CN114981416A - 促进造血干细胞扩增的方法和用于所述方法的试剂 - Google Patents
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Abstract
血管粘附蛋白‑1(VAP‑1)抑制剂可以在造血干细胞的离体培养中用作活性氧物种(ROS)浓度的调节剂，这使得能够实现一种离体产生经扩增的造血干细胞群体的方法。此外，VAP‑1抑制剂可以用于治疗个体的骨髓抑制或骨髓衰竭。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进造血干细胞扩增的方法和适用于造血干细胞扩增的一种或多种药剂。
背景技术
由收集自健康供体的骨髓(BM)或脐带血(CB)中收集的造血干细胞(HSC)的移植可以用于治疗多种造血疾病，包括例如白血病、严重再生障碍性贫血、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和免疫缺陷病症。因此，包括HSC在内的患病造血细胞被消融且被健康细胞所取代。出生后的造血和造血干细胞的维持主要发生在骨髓中，其中HSC和其后代位于专门的生态位中。
造血干细胞(HSC)高度依赖于骨髓(BM)中的血管周围的干细胞生态位。确定HSC与其微环境之间的相互作用可能有助于确定造血干细胞移植和影响造血的治疗的领域中的临床方法和机会。因此，更好地了解调节造血的机制将有助于了解血液疾病，且也可能有助于开发用于离体扩增HSC的新方法，因为可以从供体获得用于临床移植的HSC数目有限，故促进HSC扩增的方法是期望的。
发明内容
现在，已经发现血管粘附蛋白-1(VAP-1)是干细胞生态位的组分，且在造血干细胞(HSC)的维持和扩增中发挥作用。已经发现，VAP-1由靠近造血干细胞的骨髓脉管系统表达，且缺乏VAP-1会影响骨髓(BM)中HSC和造血干细胞和祖细胞(HSPC)的数目。已经发现，对VAP-1酶活性的抑制促进了脐带血和骨髓衍生的HSC的扩增。
除了VAP-1在人类HSC扩增中的作用之外，本申请案的发明人也发现了独特的人类VAP-1+HSC亚群。更具体地说，已经发现一部分原始人类造血干细胞是VAP-1阳性的，且尤其可以通过抑制血管粘附蛋白-1(VAP-1)的酶活性来实现其扩增。
本发明的发现提供了一种使用VAP-1抑制剂在临床应用中扩增HSC的方法。本发明的发现可能有助于改善损伤后的骨髓恢复，增强骨髓移植的效果并改善HSC的动员、收获和扩增。此外，本发明的发现提供了一种治疗多种血液疾病或病况的新方法，这些疾病或病况会受益于经扩增的造血干细胞群体。本发明提供了一种用于治疗骨髓功能不正常并且患者需要增强他/她的造血功能的病况的方法。在一个方面中，本发明的发现提供了一种用于离体增加脐带血HSC的数目的新颖有效方法，因为脐带血移植(UCBT)已成为没有匹配供体的患者的既定疗法，导致以前无法治愈的疾病得到治愈。
血管粘附蛋白-1(VAP-1)是一种跨膜蛋白，也称为含铜胺氧化酶(AOC 3)或氨基硫脲敏感性胺氧化酶(SSAO)。VAP-1的胞外胺氧化酶活性催化伯胺的氧化脱胺。所述反应导致形成相应的醛并释放氨和H2O2(一种活性氧物种(ROS))。根据本发明，已经观察到VAP-1抑制剂减少SSAO特异性的过氧化氢产生。更详细地说，在本发明中，已经发现VAP-1抑制剂可以用于维持所需的活性氧物种(ROS)水平一致，且从而促进HSC的扩增。HSC的维持、扩增和分化对ROS浓度极为敏感。本发明提供了一种通过使用VAP-1抑制剂抑制VAP-1的酶活性来控制ROS浓度的方法，其中将ROS水平降低到为HSC提供生长优势的水平。在本发明中，使用阻断或抑制VAP-1的酶活性，更具体地说VAP-1的胺氧化酶活性的VAP-1抑制剂来影响ROS的浓度。本发明基于使用影响ROS浓度的抑制剂化合物改善HSC的扩增。
根据本发明的一个方面，能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的VAP-1抑制剂(也称为SSAO抑制剂)在造血干细胞的离体培养中用作活性氧物种(ROS)浓度的调节剂。
根据另一方面，本发明提供了一种离体产生经扩增的造血干细胞群体的方法，所述方法包含用能够抑制血管粘附蛋白-1(VAP-1)的酶活性的血管粘附蛋白-1(VAP-1)抑制剂离体培养造血干细胞，其中所述VAP-1抑制剂以足以产生经扩增的造血干细胞群体的量存在。本发明提供了一种离体扩增脐带血和骨髓衍生的HSC用于移植的改进方法。
此外，本发明提供了一种用于造血干细胞的细胞扩增培养基，其包含能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的血管粘附蛋白(VAP-1)抑制剂。
根据第三方面，本发明还提供了一种促进个体的造血干细胞扩增的方法，包含向个体施用能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的VAP-1抑制剂或包含能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)酶活性的VAP-1抑制剂的组合物。根据本发明，一种治疗受益于经扩增的造血干细胞群体的疾病或病况的方法，包含以足以产生经扩增的造血干细胞群体的量向患有此类疾病或病况的个体施用能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的VAP-1抑制剂。根据本发明的一个实施例，VAP-1抑制剂可以用于治疗骨髓抑制或骨髓衰竭，其是指骨髓功能不正常且需要影响HSC数目的治疗的病况。
附图说明
图1.ROS浓度在HSC扩增中的作用的示意图。VAP-1/SSAO产生过氧化氢(ROS物种)、氨和醛，被根据本发明的抑制剂阻断，导致HSC的扩增。
图2.VAP-1在血管内皮和人类BM中的原始HSC上表达，且对VAP-1的抑制增加了NBSGW小鼠的植入潜力和CFU分析中的HSC数目。
(A)VAP-1在人类骨髓(BM)中的表达。组织切片用多克隆抗VAP-1抗体或兔IgG作为对照染色。所有观察到的血管均表达VAP-1。楔形符号表示表达VAP-1的小动脉，而箭头表示小静脉。比例尺50μm，(n＝2)。
(B)人类BM中原始HSC的流式细胞术鉴别。BM细胞用谱系混合物(Lineagecocktail)，即抗CD34、抗CD38、抗CD90、抗CD45RA、抗CD49f抗体染色。这些图显示了HSC的门控策略。门P-2、P-3、P-4和P-5显示HSC的顺序富集，而门P-5代表最纯的群体。
(C)使用抗VAP-1抗体JG-2在来自门P-5(Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+)的细胞中分析VAP-1的表达；19.5％的P-5细胞表达VAP-1(显示了4个有代表性的供体中的一者的数据)。
(D)自CD34+门中的新鲜冷冻人类BM中批量分选VAP-1-和VAP-1+/lo HSC。VAP-1-和VAP-1+/lo子集的频率表示点图中两个子集的相对大小。
(E)在未经照射的NBSGW小鼠中体内植入19000个VAP-1-或VAP-1-+VAP-1+(16250个VAP-1-+2750个VAP-1+)FACS分选人类BM细胞。如实验部分所述，每组一半动物接受LJP-1586(抑制剂)处理。移植后六周处死小鼠；收集BM并通过流式细胞术进行分析。来自每组的代表性流式细胞图显示人类CD45+细胞在接受体小鼠BM中的植入(百分比)。
(F)NBSGW小鼠BM中人类CD45+细胞植入百分比的总结。所有四组(VAP-1-抑制剂或对照处理和VAP-1-+VAP-1+抑制剂或对照处理)各含有三只动物，并且移植了相等数目的BM细胞以及长期HSC(CD90+CD49f+)。植入的截止值设定为0.1％。显示了实验结束时BM中供体细胞的数目。
(G)VAP-1抑制增加了CFU分析中HSC的数目。在存在LJP-1586(0.5μM)或媒剂的情况下，在CFU条件下培养五百个人类BM衍生的CD34+细胞。12天后，重新悬浮细胞，在将培养物体积增加10倍后第二次重新接种，再次重新悬浮，并在将培养物体积增加5倍后第三次重新接种。使用一式三份制得的衍生自两个供体的细胞计算结果。应用了学生t检验(studentt-test)。
图3.人类脐带血(CB)中的原始HSC表达VAP-1。
VAP-1在CB细胞中的表达。CD34+细胞自CB中分离出来并染色用于流式细胞术。在来自门P-5的细胞中分析VAP-1的表达。用抗VAP-1抗体JG-2分析来自十个供体的CB样品。显示了10个有代表性的供体中的一者的数据。
图4.LJP-1586处理促进脐带血(CB)衍生的HSC在离体扩增。
(A)LJP-1586对CD38-CD34+细胞的影响。自三个供体(CB-1、CB-2、CB-3)获得FACS分选的CD38-CD34+CB衍生的细胞，并在含有1μM LJP-1586的StemSpan SFEM培养基II中培养15天(n＝3)。
(B)B中显示的细胞使用如门P-4所示的CD45RA-CD90+CD49f+表达的附加准则针对原始HSC进一步分析。LJP-1586处理后的倍数扩增是根据三个供体的平均值计算的，并显示在各柱中(n＝3)。应用了学生t检验。
(C)LJP-1586的长期影响。一百个人类CB衍生的Lin-CD38-CD34+VAP-1+和VAP-1-HSC在存在LJP-1586(1μM)或媒剂的情况下在液体条件中培养。10、15和20天后，分析细胞的CD38-CD34+CD45RA-CD90+表达，如图4B和C(门P-3)所示。数据以起始亲本细胞(CD38-CD34+细胞)的百分比表示。自十个供体的平均值计算HSC的倍数扩增。应用学生t检验。
(D)影响分析为CFU。自三个供体获得的CB衍生的细胞在存在或不存在LJP-1586(0.5μM)的情况下在液体培养物中扩增15天，接着在存在或不存在LJP-1586的情况下通过CFU分析进行分析。使用学生t检验计算P值。
图5.LJP-1586减少液体培养物中HSC的ROS产生。ROS利用DHR-123使用来自分别含有0.25M或0.5M LJP-1586的9天液体培养物的活HSC侦测，并通过流式细胞术进行分析。显示的是利用PMA活化之后的CD38-、CD34+门控细胞。红色DHR-123氧化时变为绿色。封闭的直方图显示对照条件，开放的直方图表示在存在LJP-1586的情况下培养的HSC。细胞来自一个供体和两个技术重复。
图6.VAP-1抑制剂szTU73的结构和其在Amplex-Red分析中抑制VAP-1的酶活性的能力。
图7.VAP-1抑制剂szTU73扩增造血干细胞(CD34+CD38-CD90+CD45RA-)。CD34+脐带血衍生的细胞与不同浓度的szTU73一起培养21天。A：使用CD38和CD34作为标记物对7-AAD细胞(活)进行流式细胞术分析。B：使用CD90和CD45RA作为标记物进一步分析7-AAD-CD34+CD38-细胞。显示了门内阳性细胞的百分比。
具体实施方式
血管粘附蛋白-1(VAP-1)属于含铜胺氧化酶/氨基硫脲敏感性胺氧化酶家族，可催化伯胺的氧化脱胺，随后产生醛、铵和过氧化氢(ROS物种)。图1显示了ROS浓度在HSC扩增中的作用以及根据本发明的VAP-1抑制剂在HSC扩增中的作用的示意图。VAP-1的胺氧化酶活性催化胺氧化脱胺为其相应的醛，并产生氨和过氧化氢。过氧化氢是活性氧物种(ROS)之一。HSC的维持、扩增和分化对ROS浓度极为敏感。VAP-1的酶活性导致ROS的产生，从而影响HSC的发育和自我更新。维持HSC需要低水平的ROS，且中等水平的ROS驱动增殖和分化，而高水平的ROS会导致干细胞池的损伤和衰竭。由于VAP-1的酶活性不是ROS的唯一来源，VAP-1抑制可以用于微调ROS浓度。在本发明中，已发现VAP-1抑制剂可以用于维持和控制促进HSC扩增所需的一致水平的ROS。根据本发明，使用VAP-1抑制剂抑制或降低VAP-1的酶活性，其中ROS水平降低到为HSC提供生长优势的水平。
在本发明中，使用阻断或至少抑制VAP-1的酶活性，更具体地说VAP-1的胺氧化酶活性的VAP-1抑制剂来影响ROS的浓度。根据本发明的一个方面，VAP-1抑制剂(也称为SSAO抑制剂)在造血干细胞的离体培养中用作活性氧物种(ROS)浓度的调节剂，且因此能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的VAP-1抑制剂用于促进HSC在离体培养中的扩增。在离体培养后，经扩增的HSC群体可以用于移植到个体中。
根据本发明的一个实施例的用于离体产生经扩增的造血干细胞群体的方法包含用能够抑制血管粘附蛋白-1(VAP-1)的酶活性的血管粘附蛋白-1(VAP-1)抑制剂离体培养造血干细胞(HSC)群体，其中所述VAP-1抑制剂以足以产生经扩增的造血干细胞群体的量存在。HSC的群体是指包括HSC的群，即可以利用根据本发明的方法增加HSC的数目。
可以为此目的和使用本领域中已知的方法在任何合适的培养基中培养HSC。根据本发明的用于造血干细胞的细胞扩增培养基包含VAP-1抑制剂。培养基中VAP-1抑制剂的浓度取决于所使用的抑制剂化合物。根据本发明，VAP-1抑制剂以足以产生经扩增的造血干细胞群体的量存在。较低或较高水平的当前抑制剂可能导致HSC的扩增效率较低。在一个实施例中，VAP-1抑制剂也可以用于维持离体培养物中的造血干细胞群体。HSC扩增的程度也取决于供体。
根据本发明，所述造血干细胞是人类细胞，且衍生自脐带血、骨髓和/或外周血液。在一个优选的实施例中，本发明用于在离体培养物中扩增脐带血和/或骨髓衍生的HSC。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于促进源自脐带血(CB)的HSC扩增的改进方法。脐带CB可用作HSC的来源，且虽然最初仅用于治疗儿童，但通过改进细胞剂量和抗原匹配，其在成人中的功效已得到提高。与成人骨髓(BM)供体经常可以多次捐赠以进行重复移植不同，MHC匹配的脐带CB是独一无二的。因此，根据本发明的方法离体扩增和维持脐带CB衍生的HSC将是有帮助的。与CB移植相关的另一个问题是未成熟的HSC的植入延迟，且因此缺乏快速增殖的多能祖细胞。抑制VAP-1的酶活性也可以克服此问题。
根据本发明，调节VAP-1酶活性、更具体地说VAP-1的胺氧化酶活性的VAP-1/SSAO抑制剂可以用于治疗会受益于经扩增的造血干细胞群体的疾病或病况，包含向罹患此类疾病或病况的个体施用VAP-1抑制剂或包含VAP-1抑制剂的化合物。本发明基于一种促进个体中的造血干细胞扩增的方法，所述方法包含向个体施用能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的VAP-1抑制剂或包含所述VAP-1抑制剂的化合物。
根据本发明，能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的VAP-1抑制剂或包含所述VAP-1抑制剂的化合物用于治疗会受益于经扩增的造血干细胞群体的疾病或病况。根据本发明的一个实施例，能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的VAP-1抑制剂或包含所述VAP-1抑制剂的化合物用于治疗骨髓抑制或骨髓衰竭，骨髓抑制或骨髓衰竭在本发明中是指其中骨髓不能正常发挥功能并且需要影响HSC数目和增强造血的治疗的病况。
骨髓衰竭或骨髓抑制可能与多种其他疾病或病况有关，如作为实例提到的白血病、多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血。骨髓抑制(bone marrow suppression)，也称为骨髓抑制(myelosuppression)，是一种骨髓活性降低，导致红细胞、白细胞和血小板减少的病况。因为骨髓是血细胞的制造中心，骨髓活性的抑制会导致血细胞的缺乏。此种情况会迅速导致危及生命的感染，因为身体无法产生白细胞来应对入侵的细菌和病毒，以及由于缺乏红细胞导致贫血和由于血小板缺乏导致自发性严重出血。通常，骨髓抑制是例如化疗和/或影响免疫系统的某些药物的严重副作用。根据本发明，一种或多种VAP-1抑制剂可以用于通过改善HSC的扩增从而增强造血来治疗骨髓抑制。此外，在骨髓衰竭中，产生的红细胞、白细胞或血小板的量不足。骨髓衰竭可以是遗传的或在出生后获得的。根据本发明，可以向患者施用能够抑制血管粘附蛋白1(VAP-1)的酶活性的VAP-1抑制剂或包含VAP-1抑制剂的化合物和/或与干细胞移植一起来治疗骨髓衰竭或骨髓抑制，其中根据本发明的用于改进离体培养的方法是有利的。
根据本发明的一个实施例，用于治疗会受益于经扩增的造血干细胞群体的疾病或病况(如骨髓抑制或骨髓衰竭)的方法包含向个体施用治疗有效量的VAP-1抑制剂或包含VAP-1抑制剂的医药组合物。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”应理解为包括疾病或病症的完全治愈，以及所述疾病或病症的改善或减轻。术语“治疗有效量”意欲包括足以抑制VAP-1的酶活性并产生经扩增的造血干细胞群体的根据本发明的任何量的VAP-1抑制剂。治疗有效量可以包含单剂量或多剂量的VAP-1抑制剂。选择的一个或多个剂量应足以抑制VAP-1酶活性并促进个体HSC的扩增。
施用是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将VAP-1抑制剂或包含VAP-1抑制剂的医药组合物物理引入个体。根据本发明，VAP-1抑制剂或包含VAP-1抑制剂的组合物可以通过实现其预期目的的任何方式施用。根据本发明的一个实施例，VAP-1抑制剂或包含VAP-1抑制剂的组合物可以口服和/或作为输液施用。举例来说，施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注疗法。除了药理学活性化合物之外，医药组合物还含有合适的药学上可接受的载体，包含促进将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。
根据本发明，VAP-1抑制剂可以是抑制、影响和/或调节VAP-1的酶活性的任何合适的化合物。在本发明的一个实施例中，VAP-1抑制剂包含能够抑制血管粘附蛋白-1(VAP-1)的酶活性的抑制剂化合物，更具体地说，能够抑制VAP-1的胺氧化酶活性的抑制剂化合物。根据本发明的一个实施例，含铜胺氧化酶的抑制剂，通常称为氨基硫脲敏感性胺氧化酶(SSAO)，可用作VAP-1抑制剂，即VAP-1抑制剂也称为氨基硫脲敏感性胺氧化酶(SSAO)抑制剂。SSAO是催化伯胺氧化脱胺的酶。根据本发明的一个实施例，VAP-1/SSAO抑制剂用于抑制SSAO的活性。根据本发明的一个实施例，VAP-1/SSAO抑制剂可以抑制可溶性SSAO的SSAO活性或膜结合型VAP-1的SSAO活性。
根据本发明的一个实施例，VAP-1抑制剂包含氨基硫脲和/或羟胺。根据本发明的一个实施例，氨基硫脲和/或羟胺可以用于HSC的离体扩增方法。
根据本发明的一个实施例，VAP-1抑制剂包含能够抑制VAP-1的酶活性的抗体或其一个或多个片段和/或小分子酶抑制剂。在本发明的一个实施例中，VAP-1抑制剂包含VAP-1的小分子抑制剂。通常，小分子抑制剂是指具有低分子量的有机化合物。根据本发明的一个实施例，VAP-1抑制剂可以是能够阻断和/或抑制VAP-1的酶活性、更详细地说VAP-1的胺氧化酶活性并由此将ROS水平降低到为HSC提供生长优势的水平的任何小分子抑制剂。在本发明的一个实施例中，VAP-1抑制剂包含VAP-1小分子抑制剂和/或与能够结合VAP-1的肽缀合的VAP-1小分子抑制剂。
许多针对VAP-1的小分子抑制剂已经开发或正在开发中。根据本发明的一个实施例，VAP-1抑制剂可以是小分子抑制剂，如SSAO/VAP-1抑制剂BI 1467335(以前称为PXS-4728A(4-(E)-2-(氨基甲基)-3-氟丙-2-烯氧基)-N-叔丁基苯甲酰胺))、PXS-4681A((Z)-4-(2-(氨基甲基)-3-氟烯丙氧基)苯磺酰胺盐酸盐)、LJP-1586、PXS-4159、PXS-4206、TERN-201、ASP8232、SZV-1287(3-(3,4-二苯基-1,3-噁唑-2-基)丙醛肟)、UD-014、PRX167700、LJP1207(N'-(2-苯基-烯丙基)肼盐酸盐)、szTU73和/或RTU-009。上述这些小分子抑制剂是目前市场上已知的VAP-1抑制剂的示例性实施例。这些小分子抑制剂仅作为非限制性实例提及。
在本发明的示例性实施例中，VAP-1抑制剂包含Z-3-氟-2-(4-甲氧基苄基)烯丙胺盐酸盐(LJP1586)。LJP-1586(Z-3-氟-2-(4-甲氧基苄基)烯丙胺盐酸盐)是一种抑制剂，可阻断VAP-1的酶活性，但不影响其粘附性质。举例来说，所述化合物描述于例如O'Rourke等人,“Anti-inflammatory effects of LJP-1586[Z-3-fluoro-2-(4-methoxybenzyl)allylamine hydrochloride],an amine-based inhibitor of semicarbazide-sensitiveamine oxidase activity”,Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics,2008年2月,324(2),第867-875页。
实验部分
方法细节
免疫组织化学
为了可视化BM中的VAP-1表达，在获得伦理当局许可的情况下，自TurkuUniversity Hospital获得的匿名人骨样品被脱钙，包埋在石蜡中，并切成5μm厚的切片。切片用二甲苯脱蜡，在一系列递减浓度的乙醇中再水化，且接着用10mM柠檬酸钠(pH 6.0)在98℃下处理10分钟以进行抗原修复。为了阻断内源性过氧化物酶活性，切片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备的1％H2O2中培育30分钟。根据VECTASTAIN ABC试剂盒(VectorLaboratories)提供的说明，用针对VAP-1(1:500)的多克隆抗体和对照兔IgG进行免疫组织化学染色，在4℃过夜进行。样品用苏木精复染。使用Olympus BX60显微镜获取图像。使用ImageJ软件进行背景减除以及亮度和对比度的调整。
骨髓移植
将人类新鲜冷冻的BM CD34+细胞(LONZA)解冻并用针对人类VAP-1的不同表位的APC缀合的小鼠抗谱系混合物、PE-Cy7缀合的抗CD34和FITC缀合的单克隆抗体1B2、TK8-14和JG-2进行染色。对于VAP-1+/lo和VAP-1-细胞的批量细胞分选，我们使用Sony SH800细胞分选机与A2类II级生物安全柜，使用130μm微流体分选芯片。不需要照射来接受人类细胞的NBSGW(免疫缺陷，c-Kit缺陷)小鼠被用作BM供体。在VAP-1-组中，每只动物静脉内注射19000个细胞，以及在VAP-1-+VAP-1+/lo组中，每只动物静脉内注射16250个VAP-1-细胞和2750个VAP-1+/lo细胞。移植后一天，小鼠腹腔内注射VAP-1抑制剂LJP-1586(O'Rourke等人,“Anti-inflammatory effects of LJP-1586[Z-3-fluoro-2-(4-methoxybenzyl)allylamine hydrochloride],an amine-based inhibitor of semicarbazide-sensitiveamine oxidase activity”,Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics,2008年2月,324(2),第867-875页)，剂量为10mg/kg，或注射100μl PBS作为对照，每周三次，共六周。在处理结束时处死小鼠，并收集BM。BM细胞针对抗小鼠CD45、抗人类CD45、抗人类CD34、抗人类CD19以及抗人类CD33进行染色。样品在LSR fortessa上运行，并使用FlowJo分析数据。嵌合百分比[嵌合％＝(测试供体衍生的细胞％)×100/((测试供体衍生的细胞％+(竞争者衍生的细胞％))]如所述计算(Ema等人,“Adult mousehematopoietic stem cells:purification and single-cell assays”,Nat Protoc20061(6),2979-2987)。
Amplex Red分析
使用Amplex Red分析法，使用Amplex Red试剂(10-乙酰基-3,7-二羟基啡噁嗪；Molecular Probes Europe BV)(一种高灵敏度和稳定的H2O2探针)测量VAP-1抑制剂szTU73的抑制能力。测量样品的荧光强度(激发，545nm；发射，590nm；Tecan ULTRA荧光偏振计)，并根据标准H2O2的系列稀释产生的校准曲线计算H2O2浓度。为了评估通过VAP-1转染的细胞裂解物经由SSAO介导的反应形成的H2O2的量，将特定酶抑制剂，即氨基硫脲(100mM)和羟胺(5mM)包括在进行相同处理和测量的对照孔中，并且自形成的H2O2总量中减去这些值。
ROS产生的测量
人类CD34+BM细胞在含有人类干细胞因子(100ng/ml)、FMS样酪氨酸激酶3配体(100ng/ml)和血小板生成素(50ng/ml)(均来自Peprotech)的具有或不具有LJP-1586的StemSpan SFEM培养基II(STEMCELL Technologies)中液体培养九天。九天后，细胞用抗CD38和抗CD34抗体染色，用DMEM洗涤，离心并重新悬浮于100μl DMEM中。接着，通过DHR-123试剂(Molecular Probes)检测ROS。为此，将DHR-123稀释在DMSO中并作为5mM储备溶液保存在-20℃下供一次性使用。将等分试样解冻，稀释160倍(30μM)，接着将12.5μl添加到悬浮在100μl DMEM中的HSC中，最终浓度为3μM。接着将细胞在37℃下培育10分钟，接着用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich)活化。PMA储备溶液在DMSO中以1mg/ml冷冻，新鲜解冻，并稀释500倍，以便添加12.5μl到最终浓度为200ng/ml。在37℃下20分钟后，细胞用PBS洗涤，重新悬浮，且通过流式细胞术分析，红色DHR123氧化后变为绿色。对CD38-和CD34+阳性细胞进行门控，并使用LSR Fortessa仪器(BD Biosciences)自过滤器通道530nm/30nm测量氧化DHR-123的荧光强度，并通过FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
集落形成单位(CFU)分析、长期培养起始细胞(LTC-IC)分析和液体培养
对于人类脐带CB细胞，使用基于抗体的EasySep试剂盒富集CD34+CB细胞，随后用抗CD38和抗CD34抗体染色。CD38-CD34+细胞使用FACSAria IIu仪器(BD Biosciences)分选，接着在含有人类干细胞因子(100ng/ml)、FMS样酪氨酸激酶3配体(100ng/ml)和血小板生成素(50ng/ml)(均来自Peprotech)的StemSpan SFEM培养基II(STEMCELL Technologies)中培养。以每毫升1×103个的密度接种细胞。当有指示时，在接种后立即添加LJP-1586。培养物维持21天，在第5、8、12、15和18天用含有相同细胞因子和LJP-1586的培养基替换一半培养基。
将自如上所述获得的15天龄体外培养物中收集的900个CD38-CD34+细胞的后代在含有或缺乏LJP-1586的甲基纤维素培养基(H4436，STEMCELL Technologies)中生长。14天后，通过显微镜对单一、多谱系和混合集落进行视觉评分。根据制造商的方案，将来自AllCells的冷冻保存的人类CD34+细胞解冻、重新悬浮并计数。五百个解冻的人类BM CD34+细胞在含有或缺乏LJP-1586的基于甲基纤维素的完全培养基(H4436，STEMCELLTechnologies)中培养。在接种后14天计数集落总数。通过在无菌条件下收获和解离细胞进行两次重新接种。
自人类脐带CB中分离CD34+细胞并分选VAP-1+和VAP-1-HSC
使用Ficoll-Plaque梯度离心(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和EasySep人类脐带血CD34阳性选择试剂盒II(STEMCELL Technologies)经由两步程序自人类脐带CB中分离出CD34+细胞。对于来自CB的VAP-1+和VAP-1-细胞的批量和单细胞分选，我们使用Sony SH800细胞分选机与A2类II级生物安全柜，使用130μm微流体分选芯片。此分选机对细胞施加低剪切应力，从而在细胞培养过程中获得更好的存活率。CD34+细胞也被分选为VAP-1+和VAP-1-HSC(谱系-CD34+CD38)。接着在含有人类干细胞因子(100ng/ml)、FMS样酪氨酸激酶3配体(100ng/ml)和血小板生成素(50ng/ml)(均来自Peprotech)的StemSpanSFEM培养基II(STEMCELL Technologies)中培养100个VAP-1+和VAP-1-HSC。接种后立即添加LJP-1586，浓度为1μM。培养物维持20天。在第5、8、10、12、15和18天添加含有相同细胞因子和LJP-1586的新鲜培养基。在第10天和第15天使用LSR Fortessa仪器(BD Biosciences)分析细胞的CD38-CD34+CD45RA-CD90+表达。或者，在CB培养物中使用浓度为1、5和10微摩尔的VAP-1抑制剂szTU73。
结果
VAP-1由人类骨髓(BM)中的HSC和血管内皮细胞表达，且抑制VAP-1有助于其扩增
在此实例中，我们研究了BM中的人类HSC和血管细胞是否表达VAP-1。我们使用多克隆抗VAP-1抗体在人类BM的组织切片中检测到VAP-1。小动脉(空心箭头)和小静脉(箭头)被此抗体显著染色(图2A)，我们研究了自人类BM制备的CD34+细胞悬浮液中的HSC。阴性细胞中谱系-CD34+CD38-CD90+CD45RA-CD49f+细胞的流式细胞术分析显示，HSC子集在细胞表面上表达VAP-1，如图2B和2C所示。
接下来，我们将人类VAP-1-HSC和阴性HSC池中含有14.5％VAP-1+的池转移到NBSGW小鼠中，所述小鼠接受人类细胞而不进行照射，从而保存完整的VAP-1阳性BM脉管系统(图2D)。这些小鼠接受了VAP-1抑制剂或对照处理。转移池中VAP-1+细胞的存在增加了BM中人类来源的CD45+细胞(图2E)的数目，且转移池中具有VAP-1+细胞并接受抑制剂的3/3小鼠接受了人类BM植入，而没有VAP-1+细胞和抑制剂的情况下均没有显示植入(图2F)。
为了测试人类HSC的功能，我们在LJP-1586存在下进行了CFU分析。当BM衍生的CD34+细胞在设计用于人类CFU分析的基于甲基纤维素的培养基中培养时，由LJP-1586处理的培养物形成的CFU数目比由对照培养物形成的CFU数目高33％。为了确定这些集落是否含有HSC，我们将其分离成单细胞悬浮液，重新接种细胞，并重复此过程两次。在此程序之后，由经LJP-1586处理的培养物形成的CFU数目比对照培养物形成的CFU数目高92％(图2G)。这些发现表明，BM衍生的HSC在LJP-1586存在的情况下不仅可以存活，而且可以在重复培养中扩增。
脐带血(CB)中的HSC表达VAP-1
人类脐带CB可能是另一种方便的HSC来源。自人类脐带CB中分离CD34+细胞并使用HSC标记物对其进行分析(图3)，这些细胞表达VAP-1。使用识别VAP-1的不同表位的三种VAP-1特异性单克隆抗体(1B2、TK8-14和JG-2)证实了此发现。我们也使用FACS分选的脐带血CD34+细胞确认了VAP-1的表达。总之，VAP-1存在于脐带CB的HSC上。
抑制VAP-1促进脐带血(CB)衍生的人类HSC在体外的扩增
接下来，我们研究了VAP-1的抑制是否有助于脐带CB中HSC的扩增。为此，我们将自人类CB中分选出来的CD34+细胞在含有或缺乏各种浓度的LJP-1586或szTU73(一种VAP-1抑制剂)的StemSpan SFEM培养基II中培养21天(Knapp等人,“Dissociation of Survival,Proliferation,and State Control in Human Hematopoietic Stem Cells”,Stem CellReports 2017,1月10日:8(1),152-162)，如图6所示，使用习知Amplex Red分析。与对照细胞(不含LJP-1586)相比，HSC在用1μM LJP-1586处理并生长18天的培养物中扩增超过31倍。在用更高或更低浓度的1μM LJP-1586处理的培养物中，HSC的扩增效率较低。HSC扩增的程度取决于供体，但在自单个供体分选的样品中是一致的(图4A)。使用附加标记物CD45RA-CD90+CD49f+进一步评估原始HSC。门P-3中超过12％的HSC是原始HSC(CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+)，且经LJP-1586处理的培养物的数目与未经处理的培养物相比高11倍(图4B)。总之，与未处理的细胞相比，在液体培养物中暴露于LJP-1586会显著扩增HSC(CD34+CD38-)和原始HSC(CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+)。我们进一步测试了VAP-1-和VAP-1+HSC在液体培养物中扩增的能力。与CFU分析不同，VAP-1+HSC是长期培养中唯一存活的细胞类型，且VAP-1抑制促进了其在第20天的扩增(图4C)。同样，szTU73抑制剂能够在21天培养中扩增造血干细胞，最佳浓度在1-5微摩尔范围内，如图7所示。
由于抑制剂LJP-1586阻断了VAP-1的胺氧化酶活性，我们测试了其是否会降低人类HSC培养物中ROS的浓度，并为其提供优于未处理细胞的生长优势。因此，我们收集细胞并通过使用二氢罗丹明(DHR123)和流式细胞术进行氧化爆发分析。我们发现，与对照细胞相比，当细胞与LJP-1586抑制剂一起培养时，ROS减少了62％(MFI)(图5中显示了骨髓衍生的HSC)。
在LJP-1586存在下在液体培养物中扩增的CB衍生的HSC在集落形成中具有完全的功能
鉴于我们可以在液体培养中扩增自脐带CB获得的HSC(图4B，4C)，我们通过CFU分析研究了这些细胞的干性。为此，我们收集了在LJP-1586存在下在液体培养中扩增超过15天的所有细胞，并将其接种到含有LJP-1586的基于甲基纤维素基的培养基中。经过LJP-1586处理的培养物形成的CFU数目在培养15天后比对照培养物形成的CFU数目高7.9倍(图4D)。总之，这些结果表明，VAP-1的抑制促进了HSC在液体培养物中的扩增，并且抑制剂处理的细胞完全能够形成集落。因此，根据本发明的方法可以用于在临床环境中扩增HSC。
Claims (8)
1.一种离体产生经扩增的造血干细胞群体的方法，所述方法包含用能够抑制血管粘附蛋白-1(VAP-1)的酶活性的血管粘附蛋白-1(VAP-1)抑制剂离体培养造血干细胞群体，其中所述VAP-1抑制剂以足以产生经扩增的造血干细胞群体的量存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述造血干细胞是人类细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述造血干细胞衍生自脐带血、骨髓和/或外周血液。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于VAP-1抑制剂包含能够抑制VAP-1的酶活性的小分子抑制剂。
5.能够抑制血管粘附蛋白-1(VAP-1)的酶活性的血管粘附蛋白-1(VAP-1)抑制剂在造血干细胞的离体培养中用作活性氧物种(ROS)浓度的调节剂的用途。
6.一种用于造血干细胞的细胞扩增培养基，其包含能够抑制血管粘附蛋白-1(VAP-1)的酶活性的血管粘附蛋白-1(VAP-1)抑制剂。
7.用于治疗骨髓抑制或骨髓衰竭的能够抑制血管粘附蛋白-1(VAP-1)的酶活性的血管粘附蛋白-1(VAP-1)抑制剂，其中所述VAP-1抑制剂维持和/或扩增造血干细胞(HSC)。
8.根据权利要求7所述的用于治疗骨髓抑制或骨髓衰竭的血管粘附蛋白-1(VAP-1)抑制剂，其特征在于VAP-1抑制剂包含能够抑制VAP-1的酶活性的小分子抑制剂。
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