NaOH或HCl调节pH值，得到壳聚糖溶液；
步骤2：制备不同材料乳糖酶微胶囊制备：
1)将1％的海藻酸钠、1％的海藻酸钠加0.1％的黄原胶、1％海藻酸钠加0.1％黄原胶溶液加0.5％β环糊精分别与1％的β-半乳糖苷酶混合均匀；
利用转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌CaCl2溶液中，搅拌，静置，得到海藻酸钙微胶囊(Alg)、海藻酸钙-黄原胶微胶囊(Alg-XG)、海藻酸钙-黄原胶-β-环糊精微胶囊(Alg-XG-β-CD)；
2)步骤1)得到Alg、Alg-XG、Alg-XG-β-CD三种微胶囊后，将其分别放置到壳聚糖溶液中，静置，即得到海藻酸钙-壳聚糖微胶囊(Alg-CS)、海藻酸钙-黄原胶-壳聚糖微胶囊(Alg-XG-CS)、海藻酸钙-黄原胶-β-环糊精-壳聚糖微胶囊(Alg-XG-β-CD-CS)；
3)将1％的黄原胶溶液、1％的结冷胶溶液、0.5％黄原胶溶液加0.5％结冷胶溶液分别与1％的β-半乳糖苷酶混合均匀；利用转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌的壳聚糖溶液中，搅拌，得到黄原胶-壳聚糖微胶囊(XG-CS)、结冷胶-壳聚糖微胶囊(GG-CS)、黄原胶-结冷胶-壳聚糖微胶囊(XG-GG-CS)。
2.根据权利要求1所述的一种乳糖酶微胶囊制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：取壳聚糖溶于1％的冰乙酸，充分溶解后利用NaOH或HCl调节pH值，得到pH为6的1％的壳聚糖溶液。
3.根据权利要求1所述的一种乳糖酶微胶囊制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，利用恒流泵以300-600r/min的转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌的2％的CaCl2溶液中，滴入的高度离液面的高度大约为5cm，搅拌一定时间后，静置30min，待湿胶囊充分络合，筛网过滤。
4.根据权利要求1所述的一种乳糖酶微胶囊制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述步骤2)分别放置到1％的壳聚糖溶液中，静置30min，待湿胶囊小球充分络合，筛网过滤。
5.根据权利要求1所述的一种乳糖酶微胶囊制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述步骤3)利用恒流泵以300-600r/min的转速匀速逐滴滴入的方式将混合液滴入到缓慢搅拌的1％壳聚糖溶液中，滴入的高度离溶液液面的高度大约为5cm，搅拌一定时间后，待湿胶囊充分络合，筛网过滤。
6.根据权利要求1所述的一种乳糖酶微胶囊制备方法，其特征在于，所述黄原胶-结冷胶-壳聚糖乳糖酶微胶囊单位酶活范围为4.0-5.056U/g、包埋率范围为80-94.6％时，酶浓度为0.7-1.21％、壳聚糖浓度为0.81-1.18％、混合胶总量为0.84-1.37％，当单位酶活为4.49983U/g、包埋率为94.044％时，酶浓度为1.02％、壳聚糖浓度为0.83％、混合胶总量为1.17％，当静置时间为30-50min，混合胶中结冷胶和黄原胶比例在0.8：0.2到0.4：0.6范围之间时，生产的乳糖酶微胶囊的单位酶活及包埋率较高。
7.根据权利要求1所述的一种乳糖酶微胶囊制备方法，其特征在于，所述黄原胶-结冷胶-壳聚糖最适pH为7.0；最适温度为50℃，60℃和70℃基本失活，80℃彻底失活。
8.基于权利要求1-7任一项所述的一种利用乳糖酶微胶囊制备方法制备低乳糖液态羊乳的方法，其特征在于，包括以下步骤；
将绵羊乳和山羊乳分别置于无菌容器中，添加质量比为2‰-8‰的乳糖酶微胶囊，在45-55℃下恒温酶解3-5h，过滤即得低乳糖绵羊乳和山羊乳，其乳糖水解率分别为75.49％-92.68％和78.61％-93.52％，乳糖酶微胶囊回收利用；
采用绵羊乳粉和山羊乳粉为原料时，需将绵羊乳粉和山羊乳粉分别加水至浓度为18％(w/v)和12.5％(w/v)，即得复原绵羊乳和山羊乳。
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