CN114981305A - Claudin18.2结合部分及其用途 - Google Patents

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庄秋传
方旭
张青山
许曼曼
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Abstract

提供了结合于Claudin18.2(紧密连接蛋白18.2)的单结构域抗体，以及包含所述单结构域抗体的嵌合抗原受体。还提供了包含所述嵌合抗原受体的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)。还提供了治疗疾病或病症的药物组合物、试剂盒和方法。

Description

CLAUDIN18.2结合部分及其用途
交叉参考
本申请要求2019年12月27日提交的国际专利申请号PCT/CN2019/129095的优先权权益，所述国际专利申请的内容以引用的方式整体并入本文中。
序列表
本申请以引用的方式并入序列表，该序列表呈文本格式与本申请一起提交，标题为“14651-011-228_SEQ_LISTING.txt”，创建于2020年12月24日，大小为124,111字节。
1.技术领域
本公开涉及抗Claudin18.2单结构域抗体、嵌合抗原受体、工程化免疫效应细胞和它们的使用方法。本公开还涉及用于治疗用途的细胞的活化和扩增，尤其涉及基于嵌合抗原受体的T细胞免疫疗法。
2.背景技术
胃癌(GC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其5年生存率为5％-20％(FerlayJ.等人，International journal of cancer 136(5):E359-386(2015))。由于早期疾病症状大多是非特异性的，因此在无法进行常规筛查的国家，大多数患有GC或胃食管连接部(GEJ)癌症的患者在晚期才被诊断出(Maconi G.等人，(2008)World J Gastroenterol14(8):1149-1155)。目前推荐铂和氟嘧啶(fluoropyrimidine)衍生物的化学疗法作为不可切除或转移性GC/GEJ癌症的一线疗法。然而，最终在接受这类治疗的患者中观察到疾病进展，中位无进展生存期为5-7个月，中位总生存期为9-11个月(Roberto I.等人，PLoS One 9(9):e108940(2014)；Kim H.S.等人，Annals of Oncology 24(11):2850-2854(2013))。
Claudin18.2(紧密连接蛋白18.2)是Claudin18的剪接变体，它是紧密连接蛋白四聚体膜蛋白家族的一员，所述蛋白质在上皮细胞的连接处表达并建立细胞旁屏障且控制细胞间分子的流动，在细胞信号传导和上皮细胞极性维持中起关键作用(Singh等人，JOncol.2010:541957(2010))。Claudin18.2的表达严格限制在正常组织中胃粘膜的紧密连接处，并埋藏在超分子复合物中，因此，静脉内(IV)抗体基本上难以接近正常组织中的Claudin18.2。然而，Claudin18.2暴露在癌细胞表面上，并且在高达80％的GC肿瘤中发现了它的表达，并在许多其它类型的肿瘤中也异常活化，例如胰腺癌、食管癌、卵巢癌和肺癌，如非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌和它们的转移(Sahin U.等人，Clinical Cancer Research 14(23):7624-7634(2018))。尽管抗Claudin18.2抗体和嵌合抗原受体(CAR)已经研究了多年，但仍需要改进的结合Claudin18.2的治疗性分子和工程化Claudin18.2靶向细胞。例如，需要开发稳定且小尺寸的Claudin18.2结合分子，用于更有效或更高效的CAR-T细胞疗法。
3.发明内容
本申请提供了包含一种或多种抗Claudin18.2单结构域抗体(sdAb)或其抗原结合片段的特异性结合于Claudin18.2的结合部分、包含一种或多种抗Claudin18.2 sdAb或其抗原结合片段(例如VHH片段)的嵌合抗原受体(CAR)、工程化免疫效应细胞和它们例如在癌症免疫疗法中的使用方法。
在一个方面，本公开提供了包含单结构域抗体或其抗原结合片段的特异性结合于Claudin18.2的结合部分，所述单结构域抗体或其抗原结合片段包含：(i)包含选自由SEQID NO:1-11和113-125组成的组的氨基酸序列的CDR1区；(ii)包含选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的氨基酸序列的CDR2区；以及(iii)包含选自由SEQ ID NO:24-37和126-139组成的组的氨基酸序列的CDR3区，或其在CDR1、CDR2和CDR3每一个中包含最多5个氨基酸取代、缺失和/或插入(例如，一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失和/或插入)的变体。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含单结构域抗体或其抗原结合片段，所述单结构域抗体或其抗原结合片段包含以下中的任一个：(1)包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:113的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3；(2)包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:25或SEQID NO:127的氨基酸序列的CDR3；(3)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3；(4)包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1；包含SEQID NO:15的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3；(5)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR3；(6)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3；(7)包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR3；(8)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR3；(9)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3；(10)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR3；(11)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR3；(12)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3；(13)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR3；(14)包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，本文提供了这些Claudin18.2结合部分的变体，所述变体在CDR中包含最多约5个氨基酸取代、缺失和/或插入(例如，一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失和/或插入)。
在一些实施方案中，本文提供的Claudin18.2结合部分包含来自包含单结构域抗体或其抗原结合片段的结合部分的CDR1、CDR2和CDR3，所述单结构域抗体或其抗原结合片段具有选自由SEQ ID NO:38-51和77-85组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含单结构域抗体或其抗原结合片段的特异性结合于Claudin18.2的结合部分，所述单结构域抗体或其抗原结合片段包含：(i)分别具有如SEQ ID NO:38中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ii)分别具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iii)分别具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(iv)分别具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(v)分别具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(vi)分别具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(vii)分别具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(viii)分别具有如SEQ IDNO:45中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(ix)分别具有如SEQID NO:46中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(x)分别具有如SEQID NO:47中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xi)分别具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xii)分别具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xiii)分别具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xiv)分别具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xv)分别具有如SEQ ID NO:77中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xvi)分别具有如SEQ ID NO:78中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xvii)分别具有如SEQ ID NO:79中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xviii)分别具有如SEQ ID NO:80中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xix)分别具有如SEQ ID NO:81中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xx)分别具有如SEQ ID NO:82中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；(xxi)分别具有如SEQ ID NO:83中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或(xxii)分别具有如SEQ ID NO:84中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或(xxiii)分别具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，CDR1、CDR2或CDR3根据Kabat编号方案、IMGT编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案、Contact编号方案或它们的组合来确定。
在一些实施方案中，结合部分还包含如以下中所示的一个或多个FR区：SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84和/或SEQ ID NO:85。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含单结构域抗体或抗原结合片段，所述单结构域抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是单结构域抗体。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是VHH结构域。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是仅有重链的抗体(HCAb)，并且HCAb包含VHH结构域，所述VHH结构域具有与SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本文还提供了与上述结合部分竞争结合Claudin18.2的结合部分。本文公开的示例性Claudin18.2结合部分对Claudin18.2的结合亲和力比其对Claudin18.1的亲和力大至少50倍。
在一些实施方案中，本文公开的结合部分包含至少两种通过接头连接的抗Claudin18.2单结构域抗体或抗原结合片段(例如VHH片段)，其中抗Claudin18.2单结构域抗体或抗原结合片段结合于相同的抗原表位。在一些实施方案中，结合部分包含至少两种通过接头连接的抗Claudin18.2单结构域抗体或抗原结合片段(例如VHH片段)，其中这些单结构域抗体或抗原结合片段结合于不同的抗原表位。
在一些实施方案中，本文所述的结合部分包含恒定区，所述恒定区连接于可变区的C端，例如VHH结构域/片段。在一些实施方案中，恒定区是免疫球蛋白重链恒定区或免疫球蛋白重链恒定区的一部分，例如免疫球蛋白重链恒定区的铰链-CH2-CH3结构域。在一些实施方案中，本公开的恒定区是IgG、IgM或IgA重链恒定区或它们的一部分。在一些实施方案中，恒定区是IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区或它们的一部分，例如IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区的铰链-CH2-CH3结构域。在一些实施方案中，本公开的恒定区是人或骆驼科IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区的铰链-CH2-CH3结构域。在一个实施方案中，恒定区是人IgG1恒定区，其具有SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的结合部分是骆驼科、嵌合、人或人源化单结构域抗体或其抗原结合片段。
本公开还提供了一种结合部分，其包含：(i)抗Claudin18.2单结构域抗体或抗原结合片段，和(ii)抗体轻链或其一部分，这两者通过二硫键连接以结合Claudin18.2。在一些实施方案中，结合部分包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、(scFv)2、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体或其抗原结合片段与剂进行基因融合或化学缀合。本公开还提供了一种免疫缀合物，其包含与治疗剂如细胞毒素连接的本文所述的Claudin18.2结合部分。本公开还提供了一种双特异性分子，其包含本文所述的Claudin18.2结合部分，所述Claudin18.2结合部分连接于与所述Claudin18.2结合部分具有不同结合特异性的第二功能部分(例如，第二结合部分)，包括结合于不同Claudin18.2表位的第二结合部分，或结合于不同抗原的第二结合部分。还提供了一种多特异性分子，其包含本文所述的Claudin18.2结合部分，所述Claudin18.2结合部分连接于与所述Claudin18.2结合部分具有不同结合特异性的两个或更多个功能部分(例如，两个或更多个结合部分)，例如结合于不同Claudin18.2表位或不同抗原的第二结合部分，和结合于不同Claudin18.2表位或不同抗原的第三结合部分。在一些实施方案中，本文所述的Claudin18.2结合部分由溶瘤病毒表达或与溶瘤病毒结合使用。
本公开还提供了编码本文所述的Claudin18.2结合部分的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和含有所述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。
在另一个方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含本文所述的Claudin18.2结合部分。在一些实施方案中，Claudin18.2CAR包含：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含本文所述的Claudin18.2结合部分；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR包含：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含本文所述的抗Claudin18.2单结构域抗体或其抗原结合片段，例如VHH结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR包含Claudin18.2结合部分，所述Claudin18.2结合部分在细胞外抗原结合结构域中包含一种或多种抗Claudin18.2单结构域抗体或抗原结合片段，例如VHH域。在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR包含一种或多种通过接头连接的抗Claudin18.2单结构域抗体或抗原结合片段，其中这些单结构域抗体或抗原结合片段结合于相同的抗原表位。在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR包含一种或多种通过接头连接的抗Claudin18.2单结构域抗体或抗原结合片段，其中这些单结构域抗体或抗原结合结构域结合于不同的抗原表位。在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR包含至少两个通过接头连接的VHH结构域，其中所述VHH结构域结合于相同的抗原表位。在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR包含至少两个通过接头连接的VHH结构域，其中这些VHH结构域结合于不同的抗原表位。
在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域还包含一个或多个额外的抗原结合结构域。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域还包含一个额外的抗原结合结构域。在其它实施方案中，细胞外抗原结合结构域还包含两个额外的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR还包含位于N端的信号肽。在一些实施方案中，信号肽来源于选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽来源于CD8α。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR还包含位于细胞外抗原结合结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域来源于CD8α。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
在根据上述任一种CAR的一些实施方案中，跨膜结构域来源于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于CD8α或CD28。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
细胞内信号传导结构域包含主要细胞内信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域是含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的结构域。在一些实施方案中，含ITAM的结构域是CD3-ζ的胞质结构域，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体(例如CD83和MD-2)和它们的组合。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域包含CD28的胞质结构域和/或CD137的胞质结构域。在一些实施方案中，CD28的胞质结构域和CD137的胞质结构域分别包含SEQ ID NO:71和SEQID NO:70的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR从N端到C端包含信号肽、包含本文所述的抗Claudin18.2单结构域抗体或其抗原结合片段(例如VHH结构域)的Claudin18.2结合部分、铰链结构域、跨膜结构域、主要细胞内信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR从N端到C端包含源自CD8α的信号肽、抗Claudin18.2VHH结构域、源自CD8α的铰链结构域、源自CD8α或CD28的跨膜结构域、CD137胞质结构域和CD3-ζ胞质结构域。在一些实施方案中，CAR从N端到C端包含SEQ ID NO:67的信号肽、具有选自SEQ ID NO:38-51和77-85的组的氨基酸序列的上述VHH结构域、SEQ ID NO:68的铰链结构域、SEQ ID NO:69的跨膜结构域、SEQ ID NO:70的CD137胞质结构域和SEQ ID NO:72的CD3-ζ胞质结构域。
在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:53-66和86-93中的任一个的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:53-66和86-93中的任一个的氨基酸序列。
本申请提供了一种编码本文所述的CAR的核酸。本申请还提供了一种包含上述核酸的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体、慢病毒载体或非病毒载体。
本申请提供了一种工程化免疫细胞，其包含上述CAR或上述核酸或上述载体。在一些实施方案中，免疫细胞是免疫效应细胞，例如T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，例如细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。
本申请还针对一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的结合部分、免疫缀合物、双特异性分子、多特异性或多价分子、溶瘤病毒、CAR和/或工程化免疫细胞，以及药学上可接受的赋形剂。
本文还提供了一种治疗有需要的受试者的表达Claudin18.2的肿瘤或癌症的方法，其通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物来实现。
表达Claudin18.2的肿瘤或癌症是实体或非实体的肿瘤或癌症，包括但不限于胃、食管、胃食管、胰腺、卵巢、结肠、肝、头颈、胆囊和肺的肿瘤或癌症。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的肿瘤或癌症是胃肿瘤或癌症。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的肿瘤或癌症是胃食管肿瘤或癌症。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，用于治疗肿瘤或癌症的工程化免疫细胞是自体的。在一些实施方案中，工程化免疫细胞是同种异体的。
还提供了使用方法、试剂盒和制品，其包含上述Claudin18.2(紧密连接蛋白18.2)结合部分、CAR、工程化免疫效应细胞、分离的核酸或载体中的任何一种。
4.附图说明
图1显示了本公开的嵌合抗Claudin18.2抗体对PANC1.huCLDN18.1.Luc和PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞的结合效力。
图2显示了携带LIC182501-LIC182510 CAR的T细胞针对Claudin18.2阳性或阴性细胞系的体外细胞毒性。“UnT”表示用作对照的未转导的T细胞。
图3显示了携带LIC182511-LIC182514 CAR的T细胞针对Claudin18.2阳性或阴性细胞系的体外细胞毒性。“UnT”表示用作对照的未转导的T细胞。
图4显示了在移植NUGC4细胞的异种移植模型中Claudin18.2CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效。通过肿瘤体积(a部分)和终点肿瘤重量(b部分)的变化来评估小鼠以监测肿瘤生长。****表示p<0.0001；**表示0.001<p<0.01；*表示0.01<p<0.05。
图5显示了人源化抗Claudin18.2嵌合抗体的结合特征。嵌合抗体显示出以剂量依赖性方式与PANC1.huCLDN18.2.Luc有效结合，但不与PANC1.huCLDN18.1.Luc细胞结合。“CLDN18.2”表示PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞；“CLDN18.1”表示PANC1.huCLDN18.1.Luc细胞。
图6显示了人源化Claudin18.2 CAR-T细胞以及其亲本CAR-T细胞分别针对PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞系、PANC1.huCLDN18.1.Luc细胞系和NUGC4.Luc细胞系的体外细胞毒性测定结果。175DX CAR-T用作基准对照。CD19 CAR-T用作阴性对照。“UnT”表示用作对照的未转导的T细胞。
图7显示了人源化Claudin18.2 CAR-T细胞以及其亲代CAR-T细胞分别与PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞系、PANC1.huCLDN18.1.Luc细胞系和NUGC4.Luc细胞系共培养时的IFNγ释放。d部分显示了CAR-T细胞的自发IFNγ释放。175DX CAR-T用作基准对照。CD19 CAR-T用作阴性对照。“UnT”表示用作对照的未转导的T细胞。
5.具体实施方式
本公开部分地基于结合于Claudin18.2的新型单结构域抗体(例如，VHH结构域)、包含所述单结构域抗体的嵌合抗原受体或工程化细胞以及它们改进的特性。
5.1定义
本文描述或引用的技术和程序包括那些通常很好理解和/或本领域技术人员使用常规方法，例如以下中描述的广泛使用的方法通常采用的技术和程序：Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版2001)；Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑，2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑2010)；以及Antibody Engineering第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版2010)。除非本文另有定义，否则本说明书中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。为了解释本说明书，以下术语描述将适用，并且在适当的情况下，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果所阐述的术语的任何描述与以引用方式并入本文中的任何文件相冲突，则应以下述术语的描述为准。
如本文中所用，术语“结合部分”是指特异性结合抗原(例如Claudin18.2)的分子或分子的一部分。结合部分可以是蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质或小分子量化合物。在一些实施方案中，结合部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合部分是抗体或其抗原结合片段。Claudin18.2结合部分还包括受体、配体、适体和其它具有已知的结合配偶体的分子。结合部分可能是单价的，这意味着它含有一个与抗原(例如Claudin18.2)特异性相互作用的结合位点。结合部分也可以是二价的，这意味着它含有两个与抗原(例如Claudin18.2)特异性相互作用的结合位点。结合部分可以是多价的，这意味着它含有多个与抗原(例如Claudin18.2)特异性相互作用的结合位点。二价结合部分或多价结合部分可以与单一抗原(例如Claudin18.2分子)上的一个或多个表位相互作用。在一些实施方案中，二价结合部分或多价结合部分可以与两个或更多个Claudin18.2分子相互作用。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并以最广泛的意义使用，具体涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、由至少两种完整抗体形成的具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性即可)、单链抗体和其片段(例如，结构域抗体)，如下所述。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和力成熟的，以及来自其它物种的抗体，例如小鼠、兔子、美洲驼等。术语“抗体”意图包括免疫球蛋白类多肽中的B细胞的多肽产物，其能够结合于特定分子抗原并且由两对相同的多肽链构成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基端部分包括约100至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基端部分包括恒定区。参见例如Antibody Engineering(Borrebaeck编辑，第2版1995)；以及Kuby，Immunology(第3版1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如美洲驼或羊驼)的单结构域抗体或其人源化变体、细胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体和上述任一者的功能片段(例如，抗原结合片段)，功能片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，其保留该片段所源自的抗体的部分或全部结合活性。功能片段(例如，抗原结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体(minibody)。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗原结合结构域或含有与抗原结合的抗原结合位点的分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。这类抗体片段可见于例如Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编辑，1995)；Huston等人，1993，Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra，1989，Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day，Advanced Immunochemistry(第2版1990)。本文提供的抗体可为免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可能既不激动也不拮抗。
“抗原”是抗体可以选择性结合的一种结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽。在某些实施方案中，抗原与细胞相关，例如存在于细胞上或细胞内。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整抗体具有一种或多种效应功能。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含位于VH和VL结构域之间的多肽接头，该接头使得sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv片段的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“仅有重链的抗体”或“HCAb”是指一种功能抗体，它包含重链，但缺少通常在4链抗体中发现的轻链。已知骆驼科动物(例如骆驼、美洲驼或羊驼)会产生HCAb。
如本文中所用，“单结构域抗体”或“sdAb”是指单个单体可变抗体结构域并且能够结合抗原(例如，结合于Claudin18.2的单结构域抗体)。单结构域抗体包括如本文所述的VHH域。单结构域抗体的实例包括但不限于天然缺乏轻链的抗体，例如来自骆驼科物种(例如美洲驼)的抗体、源自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除源自抗体的那些外的单结构域支架。单结构域抗体可源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。举例来说，单结构域抗体可以源自在骆驼科物种中，例如在骆驼、美洲驼羊、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。骆驼科以外的其它物种可以产生天然缺乏轻链的重链抗体；源自这类其它物种的VHH在本公开的范围内。在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体(例如，VHH)具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。单结构域抗体可以与如本文所述的另一种分子(例如，剂)进行基因融合或化学缀合。单结构域抗体可能是较大的结合分子(例如，多特异性抗体或嵌合抗原受体)的一部分。
术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用(van der Waals interaction)。复合物还可包括通过共价或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点与靶分子(例如抗原)的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。结合分子(例如抗体)与单价抗原的解离速率(koff)与结合速率(kon)的比值(koff/kon)是解离常数KD，它与亲和力成反比。KD值越低，抗体的亲和力越高。KD值因抗体和抗原的不同复合物而异，并且取决于kon和koff。本文提供的抗体的解离常数KD可以使用本文提供的任何方法或本领域技术人员众所周知的任何其它方法来确定。一个结合位点的亲和力并不总能反映抗体与抗原之间相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇的复杂抗原(例如多价抗原)与包含多个结合位点的抗体接触时，抗体与抗原在一个位点的相互作用将增加在第二个位点发生反应的可能性。多价抗体与抗原之间的这种多重相互作用的强度称为亲合力。
关于本文所述的结合分子，例如“结合于”、“特异性结合于”的术语和类似术语在本文中也可互换使用，是指特异性结合于抗原的抗原结合结构域的结合分子，例如多肽。结合于或特异性结合于抗原的结合分子或抗原结合结构域可以例如通过免疫测定、
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或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定。在一些实施方案中，如使用实验技术，例如放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)所测定，当结合分子或抗原结合结构域与抗原结合的亲和力比与任何交叉反应性抗原更高时，结合分子或抗原结合结构域结合于或特异性结合于抗原。通常，特定的或选择性的反应将至少是背景信号或噪声的两倍，并且可能是背景的10倍以上。关于结合特异性的讨论，参见例如Fundamental Immunology 332-36(Paul编辑，第2版1989)。在某些实施方案中，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或RIA确定，结合分子或抗原结合结构域与“非靶”蛋白的结合程度小于结合分子或抗原结合结构域与其特定靶抗原的结合的约10％。结合于抗原的结合分子或抗原结合结构域包括能够以足够的亲和力结合抗原，使得该结合分子可用作例如靶向抗原的治疗剂和/或诊断剂的结合分子或抗原结合结构域。在某些实施方案中，结合于抗原的结合分子或抗原结合结构域具有小于或等于1μM、800nM、600nM、550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(KD)。在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域结合于在来自不同物种的抗原中保守的抗原表位。
术语“EC50”，也称为半最大有效浓度，是指在指定的暴露时间后，诱导的反应在基线与最大值之间一半处的抗体浓度。
术语“IC50”，也称为半最大抑制浓度，是指相对于不存在抗体时，抗体抑制特定生物或生化功能50％的浓度。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“嵌合”序列，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可(参见美国专利号4,816,567；以及Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55)。嵌合序列可以包括人源化序列。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含非人(例如骆驼科、鼠类、非人灵长类)抗体的“人源化”形式的部分，其包括来自人免疫球蛋白(例如受体抗体)的序列，其中天然CDR残基被来自非人物种(例如供体抗体)的相应CDR残基替换，非人物种为例如骆驼科、小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物。在一些情况下，人免疫球蛋白序列的一个或多个FR区残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰以进一步提高抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以包含至少一个或多个可变区的基本全部，其中全部或基本全部的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR且全部或基本全部的FR为人免疫球蛋白序列的FR。在某些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。对于进一步的细节，参见Jones等人，Nature 321:522-25(1986)；Riechmann等人，Nature332:323-29(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96(1992)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89(1992)；美国专利No:6,800,738；6,719,971；6,639,055；6,407,213；以及6,054,297。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“完全人抗体”或“人抗体”的部分，其中这些术语在本文中可互换使用并且是指包含人可变区和例如人恒定区的抗体。结合分子可以包含单结构域抗体序列。在具体实施方案中，这些术语是指包含人源可变区和恒定区的抗体。在某些实施方案中，“完全人”抗体还可以涵盖结合多肽并且由作为人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体的核酸序列编码的抗体。术语“完全人抗体”包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，如Kabat等人(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242)所述。“人抗体”是具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已经使用任何制造人抗体的技术制造的抗体。人抗体的这一定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581(1991))和酵母展示文库(Chao等人，Nature Protocols 1:755-68(2006))。以下中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体：Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.147(1):86-95(1991)；以及van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用于转基因动物来制备，该转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生这类抗体，但其内源基因座已被禁用，例如小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如Jakobovits，Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66(1995)；Brüggemann和Taussing，Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58(1997)；以及美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，又参见例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-62(2006)。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“重组人抗体”的部分，其中该短语包括通过重组方式制备、表达、创造或分离的人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体、从针对人免疫球蛋白基因进行转基因和/或转染色体的动物(例如，小鼠或牛)中分离的抗体(参见例如Taylor，L.D.等人，Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992))或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、创造或分离的抗体。这类重组人抗体可具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH公布号91-3242)。然而，可对这类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列的进行转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然源自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列相关但可能不天然存在于体内人抗体种系库中的序列。
在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“单克隆抗体”的一部分，其中如本文中所用的该术语是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，例如，除了可少量存在的可能天然存在的突变或众所周知的翻译后修饰(例如氨基酸异构化或脱酰胺化、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺化)之外，构成该群体的个体抗体是相同的，每个单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。在具体实施方案中，如本文中所用的“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其它细胞产生的抗体。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，可用于本公开的单克隆抗体可以通过Kohler等人，Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌或真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人，Nature352:624-28(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-97(1991)描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其它方法是本领域众所周知的。参见例如Short Protocolsin Molecular Biology(Ausubel等人编辑，第5版2002)。
典型的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。在IgG的情况下，4链单元通常约为150,000道尔顿(dalton)。每条L链通过一个共价二硫键连接到一条H链，而两条H链通过一个或多个二硫键相互连接，这取决于H链同种型。每个H链和L链还具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N端具有可变结构域(VH)，接着每个α和γ链是三个恒定结构域(CH)，μ和ε同种型是四个CH结构域。每条L链在N端都有可变结构域(VL)，接着另一末端是恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，CL与重链的第一个恒定结构域(CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面。VH与VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见例如Basic and Clinical Immunology 71(Stites等人编辑，第8版1994)；以及Immunobiology(Janeway等人编辑，第5版2001)。
术语“Fab”或“Fab区”是指与抗原结合的抗体区。常规IgG通常包含两个Fab区，每个Fab区位于Y形IgG结构的两个臂之一上。每个Fab区通常由重链和轻链各自的一个可变区和一个恒定区构成。更具体地说，Fab区中重链的可变区和恒定区为VH和CH1区，Fab区中轻链的可变区和恒定区为VL和CL区。Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以按各种方式排列以赋予根据本公开的抗原结合能力。例如，VH和CH1区可以在一个多肽上，VL和CL区可以在单独的多肽上，类似于常规IgG的Fab区。或者，VH、CH1、VL和CL区都可以在相同的多肽上并且以不同的顺序取向，如下文部分更详细地描述。
术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基端并且在重链中长度为约120至130个氨基酸并在轻链中长度为约100至110个氨基酸，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可称为“VH”。轻链的可变区可称为“VL”。术语“可变”是指可变区某些区段的序列在抗体之间有很大差异的事实。V区介导抗原结合并界定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并不是均匀分布在可变区的110个氨基酸跨度内的。相反，V区由以下组成：称为框架区(FR)的约15-30个氨基酸的可变性较小(例如，相对不变)的延伸段被称为“高变区”的每个约9-12个氨基酸长的可变性较大(例如，极端可变性)的较短区域分隔。重链和轻链的可变区各包含四个FR，它们大多采用β-折叠构型，由三个高变区连接，形成连接β-片层结构的环，有时构成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起为抗体的抗原结合位点的形成作出贡献(参见例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)中抗体的参与。可变区的序列在不同抗体之间有很大差异。在具体实施方案中，可变区是人可变区。
术语“根据Kabat的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”和其变体是指在Kabat等人，同上中用于抗体汇编的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸，对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以在残基52之后包括单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在残基82之后包括三个插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列的同源区域与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定给定抗体的Kabat残基编号。当指代可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，同上)。当指代免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人，同上报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。例如AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon已描述其它编号系统。
根据Kabat等人(“Sequence of proteins of immunological interest”，USPublic Health Services，NIH Bethesda，Md.，公布号91)给出的VH结构域的通用编号来编号单结构域抗体(例如VHH)的氨基酸残基，适用于Riechmann和Muyldermans，J.Immunol.Methods 2000年6月23日；240(1-2):185-195的文章中来自骆驼科动物的VHH结构域。根据该编号，VHH的FR1包含位置1-30的氨基酸残基，VHH的CDR1包含位置31-35的氨基酸残基，VHH的FR2包含位置36-49的氨基酸，VHH的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基，VHH的FR3包含位置66-94的氨基酸残基，VHH的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。在这方面，应该注意的是，正如本领域关于VH结构域和VHH结构域众所周知的，每个CDR中的氨基酸残基总数可以变化并且可能不对应于Kabat编号表示的氨基酸残基总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或者实际序列可能含有比Kabat编号允许的数目更多的氨基酸残基)。关于根据Kabat的VHH结构域的示例性编号，参见例如Deschacht等人，2010.J Immunol 184:5696-704。
当用于提及抗体时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基端部分包括约120至130个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是五种不同类型(例如同种型)之一，称为α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五种众所周知的抗体类别(例如同种型)，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
当用于提及抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基端部分包括约100至约110个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基端部分包括恒定区。轻链的大致长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，有两种不同的类型，称为κ(κ)或λ(λ)。
如本文中所用，术语“高变区”、“HVR”、“互补决定区”和“CDR”可互换使用。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列中的可变区序列。
CDR区是本领域技术人员众所周知的并且已由众所周知的编号系统定义。例如，Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(参见例如Kabat等人，同上)。Chothia代之以指结构环的位置(参见例如Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-17(1987))。当使用Kabat编号约定编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32与H34之间变化，取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅存在35A，则环在33处结束；如果35A和35B都存在，则环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如Antibody Engineering第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版2010))。“contact”高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。另一个已经开发并被广泛采用的通用编号系统是ImMunoGeneTics(IMGT)Information
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(Lafranc等人，Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003))。IMGT是一个综合信息系统，专门研究人和其它脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC)。在本文中，根据氨基酸序列和在轻链或重链中的位置来指代CDR。由于免疫球蛋白可变结构域结构内CDR的“位置”在物种之间是保守的并且存在于称为环的结构中，通过使用根据结构特征对齐可变结构域序列的编号系统，很容易鉴定CDR和框架残基。这一信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和替换到来自通常人抗体的受体框架中。Honegger和Plückthun，J.Mol.Biol.309:657-70(2001)开发了一个额外的编号系统(AHon)。编号系统之间的对应关系，包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统，对于本领域技术人员来说是众所周知的(参见例如Kabat，同上；Chothia和Lesk，同上；Martin，同上；Lefranc等人，同上)。来自这些高变区或CDR中的每一者的残基在下表1中举例说明。
表1.根据各种编号系统的示例性CDR
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给定CDR的边界可能视用于鉴定的方案而变。因此，除非另有说明，否则术语给定抗体或其区域，例如可变区的“CDR”和“互补决定区”，以及抗体或其区域的单个CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2)，应理解为涵盖如上文所述的任何已知方案所定义的互补决定区。在一些情况下，指定用于鉴定特定CDR的方案，例如由IMGT、Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。在其它情况下，给出CDR的特定氨基酸序列。应当注意，CDR区也可以通过各种编号系统的组合，例如Kabat和Chothia编号系统的组合或Kabat和IMGT编号系统的组合来定义。因此，例如“如特定VH或VHH中阐述的CDR1”的术语包括如由上述示例性CDR编号系统定义的任何CDR1，但不限于此。一旦给出可变区(例如，VHH、VH或VL)，本领域技术人员将理解该区域内的CDR可以由不同的编号系统或它们的组合来定义。
高变区可包含如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，和VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如与Fc受体的相互作用。该术语是指免疫球蛋白分子的一部分，其相对于免疫球蛋白的另一部分，含有抗原结合位点的可变区，具有更保守的氨基酸序列。恒定区可以含有重链的CH1、CH2和CH3区以及轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”是指那些位于CDR两侧的可变区残基。FR残基存在于例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体(例如，单结构域抗体)、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除了高变区残基或CDR残基之外的那些可变结构域残基。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能会变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226或Pro230的氨基酸残基延伸到其羧基端。可例如在产生或纯化抗体期间或通过以重组方式将编码抗体重链的核酸工程化来去除Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有K447残基的抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体以及具有和不具有K447残基的抗体的混合物的抗体群体。“功能Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。示例性“效应功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调等。这类效应功能通常需要将Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或结构域)组合，并且可以使用本领域技术人员已知的各种测定法来评估。“变异Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(例如，取代、添加或缺失)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。在某些实施方案中，变异Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中存在约1至约10个氨基酸取代，或约1至约5个氨基酸取代。本文中的变异Fc区可以与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，或与其具有至少约90％同源性，例如与其具有至少约95％同源性。
如本文中所用，“表位”是本领域中的术语并且是指结合分子(例如，包含单结构域抗体序列的抗体)可以特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续表位。例如，在多肽抗原的情况下，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可以包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“构象”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员将理解，一般来说，线性表位可能或可能不依赖于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方案中，结合分子与一组氨基酸结合，而不管它们是否折叠成天然的三维蛋白质结构。在其它实施方案中，结合分子需要构成表位的氨基酸残基表现出特定的构象(例如弯曲、扭曲、翻转或折叠)以便识别和结合该表位。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
“激动剂”或活化抗体是增强或启动其结合的抗原信号传导的抗体。在一些实施方案中，激动剂抗体在不存在天然配体的情况下引起或激活信号传导。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在比对序列并引入空位(如果需要的话)以实现最大百分比的序列同一性之后，并在不将任何保守取代视为序列同一性的部分的情况下，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(例如，CAR或sdAb)对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文中所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白(例如，CAR或sdAb)具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两者结合不同的抗原。如本文中所用，术语“双特异性”表示抗原结合蛋白(例如，CAR或sdAb)具有两种不同的抗原结合特异性。如本文中所用，术语“单特异性”CAR表示具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白(例如，CAR或sdAb)，所述结合位点中的每一个结合抗原的相同表位。
如本文中所用，术语“价”表示在抗原结合蛋白(例如CAR或sdAb)中存在指定数量的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示在抗原结合蛋白(例如CAR或sdAb)中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
如本文中所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指基因工程受体，其可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫效应细胞如T细胞上。一些CAR也被称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方案中，CAR包含对一种或多种抗原(例如肿瘤抗原)具有特异性的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和T细胞和/或其它受体的细胞内信号传导结构域。“CAR-T细胞”是指表达CAR的T细胞。
术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”可在本文中互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性或分支的，其可以包含经过修饰的氨基酸，并且其可以间杂非氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物的多肽，包括但不限于非天然氨基酸，以及本领域已知的其它修饰。应当理解，因为本公开的多肽可以基于抗体或免疫球蛋白超家族的其它成员，所以在某些实施方案中，“多肽”可以作为单链或作为两条或更多条缔合链出现。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应合并成聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和其类似物。如本文中所用，“寡核苷酸”是指短的、通常为单链的合成多核苷酸，其长度通常但不一定小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不相互排斥。以上对多核苷酸的描述同样完全适用于寡核苷酸。产生本公开的结合分子的细胞可以包括亲本杂交瘤细胞，以及已经引入了编码抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。除非另有说明，否则本文公开的任何单链多核苷酸序列的左手端是5'末端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录物从5'到3'添加的方向称为转录方向；DNA链上与RNA转录物具有相同序列的在RNA转录物的5'末端的5'的序列区域称为“上游序列”；DNA链上与RNA转录物具有相同序列的在RNA转录物的3'末端的3'的序列区域称为“下游序列”。
“分离的核酸”是一种核酸，例如RNA、DNA或混合核酸，其与天然伴随天然序列的其它基因组DNA序列以及蛋白质或复合物如核糖体和聚合酶基本上分离。“分离的”核酸分子是与核酸分子的天然来源中存在的其它核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，在通过重组技术产生时可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。在一具体实施方案中，分离或纯化一种或多种编码如本文所述的单结构域抗体或抗体的核酸分子。该术语包括已从天然存在的环境中去除的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可以包括该分子的分离形式。具体地说，编码本文所述的CAR或sdAb的“分离的”核酸分子是被鉴定并与至少一种污染核酸分子分离的核酸分子，所述污染核酸分子通常在产生所述分离的核酸分子的环境中与所述分离的核酸分子缔合。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
如本文中所用，术语“可操作地连接”和类似的短语(例如，进行基因融合)当用于提及核酸或氨基酸时分别是指核酸序列或氨基酸序列的操作连接，使得彼此形成功能关系。例如，可操作连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR以及终止子序列引起核酸分子(例如RNA)的准确产生。在一些实施方案中，可操作地连接的核酸元件引起开放阅读框的转录并最终产生多肽(即，开放阅读框的表达)。作为另一个实例，可操作连接的肽是其中功能结构域以适当距离彼此放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。
术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列，包括例如编码如本文所述的结合分子(例如抗体)的核酸序列，以将核酸序列引入至宿主细胞中的一种物质。适用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，它们可以包括可用于稳定整合到宿主细胞染色体中的选择序列或标记。此外，载体可以包括一种或多种选择标记基因和适当的表达控制序列。可以包括的选择标记基因例如提供了对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷型缺乏或提供了培养基中没有的关键营养素。表达控制序列可以包括本领域众所周知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共表达两种或更多种核酸分子(例如，抗体重链和轻链或抗体VH和VL)时，可以将两种核酸分子例如插入到单个表达载体或单独的表达载体中。对于单个载体表达，编码核酸可操作地连接到一种共同的表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，例如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。可以使用本领域众所周知的方法确认核酸分子引入宿主细胞。这类方法包括例如核酸分析，例如mRNA的诺瑟印迹(Northern blot)或聚合酶链式反应(PCR)扩增、用于基因产物表达的免疫印迹、或其它合适的测试引入的核酸序列或其相应基因产物的表达的分析方法。本领域技术人员理解核酸分子以足以产生所需产物的量表达，并且进一步理解可以使用本领域众所周知的方法优化表达水平以获得足够的表达。
如本文中所用，术语“宿主”是指动物，例如哺乳动物(例如人)。
如本文中所用，术语“宿主细胞”是指可以用核酸分子转染的特定受试者细胞以及这种细胞的后代或潜在后代。由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或者核酸分子整合到宿主细胞基因组中，这种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不同。
如本文中所用，术语“自体同源的”意指源自同一个体，随后被重新引入该个体的任何材料。
“同种异体的”是指源自相同物种的不同个体的移植物。
如本文中所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞和其后代。
如本文中所用的术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府监管机构批准的或者在美国药典、欧洲药典或其它公认药典中列出可用于动物并且更具体地可用于人的。
“赋形剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。赋形剂包括例如包封材料或添加剂，例如吸收促进剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、运载体、包衣剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、调味剂、保湿剂、润滑剂、香料、防腐剂、推进剂、释放剂、杀菌剂、甜味剂、增溶剂、润湿剂和它们的混合物。术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(Freunds’adjuvant)(完全或不完全)或媒介物。
在一些实施方案中，赋形剂是药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。药学上可接受的赋形剂的其它实例描述于Remington和Gennaro，Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版1990)中。
在一个实施方案中，每种组分在与药物制剂的其它成分相容的意义上是“药学上可接受的”，并且适于与人和动物的组织或器官接触使用而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。参见例如LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia，PA，2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第6版；Rowe等人编辑；The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2009；Handbook of Pharmaceutical Additives，第3版；Ash和Ash编辑；Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation，第2版；Gibson编辑；CRC Press LLC:Boca Raton，FL，2009。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对暴露其中的细胞或哺乳动物是无毒的。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是水性pH缓冲溶液。
在一些实施方案中，赋形剂是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用组合物(例如药物组合物)时，水是示例性的赋形剂。盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油水溶液也可以用作液体赋形剂，特别是用于可注射溶液。赋形剂还可以包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。口服组合物，包括制剂，可以包括标准赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
组合物，包括药物化合物，可以含有例如分离或纯化形式的结合分子(例如抗体)以及适量的赋形剂。
如本文中所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指本文提供的单结构域抗体或包含剂和单结构域抗体或药物组合物的治疗分子足以产生所需结果的量。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。如本文中所用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如非灵长类动物或灵长类动物(例如人)。在具体实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是被诊断患有疾病或病症的哺乳动物，例如人。在另一个实施方案中，受试者是处于发展疾病或病症的风险中的哺乳动物，例如人。
“施用(Administer)”或“施用(administration)”是指例如通过粘膜、皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其它物理递送方法，将存在于体外的物质注射或以其它方式物理递送到患者体内的行为。
如本文中所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指由施用一种或多种疗法引起的疾病或病症的进展、严重性和/或持续时间的减少或改善。可以通过评估与潜在病症相关的一种或多种症状是否有减少、缓解和/或减轻，从而在患者身上观察到改善来确定治疗，尽管患者可能仍然受到潜在病症的折磨。术语“治疗”包括控制和改善疾病。术语“管理(manage)”、“管理(managing)”和“管理(management)”是指受试者疗法中获得的有益效果，不一定治愈疾病。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指降低疾病、病症、疾患或相关症状(例如，糖尿病或癌症)发作(或复发)的可能性。
如本文中所用，“延迟”癌症的发展是指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推延疾病的发展。这种延迟可能有不同的时间长度，取决于病史和/或正在接受治疗的个体。正如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以包括预防，因为个体不会显现疾病。“延迟”癌症发展的方法是一种在给定时间范围内降低疾病发展可能性和/或与不使用该方法相比在给定时间范围内减轻疾病程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用统计学上显著数量的个体。可以使用标准方法检测癌症的发展，包括但不限于计算机轴向断层扫描(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血测试、动脉造影或活检。发展也可以指最初可能无法检测到的癌症进展，包括发生、复发和发作。
术语“约”和“大约”是指在给定值或范围的20％内、15％内、10％内、9％内、8％内、7％内、6％内、5％内、4％内、3％内、2％内、1％内或更小。
除非上下文另有明确规定，否则如在本公开和权利要求书中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。
应该理解，每当在本文用术语“包含”来描述实施方案时，还提供根据“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方案。应该理解，每当在本文用短语“基本上由……组成”来描述实施方案时，还提供根据“由……组成”描述的其它类似实施方案。
如在“A与B之间”或“A-B之间”这样的短语中使用的术语“之间”是指包括A和B两者的范围。
如本文在例如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意图包括：A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，如在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意图包括以下实施方案的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
5.2.Claudin18.2结合部分
Claudin18.2是Claudin18的同种型2，是细胞表面蛋白Claudin家族的一员。Claudin是紧密细胞连接处的重要成分，形成控制细胞间分子流动的细胞旁屏障。不同的Claudin在不同的组织上表达，它们的功能改变与这些组织的癌症形成有关。在正常组织中，Claudin18.2的表达仅限于胃粘膜上皮细胞。Claudin18.2的表达在胃癌和其转移的恶性转化中保留。也在胰腺、食管、卵巢和肺部肿瘤中发现Claudin18.2的异位活化。
人Claudin18.2蛋白有261个氨基酸(NCBI，NP_001002026.1)。Claudin18.2是一种四跨型跨膜蛋白，N端和C端在细胞质中。Claudin18.2有两个细胞外环，它们与例如收紧溶质的细胞旁间隙和形成细胞旁离子孔等功能有关。
本文提供的Claudin18.2结合部分特异性结合Claudin18.2、其片段或其变体。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分特异性结合人Claudin18.2。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分特异性结合Claudin18.2的细胞外结构域。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分特异性结合Claudin18.2的第一个细胞外环。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分特异性结合Claudin18.2的第二个细胞外环。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分特异性结合Claudin18.2的第一个和第二个细胞外环。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分结合Claudin18.2的亲和力比抗体对Claudin18.1的亲和力大至少20倍。在一些实施方案中，在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分结合Claudin18.2的亲和力比抗体对Claudin18.1的亲和力大至少50倍。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分结合Claudin18.2的亲和力比抗体对Claudin18.1的亲和力大至少100倍。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分不会可检测地结合Claudin18.1。
在一些实施方案中，本文提供的Claudin18.2结合部分(例如，抗体)以约1.0μM或更小、约100.0nM或更小、约40.0nM或更小、约20.0nM或更小、约10.0nM或更小、约1.0nM或更小、约0.1nM或更小、50.0pM或更小、10.0pM或更小或1.0pM或更小的缔合常数(KD)结合Claudin18.2(例如，人Claudin18.2)。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分(例如，抗体)以约1.0μM或更小、约100.0nM或更小、约40.0nM或更小、约20.0nM或更小、约10.0nM或更小、约1.0nM或更小或约0.1nM或更小的半最大有效浓度(EC50)结合Claudin18.2(例如，人Claudin18.2)。
在一些实施方案中，本文提供的Claudin18.2结合部分调节一种或多种Claudin18.2活性。在一些实施方案中，本文提供的Claudin18.2结合部分是拮抗剂抗体。
5.2.1.结合Claudin18.2的单结构域抗体
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，单结构域抗体是仅有重链的抗体(HCAb)，并且抗原结合片段是仅有重链的抗体(HCAb)的可变区，即VHH片段，或具有完整或部分重链恒定区的VHH片段。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含至少两个通过接头连接的VHH片段，其中VHH片段结合于相同的抗原表位。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含至少两个通过接头连接的VHH片段，其中这些VHH片段结合于不同的抗原表位。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含一个或多个与完整或部分重链恒定区连接的VHH结构域。在一些实施方案中，重链恒定区是免疫球蛋白重链恒定区或免疫球蛋白重链恒定区的一部分，例如免疫球蛋白重链恒定区的铰链-CH2-CH3结构域。在一些实施方案中，本公开的重链恒定区是IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区或它们的一部分，例如IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区的铰链-CH2-CH3结构域。在一些实施方案中，本公开的重链恒定区是人或骆驼科IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区的铰链-CH2-CH3结构域。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分提供了一种结合部分，其包含(i)抗Claudin18.2单结构域抗体或抗原结合片段，和(ii)抗体轻链或其一部分，这两者通过二硫键连接以结合Claudin18.2。在一些实施方案中，结合部分是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、(scFv)2、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
在一些实施方案中，本文提供的结合部分是骆驼科、嵌合、人或人源化单结构域抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体是分离的。在一些实施方案中，抗体基本上是纯的。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是单特异性结合部分。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是双特异性结合部分。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是多特异性结合部分。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含单价结合部分。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含二价结合部分。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含多价结合部分。在一些实施方案中，二价结合部分包含两个单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，二价结合部分包含第一单结构域抗体或其抗原结合片段和第二单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一单结构域抗体或抗原结合片段通过接头连接到第二单结构域抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分从N端到C端包含第一单结构域抗体或其抗原结合片段、接头和第二单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第二单结构域抗体或其抗原结合片段是第一单结构域抗体或其抗原结合片段的串联重复。在一些实施方案中，第一单结构域抗体或其抗原结合片段和第二单结构域抗体或其抗原结合片段识别Claudin18.2上的不同表位。在一些实施方案中，第一单结构域抗体或抗原结合片段和第二单结构域抗体或抗原结合片段识别Claudin18.2上的相同表位。
本文所述的抗体(例如sdAb)可以使用本领域已知的或如下文(例如，第5.2.6节中)更详细地描述的任何方法制备。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是人源化抗体。用于产生人源化抗体的各种方法是本领域已知的并且如下文(例如，第5.2.2节中)更详细地描述。在一些实施方案中，人源化抗体包含一个或多个氨基酸残基，这些氨基酸残基已从非人来源引入其序列中。
抗体的CDR由本领域技术人员使用各种方法/系统来定义。这些系统和/或定义经过多年发展和完善，包括Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact。Kabat定义基于序列可变性，并且被普遍使用。Chothia定义基于结构环区域的位置。IMGT系统基于序列可变性和可变结构域结构内的位置。AbM定义是Kabat和Chothia之间的折衷。Contact定义基于对可用抗体晶体结构的分析。在一些实施方案中，根据各种系统的示例性CDR如上表1中所定义。然而，应当理解，提及特定抗体的一个或多个可变结构域CDR将涵盖本领域技术人员已知的所有CDR定义。
本文提供的Claudin18.2结合部分包括本文提供的抗Claudin18.2单结构域抗体和其人源化型式和其抗原结合片段，其中CDR1、CDR2、CDR3根据Kabat编号定义，参考Deschacht等人，2010.JImmunol 184:5696-704和下表2中总结的可变区序列或序列ID号。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是一种抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含本文描述的任一种抗体的一个、两个和/或三个CDR。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含一个、两个和/或三个CDR，或来自表2的可变区。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含与VHH结构域的C端连接的恒定区。
与含有具有IMAB362的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的单链可变片段(scFv)的基准相比，本公开的示例性抗Claudin18.2抗体显示更高的与Claudin18.2的结合能力。
表2.CDR和VHH结构域的氨基酸序列和/或序列ID号
Figure BDA0003709776140000391
Figure BDA0003709776140000401
本申请的一个方面提供了一种抗Claudin18.2 sdAb，其包含SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一者的CDR区。因此，在一些实施方案中，本文提供了一种结合于Claudin18.2的单结构域抗体，其包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中CDR序列选自表2中的单结构域抗体中的那些CDR序列。
在一些实施方案中，提供了一种抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一者的氨基酸序列的一个、两个或全部三个CDR。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:38中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:38中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:38中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:38中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:38中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:38中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:38中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:39中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:39中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:39中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:39中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:39中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:39中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:39中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:40中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:40中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:40中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:40中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:40中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:40中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:40中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:41中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:41中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:41中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:41中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:41中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:41中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:41中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:42中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:42中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:42中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:42中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:42中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:42中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:42中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:43中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:43中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:43中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:43中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:43中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:43中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:43中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:44中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:44中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:44中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:44中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:44中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:44中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:44中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:45中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:45中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:45中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:45中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:45中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:45中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:45中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:46中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:46中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:46中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:46中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:46中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:46中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:46中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:47中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:47中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:47中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:47中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:47中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:47中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:47中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:48中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:48中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:48中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:48中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:48中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:48中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:48中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:49中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:49中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:49中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:49中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:49中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:49中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:49中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:50中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:50中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:50中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:50中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:50中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:50中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:50中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:51中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:51中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:51中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:51中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:51中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:51中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:51中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:77中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:77中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:77中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:77中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:77中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:77中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:77中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:78中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:78中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:78中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:78中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:78中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:78中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:78中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:79中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:79中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:79中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:79中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:79中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:79中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:79中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:80中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:80中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:80中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:80中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:80中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:80中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:80中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:81中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:81中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:81中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:81中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:81中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:81中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:81中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:82中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:82中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:82中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:82中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:82中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:82中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:82中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:83中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:83中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:83中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:83中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:83中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:83中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:83中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:84中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:84中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:84中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:84中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:84中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:84中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:84中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:85中所示的CDR1的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:85中所示的CDR2的氨基酸序列的CDR2。在其它实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:85中所示的CDR3的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:85中所示的CDR1和CDR2的氨基酸序列的CDR1和CDR2。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:85中所示的CDR1和CDR3的氨基酸序列的CDR1和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:85中所示的CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR2和CDR3。在一些实施方案中，单结构域抗体具有具备如SEQ ID NO:85中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。CDR序列可以根据众所周知的编号系统来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号。在其它实施方案中，CDR是根据Chothia编号。在其它实施方案中，CDR是根据Contact编号。在其它实施方案中，CDR是根据多种编号系统的组合，例如，Kabat和Chothia编号系统的组合，或Kabat和IMGT编号系统的组合。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2单结构域抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:24的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:113的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:126的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:25的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:127的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:26的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:115的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:128的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:27的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:116的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:129的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:28的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:117的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:130的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:29的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:118的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:131的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:30的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:119的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:132的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:31的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:133的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:32的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:121的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:33的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:122的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:135的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:34的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:123的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:136的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:35的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:124的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:137的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:36的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:122的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:138的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQID NO:37的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包括包含SEQ IDNO:125的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ IDNO:139的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，单结构域抗体还包含表2中的单结构域抗体的一个或多个框架区。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:38的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:39的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:40的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:41的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:42的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:43的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:44的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:45的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:46的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQID NO:47的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:48的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:49的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:50的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:51的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:77的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:78的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ IDNO:79的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:80的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:81的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:82的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:83的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:84的序列的VHH结构域的框架。在一些实施方案中，单结构域抗体包含一个或多个源自包含SEQ ID NO:85的序列的VHH结构域的框架。
在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体为人源化单结构域抗体。在一些实施方案中，人源化单结构域抗体可以使用下文第6部分中举例说明的方法或下文部分中描述的方法产生。
本文所述的框架区根据CDR编号系统的边界来确定。换句话说，如果CDR由例如Kabat、IMGT或Chothia确定，则框架区是可变区中围绕CDR的氨基酸残基，从N端到C端呈以下格式：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。例如，FR1定义为如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1氨基酸残基N端的氨基酸残基，FR2定义为如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的介于CDR1与CDR2氨基酸残基之间的氨基酸残基，FR3定义为如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的介于CDR2与CDR3氨基酸残基之间的氨基酸残基，而FR4定义为如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR3氨基酸残基C端的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种分离的抗Claudin18.2单结构域抗体，其包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VHH结构域。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于上述任一种抗体(包括表2中的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。
可以使用数学算法来确定两个序列(例如氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性实例是Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268(1990)的算法，修改为Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877(1993)。这种算法被并入Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以使用NBLAST核苷酸程序参数集进行，例如得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以使用XBLAST程序参数集进行，例如得分＝50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得空位比对以进行比较，可以如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389 3402(1997)中所述利用Gapped BLAST。或者，PSI BLAST可用于进行迭代搜索，以检测分子之间的远距离关系(同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如万维网上的美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller，CABIOS 4:11-17(1998)的算法。这种算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。两个序列之间的同一性百分比可以使用与上述技术类似的技术来确定，允许或不允许缺口。在计算同一性百分比时，通常只计数完全匹配。
在一些实施方案中，提供了一种抗Claudin18.2 sdAb，其包括包含以下的三个CDR：(a)与选自SEQ ID NO:1-11和113-125的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR1；(b)与选自SEQ ID NO:12-23的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR2；以及(c)与选自SEQ ID NO:24-37和126-139的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3。在一些实施方案中，虽然具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一百分比的同一性的CDR相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗Claudin18.2 sdAb保留与Claudin18.2结合的能力。在一些实施方案中，提供了一种抗Claudin18.2 sdAb，其包括包含以下的三个CDR：(a)相对于选自SEQ ID NO:1-11和113-125的氨基酸序列具有约1个、2个、3个、4个或5个中的任何数目的氨基酸取代(例如，保守取代)、插入或缺失的CDR1；(b)相对于选自SEQ ID NO:12-23的氨基酸序列具有约1个、2个、3个、4个或5个中的任何数目的氨基酸取代(例如，保守取代)、插入或缺失的CDR2；以及(c)相对于选自SEQ ID NO:24-37和126-139的氨基酸序列具有约1个、2个、3个、4个或5个中的任何数目的氨基酸取代(例如，保守取代)、插入或缺失的CDR3。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb是亲和力成熟的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb是骆驼科的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2sdAb是人源化的。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含sdAb，所述sdAb包括包含以下的可变结构域(例如VHH结构域)：(1)包含选自由SEQ ID NO:1-11和113-125组成的组的氨基酸序列或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、插入或缺失的变体的CDR1；(2)包含选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的氨基酸序列或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、插入或缺失的变体的CDR2；和/或(3)包含选自由SEQ ID NO:24-37和126-139组成的组的氨基酸序列或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、插入或缺失的变体的CDR3。在一些实施方案中，CDR(VHH CDR1、VHH CDR2和/或VHH CDR3)包含一个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，CDR(VHH CDR1、VHH CDR2和/或VHH CDR3)包含两个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，CDR(VHH CDR1、VHH CDR2和/或VHH CDR3)包含三个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，CDR(VHH CDR1、VHH CDR2和/或VHH CDR3)包含四个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，CDR(VHH CDR1、VHH CDR2和/或VHH CDR3)包含五个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是保守取代。在一些实施方案中，进行一个或多个取代以使抗体人源化。在一些实施方案中，进行一个或多个取代、插入或缺失以使亲和力成熟。在一些实施方案中，进行一个或多个取代、插入或缺失以使抗体优化。
在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ IDNO:39的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:83的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:84的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在某些实施方案中，本文所述的单结构域抗体包含与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VHH结构域，其中该单结构域抗体结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，虽然具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一百分比的同一性的VHH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗Claudin18.2单结构域抗体保留与Claudin18.2结合的能力。在一些实施方案中，在选自SEQ ID NO:38-51和77-85的氨基酸序列中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。(在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR以外的区域(即，在FR中)。
在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描来定位功能表位，以鉴定Claudin18.2蛋白中与本文提供的抗Claudin18.2单结构域抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，可以采用与Claudin18.2结合的抗Claudin18.2单结构域抗体的构象和晶体结构来鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性结合于与本文提供的任何抗Claudin18.2单结构域抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。在一些实施方案中，提供一种抗体，其结合的表位与包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体相同。
在一些实施方案中，本文提供了一种抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与本文所述的任一种抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，可以使用ELISA测定来确定竞争性结合。举例来说，在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQID NO:42的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。在一些实施方案中，提供一种抗体，其与包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的抗Claudin18.2单结构域抗体竞争性地特异性结合于Claudin18.2。
在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含抗体。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含骆驼科、嵌合或人源化抗体。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是单结构域抗体。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分是sdAb的抗原结合片段或可变区。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含具有来自本文所述的sdAb的CDR1、CDR2和/或CDR3的抗体。在一些实施方案中，Claudin18.2结合部分包含本文所述的抗Claudin18.2抗体的变体。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体的变体包含一个至三十个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体的变体包含一个至二十五个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体的变体包含一个至二十个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体的变体包含一个至十五个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体的变体包含一个至十个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体的变体包含一个至五个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体的变体包含一个至三个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，保守氨基酸取代在抗体的VHH CDR中。在一些实施方案中，保守氨基酸取代不在抗体的VHHCDR中。在一些实施方案中，保守氨基酸取代在抗体的框架区中。
在一些实施方案中，提供了包含任一种上述抗Claudin18.2 sdAb的抗Claudin18.2抗体或抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体是单克隆抗体，包括骆驼科、嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体是抗体片段，例如VHH片段。在一些实施方案中，抗Claudin18.2抗体是包含任何抗体类别或同种型，例如IgG1或IgG4的Fc区的全长仅有重链的抗体。在一些实施方案中，如果需要，Fc区具有减少或最小化的效应功能。其它示例性Claudin18.2结合分子在以下部分中更详细地描述。在一些实施方案中，本文提供了一种分离的核酸，其编码本文提供的任何Claudin18.2结合部分。下面提供了关于核酸序列和载体的更详细描述。
在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗Claudin18.2抗体(例如抗Claudin18.2单结构域抗体)或抗原结合蛋白可以单独或组合并入任何特征，如以下第5.2.2节至第5.2.7节中所述。上面提到的各个方面也在以下部分中更详细地描述。
5.2.2.人源化单结构域抗体
本文所述的单结构域抗体包括人源化单结构域抗体。已经描述了将来自骆驼科物种的单结构域抗体人源化的一般策略(参见例如Vincke等人，J.Biol.Chem.，284(5):3273-3284(2009))并且可用于产生如本文所公开的人源化VHH结构域。来自骆驼科物种的人源化单结构域抗体的设计可以包括VHH中的标志残基，例如残基11、37、44、45和47(残基编号根据Kabat)(Muyldermans，Reviews Mol Biotech74:277-302(2001)。
人源化抗体，例如本文公开的人源化单结构域抗体也可以使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP239,400；国际公布号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering7(6):805-814(1994)；以及Roguska等人，PNAS 91:969-973(1994))、链改组(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)以及例如以下中公开的技术：美国专利号6,407,213；美国专利号5,766,886；WO9317105；Tan等人，J.Immunol.169:1119 25(2002)；Caldas等人，Protein Eng.13(5):353-60(2000)；Morea等人，Methods 20(3):267 79(2000)；Baca等人，J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)；Roguska等人，Protein Eng.9(10):895 904(1996)；Couto等人，CancerRes.55(23增刊):5973s-5977s(1995)；Couto等人，Cancer Res.55(8):1717-22(1995)；Sandhu JS，Gene 150(2):409-10(1994)；以及Pedersen等人，J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)。另见美国专利公布号US2005/0042664A1(2005年2月24日)，每一篇都以引用的方式的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体可以是结合于Claudin18.2，包括人Claudin18.2的人源化单结构域抗体。例如，本公开的人源化单结构域抗体可以包含SEQ IDNO:38-51和77-85中所示的一个或多个CDR。用于非人抗体人源化的各种方法是本领域已知的。举例来说，人源化抗体可以引入一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变结构域。例如，可以按照以下的方法，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列进行人源化：Jones等人，Nature321:522-25(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-27(1988)；以及Verhoeyen等人，Science239:1534-36(1988))。在一个具体实施方案中，本文提供的单结构域抗体的人源化如下文第6节中所述进行。
在一些情况下，通过CDR移植来构建人源化抗体，其中亲本非人抗体的CDR的氨基酸序列被移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定，CDR中只有大约三分之一的残基实际接触抗原，并将这些残基称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人，FASEB J.9:133-39(1995))。在SDR移植技术中，只有SDR残基被移植到人抗体框架上(参见例如Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005))。
用于制备人源化抗体的人可变结构域的选择对于降低抗原性来说是很重要的。例如，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变域序列的整个文库筛选非人抗体的可变结构域序列。可以选择与非人抗体最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人，J.Immunol.151:2296-308(1993)；以及Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-17(1987))。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.151:2623-32(1993))。在一些情况下，该框架来源于最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，人种系基因用作框架区的来源。
在称为超级人源化的基于CDR比较的替代范式中，FR同源性是无关紧要的。该方法由将非人序列与功能性人种系基因库进行比较组成。然后选择那些编码与鼠序列相同或密切相关的规范结构的基因。接下来，在与非人抗体共享规范结构的基因中，选择在CDR内具有最高同源性的基因作为FR供体。最后，将非人CDR移植到这些FR上(参见例如Tan等人，J.Immunol.169:1119-25(2002))。
通常还期望在保留对抗原的亲和力和其它有利的生物学特性下将抗体人源化。为了实现这一目标，根据一种方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可用的并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序可用于说明和显示选定候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些程序包括例如WAM(Whitelegg和Rees，Protein Eng.13:819-24(2002))、Modeller(Sali和Blundell，J.Mol.Biol.234:779-815(1993))和Swiss PDBViewer(Guex和Peitsch，Electrophoresis 18:2714-23(1997))。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从接受者和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现所需的抗体特性，例如对靶抗原的亲和力增加。一般来说，高变区残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。
抗体人源化的另一种方法是基于称为人字符串内容(Human String Content，HSC)的抗体人性度量。该方法将小鼠序列与人种系基因库进行比较，并将差异评分为HSC。然后通过最大化其HSC而不是使用全局同一性量度产生多种不同的人源化变体，从而使靶序列人源化(Lazar等人，Mol.Immunol.44:1986-98(2007))。
除了上述方法之外，经验方法可用于产生和选择人源化抗体。这些方法包括那些基于大型人源化变体文库的产生和使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆的方法。抗体变体可以从噬菌体、核糖体和酵母展示文库以及通过细菌菌落筛选来分离(参见例如Hoogenboom，Nat.Biotechnol.23:1105-16(2005)；Dufner等人，Trends Biotechnol.24:523-29(2006)；Feldhaus等人，Nat.Biotechnol.21:163-70(2003)；以及Schlapschy等人，Protein Eng.Des.Sel.17:847-60(2004))。
在FR文库方法中，在FR中的特定位置引入一系列残基变体，然后筛选文库以选择最能支持移植CDR的FR。待取代的残基可以包括一些或所有被鉴定为可能有助于CDR结构的“游标”残基(参见例如，Foote和Winter，J.Mol.Biol.224:487-99(1992))，或来自Baca等人J.Biol.Chem.272:10678-84(1997)鉴定的更有限的一组靶残基。
在FR改组中，整个FR与非人CDR组合，而不是创建选定残基变体的组合文库(参见例如Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60(2005))。可以使用一步FR改组方法。这种方法已显示是有效的，因为所得抗体表现出改进的生化和物理化学性质，包括增强的表达、增加的亲和力和热稳定性(参见例如Damschroder等人，Mol.Immunol.44:3049-60(2007))。
“人类化”方法基于对基本最小特异性决定簇(MSD)的实验鉴定，并基于将非人片段顺序替换到人FR文库中并评估结合。这种方法通常可保留表位并从具有不同人V区段CDR的多个亚类鉴定出抗体。
“人类工程化”方法包括通过对抗体的氨基酸序列进行特异性改变来改变非人抗体或抗体片段，从而产生在人中具有降低的免疫原性，但仍保留了原始非人抗体的期望结合特性的修饰抗体。通常，该技术涉及将非人抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用全局风险/报酬计算进行分类，所述计算评估进行特定取代的预测益处(例如，对于人中的免疫原性)与取代将影响所得抗体折叠的风险。可以通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共有人抗体序列的相应区域进行比对来选择在非人抗体序列的给定位置(例如，低风险或中等风险)要被取代的特定人氨基酸残基。根据比对，非人序列中低风险或中等风险位置的氨基酸残基可以取代人抗体序列中的相应残基。以下中更详细地描述了制造人工程化蛋白质的技术：Studnicka等人，ProteinEngineering 7:805-14(1994)；美国专利号5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619；以及PCT公布WO 93/11794。
可以使用例如Composite Human AntibodyTM技术(Antitope Ltd.，Cambridge，United Kingdom)产生复合人抗体。为了产生复合人抗体，以避开T细胞表位，从而使所得抗体的免疫原性最小化的方式从多个人抗体可变区序列的片段中设计可变区序列。
去免疫抗体是已经去除了T细胞表位的抗体。已经描述了用于制备去免疫抗体的方法。参见例如Jones等人，Methods Mol Biol.525:405-23(2009)；xiv和De Groot等人，Cell.Immunol.244:148-153(2006))。去免疫抗体包含T细胞表位耗尽的可变区和人恒定区。简单地说，克隆抗体的可变区并随后通过在T细胞增殖测定中测试源自抗体可变区的重叠肽来鉴定T细胞表位。T细胞表位经由计算机方法鉴定，以鉴定与人MHC II类结合的肽。在可变区中引入突变以消除与人MHC II类的结合。然后利用突变的可变区来产生去免疫抗体。
在一些更具体的实施方案中，人源化单结构域抗体根据下文第6节中示例的方法产生。在一些具体实施方案中，本文提供的人源化单结构域抗体包含SEQ ID NO:77-85。
5.2.3.单结构域抗体变体
在一些实施方案中，考虑本文所述的与Claudin18.2结合的单结构域抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要优化结合亲和力和/或抗体的其它生物学特性，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解度。因此，除了本文所述的与Claudin18.2结合的单结构域抗体之外，预期可制备本文所述的与Claudin18.2结合的单结构域抗体的变体。例如，可以通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA中，和/或通过合成所需的抗体或多肽来制备单结构域抗体变体。本领域技术人员理解氨基酸变化可能改变单结构域抗体的翻译后过程。
化学修饰
在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体例如通过将任何类型的分子共价连接于单结构域抗体而被化学修饰。抗体衍生物可以包括例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白质连接、或与一个或多个免疫球蛋白结构域(例如，Fc或Fc的一部分)缀合进行化学修饰的抗体。多种化学修饰中的任一种都可以通过已知技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、配制、衣霉素(tunicamycin)的代谢合成等。此外，抗体可以含有一种或多种非经典氨基酸。
在一些实施方案中，改变本文提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。宜通过改变氨基酸序列以便创建或去除一个或多个糖基化位点来实现抗体的糖基化位点的添加或缺失。
当本文提供的单结构域抗体与Fc区融合时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其一般通过N键连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本文提供的结合分子中的寡糖进行修饰以创建具有某些改良特性的变体。
在其它实施方案中，当本文提供的单结构域抗体与Fc区融合时，本文提供的抗体变体可具有连接于所述Fc区(直接或间接)的缺乏岩藻糖的碳水化合物结构。例如，这类抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。例如，如WO2008/077546中所述，如通过MALDI-TOF质谱法所测量，通过相对于连接于Asn 297的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量。Asn297是指位于Fc区中的约位置297(Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即在位置294与位置300之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改良的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108和US 2004/0093621。关于“脱岩藻糖基化的”或“缺乏岩藻糖的”抗体变体的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108；以及WO 2004/056312，尤其在实施例11)；和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
包含本文提供的单结构域抗体的结合分子进一步提供有两分型寡糖(bisectedoligosaccharide)，例如其中连接于Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc两分。这类变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改良的ADCC功能。这类变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美国专利号6,602,684(Umana等人)和US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。这类变体可以具有改良的CDC功能。这类变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
在包含本发明的单结构域抗体和Fc区的分子中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一些实施方案中，本申请涵盖具有一些但不是所有效应功能的变体，这使得其成为如下应用的期望候选物，在该应用中结合分子的体内半衰期是重要的，但某些效应功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的减少/消除。举例来说，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保结合分子缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。γ在美国专利号5,500,362中描述了用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例(参见例如Hellstrom，I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom，I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View，CA；以及CytoTox
Figure BDA0003709776140000851
非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。可用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可以在体内，例如在例如Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood101:1045-1052(2003)；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法来进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减少的效应功能的结合分子包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被取代的那些结合分子(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR的结合提高或降低的某些变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，变体包含具有改良ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的取代的Fc区。在一些实施方案中，在Fc区中做出改变，引起改变的(即，改良的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的结合分子，FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。那些分子包含其中具有改善Fc区与FcRn结合的一个或多个取代的Fc区。这类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或多处具有取代，例如Fc区残基434的取代的那些变体(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan&Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
在一些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程化的抗体，其中抗体的一个或多个残基经半胱氨酸残基取代。在一些实施方案中，被取代的残基存在于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可及位点，并且可以用于将抗体与其它部分(例如药物部分或接头-药物部分)缀合，以创建免疫缀合物，如本文进一步所描述。
取代、缺失或插入
变异可以是编码单结构域抗体或多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，其导致与原始抗体或多肽相比氨基酸序列发生变化。用于取代诱变的感兴趣位点包括CDR和FR。
氨基酸取代可以是一种氨基酸被另一种具有相似结构和/或化学性质的氨基酸替换，例如亮氨酸被丝氨酸替换，例如保守氨基酸替换的结果。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码本文提供的分子的核苷酸序列中引入突变，包括例如引起氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代，少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在一具体实施方案中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。允许的变异可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并对所得变体测试亲本抗体表现出的活性来确定。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有多个残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。
通过保守氨基酸取代产生的单结构域抗体包括在本公开中。在“保守氨基酸取代”中，氨基酸残基被具有电荷相似的侧链的氨基酸残基替换。如上所述，本领域中已定义具有电荷类似的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，可以例如通过饱和诱变，沿全部或部分编码序列随机引入突变，并且可以针对生物活性筛选所得突变体以鉴定保留活性的突变体。在诱变之后，可以表达编码的蛋白质并且可以确定蛋白质的活性。可以进行保守(例如，在具有相似性质和/或侧链的氨基酸组内)取代，以维持或不显著改变性质。示例性取代展示在下表3中。
表3.氨基酸取代
Figure BDA0003709776140000881
Figure BDA0003709776140000891
氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分组(参见例如Lehninger，Biochemistry 73-75(第2版1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；以及(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，天然存在的残基可以基于共同的侧链特性分为组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。举例来说，任何不参与维持单结构域抗体正确构象的半胱氨酸残基也可以用例如另一种氨基酸如丙氨酸或丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。非保守取代将需要将这些类别之一的成员换成另一个类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将具有某些生物学特性的改变(例如，改善)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其宜例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文中所描述的那些技术产生。简单地说，使一个或多个CDR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并针对特定的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在CDR中做出改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。可以在CDR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间高频率地突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)中做出这类改变，其中测试所得变异抗体或其片段的结合亲和力。例如，在Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中已经描述了通过从二级文库构建和重新选择的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入被选择用于成熟的可变基因中。然后，创建二级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及CDR指导的方法，其中将几个CDR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特定鉴定参与抗原结合的CDR残基。以下章节提供了关于亲和力成熟的更详细描述。
在一些实施方案中，可以在一个或多个CDR内发生取代、插入或缺失，只要这类改变不实质性降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在CDR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。在上文提供的变体VHH序列的一些实施方案中，每个CDR是未改变的，或者含有不超过1个、2个或3个氨基酸取代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶标的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells，Science，244:1081-1085(1989)所述。在这一方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。或者或另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。可以靶向或消除这类接触残基和邻近残基作为取代的候选残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有100或更多个残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N端或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合。
可以使用本领域已知的方法进行变异，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。可以对克隆的DNA进行定点诱变(参见例如Carter，Biochem J.237:1-7(1986)；以及Zoller等人，Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982))、盒式诱变(参见例如Wells等人，Gene34:315-23(1985))或其它已知技术以产生单结构域抗体变异DNA。
在一些实施方案中，本文公开的Claudin18.2结合部分的变体可以保持与亲本结合部分相似程度、相同程度或更高程度的识别靶标(例如，Claudin18.2)的能力。在一些实施方案中，变体可以与亲本结合部分至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一。在一些实施方案中，变体可以具有与本文公开的抗体至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一的氨基酸序列。
5.2.4体外亲和力成熟
在一些实施方案中，与亲本抗体相比具有改进的特性，如亲和力、稳定性或表达水平的抗体变体可以通过体外亲和力成熟来制备。与自然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原理。抗体文库展示在生物体(例如噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面或与其编码的mRNA或DNA缔合(例如共价或非共价)。所展示抗体的亲和力选择允许分离携带编码抗体的遗传信息的生物体或复合物。使用如噬菌体展示等展示方法进行两轮或三轮突变和选择通常会产生亲和力在低纳摩尔范围内的抗体片段。亲和力成熟的抗体可以对靶抗原具有纳摩尔甚至皮摩尔的亲和力。
噬菌体展示是一种广泛用于展示和选择抗体的方法。抗体作为与噬菌体外壳蛋白的融合体展示在Fd或M13噬菌体的表面上。选择涉及暴露于抗原以允许噬菌体展示的抗体结合其靶标，这一过程称为“淘选”。与抗原结合的噬菌体被回收并用于感染细菌以产生用于其它轮选择的噬菌体。有关评论，参见例如Hoogenboom，Methods.Mol.Biol.178:1-37(2002)；以及Bradbury和Marks，J.Immunol.Methods290:29-49(2004)。
在酵母展示系统中(参见例如，Boder等人，Nat.Biotech.15:553–57(1997)；以及Chao等人，Nat.Protocols 1:755-68(2006))，抗体可能与酵母凝集素蛋白Aga2p的粘附亚基融合，该亚基通过与Aga1p的二硫键附着在酵母细胞壁上。经由Aga2p展示蛋白质将蛋白质从细胞表面投射开，从而最大限度地减少与酵母细胞壁上其它分子的潜在相互作用。磁分离和流式细胞术用于筛选文库以选择具有改良的亲和力或稳定性的抗体。与感兴趣可溶性抗原的结合是通过用生物素化抗原和与荧光团缀合的二级试剂(如链霉亲和素)标记酵母来确定的。抗体表面表达的变化可以通过在单链抗体(例如scFv)两侧的血凝素或c-Myc表位标签的免疫荧光标记来测量。已显示表达与展示的蛋白质的稳定性相关，因此可以针对改良的稳定性以及亲和力来选择抗体(参见例如Shusta等人，J.Mol.Biol.292:949-56(1999))。酵母展示的另一个优点是展示的蛋白质在真核酵母细胞的内质网中折叠，利用内质网伴侣蛋白和质量控制机制。一旦成熟完成，就可以在展示在酵母表面上的同时便利地“滴定”抗体亲和力，无需表达和纯化每个克隆。酵母表面展示的一个理论限制是功能文库的大小可能比其它展示方法的小；然而，最近的一种方法使用酵母细胞的交配系统来创建大小估计为1014的组合多样性(参见例如美国专利公布2003/0186374；以及Blaise等人，Gene 342:211-18(2004))。
在核糖体展示中，产生抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物以在无细胞系统中进行选择。编码特定抗体文库的DNA文库与缺少终止密码子的间隔序列进行基因融合。该间隔序列在翻译时仍连接于肽基tRNA并占据核糖体隧道，从而使感兴趣的蛋白质从核糖体中突出并折叠。由此产生的mRNA、核糖体和蛋白质的复合物可以与表面结合的配体结合，从而允许通过用配体进行亲和捕捉同时分离抗体和其编码mRNA。然后核糖体结合的mRNA被逆转录回cDNA，然后可以进行诱变并用于下一轮选择(参见例如Fukuda等人，Nucleic AcidsRes.34:e127(2006))。在mRNA展示中，使用嘌呤霉素作为衔接分子在抗体与mRNA之间建立共价键(Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:3750-55(2001))。
由于这些方法完全在体外进行，因此与其它选择技术相比，它们具有两个主要优势。首先，文库的多样性不受细菌细胞转化效率的限制，而仅受试管中存在的核糖体和不同mRNA分子的数量限制。其次，在每一轮选择之后例如通过非校对聚合酶可以很容易地引入随机突变，因为在任何多样化步骤之后都不需要转化任何文库。
在一些实施方案中，可以使用哺乳动物展示系统。
也可以有针对性地或经由随机引入将多样性引入抗体文库的CDR中。前一种方法包括经由高水平或低水平的诱变顺序靶向抗体的所有CDR，或靶向孤立的体细胞超突变热点(参见例如Ho等人，J.Biol.Chem.280:607-17(2005))或因实验依据或结构原因而怀疑影响亲和力的残基。也可以经由DNA改组或类似技术替换天然多样化的区域来引入多样性(参见例如Lu等人，J.Biol.Chem.278:43496-507(2003)；美国专利号5,565,332和6,989,250)。替代技术靶向延伸到框架区残基中的高变环(参见例如Bond等人，J.Mol.Biol.348:699-709(2005))，在CDR中采用环缺失和插入，或使用基于杂交的多样化(参见例如美国专利公布号2004/0005709)。在CDR中产生多样性的额外方法公开于例如美国专利号7,985,840中。可用于产生抗体文库和/或抗体亲和力成熟的其它方法公开于例如美国专利号8,685,897和8,603,930以及美国公布号2014/0170705、2014/0094392、2012/0028301、2011/0183855和2009/0075378，其中的每一个都以引用的方式并入本文中。
文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术来完成。例如，单结构域抗体可以固定在固体载体、柱、针或纤维素/聚(偏二氟乙烯)膜/其它过滤器上，在附着在吸附板上或用于细胞分选的宿主细胞上表达，或与生物素缀合，以用链霉亲和素包被的珠粒捕捉，或用于任何其它淘选展示文库的方法中。
有关体外亲和力成熟方法的评论，参见例如Hoogenboom，Nature Biotechnology23:1105-16(2005)；Quiroz和Sinclair，Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51(2010)；以及其中的参考文献。
5.2.5.单结构域抗体的修饰
单结构域抗体的共价修饰包括在本公开的范围内。共价修饰包括使单结构域抗体的目标氨基酸残基与能够与单结构域抗体的选定侧链或N端或C端残基反应的有机衍生剂反应。其它修饰包括谷氨酰胺和天冬酰胺残基分别脱酰胺成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基甲基化(参见例如Creighton，Proteins:Structure和Molecular Properties 79-86(1983))；N端胺的乙酰化；以及任何C端羧基的酰胺化。
包括在本公开范围内的单结构域抗体的其它类型的共价修饰包括如上所述改变抗体或多肽的天然糖基化模式(参见例如Beck等人，Curr.Pharm.Biotechnol.9:482-501(2008)；以及Walsh，Drug Discov.Today 15:773-80(2010))，并以例如美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述的方式将抗体连接到多种非蛋白质聚合物中的一种，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。本公开的结合于Claudin18.2的单结构域抗体也可以与一个或多个免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc)进行基因融合或缀合以延长半衰期和/或赋予已知的Fc介导的效应功能。
还可以修饰本公开的结合于Claudin18.2的单结构域抗体以形成嵌合分子，该嵌合分子包含与另一个异源多肽或氨基酸序列，如表位标签(参见例如Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-33(2003))或IgG分子的Fc区(参见例如Aruffo，Antibody Fusion Proteins 221-42(Chamow和Ashkenazi编辑，1999))融合的结合于Claudin18.2的单结构域抗体。结合于Claudin18.2的单结构域抗体也可用于产生结合Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)，如下文更详细地描述。
本文还提供了包含本公开的结合于Claudin18.2的单结构域抗体和异源多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，与抗体进行基因融合或化学缀合的异源多肽可用于使抗体靶向具有细胞表面表达的Claudin18.2的细胞。
本文还提供了结合于Claudin18.2抗原的抗体组。在具体实施方案中，抗体组对Claudin18.2抗原具有不同的缔合速率、不同的解离速率、不同的亲和力，和/或对Claudin18.2抗原的不同特异性。在一些实施方案中，这些组包含约10种至约1000种或更多种抗体或由其组成。抗体组可用于例如96孔或384孔板中，用于ELISA等测定。
5.2.6.单结构域抗体的制备
已经描述了制备单结构域抗体的方法。参见例如Els Pardon等人，NatureProtocol，9(3):674(2014)。可以使用本领域已知的方法获得单结构域抗体(例如VHH)，例如通过对骆驼科动物(例如骆驼或美洲驼)进行免疫接种并从中获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆单结构域抗体文库，随后通过ELISA利用未选择文库的单个克隆或通过使用噬菌体展示进行选择。
本文提供的单结构域抗体可以通过培养用含有编码单结构域抗体的核酸的载体转化或转染的细胞来产生。可使用标准重组技术获得编码本公开抗体的多肽组分的多核苷酸序列。可以从产生抗体的细胞，如杂交瘤细胞或B细胞中分离所需的多核苷酸序列并进行测序。或者，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，将编码多肽的序列插入到能够在宿主细胞中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可用和已知的许多载体可用于达成本公开的目的。适当载体的选择将主要取决于要插入载体中的核酸的大小以及要用该载体转化的特定宿主细胞。适合表达本公开的抗体的宿主细胞包括原核生物，例如古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物；真核微生物，例如丝状真菌或酵母；无脊椎动物细胞，例如昆虫或植物细胞；和脊椎动物细胞，例如哺乳动物宿主细胞系。将宿主细胞用上述表达载体转化并在常规营养培养基中进行培养，根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的需要进行修改。使用如本领域已知的标准蛋白质纯化方法纯化宿主细胞产生的抗体。使用如本领域已知的标准蛋白质纯化方法纯化宿主细胞产生的抗体。
以下中进一步描述了包括载体构建、表达和纯化在内的抗体产生方法：Plückthun等人，Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli:From PCR to fermentation 203-52(McCafferty等人编辑，1996)；Kwong和Rader，E.coliExpression and Purification of Fab Antibody Fragments，Current Protocols in Protein Science(2009)；Tachibana和Takekoshi，Production of Antibody FabFragments in Escherichia coli，Antibody Expression and Production(Al-Rubeai编辑，2011)；以及Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑，2009)。
当然，预期可以采用本领域众所周知的替代方法来制备抗Claudin18.2单结构域抗体。例如，可以通过使用固相技术进行直接肽合成来产生适当的氨基酸序列或其部分(参见例如，Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis(1969)；以及Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149-54(1963))。可以使用手动技术或通过自动化进行体外蛋白质合成。可以分开化学合成抗Claudin18.2抗体的各个部分并使用化学或酶促方法组合以产生所需的抗Claudin18.2抗体。或者，如例如美国专利号5,545,807和5,827,690中所公开，可从被工程化成表达抗体的转基因动物的细胞或体液，例如乳汁中纯化抗体。
具体地说，本文提供的单结构域抗体或其它Claudin18.2结合剂可以通过以下来产生：对美洲驼进行免疫接种，进行单B细胞分选，进行V基因提取，克隆Claudin18.2结合剂(例如VHH-Fc融合物)，然后进行小规模表达和纯化。可以对结合于Claudin18.2的单结构域抗体和其它分子进行额外筛选，包括选择ELISA阳性、BLI阳性和KD小于100nM中的一项或多项。如下文第6节所述，这些选择标准可以组合。此外，可以测定各个VHH结合剂(和其它结合于Claudin18.2的分子)与表达Claudin18.2的细胞结合的能力。可以使用FACS分析并测量荧光标记的VHH分子的平均荧光强度(MFI)，对表达Claudin18.2的细胞进行这类测定。上面提到的多个方面将在下面更详细地描述。
多克隆抗体
多克隆抗体通常通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生。使用双官能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1独立地为低级烷基)，将相关抗原与在要免疫接种的物种中具有免疫原性的蛋白质缀合，该蛋白质例如钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。可以采用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂(Freund'scomplete adjuvant)和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成海藻糖二克利霉菌酸酯(synthetic trehalose dicorynomycolate))。免疫接种方案可由本领域技术人员在不进行过度实验下来选择。
举例来说，通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合并在多个部位皮内注射溶液，使动物针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫。一个月后，这些动物通过在多个部位皮下注射含1/5至1/10原始量的肽或缀合物的弗氏完全佐剂进行加打。七至十四天后，对动物取血并测定血清的抗体滴度。对动物加打直到滴度平台期。缀合物也可以在重组细胞培养物中制成蛋白质融合物。此外，例如明矾的聚集剂也适用于增强免疫反应。
单克隆抗体
单克隆抗体是从基本上同质的抗体群体中获得的，例如，除了可少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如异构化或酰胺化)之外，构成该群体的个体抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征为不是离散抗体的混合物。
举例来说，单克隆抗体可以通过由Kohler等人，Nature，256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。
在杂交瘤方法中，对适当的宿主动物进行免疫接种以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫接种的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外免疫接种。然后使用合适的融合剂，如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页(AcademicPress，1986)。
免疫剂通常包括抗原蛋白或其融合变体。Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，Academic Press(1986)，第59-103页。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞。将由此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。优选的永生化骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持所选的产生抗体的细胞稳定地高水平产生抗体并且对培养基如HAT培养基敏感的细胞。
分析杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对所需抗原的单克隆抗体。这样的技术和测定是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson等人，Anal.Biochem.，107:220(1980)的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来确定。
在鉴定出产生所需特异性、亲和力和/或亲合力的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序将克隆进行亚克隆并通过标准方法(Goding，同上)生长。用于达成此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内生长成肿瘤。
由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法从培养基、腹水或血清中适当地分离。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法例如美国专利号4,816,567中描述以及如上所述的那些重组方法制备。编码单克隆抗体的DNA容易分离并使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合于编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行测序。杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离，即可将DNA放入表达载体中，然后转染到宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞或不另外生成免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在这类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的评论文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5:256-262(1993)和Pliickthun，Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，抗体可以从使用以下中所述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离：McCafferty等人，Nature，348:552-554(1990)；Clackson等人，Nature，352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)。随后的公布描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人，Bio/Technology，10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nucl.AcidsRes.，21:2265-2266(1993))。因此，这些技术为用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术提供了可行的替代方案。
DNA也可以通过以下进行修饰：取代编码序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81:6851(1984))；或将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到编码序列。这种非免疫球蛋白多肽可以被取代以产生嵌合二价抗体，该抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
嵌合或杂交抗体也可以在体外使用合成蛋白质化学中的已知方法制备，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于达成此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺酸酯。
原核细胞中的重组产生
可以使用标准重组技术获得编码本公开的抗体的多核酸序列。可以从产生抗体的细胞，如杂交瘤细胞中分离所需的多核酸序列并进行测序。或者，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，将编码多肽的序列插入到能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可用和已知的许多载体可用于达成本公开的目的。适当载体的选择将主要取决于要插入载体中的核酸的大小以及要用该载体转化的特定宿主细胞。每个载体含有各种组分，这取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或两者兼有)和其与其所在的特定宿主细胞的相容性。载体组分通常包括但不限于复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。
通常，源自与宿主细胞相容的物种的含有复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。该载体通常携带一个复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常使用pBR322转化，pBR322是一种源自大肠杆菌物种的质粒。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详细地描述于Carter等人，美国专利号5,648,237中。
此外，与宿主微生物相容的含有复制子和控制序列的噬菌体载体可以结合这些宿主用作转化载体。例如，噬菌体如GEMTM-11可用于制备重组载体，该载体可用于转化易感宿主细胞如大肠杆菌LE392。
本申请的表达载体可以包含两个或更多个启动子-顺反子对，编码每个多肽组分。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5')的非翻译调节序列。原核启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的变化，例如营养物的存在或不存在或温度变化，启动在其控制下的顺反子转录水平增加的启动子。
被多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。选择的启动子可以通过经由限制酶消化从源DNA中去除启动子并将分离的启动子序列插入本申请的载体中而与编码本发明抗体的顺反子DNA可操作地连接。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许表达的靶基因更大的转录和更高的产量。
适于与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子，例如tac或trc启动子。然而，在细菌中起作用的其它启动子(例如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核酸序列已经公开，从而使技术人员能够使用接头或衔接体将它们可操作地连接到编码靶肽的顺反子上(Siebenlist等人Cell 20:269(1980))以提供任何所需的限制性位点。
一方面，重组载体内的每个顺反子包含指导表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列组分。通常，信号序列可以是载体的组分，或者它可以是插入载体中的靶多肽DNA的一部分。出于本发明的目的所选择的信号序列应该是由宿主细胞识别并加工(即，被信号肽酶裂解)的序列。对于不能识别和加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，可以用选自例如由以下组成的组的原核信号序列取代所述信号序列：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。
在一些实施方案中，根据本公开的抗体的产生可以发生在宿主细胞的细胞质中，因此不需要每个顺反子内都存在分泌信号序列。某些宿主菌株(例如，大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许表达的蛋白质亚基进行正确的折叠和组装。
适合表达本公开的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、杆菌(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如绿脓杆菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、志贺氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一些实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞用作宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington，D.C.:American Society for Microbiology，1987)，第1190-1219页；ATCC寄存编号27,325)和其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8AompT A(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其它菌株和其衍生物，例如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些实例是示例性的而非限制性的。用于构建具有确定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法是本领域已知的并且描述于例如Bass等人，Proteins，8:309-314(1990)。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，通常需要选择合适的细菌。例如，当使用众所周知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌物种可以适合用作宿主。
通常，宿主细胞应该分泌最少量的蛋白水解酶，并且可以在细胞培养物中根据需要加入额外的蛋白酶抑制剂。
将宿主细胞用上述表达载体转化并在常规营养培养基中进行培养，根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的需要进行修改。转化意指将DNA引入原核宿主中，使DNA可作为染色体外元件或通过染色体的组成部分进行复制。取决于所使用的宿主细胞，使用适合这类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本申请的抗体的原核细胞在本领域已知并且适合于培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适培养基的实例包括luria肉汤(LB)加上必要的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还含有基于表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。举例来说，将氨苄西林(ampicillin)添加到培养基中以使表达氨苄西林抗性基因的细胞生长。
除了碳、氮和无机磷酸盐源之外的任何必要的补充剂也可以以适当的浓度单独引入，或作为与另一种补充剂或介质，如复合氮源的混合物引入。任选地，培养基可以含有一种或多种选自由以下组成的组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代乙醇酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。原核宿主细胞在合适的温度和pH下培养。
如果在本申请的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合于该启动子活化的条件下诱导蛋白质表达。在本申请的一个方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，转化的宿主细胞在用于诱导的磷酸盐限制培养基中培养。优选地，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等人，J.Immunol.Methods 263:133-147(2002))。如本领域已知的，根据所采用的载体构建体，可以使用多种其它诱导剂。
本公开的表达的抗体被分泌到宿主细胞的周质中并从周质中回收。蛋白质回收通常涉及一般通过诸如渗透压休克、超声处理或溶解等方式来破坏微生物。一旦细胞被破坏，就可以通过离心或过滤去除细胞碎片或整个细胞。蛋白质可以例如通过亲和树脂色谱法进一步纯化。或者，可以将蛋白质转运到培养基中并在其中分离。可以从培养物中去除细胞，并过滤和浓缩培养物上清液以进一步纯化所产生的蛋白质。表达的多肽可以使用如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹(Western blot)测定法等众所周知的方法进一步分离和鉴定。
或者，通过发酵过程大量产生蛋白质。各种大规模的补料分批发酵程序可用于产生重组蛋白。为了提高本公开的抗体的产量和质量，可以修改各种发酵条件。例如，已证明伴侣蛋白有助于细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的正确折叠和溶解。Chen等人J BioChem274:19601-19605(1999)；美国专利号6,083,715；美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun，J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000)；Ramm和Pluckthun，J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000)；Arie等人，Mol.Microbiol.39:199-210(2001)。
为了最大程度地减少表达的异源蛋白质(尤其是那些对蛋白水解敏感的)的蛋白水解，某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株可用于本发明，如例如以下中所述：美国专利号5,264,365；美国专利号5,508,192；Hara等人，Microbial Drug Resistance，2:63-72(1996)。缺乏蛋白水解酶并用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株可用作编码本申请的抗体的表达系统中的宿主细胞。
本文产生的抗体可以进一步纯化以获得基本上均质的制剂，用于进一步的测定和用途。可以采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适纯化程序的示例：在免疫亲和或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶上或阳离子交换树脂如DEAE上的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和例如使用Sephadex G-75的凝胶过滤。在一些实施方案中，例如固定在固相上的蛋白A可以用于本公开的结合分子的免疫亲和纯化。固定蛋白A的固相优选是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选是可控孔玻璃柱或硅酸柱。在一些实施方案中，柱已经涂有试剂，例如甘油，以试图防止污染物的非特异性粘附。然后洗涤固相以去除与固相非特异性结合的污染物。最后，通过洗脱从固相中回收感兴趣的抗体。
真核细胞中的重组产生
对于真核表达，载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
用于真核宿主的载体也可以是编码信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N端具有特定裂解位点的其它多肽的插入物。所选异源信号序列优选为由宿主细胞识别并加工(即，被信号肽酶裂解)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。将这类前体区域的DNA与编码本申请的抗体的DNA在阅读框架内连接。
通常，对于哺乳动物表达载体来说并不需要复制起点组分(通常仅使用SV40起点，因为其包含早期启动子)。
表达和克隆载体可含有选择基因，也称为可选择标记。选择基因可编码如下蛋白质，该蛋白质赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤(methotrexate)或四环素的抗性；弥补营养缺陷；或提供从复合培养基中无法获得的关键营养物质。
选择方案的一个实例利用药物来抑制宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生赋予抗药性的蛋白质，并因此经受住选择方案。这种显性选择的实例利用药物新霉素、麦考酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
适用于哺乳动物细胞的可选择标记的另一个实例是那些能够鉴定有能力吸收编码本申请的抗体的核酸的细胞的标记。例如，首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有的转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，示例性的适当宿主细胞为缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。或者，可通过在含有针对可选择标记的选择剂(例如氨基糖苷类抗生素)的培养基中使细胞生长来选择用多肽的DNA编码序列、野生型DHFR蛋白和另一种可选择标记(例如氨基糖苷3'-磷酸转移酶，APH)转化或共转化的宿主细胞(尤其是含有内源DHFR的野生型宿主)。
表达和克隆载体通常含有被宿主生物体识别并且可操作地连接于编码所需多肽序列的核酸的启动子。真核基因具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。可包括在许多基因的转录起始位点上游70至80个碱基处发现的另一个序列。大部分真核基因的3'末端可能是用于在编码序列的3'末端添加多聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列均可插入真核表达载体中。
可例如通过启动子对哺乳动物宿主细胞中多肽自载体的转录进行控制，条件是这类启动子与宿主细胞系统相容，所述启动子可获自病毒基因组，如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；热休克启动子。
通常通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核细胞对编码本公开抗体的DNA的转录。现已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。实例包括位于复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件，还可参见Yaniv，Nature 297:17-18(1982)。增强子可剪接入载体中多肽编码序列的5'位或3'位，但是优选位于启动子5'位点处。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还含有对终止转录和稳定mRNA来说所必需的序列。这类序列通常可得自真核或病毒DNA或cDNA的5'(有时为3')非翻译区。这些区含有被转录为编码多肽的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分为牛生长激素多腺苷酸化区。
适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已成为一种常规方法。有用哺乳动物宿主细胞系的实例为由SV 40转化的猴肾CV1细胞(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(293细胞或进行亚克隆以在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HepG2)。
可以将宿主细胞用上述用于产生抗体的表达或克隆载体转化并在常规营养培养基中进行培养，根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的需要进行修改。
用于产生本申请的抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基，例如Ham的F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)以及达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。此外，以下中描述的任何培养基都可用作宿主细胞的培养基：Ham等人，Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。这些培养基中的任何一种可根据需要补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或同等的能量源。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员来说将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生或直接分泌到培养基中。如果抗体是在细胞内产生的，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片，宿主细胞或溶解的片段。当抗体分泌到培养基中时，来自这种表达系统的上清液通常首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置进行浓缩。可以在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
从细胞制备的蛋白质组合物可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法进行纯化，亲和色谱法是优选的纯化技术。亲和配体所连接的基质通常是琼脂糖，但也可以使用其它基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质(如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯苯))可实现更快的流速和更短的处理时间。还可以使用其它蛋白质纯化技术，例如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、肝素SEPHAROSETM上的色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀，取决于要回收的抗体。在任何初步纯化步骤之后，可以对包含感兴趣的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱法。
5.2.7.包含单结构域抗体的结合分子
在另一个方面，本文提供了包含本文提供的单结构域抗体(例如，针对Claudin18.2的VHH结构域)的结合分子。除了下文第5.3节所述的本文提供的嵌合抗原受体(CAR)之外，在一些实施方案中，本文提供的针对Claudin18.2的单结构域抗体是其它结合分子的一部分。本文描述了本公开的示例性结合分子。
融合蛋白
在各种实施方案中，本文提供的单结构域抗体可以与另一种剂，例如基于蛋白质的实体进行基因融合或化学缀合。单结构域抗体可以与该剂化学缀合，或以其它方式与该剂非共价缀合。该剂可以是肽或抗体(或其片段)。
因此，在一些实施方案中，本文提供了与异源蛋白质或多肽(或其片段，例如，与约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个或约500个氨基酸或超过500个氨基酸的多肽)重组融合或化学缀合(共价或非共价缀合)的单结构域抗体(例如，VHH结构域)，以及其用途。特别地，本文提供了包含本文提供的单结构域抗体的抗原结合片段(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白。
此外，本文提供的抗体可以与标记或“标签”序列，例如肽融合，以促进纯化。在具体实施方案中，标记或标签氨基酸序列是六组氨酸肽、血凝素(“HA”)标签和“FLAG”标签。
用于将部分(包括多肽)与抗体融合或缀合的方法是已知的(参见例如Arnon等人，Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56(Reisfeld等人编辑，1985)；Hellstrom等人，Antibodies for Drug Delivery，Controlled Drug Delivery 623-53(Robinson等人编辑，第2版1987)；Thorpe，Antibody Carriers of Cytotoxic Agents inCancer Therapy:A Review，Monoclonal Antibodies:Biological and ClinicalApplications 475-506(Pinchera等人编辑，1985)；Analysis，Results，and FutureProspective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy，Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16(Baldwin等人编辑，1985)；Thorpe等人，Immunol.Rev.62:119-58(1982)；美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,723,125、5,783,181、5,908,626、5,844,095和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公布WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:10535-39(1991)；Traunecker等人，Nature，331:84-86(1988)；Zheng等人，J.Immunol.154:5590-600(1995)；以及Vil等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-41(1992))。
例如，可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)来产生融合蛋白。DNA改组可用于改变如本文提供的单结构域抗体的活性，包括例如具有较高亲和力和较低解离速率的抗体(参见例如美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人，Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33(1997)；Harayama，Trends Biotechnol.16(2):76-82(1998)；Hansson等人，J.Mol.Biol.287:265-76(1999)；以及Lorenzo和Blasco，Biotechniques 24(2):308-13(1998))。抗体或编码的抗体可通过在重组前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变而改变。编码本文提供的抗体的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、节段、部分、结构域、片段等重组。
在一些实施方案中，本文提供的单结构域抗体(例如，VHH结构域)与第二抗体缀合以形成抗体杂缀合物。
在各种实施方案中，单结构域抗体与剂进行基因融合。基因融合可以通过在单结构域抗体与剂之间放置接头(例如，多肽)来实现。接头可以是柔性接头。
在各种实施方案中，单结构域抗体与治疗分子进行基因缀合，利用铰链区将单结构域抗体与治疗分子连接。
本文还提供了制备本文提供的各种融合蛋白的方法。上文第5.2.6节中描述的各种方法也可用于制备本文提供的融合蛋白。
在一个具体实施方案中，本文提供的融合蛋白是重组表达的。本文提供的融合蛋白的重组表达可能需要构建含有编码该蛋白质或其片段的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码本文提供的蛋白质或其片段的多核苷酸，即可使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术产生用于产生该分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员众所周知的方法构建含有编码序列和适当转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供了可复制载体，其包含编码本文提供的融合蛋白或其片段或CDR的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接于启动子。
可以通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本文提供的融合蛋白。因此，本文还提供了含有编码本文提供的融合蛋白或其片段的多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸可操作地连接于异源启动子。
多种宿主表达载体系统可用于表达本文提供的融合蛋白。这样的宿主表达系统不仅代表了可以产生和随后纯化感兴趣的编码序列的媒介物，而且还代表了当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以当场表达本文提供的融合蛋白的细胞。这些表达系统包括但不限于微生物，例如用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)感染或用含有编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0和3T3细胞)，该重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。细菌细胞如大肠杆菌或真核细胞，特别是用于表达完整的重组抗体分子的这些细胞，可用于表达重组融合蛋白。举例来说，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的哺乳动物细胞与如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的载体结合是抗体或其变体的有效表达系统。在一个具体实施方案中，编码本文提供的融合蛋白的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节。
在细菌系统中，根据所表达的融合蛋白的预期用途，可以有利地选择多种表达载体。例如，当要生产大量这样的融合蛋白以产生融合蛋白的药物组合物时，可能需要指导容易纯化的高水平融合蛋白产物表达的载体。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO 12:1791(1983))，其中编码序列可以单独连接到载体中，与lacZ编码区同框，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985)；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))等等。pGEX载体也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。一般来说，这类融合蛋白是可溶的并且可以通过吸附和结合基质谷胱甘肽琼脂糖珠，然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从溶解细胞中纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，以便克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，感兴趣的编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入到腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区域(例如，El或E3区域)中插入将产生一种重组病毒，该病毒是活的并且能够在受感染的宿主中表达融合蛋白(例如参见Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355-359(1984))。插入的编码序列的有效翻译还可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，包括天然的和合成的。可以通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高表达效率(参见例如Bittner等人，Methods in Enzymol.153:51-544(1987))。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞品系。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)可能对蛋白质的功能很重要。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物进行翻译后加工和修饰的特征和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保正确地修饰和加工所表达的外源蛋白质。为此，可以使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和基因产物磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。
为长期高产量地生产重组蛋白，可以利用稳定表达。举例来说，可以将稳定表达融合蛋白的细胞系工程化。宿主细胞可以用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标记来转化，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外源DNA后，工程化细胞可以在富集培养基中生长1-2天，然后切换到选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长形成焦点，进而可以克隆并扩大到细胞系。这一方法可以有利地用于将表达融合蛋白的细胞系工程化。这类工程化细胞系在筛选和评估与结合分子直接或间接相互作用的组合物方面可能特别有用。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11:223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，Cell 22:8-17(1980))基因，可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，它赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980)；O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981))；gpt，它赋予麦考酚酸抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981))；neo，它赋予氨基糖苷G-418抗性(Wu和Wu，Biotherapy 3:87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan，Science 260:926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)；May，TIB TECH 11(5):l55-2 15(1993))；以及hygro，它赋予潮霉素抗性(Santerre等人，Gene 30:147(1984))。重组DNA技术领域中通常已知的方法可以常规用于选择所需的重组克隆，并且这类方法在例如以下中有所描述：Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer和Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；以及第12和13章，Dracopoli等人(编辑)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150:1(1981)，全部内容以引用的方式并入本文中。
融合蛋白的表达水平可以通过载体扩增来提高(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，NewYork，1987))。当表达融合蛋白的载体系统中的标记可扩增时，增加宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平将增加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与融合蛋白基因相关，因此融合蛋白的产量也会增加(Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
宿主细胞可以与本文提供的多种表达载体共转染。载体可以含有相同的可选择标记，这些标记能够使相应的编码多肽同等地表达。或者，可以使用编码并能够表达多种多肽的单一载体。编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
一旦本文提供的融合蛋白已经通过重组表达产生，则它可以通过本领域已知的用于纯化多肽(例如免疫球蛋白分子)的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法(特别是蛋白A后对特定抗原的亲和力)、尺寸柱色谱法和Kappa选择亲和色谱法)、离心、差异溶解度或任何其它用于纯化蛋白质的标准技术。此外，本文提供的融合蛋白分子可以与本文所述或本领域另外已知的异源多肽序列融合以促进纯化。
免疫缀合物
在一些实施方案中，本公开还提供了免疫缀合物，其包含与一种或多种细胞毒性剂缀合的本文所述的任何抗体(例如抗Claudin18.2单结构域抗体)，所述细胞毒性剂例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或它们的片段)或放射性同位素。
在一些实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于美登素(maytansinoid)(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥瑞他汀(auristatin)，例如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；以及Lode等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环霉素(anthracycline)，例如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，例如多西他赛(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯(trichothecene)；以及CC1065。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌)、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记，例如再次碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双官能蛋白偶联剂制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(如己二酸二甲酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。举例来说，可以如Vitetta等人，Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见例如WO94/11026。
接头可以是促进缀合剂在细胞中释放的“可裂解接头”，但本文也考虑不可裂解接头。用于本公开缀合物的接头包括但不限于酸不稳定接头(例如腙接头)、含二硫键的接头、肽酶敏感接头(例如包含氨基酸的肽接头，如缬氨酸和/或瓜氨酸，例如瓜氨酸-缬氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸)、光不稳定接头、二甲基接头、硫醚接头或设计用于逃避转运蛋白介导的多药耐药性的亲水接头。
本文中的免疫缀合物或ADC考虑但不限于用交联试剂制备的这类缀合物，包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
在其它实施方案中，本文提供的抗体与例如诊断分子缀合或重组融合。这类诊断和检测可以例如通过将抗体与可检测物质偶联来完成，这些可检测物质包括但不限于各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素或亲和素/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、荧光素或水母发光蛋白；化学发光材料，例如225Acγ发射、Auger发射、β发射、α发射或正电子发射放射性同位素。
5.3.嵌合抗原受体
本申请的一个方面提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域，该细胞外抗原结合结构域包含本文所述的Claudin18.2结合部分，例如sdAb或其抗原结合片段(例如，VHH结构域)。上述任何一种抗Claudin18.2 sdAb或抗原结合片段均可用于本文所述的CAR。举例说明了包含本发明VHH结构域的示例性CAR(即，基于VHH的CAR)，并且如下文第6节所述证明了它们的优良作用。
CAR包含：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含抗Claudin18.2sdAb或其抗原结合片段；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗Claudin18.2sdAb可以是骆驼科、嵌合或人源化的。在一些实施方案中，CAR包含一种或多种抗Claudin18.2sdAb或其抗原结合片段。下面更详细地描述每种组分和额外区域。
5.3.1.细胞外抗原结合结构域
本文所述的CAR的细胞外抗原结合结构域包含一种或多种(例如1种、2种、3种、4种、5种、6种或更多种中的任一种)单结构域抗体。单结构域抗体可以直接经由肽键或经由肽接头彼此融合。
单结构域抗体
本公开的CAR包括包含一种或多种单结构域抗体的细胞外抗原结合结构域。sdAb可以具有相同或不同的来源，并且具有相同或不同的大小。示例性sdAb包括但不限于来自仅有重链的抗体的重链可变结构域(例如，VHH或VNAR)、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4链抗体的单结构域(例如VH或VL)、人源化的仅有重链的抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单结构域抗体，以及工程化结构域和除源自抗体的那些外的单结构域支架。本领域已知的或由本公开开发的任何sdAb，包括在本公开中上文所述的单结构域抗体在内，可用于构建本文所述的CAR。sdAb可源自任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼羊、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文考虑的单结构域抗体还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一些实施方案中，sdAb源自天然存在的单结构域抗原结合分子，其称为无轻链的重链抗体(本文也称为“仅有重链的抗体”)。例如，这类单结构域分子公开于WO 94/04678和Hamers-Casterman，C.等人Nature 363:446-448(1993)中。为清楚起见，源自天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中称为VHH以区别于四链免疫球蛋白的常规VH。这种VHH分子可以源自在骆驼科物种如骆驼、美洲驼羊、骆马、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。骆驼科以外的其它物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子，并且这种VHH在本公开的范围内。此外，还考虑VHH的人源化型式以及其它修饰和变体并在本公开的范围内。
来自骆驼科动物的VHH分子比IgG分子小约10倍。它们是单一多肽，并且可以是非常稳定的，可以抵抗极端的pH值和温度条件。此外，它们可以抵抗蛋白酶的作用，而常规4链抗体则不然。此外，体外表达VHH产生高产量、正确折叠的功能性VHH。另外，在骆驼科动物中产生的抗体可以识别除由通过使用抗体文库或通过免疫接种除骆驼科动物外的哺乳动物体外产生的抗体所识别的那些表位外的表位(参见例如WO9749805)。因此，包含一个或多个VHH结构域的多特异性或多价CAR可以比包含源自常规4链抗体的抗原结合片段的多特异性或多价CAR更高效地与靶标相互作用。由于已知VHH结合到“不寻常的”表位(例如腔或沟)中，因此包含这种VHH的CAR的亲和力可能比常规多特异性多肽更加适合用于治疗性治疗。
在一些实施方案中，sdAb源自软骨鱼中发现的免疫球蛋白的可变区。例如，sdAb可源自鲨鱼血清中发现的称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源自NAR(“IgNAR”)的可变区的单结构域分子的方法描述于WO 03/014161和Streltsov，ProteinSci.14:2901-2909(2005)中。
在一些实施方案中，sdAb是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)。在一些实施方案中，框架区的氨基酸序列可以通过框架区中特定氨基酸残基的“骆驼化”而改变。骆驼化是指来自常规4链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被存在于重链抗体的VHH结构域中的一个或多个相应位置处的一个或多个氨基酸残基替换或取代。这可以以本领域已知的方式进行，所述方式对于技术人员来说是清楚的。这类“骆驼化”取代优选被插入在形成VH-VL界面和/或存在于所述界面的氨基酸位置，和/或在所谓的骆驼科标志残基处，如本文所定义(参见例如WO 94/04678；Davies和Riechmann FEBS Letters 339:285-290(1994)；Davies和Riechmann，Protein Engineering 9(6):531-537(1996)；Riechmann，J.Mol.Biol.259:957-969(1996)；以及Riechmann和Muyldermans，J.Immunol.Meth.231:25-38(1999))。
在一些实施方案中，sdAb是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单结构域抗体。参见例如US20090307787、美国专利号8,754,287、US20150289489、US20100122358和WO2004049794。在一些实施方案中，sdAb是亲和力成熟的。
在一些实施方案中，天然存在的针对特定抗原或靶标的VHH结构域可以从骆驼科动物VHH序列的(原初或免疫)文库中获得。这类方法可以涉及或可以不涉及使用所述抗原或靶标、或其至少一部分、片段、抗原决定簇或表位，使用一种或多种本领域已知的筛选技术来筛选这样的文库。这类文库和技术例如描述于WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中。或者，可以使用源自(原初或免疫)VHH文库的改进的合成或半合成文库，例如通过例如WO 00/43507中描述的技术例如随机诱变和/或CDR改组从(原初或免疫)VHH文库获得的VHH文库。
在一些实施方案中，单结构域抗体由常规四链抗体产生。参见例如EP 0 368 684；Ward等人，Nature，341(6242):544-6(1989)；Holt等人，Trends Biotechnol.，21(11):484-490(2003)；WO 06/030220；以及WO 06/003388。
在一些实施方案中，本文提供的细胞外抗原结合结构域包含至少一个结合结构域，并且该至少一个结合结构域包含结合如本文提供的结合于Claudin18.2的单结构域抗体，例如上文第5.2节中所述的抗Claudin18.2单结构域抗体。
在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含抗Claudin18.2 sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中该抗Claudin18.2sdAb是如上文第5.2节中所述的抗Claudin18.2 sdAb，包括例如表2中的VHH结构域和具有表2中的那些VHH结构域任一者中的一个、两个或所有三个CDR的那些。在一些实施方案中，抗Claudin18.2sdAb是骆驼科、嵌合、人或人源化的。
在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含抗Claudin18.2 sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中该抗Claudin18.2sdAb包含SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:84或SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在其它实施方案中，本文提供了一种CAR，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含抗Claudin18.2 sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中该抗Claudin18.2sdAb包含与SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQID NO:51、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含两个或更多个抗原结合结构域。在这两个或更多个抗原结合结构域中，至少一个是如本文提供的结合于Claudin18.2的VHH。在一些实施方案中，一种或多种额外的结合结构域也是结合于Claudin18.2的VHH。在其它实施方案中，一种或多种额外的结合结构域结合于一种或多种额外的不同抗原，例如靶向一种或多种额外的不同抗原的1个、2个、3个、4个或更多个额外的单结构域抗体结合区(sdAb)。
在一些实施方案中，本文提供了一种多价(例如二价和三价)CAR，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含两个或更多个特异性结合于Claudin18.2的单结构域抗体(sdAb)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含两种本文提供的特异性结合于Claudin18.2的单结构域抗体(sdAb)。在其它实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含三种本文提供的特异性结合于Claudin18.2的单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，两个或更多个抗Claudin18.2sdAb选自上文第5.2节中所述的那些抗Claudin18.2 sdAb，包括例如表2中的VHH结构域和具有表2中的那些VHH结构域任一者中的一个、两个或所有三个CDR的那些。在一些实施方案中，抗Claudin18.2sdAb是骆驼科、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，两个或更多个抗Claudin18.2 sdAb各自独立地选自包含与SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的抗Claudin18.2 sdAb。
在其它实施方案中，本文提供了一种多特异性(例如双特异性和三特异性)CAR，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含特异性结合于Claudin18.2的第一单结构域抗体(sdAb)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR还包含特异性结合于第二抗原(例如第二肿瘤抗原)的第二单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，CAR还包含特异性结合于第二抗原(例如第二肿瘤抗原)的第二单结构域抗体(sdAb)；以及特异性结合于第三抗原(例如第三肿瘤抗原)的第三单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施方案中，本公开的CAR靶向的额外抗原是细胞表面分子。可以选择单结构域抗体来识别充当与特殊疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。肿瘤表达多种可作为免疫反应(尤其是T细胞介导的免疫反应)的靶抗原的蛋白质。CAR靶向的抗原可以是单个病变细胞上的抗原，或是在各自都会影响疾病的不同细胞上表达的抗原。CAR靶向的抗原可能直接或间接牵涉到疾病中。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其可引发免疫反应，尤其是T细胞介导的免疫反应。本公开的靶向抗原的选择将取决于待治疗的癌症的具体类型。示例性肿瘤抗原包括但不限于神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺素、PSMA、HER2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD19、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中，肿瘤抗原包含一种或多种与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达多种可作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子的组，例如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胚胎抗原，例如癌胚抗原(CEA)。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所独有的，不会出现在体内的其它细胞上。TAA不是肿瘤细胞所独有的，而是也在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以发生在使免疫系统能够对抗原作出反应的条件下。TAA可以是在胎儿发育过程中，当免疫系统不成熟且无法响应时在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是正常细胞上通常以极低水平存在但以高得多的水平在肿瘤细胞上表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，诸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，例如CEA；过表达的癌基因和突变的抑癌基因，例如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位引起的独特肿瘤抗原；例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，例如爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barrvirus)抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。
其它基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
除了本文提供的一种或多种抗原结合结构域外，本文提供的CAR还可包含以下一种或多种：接头(例如肽接头)、跨膜结构域、铰链区、信号肽、细胞内信号传导结构域、共刺激信号传导结构域，下文将更详细地描述其中的每一个。
在一些实施方案中，CAR在细胞外结构域的N端含有将新生受体引导至内质网的信号肽，且在细胞外抗原结合结构域的C端含有使受体更可用于结合的铰链肽。信号肽可源自选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽来源于CD8α。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域来源于CD8α。在一些实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。CAR的跨膜结构域可源自选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于CD8α或CD28。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。CAR的细胞内信号传导结构域可包含主要细胞内信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，CARs优选包含主要细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。主要细胞内信号传导结构域可以是含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)结构域。含ITAM结构域可以是具有例如SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CD3-ζ的胞质结构域，其磷酸化导致T细胞活化。共刺激信号传导结构域可来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体和它们的组合。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域包含CD28的胞质结构域和/或CD137的胞质结构域。CD28的胞质结构域和CD137的胞质结构域分别包含SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种Claudin18.2CAR，其从N端到C端依次包含：SEQ ID NO:67的信号肽、选自由SEQ ID NO:38-51和77-85组成的组的上文针对抗Claudin18.2 VHH所述的VHH结构域、SEQ NO:68的铰链结构域、SEQ ID NO:69的跨膜结构域、SEQ ID NO:70的CD137胞质结构域和SEQ ID NO:72的CD3-ζ’s胞质结构域。在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR是单特异性的。在其它实施方案中，Claudin18.2 CAR是多特异性的。在一些实施方案中，Claudin18.2 CAR是单价的。在其它实施方案中，Claudin18.2 CAR是多价的。
肽接头
本文所述的多特异性或多价CAR中的各种单结构域抗体可以经由肽接头彼此融合。在一些实施方案中，单结构域抗体直接彼此融合而没有任何肽接头。连接不同单结构域抗体(例如，VHH)的肽接头可以相同或不同。CAR的不同结构域也可以经由肽接头相互融合。
CAR中的每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列，取决于单结构域抗体和/或各个结构域的结构和/或功能特征。可以独立地选择并优化每个肽接头。CAR中使用的肽接头的长度、弹性程度和/或其它特性可能对包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力在内的特性有一些影响。举例来说，可以选择较长的肽接头以确保两个相邻结构域不会在空间上相互干扰。在一些实施方案中，短肽接头可以布置在跨膜结构域与CAR的细胞内信号传导结构域之间。在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域可以相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。
肽接头可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个或更多氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约100个、75个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或更少氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸或约1个氨基酸至约100个氨基酸中的任一者。
肽接头可以具有天然存在的序列，或非天然存在的序列。例如，源自仅有重链的抗体的铰链区的序列可用作接头。参见例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是至少为一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性接头。示例性肽接头列于下表4中。在一个具体实施方案中，连接两个或更多个本文提供的抗Claudin18.2 VHH结构域的肽接头是(GGGGS)n(SEQ ID NO:98)，其中n任选地为1、2、3、4、5或6。
表4.示例性肽接头
Figure BDA0003709776140001281
Figure BDA0003709776140001291
例如，如以下中所述的本领域已知的其它接头也可以包括在本文提供的CAR中：WO2016014789、WO2015158671、WO2016102965、US20150299317、WO2018067992、US7741465；Colcher等人，J.Nat.Cancer Inst.82:1191-1197(1990)；和Bird等人，Science 242:423-426(1988)，每个的公开内容以引用的方式并入本文中。
5.3.2.跨膜结构域
本公开的CAR包含可以直接或间接与细胞外抗原结合结构域融合的跨膜结构域。跨膜结构域可源自天然来源或合成来源。如本文中所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜，优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。适用于本文所述的CAR的跨膜结构域可以从天然存在的蛋白质中获得。或者，它可以是合成的非天然存在的蛋白质区段，例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。
跨膜结构域根据跨膜结构域的三维结构进行分类。举例来说，跨膜结构域可形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β-桶状结构或能够跨越细胞磷脂质双层的任何其它稳定结构。此外，跨膜结构域还可以或可替代地根据跨膜结构域拓扑学(包括跨膜结构域穿过膜的次数和蛋白质的取向)进行分类。举例来说，单次穿膜蛋白穿过细胞膜一次，多次穿膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次)。膜蛋白可以被定义为I型、II型或III型，这取决于它们的末端和一个或多个穿膜区段相对于细胞内部和外部的拓扑学。I型膜蛋白具有单个跨膜区，并且其取向使得蛋白质的N端存在于细胞脂质双层的胞外侧上，而蛋白质的C端存在于胞质侧上。II型膜蛋白也具有单个跨膜区，但其取向使得蛋白质的C端存在于细胞脂质双层的胞外侧上，而蛋白质的N端存在于胞质侧上。III型膜蛋白具有多个跨膜区，并且可根据跨膜区段的数量以及N端和C端的位置进一步细分。
在一些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域源自I型单次穿膜蛋白。在一些实施方案中，来自多次穿膜蛋白的跨膜结构域也适用于本文所述的CAR。多次穿膜蛋白可包含复杂(至少2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个)α螺旋或β折叠结构。在一些实施方案中，多次穿膜蛋白的N端和C端存在于脂质双层的相对侧上，例如，蛋白质的N端存在于脂质双层的胞质侧上，蛋白质的C端存在于胞外侧上。
在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含选自以下跨膜结构域的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。在一些实施方案中，跨膜结构域源自选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。
在一些具体实施方案中，跨膜结构域源自CD8α。在一些实施方案中，跨膜结构域是包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CD8α的跨膜结构域。
用于本文所述的CAR中的跨膜结构域还可以包含合成的非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施方案中，蛋白质区段是至少约20个氨基酸，例如至少18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸。合成跨膜结构域的实例是本领域中，例如美国专利No.7,052,906和PCT公布号WO 2000/032776中已知的，所述美国专利和PCT公布的相关公开内容以引用的方式并入本文中。
本文提供的跨膜结构域可包含跨膜区和位于跨膜结构域C端侧的胞质区。跨膜结构域的胞质区可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施方案中，有助于跨膜结构域在脂质双层中进行定向。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的胞质区。在一些实施方案中，跨膜结构域的胞质区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的胞质区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，本文提供的CAR的跨膜结构域包含人造疏水性序列。例如，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可以存在于跨膜结构域的C端。在一些实施方案中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区是疏水性的。在一些实施方案中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白质或蛋白质区段的亲水性或疏水性或亲水性特征可以通过本领域已知的任何方法，例如Kyte和Doolittle亲水性分析来进行评估。
5.3.3.细胞内信号传导结构域
本公开的CAR包含细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指细胞的特殊功能。例如，T细胞的效应功能可以是溶细胞活性或包括分泌细胞因子在内的辅助活性。因此，术语“胞质信号传导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞执行特殊功能的蛋白质部分。虽然通常可以采用整个胞质信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整条链。就使用胞质信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应功能信号即可。因此，术语胞质信号传导序列意在包括足以转导效应功能信号的胞质信号传导结构域的任何截短部分。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的主要细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含基本上由免疫效应细胞的主要细胞内信号传导结构域组成的细胞内信号传导结构域。“主要细胞内信号传导结构域”是指以刺激方式起作用以诱导免疫效应功能的胞质信号序列。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。如本文中所用，“ITAM”是通常存在于在许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部的保守蛋白质基序。基序可以包含由6-8个氨基酸分隔的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列，其中每个x独立地是任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导很重要，这至少部分由信号传导分子激活后ITAM中酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM还可以用作其它参与信号传导通路的蛋白质的对接位点。示例性的含ITAM的主要胞质信号传导序列包括来源于CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域由CD3ζ的胞质信号传导结构域组成。在一些实施方案中，CD3ζ的主要细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域是野生型CD3ζ的胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域是含有一种或多种突变，例如Q65K的CD3ζ的胞质信号传导结构域的功能突变体。
5.3.4.共刺激信号传导结构域
许多免疫效应细胞除了刺激抗原特异性信号外还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和生存，以及激活细胞的效应功能。在一些实施方案中，CAR包含至少一个共刺激信号传导结构域。如本文中所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱导如效应功能的免疫反应的蛋白质的至少一部分。本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白的胞质信号传导结构域，其转导信号并调节免疫细胞如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞介导的反应。“共刺激信号传导结构域”可以是共刺激分子的胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(例如T细胞)上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激反应，例如但是不限于增殖和生存。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含单个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个(例如约2个、3个、4个或更多个中的任一者)共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白的两个或更多个共刺激信号传导结构域，例如本文所述的任两个或更多个共刺激蛋白。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含主要细胞内信号传导结构域(CD3ζ的例如胞质信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导结构域和主要细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ的胞质信号传导结构域)经由任选的肽接头彼此融合。主要细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域可以按任何合适的顺序排列。在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导结构域位于跨膜结构域与主要细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ的胞质信号传导结构域)之间。多个共刺激信号传导结构域可以提供累加或协同刺激作用。
宿主细胞(例如，免疫细胞)中共刺激信号传导结构域的活化可能诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬特性、增殖、分化、生存和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域适用于本文所述的CAR中。基于例如将表达效应分子的免疫效应细胞的类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和所需免疫效应功能(例如，ADCC效应)等因素，选择共刺激信号传导结构域的类型。用于CAR的共刺激信号传导结构域的实例可以是共刺激蛋白的胞质信号传导结构域，所述共刺激蛋白包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNFRII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其它共刺激分子，例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、Claudin18.20、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。
在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导结构域选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合于CD83的配体(例如CD83和MD-2)。
在一些实施方案中，本公开的CAR中的细胞内信号传导结构域包含源自CD137的共刺激信号传导结构域(即，4-1BB)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞质信号传导结构域和CD137的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CD137的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，本公开的CAR中的细胞内信号传导结构域包括包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的源自CD28的共刺激信号传导结构域。
也在本公开的范围内的是本文所述的任何共刺激信号传导结构域的变体，使得共刺激信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫反应。在一些实施方案中，与野生型对应共刺激信号传导结构域相比，共刺激信号传导结构域包含多达10个氨基酸残基变异(例如，1个、2个、3个、4个、5个或8个)。这种包含一个或多个氨基酸变异的共刺激信号传导结构域可被称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导增加和免疫反应刺激增强。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导减少和免疫反应刺激减弱。
5.3.5.铰链区
本公开的CAR可以包含位于细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性以及结构域的一或两者相对于彼此运动。可以使用提供细胞外抗原结合结构域相对于效应分子的跨膜结构域的这种柔性和运动的任何氨基酸序列。
铰链结构域可含有约10-100个氨基酸，例如约15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，铰链结构域的长度可以是至少约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个或75个氨基酸中的任一者。
在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。本领域已知的包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域适用于本文所述的嵌合受体。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域的至少一部分并且赋予包含嵌合受体柔性。在一些实施方案中，铰链结构域源自CD8α。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8α的铰链结构域的至少约15个(例如，20个、25个、30个、35个或40个中的任一者)连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD8α的铰链结构域包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
抗体如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体的铰链结构域也适用于本文所述的pH依赖性嵌合受体系统。在一些实施方案中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1与CH2的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域属于抗体，并且包含抗体的铰链结构域和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在一些实施方案中，位于Fc受体的细胞外配体结合结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域是肽接头，例如(GxS)n接头，其中x和n可以独立地是3与12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多。
5.3.6.信号肽
本公开的CAR可以在多肽的N端包含信号肽(也称为信号序列)。通常，信号肽是使多肽靶向细胞中所需位点的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使效应分子靶向细胞的分泌通用，并将允许效应分子整合和锚定到脂质双层中。本领域技术人员将显而易见适用于本文所述的CAR中的包括天然存在的蛋白质的信号序列或合成的非天然存在的信号序列的信号肽。在一些实施方案中，信号肽源自选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽源自CD8α。在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列。
5.3.7.示例性CAR
如以下第6节所示产生示例性CAR，例如下表5中列出的那些。
表5.CAR和相应VHH的氨基酸序列ID编号
CAR代码 CAR SEQ ID NO. VHH代码 VHH SEQ ID NO.
LIC182501 SEQ ID NO:53 VHH182501 SEQ ID NO:38
LIC182502 SEQ ID NO:54 VHH182502 SEQ ID NO:39
LIC182503 SEQ ID NO:55 VHH182503 SEQ ID NO:40
LIC182504 SEQ ID NO:56 VHH182504 SEQ ID NO:41
LIC182505 SEQ ID NO:57 VHH182505 SEQ ID NO:42
LIC182506 SEQ ID NO:58 VHH182506 SEQ ID NO:43
LIC182507 SEQ ID NO:59 VHH182507 SEQ ID NO:44
LIC182508 SEQ ID NO:60 VHH182508 SEQ ID NO:45
LIC182509 SEQ ID NO:61 VHH182509 SEQ ID NO:46
LIC182510 SEQ ID NO:62 VHH182510 SEQ ID NO:47
LIC182511 SEQ ID NO:63 VHH182511 SEQ ID NO:48
LIC182512 SEQ ID NO:64 VHH182512 SEQ ID NO:49
LIC182513 SEQ ID NO:65 VHH182513 SEQ ID NO:50
LIC182514 SEQ ID NO:66 VHH182514 SEQ ID NO:51
LIC182513H4 SEQ ID NO:86 VHH182513H4 SEQ ID NO:78
LIC182513H7 SEQ ID NO:87 VHH182513H7 SEQ ID NO:79
LIC182513H8 SEQ ID NO:88 VHH182513H8 SEQ ID NO:80
LIC182513H9 SEQ ID NO:89 VHH182513H9 SEQ ID NO:81
LIC182513H10 SEQ ID NO:90 VHH182513H10 SEQ ID NO:82
LIC182511H6 SEQ ID NO:91 VHH182511H6 SEQ ID NO:83
LIC182511H8 SEQ ID NO:92 VHH182511H8 SEQ ID NO:84
LIC182511H9 SEQ ID NO:93 VHH182511H9 SEQ ID NO:85
在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ IDNO:90的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，本文提供的CAR包含相对于下文第6节中例示的任一种CAR，如上表5中的那些具有一定百分比同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2CAR，其包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQID NO:60的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2CAR，其包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQID NO:65的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2CAR，其包含与SEQ ID NO:86的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:87的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:88的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQID NO:89的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2CAR，其包含与SEQ ID NO:91的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:92的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，本文提供了一种Claudin18.2 CAR，其包含与SEQ ID NO:93的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种分离的核酸，其编码本文提供的任何Claudin18.2 CAR。下面提供了关于核酸序列和载体的更详细描述。
5.4.工程化免疫效应细胞
在又一方面，本文提供了包含本文所述的任一种CAR的宿主细胞(例如免疫效应细胞)。
因此，在一些实施方案中，本文提供了一种包含CAR的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含一种或多种抗Claudin18.2 sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中该抗Claudin18.2 sdAb是如上文第5.2节中所述的抗Claudin18.2 sdAb，包括例如表2中的VHH结构域和具有表2中的那些VHH结构域任一者中的一个、两个或所有三个CDR的那些。在一些实施方案中，抗Claudin18.2 sdAb是骆驼科、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体(例如CD83和MD-2)和它们的组合。在一些实施方案中，CAR还包含位于细胞外抗原结合结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如CD8α铰链结构域)。在一些实施方案中，CAR还包含位于多肽N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N端到C端包含：CD8α信号肽、细胞外抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源自CD137的共刺激信号传导结构域和源自CD3ζ的主要细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含CAR的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含一种或多种抗Claudin18.2 sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中该抗Claudin18.2 sdAb包含SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种包含CAR的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含一种或多种抗Claudin18.2 sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中该抗Claudin18.2 sdAb包含与SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一者的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体(例如CD83和MD-2)和它们的组合。在一些实施方案中，CAR还包含位于细胞外抗原结合结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如CD8α铰链结构域)。在一些实施方案中，CAR还包含位于多肽N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N端到C端包含：CD8α信号肽、细胞外抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源自CD137的共刺激信号传导结构域和源自CD3ζ的主要细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含CAR的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，该CAR包含选自由SEQ ID NO:53-66和86-93组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了一种包含CAR的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，该CAR包含与选自由SEQID NO:53-66和86-93组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
在其它实施方案中，提供了一种包含多特异性(例如双特异性或三特异性)或多价(例如二价或三价)嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，该CAR包括包含以下的多肽：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含特异性结合于Claudin18.2的第一单结构域抗体(sdAb)和一种或多种额外的抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，额外的抗原结合结构域结合于Claudin18.2的不同表位。在其它实施方案中，额外的抗原结合结构域结合于不同抗原，例如CD22、CD19、CD20、CD33、CD38、BCMA、CS1、ROR1、GPC3、CD123、IL-13R、CD138、c-Met、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3和糖脂F77。在一些实施方案中，第一sdAb和/或额外的sdAb是骆驼科、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，第一单结构域抗体和额外的单结构域抗体经由肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体(例如CD83和MD-2)和它们的组合。在一些实施方案中，多特异性CAR还包含位于细胞外抗原结合结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如CD8α铰链结构域)。在一些实施方案中，多特异性CAR还包含位于多肽N端的信号肽(例如CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N端到C端包含：CD8α信号肽、细胞外抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源自CD137的共刺激信号传导结构域和源自CD3ζ的主要细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，工程化免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，工程化免疫效应细胞是自体同源的。在一些实施方案中，工程化免疫效应细胞是同种异体的。
还提供了包含(或表达)两种或更多种不同CAR的工程化免疫效应细胞。本文所述的任两种或更多种CAR可以组合表达。CAR可以靶向不同的抗原，从而提供协同或累加效应。两种或更多种CAR可以在相同的载体或不同的载体上编码。
工程化免疫效应细胞还可以表达一种或多种治疗性蛋白质和/或免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂。参见例如国际专利申请号PCT/CN2016/073489和PCT/CN2016/087855，其全部内容以引用的方式并入本文中。
5.4.1.载体
本公开提供了用于克隆和表达本文所述的任一种CAR的载体。在一些实施方案中，载体适用于在真核细胞例如哺乳动物细胞中复制和整合。在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体和它们的衍生物。病毒载体技术是本领域中众所周知的，并且例如描述于Sambrook等人(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)以及其它病毒学和分子生物学手册中。
许多基于病毒的系统已被开发用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体外或离体地将其递送至工程化哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自失活慢病毒载体。例如，可用本领域已知的方案来包装携带免疫调节剂(如免疫检查点抑制剂)编码序列的自失活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自失活慢病毒载体。可使用本领域已知的方法将所得慢病毒载体用于转导哺乳动物细胞(例如原代人T细胞)。源自例如慢病毒等逆转录病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定整合并在后代细胞中繁殖。慢病毒载体还具有低免疫原性，并且可以转导非增殖细胞。
在一些实施方案中，载体包含任一种编码本文所述的CAR的核酸。可使用本领域中任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中，所述方法包括例如使用限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择标记。在一些实施方案中，核酸可操作地连接于启动子。已经探索了多种启动子用于哺乳动物细胞中进行基因表达，并且本领域已知的任何启动子都可以用于本公开。启动子可以粗略地分类为组成型启动子或调节型启动子，例如诱导型启动子。
在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接于启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿病毒40早期启动子(SV40)和鸡β-肌动蛋白启动子与CMV早期增强子(CAGG)联合。这类组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率已在大量研究中进行了广泛比较。例如，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK驱动原代人T细胞中嵌合抗原受体表达的效率，并得出结论，即hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，而且还在CD4和CD8人T细胞中得到最佳保持(Molecular Therapy，17(8):1453-1464(2009))。在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接于hEF1α启动子。
在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接于诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子类别。诱导型启动子可由一种或多种条件诱导，所述条件例如工程化免疫效应细胞的物理条件、微环境，或工程化免疫效应细胞的生理状态、诱导物(即，诱导剂)或它们的组合。
在一些实施方案中，诱导条件不诱导工程化哺乳动物细胞中和/或接受药物组合物的受试者中的内源基因的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐射(例如电离辐射、光)、温度(例如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的活化状态。
在一些实施方案中，载体还含有可选择标记基因或报告基因以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达CAR的细胞。可选择标记和报告基因均可侧接有适当的调节序列，以能够在宿主细胞中表达。例如，载体可含有可用于调节核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
在一些实施方案中，载体包含多于一种编码CAR的核酸。在一些实施方案中，载体包括包含编码第一CAR的第一核酸序列和编码第二CAR的第二核酸序列的核酸，其中第一核酸经由编码自裂解肽的第三核酸序列可操作地连接于第二核酸。在一些实施方案中，自裂解肽选自由T2A、P2A和F2A组成的组。
5.4.2.免疫效应细胞
“免疫效应细胞”是可以执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞在表达CAR并与靶细胞(如Claudin18.2+肿瘤细胞)结合后产生IL-2、TFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后溶解抗原特异性靶细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞为NK细胞。在其它实施方案中，免疫效应细胞可以是已建立的细胞系，例如NK-92细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞从干细胞例如造血干细胞、多能干细胞、iPS或胚胎干细胞分化而来。
工程化免疫效应细胞是通过将CAR引入免疫效应细胞(如T细胞)来制备的。在一些实施方案中，通过转染上文描述的任一种分离的核酸或任一种载体将CAR引入免疫效应细胞。在一些实施方案中，通过将蛋白质插入细胞膜，同时使细胞通过微流体系统，例如CELL
Figure BDA0003709776140001491
(参见例如美国专利申请公布号20140287509)来CAR引入免疫效应细胞。
将载体或分离的核酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的。可以通过物理、化学或生物学方法将所述的载体转移到免疫效应细胞中。
将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York。在一些实施方案中，通过电穿孔将载体引入细胞。
用于将载体引入免疫效应细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如，人)细胞的方法。
将载体引入免疫效应细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。
在一些实施方案中，编码本文所述的任何CAR的RNA分子可以通过常规方法(例如体外转录)制备，然后经由已知方法，例如mRNA电穿孔引入免疫效应细胞。参见例如Rabinovich等人，Human Gene Therapy 17:1027-1035(2006)。
在一些实施方案中，引入载体或分离的核酸后，离体增殖转导/转染的免疫效应细胞。在一些实施方案中，培养转导或转染的免疫效应细胞以繁殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一者。在一些实施方案中，进一步评估或筛选转导或转染的免疫效应细胞以选择工程化哺乳动物细胞。
报告基因可用于鉴定潜在的转染细胞和评估调节序列的功能性。一般来说，报告基因是不存在于接受者生物体或组织中或不由接受者生物体或组织表达并且所编码的多肽的表达通过一些易于检测的特性如酶活性表现出来的基因。在已将DNA引入接受者细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白(GFP)基因(例如Ui-Tei等人FEBS Letters 479:79-82(2000))。合适的表达系统是众所周知的并且可以使用已知技术制备或商购获得。
确认工程化免疫效应细胞中存在编码CAR的核酸的其它方法包括例如本领域技术人员众所周知的分子生物学测定，例如索瑟恩印迹(Southern blotting)和诺瑟印迹、RT-PCR和PCR；生化测定，如例如通过免疫学方法(例如ELISA和蛋白质印迹)检测特定肽的存在或不存在。
5.4.3.T细胞来源
在一些实施方案中，在T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。T细胞可获自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些实施方案中，可以使用多种本领域可用的T细胞系。在一些实施方案中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的多种技术例如FicollTM分离从采集自受试者的血液单位获得。在一些实施方案中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆级分并将细胞置于合适的缓冲剂或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在钙不存在的情况下的初始活化步骤可能导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过按照制造商的说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)来完成。洗涤后，可将细胞重悬在多种生物相容性缓冲液(例如，不含Ca2+、不含Mg2 +的PBS、PlasmaLyte A或其它含或不含缓冲剂的盐水溶液)中。或者，可以去除单采血液成分术样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬在培养基中。
在一些实施方案中，通过溶解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过经由PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞的特定亚群可以通过正选择或负选择技术进一步分离。例如，在一些实施方案中，T细胞通过与缀合有抗CD3/抗CD28(即，3×28)的珠粒，例如
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M-450 CD3/CD28 T一起孵育足以进行正选择所需T细胞的时间段进行分离。在一些实施方案中，所述时间段为约30分钟。在又一实施方案中，所述时间段的范围是30分钟至36小时或更长，以及介于其间的所有整数值。在另一个实施方案中，所述时间段是至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，所述时间段是10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间为24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间，例如24小时，可以增加细胞产量。在与其它细胞类型相比，T细胞很少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞，例如从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。另外，使用更长的孵育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，在一些实施方案中，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合和/或通过增加或减少珠粒与T细胞的比率，可以在培养开始时或在该过程中的其它时间点优先选择T细胞亚群或排除细胞亚群。另外，通过增加或减少珠粒或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或其它所需时间点优先选择T细胞亚群或排除T细胞亚群。技术人员会认识到也可以使用多轮选择。在一些实施方案中，可能需要执行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。也可对“未选择的”细胞进行更多轮的选择。
通过负选择富集T细胞群可以使用针对负选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，所述技术使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、Claudin18.2、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，调节性T细胞被缀合有抗C25的珠粒或其它类似的选择方法耗竭。
为了通过正选择或负选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，例如珠粒等颗粒)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著减少珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的浓度。在又一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的浓度。在又一施方案中，使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以引起细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。另外，高细胞浓度的使用可允许更高效地捕获可能微弱表达靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可具有治疗价值并且期望获得。在一些实施方案中，使用高浓度细胞允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，例如珠粒等颗粒)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这会选择表达大量待与颗粒结合的期望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更高效地被捕获。在一些实施方案中，所使用的细胞浓度为5×106/ml。在一些实施方案中，所使用的浓度可为约1×105/ml至1×106/ml以及介于两者之间的任何整数值。
在一些实施方案中，可将细胞在2-10℃下或室温下以不同的速度在旋转器上孵育不同的时间长度。
也可以在洗涤步骤后冷冻用于刺激的T细胞。不受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤可通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度上的单核细胞来提供更均一的产品。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在本说明书中是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或例如含有Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻介质，然后将细胞以1°/分钟的速度冷冻至-80℃并贮存在液氮贮存罐的蒸气相中。可使用其它受控冷冻方法以及立即在-20℃下或液氮中进行非受控冷冻。
在一些实施方案中，如本文所述，将冷冻保存的细胞解冻和洗涤，并使其在室温下静置一小时，然后进行活化。
本公开还考虑在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，分离和冷冻所需细胞，例如T细胞，以供以后用于T细胞疗法，用于治疗多种将受益于T细胞疗法的疾病或疾患，例如本文所述的那些疾病或疾患。在一个实施方案中，血液样品或单采血液成分取自一般健康受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采血液成分取自有发展疾病的风险但尚未发展疾病的一般健康受试者，并且分离和冷冻感兴趣的细胞以备后用。在某些实施方案中，T细胞可被扩增、冷冻并在以后使用。在某些实施方案中，在如本文所述诊断出特定疾病后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在又一实施方案中，在多种相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分中分离细胞，所述治疗方式包括但不限于用例如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂(例如环孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯和FK506)、抗体或其它免疫消融剂，例如CAMPATH、抗CD3抗体、癌得星(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66:807-815(1991)；Henderson等人，Immun 73:316-321(1991)；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5:763-773(1993))。在又一实施方案中，将细胞分离用于患者以及冷冻用于以后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂如氟达拉滨的T细胞消融疗法、外部-射束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH结合(例如，在所述疗法之前、与其同时或在其之后)使用。
在一些实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是使用损害免疫系统的药物进行治疗后，在患者通常从治疗中恢复期间的治疗后不久，所获得的T细胞的质量可能是最佳的或者其离体扩增的能力得到改善。同样，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可能处于用于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本公开的说明书中考虑在该恢复阶段收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。另外，在某些实施方案中，动员(例如，利用GM-CSF的动员)和调理方案可用于在受试者中创造其中有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件，特别是在治疗后的限定时间窗期间。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
5.4.4.T细胞的活化和扩增
在一些实施方案中，在用CAR对T细胞进行遗传修饰之前或之后，T细胞通常可使用如例如美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和美国专利申请公布号20060121005中所述的方法进行活化和扩增。
通常，可通过将T细胞与其上附着有剂和配体的表面接触来扩增所述T细胞，所述剂刺激CD3/TCR复合物相关信号，所述配体刺激T细胞表面上的共刺激分子。特别地，T细胞群可以如本文所述进行刺激，例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或者通过与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)和钙离子载体接触来进行。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合刺激T细胞增殖的条件下，将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，需要使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD3抗体的实例包括UCHT1、OKT3、HIT3a(BioLegend，SanDiego，US)，可以像本领域公知的其它方法一样使用(Graves J等人，J.Immunol.146:2102(1991)；Li B等人，Immunology 116:487(2005)；Rivollier A等人，Blood 104:4029(2004))。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国)，可以像本领域公知的其它方法一样使用(Berg等人，Transplant Proc.30(8):3975-3977(1998)；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9):13191328(1999)；Garland等人，J.ImmunolMeth.227(1-2):53-63(1999))。
在一些实施方案中，T细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以由不同方案提供。例如，提供每种信号的剂可以在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，所述剂可偶联至相同表面(即，呈“顺式”形式)或偶联至分开的表面(即，呈“反式”形式)。或者，一种剂可被偶联至表面上，而另一种剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的剂与细胞表面结合并且提供主要活化信号的剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种剂都可以在溶液中。在另一个实施方案中，所述剂可呈可溶形式，然后与表面交联，例如表达将与所述剂结合的Fc受体或抗体或其它结合剂的细胞。关于这一点，关于被考虑用于在本公开中某些实施方案中活化和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，参见例如美国专利申请公布号20040101519和20060034810。
在一些实施方案中，将T细胞与剂包被的珠粒组合，随后将珠粒与细胞分离，然后培养细胞。在替代实施方案中，在培养之前，不分离剂包被的珠粒和细胞，而是将它们一起培养。在又一实施方案中，首先通过施加力诸如磁力而浓缩珠粒和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28个珠粒)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，在缓冲液，优选PBS(不含例如钙和镁等二价阳离子)中组合细胞(例如，104至4×108个T细胞)和珠粒(例如，推荐滴度为的1:100抗CD3/CD28MACSiBead颗粒)。本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常稀少并且仅占样品的0.01％或者整个样品(即，100％)可能包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数目都在本公开的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著减少颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/mL的浓度。在一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的浓度。在又一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的浓度。在又一施方案中，使用1.25亿或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可以引起细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。此外，高细胞浓度的使用可允许更高效地捕获可能微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。此类细胞群可具有治疗价值并且可期望在某些实施方案中获得。例如，使用高浓度细胞允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，可将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或介于其间的任何以小时计的整数值。在另一个实施方案中，可将混合物培养21天。在一个实施方案中，将珠粒和T细胞一起培养约八天。在另一个实施方案中，将珠粒和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个周期的刺激，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适合T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小基本培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可包含增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇等还原剂。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、optimizer，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适量的血清(或血浆)或确定的激素组，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要输注入受试者的细胞培养物中。在支持生长所需的条件，例如适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)下维持靶细胞。暴露于不同刺激时间的T细胞可能表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采的外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8)的辅助性T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体对T细胞进行的离体扩增，在约第8-9天之前产生主要由TH细胞组成的T细胞群，而在约第8-9天之后，T细胞群包含越来越多的TC细胞群。因此，根据治疗目的，将主要包含TH细胞的T细胞群输注给受试者可能是有利的。类似地，如果已经分离出TC细胞的抗原特异性亚组，则将该亚组扩大至更大的程度可以是有益的。
另外，除了CD4和CD8标志物之外，其它表型标志物也有显著变化，但在很大程度上，在细胞扩增过程中可重现。因此，这种可重现性使得能够为特定目的定制活化的T细胞产品。
5.5.多核苷酸
在一些实施方案中，本文提供了包含编码本文所述的多肽(即，Claudin18.2结合部分或Claudin18.2结合CAR)的多核苷酸的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包括多肽编码序列的多核苷酸以及包括额外编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。本公开的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链(如果单链可以是编码链或非编码(反义)链)。
在一些实施方案中，多核苷酸包含编码多肽的多核苷酸(例如核苷酸序列)，所述多肽包含选自SEQ ID NO:38-51和77-85的氨基酸序列。在其它实施方案中，多核苷酸包含编码多肽的多核苷酸(例如核苷酸序列)，所述多肽包含选自SEQ ID NO:53-66和86-93的氨基酸序列。
本公开还提供了本文所述的多核苷酸的变体，其中所述变体编码例如本文所述的Claudin18.2结合部分的片段、类似物和/或衍生物。在一些实施方案中，本公开提供了一种多核苷酸，该多核苷酸包含具有与编码本文所述的多肽的多核苷酸序列至少约80％同一、至少约85％同一、至少约90％同一、至少约95％同一、至少约96％同一、至少约97％同一、至少约98％同一或至少约99％同一的核苷酸序列。
如本文中所用，短语“具有与多核苷酸序列至少约95％同一的核苷酸序列的多核苷酸”意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列几乎相同，但每100个核苷酸最多具有五个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，参考核苷酸序列中最多5％的核苷酸可以缺失或取代为另一个核苷酸，或参考序列中占总核苷酸最多5％的核苷酸数目可以插入参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'端位置或这些末端位置之间的任何位置，单独散布在参考序列中的核苷酸之间或散布在参考序列中的一个或多个连续组中。
多核苷酸变体可含有编码区、非编码区或两者中的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体由产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的性质或活性的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含不会引起氨基酸序列发生变化(由于遗传密码的简并性)的沉默取代。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，优化特定宿主的密码子表达(例如，将人mRNA中的密码子改为细菌宿主(如大肠杆菌)偏好的密码子)。在一些实施方案中，多核苷酸变体在序列的非编码区或编码区中包含至少一个沉默突变。
在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以调节或改变编码多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以增加编码多肽的表达。在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以减少编码多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体增加编码多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体减少编码多肽的表达。
在一些实施方案中，多核苷酸包含具有与编码选自SEQ ID NO:38-51、53-66和77-93的氨基酸序列的多核苷酸至少约80％同一、至少约85％同一、至少约90％同一、至少约95％同一、至少约96％同一、至少约97％同一、至少约98％同一或至少约99％同一的核苷酸序列的多核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其包含与编码选自SEQ ID NO:38-51、53-66和77-93的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，杂交在本领域技术人员已知的高度严格条件下进行。
在一些实施方案中，多核苷酸包含在相同阅读框中与有助于多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸(例如，充当用于控制多肽转运的分泌序列的前导序列)融合的多肽(例如，抗体)编码序列，该多肽(例如，抗体)。多肽可以具有前导序列，该前导序列被宿主细胞裂解以形成多肽的“成熟”形式。
在一些实施方案中，多核苷酸包含在相同阅读框中与标记或标签序列融合的多肽(例如抗体)编码序列。例如，在一些实施方案中，标记序列是六组氨酸标签(HIS-标签)，其允许有效纯化与标记融合的多肽。在一些实施方案中，标记序列是来源于流感血凝素蛋白并且适用于哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)的血凝素(HA)标签。在一些实施方案中，标记序列是FLAGTM标签。在一些实施方案中，标记可以与其它标记或标签结合使用。
在一些实施方案中，多核苷酸是分离的。在一些实施方案中，多核苷酸基本上是纯的。
还提供了包含本文所述的核酸分子的载体。在一个实施方案中，可以将核酸分子掺入重组表达载体中。本公开提供了包含本公开的任何核酸的重组表达载体。如本文中所用，术语“重组表达载体”意指一种遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当该构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并且载体在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本文所述的载体作为一个整体不是天然存在的；但是，载体的各个部分可以是天然存在的。所描述的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，它们可以是单链或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，并且可以含有天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间键，或两种类型的键。非天然存在或改变的核苷酸或核苷酸间键不阻碍载体的转录或复制。
在一个实施方案中，本公开的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括那些设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者兼有的载体，例如质粒和病毒。载体可选自由以下组成的组：pUC系列(Fermentas Life Sciences，Glen Burnie，Md.)、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，Calif.)、pET系列(Novagen，Madison，Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，Calif.)。可以使用噬菌体载体，例如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII(Stratagene)。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，使用例如Sambrook等人，同上和Ausubel等人，同上中描述的标准重组DNA技术制备重组表达载体。可以制备环状或线性的表达载体构建体以含有在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可以来源于例如ColE1、SV40、2μ质粒、λ、牛乳头状瘤病毒等。
视情况而定并考虑载体是基于DNA还是基于RNA，重组表达载体可以包含调节序列，例如转录和翻译起始密码子和终止密码子，它们对载体将引入的宿主类型(例如，细菌、植物、真菌或动物)是特异性的。
重组表达载体可以包括一种或多种标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。标记基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性；弥补营养缺陷型宿主以提供原营养等等。用于所述表达载体的合适标记基因包括例如新霉素/G418抗性基因、组氨醇x抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄西林抗性基因。
重组表达载体可以包含可操作地连接于本公开的核苷酸序列的天然或规范启动子。启动子的选择，例如强启动子、弱启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和发育特异性启动子，在技术人员的普通技能范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技能范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、RSV启动子、SV40启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。
重组表达载体可以设计用于瞬时表达、稳定表达或两者兼有。此外，可以制备重组表达载体用于组成型表达或诱导型表达。
此外，可以使重组表达载体包括自杀基因。如本文中所用，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达该基因的细胞对剂(例如药物)敏感性，并且当细胞与该剂接触或暴露于剂时导致细胞死亡的基因。自杀基因是本领域已知的并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
还提供了包含本文所述的核酸分子的宿主细胞。宿主细胞可以是任何含有异源核酸的细胞。异源核酸可以是载体(例如，表达载体)。例如，宿主细胞可以是来自任何生物体的细胞，其以任何方式被选择、修饰、转化、生长、使用或操纵，用于由细胞产生物质，例如由细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶。可以确定合适的宿主。例如，可以基于载体骨架和所需结果来选择宿主细胞。举例来说，可以将质粒或粘粒引入原核宿主细胞中以复制几种类型的载体。细菌细胞，例如但不限于DH5α、JM109和KCB、
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感受态细胞和SOLOPACK Gold细胞，可用作载体复制和/或表达的宿主细胞。此外，大肠杆菌LE392等细菌细胞可用作噬菌体病毒的宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞包括但不限于酵母(例如，YPH499、YPH500和YPH501)、昆虫和哺乳动物。用于载体的复制和/或表达的哺乳动物真核宿主细胞的实例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、COS、Saos、PC12、SP2/0(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，Manassas，VA；CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK；ECACC号85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATCC CRL-TIB-196)。其它有用的细胞系包括源自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞系，例如CHO-K1SV(Lonza Biologics，Walkersville，MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
5.6.药物组合物
在一个方面，本公开还提供了药物组合物，其包含本公开的单结构域抗体、包含单结构域抗体的结合分子或治疗分子、或工程化免疫效应细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本公开的单结构域抗体、包含单结构域抗体的结合分子或治疗分子、或工程化免疫效应细胞和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文提供的单结构域抗体和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的包含本文提供的单结构域抗体的治疗分子(例如融合蛋白、免疫缀合物和多特异性结合分子)和药学上可接受的赋形剂。
在其它实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的包含本文提供的单结构域抗体的CAR和药学上可接受的赋形剂。
在其它实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文提供的工程化免疫效应细胞和药学上可接受的赋形剂。
在其它实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文提供的核酸，例如在例如适用于基因疗法的载体和药学上可接受的赋形剂中。
在一个具体实施方案中，术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全)、载体或媒介物。药物赋形剂可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油水溶液也可以用作液体赋形剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA中描述了合适的药物赋形剂的实例。这类组合物将含有预防或治疗有效量的例如纯化形式的本文提供的活性成分，以及合适量的赋形剂，以提供适当施用于患者的形式。制剂应适合施用方式。
在一些实施方案中，赋形剂的选择部分由特定细胞、结合分子和/或抗体，和/或施用方法决定。因此，有多种合适的制剂。
通常，可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受者是无毒的，并且包括缓冲剂、包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠在内的抗氧化剂；防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；螯合剂，例如EDTA和/或非离子表面活性剂。
缓冲剂可用于将pH值控制在优化治疗效果的范围内，尤其是在稳定性取决于pH值的情况下。适用于本公开的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可包含组氨酸和三甲胺盐，例如Tris。
可添加防腐剂以阻止微生物生长。适用于本公开的防腐剂包括如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；卤化(例如，氯化、溴化、碘化)苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚。
张力剂，有时称为“稳定剂”，可用于调节或维持组合物中液体的张力。当与大的带电荷的生物分子(例如蛋白质和抗体)一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电荷的基团相互作用，从而降低分子间和分子内相互作用的可能性。示例性张力剂包括多元糖醇，三元或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
额外的示例性赋形剂包括：(1)填充剂，(2)溶解度增强剂，(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附在容器壁上的剂。这类赋形剂包括：多元糖醇(上面列举的)；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏四糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖(myoinisitose)、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，例如棉子糖；以及多糖，例如糊精或葡聚糖。
可存在非离子表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂并保护治疗性蛋白质免于搅拌诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不会导致活性治疗性蛋白质或抗体变性。合适的非离子表面活性剂包括例如聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、
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多元醇、
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聚氧乙烯山梨醇单醚(
Figure BDA0003709776140001661
等)、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子去垢剂包括十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去垢剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了将药物组合物用于体内施用，它们优选是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。通常可将药物组合物放到具有无菌进入端口的容器，如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。
施用途径是根据已知和公认的方法，例如通过单次或多次团注或以合适的方式长时间输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注，局部施用，吸入，或通过缓释放或延长释放方式施用。
在另一个实施方案中，药物组合物可以作为控释或缓释系统提供。在一个实施方案中，可以使用泵来实现控释或缓释(参见例如Sefton，Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40(1987)；Buchwald等人，Surgery 88:507-16(1980)；以及Saudek等人，N.Engl.J.Med.321:569-74(1989))。在另一个实施方案中，聚合材料可用于实现本文提供的预防剂或治疗剂(例如，如本文所述的融合蛋白)或组合物的控释或缓释(参见例如Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编辑，1974)；Controlled Drug Bioavailability， Drug Product Design和Performance(Smolen和Ball编辑，1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126(1983)；Levy等人，Science 228:190-92(1985)；During等人，Ann.Neurol.25:351-56(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.71:105-12(1989)；美国专利号5,679,377、5,916,597、5,912,015、5,989,463和5,128,326；PCT公布号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于缓释制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于缓释制剂的聚合物是惰性的，不含可浸出杂质，存储稳定，无菌且可生物降解。在另一个实施方案中，控释或缓释系统可以放置在特定靶组织，例如鼻部通道或肺的附近，因此只需要全身剂量的一小部分(参见例如Goodson，Medical Applications of Controlled Release第2卷，115-38(1984))。控释系统由例如Langer，Science 249:1527-33(1990)论述。本领域技术人员已知的任何技术都可用于产生包含一种或多种本文所述的剂的缓释制剂(参见例如美国专利号4,526,938；PCT公布号WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等人，Radiotherapy&Oncology 39:179-89(1996)；Song等人，PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97(1995)；Cleek等人，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54(1997)；以及Lam等人，Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60(1997))。
本文所述的药物组合物还可以含有正在被治疗的特定适用症所必需的超过一种活性化合物或剂。或者或另外，组合物可包含细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子以有效达成预期目的的量适当地组合存在。
活性成分还可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳液中。这类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版中。
各种组合物和递送系统是已知的并且可以与本文提供的治疗剂一起使用，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达本文提供的单结构域抗体或治疗分子的重组细胞中，构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量，例如治疗有效量或预防有效量的结合分子和/或细胞。在一些实施方案中，治疗或预防功效通过对所治疗的受试者的定期评估来监测。对于几天或更长时间内的重复施用(这取决于疾患)，维持治疗直到疾病症状得到所需的抑制。然而，其它的给药方案是可用的，并且可以确定这些给药方案。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据治疗的受试者和特定施用模式而变化，并且一般是组合物产生治疗作用的量。通常，在100％中，该量为约0.01％至约99％活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％活性成分，与药学上可接受的载体组合。
可以调整给药方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。举例来说，可以施用单次团注，可以随时间施用几个分开的剂量，或剂量可以按比例减少或增加，根据治疗情况的紧急程度所指示。尤其宜将胃肠外组合物配制成便于施用和剂量均一性的单位剂型。如本文中所用的单位剂型是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理离散单元；每个单元含有经计算可产生所需治疗作用的预定量的活性化合物，以及所需药物载体。或者，抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较少的给药频率。
对于组合物的施用，剂量可以在约0.0001至100mg/kg和更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。举例来说，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每三至6个月一次施用。本发明的抗Claudin18.2抗体的优选给药方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下给药方案之一给予抗体：(i)每4周一次，共6剂，然后每3个月一次；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每三周1mg/kg体重一次。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/mL和在一些方法中约25-300μg/mL的血浆抗体浓度。药物组合物可以是控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.，New York，1978。
在其中药物组合物包含任一种本文所述的工程化免疫细胞的一些实施方案中，药物组合物以至少约104、105、106、107、108或109细胞/kg个体体重中的任一者的剂量施用。在一些实施方案中，药物组合物以约104至约105、约105至约106、约106至约107、约107至约108、约108至约109、约104至约109、约104至约106、约106至约108或约105至约107细胞/kg个体体重中的任一者的剂量施用。在一些实施方案中，药物组合物以至少约1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107细胞/kg或更多中的任一者的剂量施用。在一些实施方案中，药物组合物以约3×105至约7×106细胞/kg或约3×106细胞/kg的剂量施用。
治疗组合物可以经由医疗装置施用，例如(1)无针皮下注射装置(例如，美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；以及4,596,556)；(2)微型输液泵(美国专利号4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利号4,486,194)；(4)输液装置(美国专利号4,447,233和4,447,224)；以及(5)渗透装置(美国专利号4,439,196和4,475,196)；其公开内容以引用的方式并入本文中。
5.7.方法和用途
在另一个方面，本文提供了使用本文提供的Claudin18.2结合分子的方法和用途，包括抗Claudin18.2 VHH、嵌合抗原受体(CAR)和/或表达重组受体的工程化细胞。
5.7.1.治疗方法和用途
本公开还提供了使用本文公开的Claudin18.2结合部分、多特异性或多价分子、缀合物、溶瘤病毒、CAR、工程化免疫细胞、编码它们的多核苷酸、包含多核苷酸的重组表达载体、含有表达载体的细胞或药物组合物的方法或用途，用于治疗表达Claudin18.2的癌症或肿瘤。不受理论束缚，Claudin18.2结合部分、多特异性或多价分子、缀合物、溶瘤病毒、CAR和工程化免疫细胞可以在体内特异性靶向表达Claudin18.2的癌细胞，从而发挥它们消除、溶解和/或杀死癌细胞的治疗作用。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的受试者的表达Claudin18.2的肿瘤或癌症的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本文公开的Claudin18.2结合部分、多特异性或多价分子、缀合物、溶瘤病毒、CAR、工程化免疫细胞、编码它们的多核苷酸、包含多核苷酸的重组表达载体、含有表达载体的细胞或药物组合物。在一些实施方案中，可治疗的表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是实体瘤或非实体瘤。作为非限制性实例，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃癌、食管癌、胃食管癌、肝癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胰腺癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌或神经胶质瘤癌或肿瘤。
在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性胃腺癌。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是食管癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃食管癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是涉及Claudin18.2表达的任何癌症或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是涉及Claudin18.2异位激活的任何癌症或肿瘤(例如，胰腺、食管、卵巢和肺肿瘤)。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性癌症或肿瘤(例如，胃肿瘤)。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性癌症或肿瘤的转移。作为非限制性实例，在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃癌腺癌的淋巴结转移或远处转移。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤位于卵巢(例如，库肯勃氏瘤(Krukenberg tumor))。在某些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤与组织学亚型相关。作为非限制性实例，在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是食管腺癌(但不是鳞状细胞癌)、粘液性(但不是浆液性)卵巢癌或导管胰腺癌(但不是胰岛癌)。
在一些实施方案中，本文公开的方法可以减少受试者中Claudin18.2阳性肿瘤细胞的数目。在一些实施方案中，本文公开的方法可以减轻受试者的肿瘤负荷。在一些实施方案中，本文公开的Claudin18.2结合部分可用于利用受试者的天然防御机制，包括CDC和ADCC，来消除恶性或癌细胞。
用于监测患者对施用本文公开的药物组合物的反应的方法是本领域已知的并且可以根据本文公开的方法使用。在一些实施方案中，本领域已知的方法可用于监测患者对施用本文公开的药物组合物的反应。在一些实施方案中，本领域已知的方法可用于监测病变尺寸，和/或淋巴结尺寸。
作为一个非限制性实例，在一些实施方案中，可以使用对比增强的CT扫描来检测和/或监测患者的病变和/或淋巴结。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物的施用可以减小CT扫描在患者中检测到的病变的尺寸。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物的施用可引起异常淋巴结的收缩。
在某些实施方案中，本文提供的方法可用于治疗受试者的癌症或减轻肿瘤负荷，其中所述癌症或肿瘤是表达Claudin18.2的癌症或肿瘤。在一个实施方案中，本文提供的方法用于治疗癌症。应当理解，治疗癌症的方法可以具有改善与癌症相关的征象或症状的抗肿瘤作用。这类征象或症状包括但不限于减轻肿瘤负荷，包括抑制肿瘤生长、减缓肿瘤生长速率、减小肿瘤尺寸、减少肿瘤细胞数目、消除肿瘤，所有这些都可以使用本领域众所周知的常规肿瘤成像技术进行测量。与癌症相关的其它征象或症状包括但不限于疲劳、疼痛、体重减轻以及与各种癌症相关的其它征象或症状。在一个非限制性实例中，本文提供的方法可以减轻肿瘤负荷。因此，本发明的药物组合物的施用可以减少受试者体内的肿瘤细胞数目，减小肿瘤尺寸，和/或根除肿瘤。肿瘤可以是实体瘤。本发明的方法还可以提供增加或延长患有癌症的受试者的生存期。此外，本发明的方法可以在受试者中提供增强的针对癌症的免疫反应。
在本发明的方法中，将治疗有效量的Claudin18.2结合部分(例如，抗体)或含有Claudin18.2结合部分(例如，抗体)的生物药物(例如，CAR-T细胞)施用于需要癌症治疗的受试者。受试者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。施用是为了引发抗癌反应，减轻受试者的疾患。可能会消除受试者体内的癌症或肿瘤细胞，但任何临床改善都会带来益处。临床改善包含癌症或肿瘤尺寸减小和进展速率降低。
本公开的方法可用于治疗具有癌症病史并且对先前疗法有反应的受试者。先前疗法可能是手术切除、放疗或传统化疗。受试者可能没有临床上可测量的肿瘤，但处于疾病进展的风险下，要么靠近原始肿瘤部位，要么发生转移。根据本领域已知的初始治疗之前或之后观察到的特征，这类受试者可以进一步细分为高风险组或低风险组。高风险受试者是肿瘤侵入邻近组织或淋巴结受累的受试者。任选地，可以施用本公开的生物药物或组合物以预防癌症在例如根据家族史和/或基因测试，易患癌症的受试者中发生。
接受施用的受试者可能患有晚期疾病形式，治疗将抑制疾病进展，缓解或逆转。之前通过其它方法治愈的受试者可以使用本发明的治疗来降低或延缓复发的风险。此外，难治性或复发性恶性肿瘤可以使用本文公开的药物组合物进行治疗。
可将有效产生所需作用的量的生物药物或组合物施用于受试者以治疗癌症或肿瘤。有效量或治疗有效量是足以在治疗时提供有益或所需临床结果的量。可以在单次施用或一系列施用(一剂或多剂)中提供有效量。可以以团注或连续灌注的形式提供有效量。就治疗而言，有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病进展或以其它方式减少疾病的病理后果的量。有效量可由医师针对特定受试者确定。在确定达到有效量的适当剂量时，通常会考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、正在治疗的疾患、疾患的严重程度以及所施用的本公开的生物药物的形式和有效浓度。
使用具有不同作用机制的剂进行组合疗法可能会产生累加或协同作用。与单一疗法相比，组合疗法可以允许单一疗法中所用的每种剂的剂量较低，从而减少毒副作用和/或增加本文公开的剂的治疗指数。组合疗法可以降低耐药癌细胞发展的可能性。
因此，本公开还提供了组合治疗方法，其中本文提供的治疗剂，例如本公开的Claudin18.2结合部分或CAR-T细胞与一种或多种有效抑制受试者中肿瘤生长的其它剂共同施用。在一个实施方案中，本发明提供一种用于抑制受试者中肿瘤生长的方法，其包括向受试者施用本公开的Claudin18.2结合部分或CAR-T细胞以及一种或多种另外的抗体，例如抗OX40抗体、抗TIM-3抗体、抗CD137抗体、抗GITR抗体、抗LAG-3抗体、抗PD-L1抗体和抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体。
可以在施用本文所述的生物药物或药物组合物之前、同时或之后施用另外的疗法。联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂共同施用，或以任一顺序但通常在使所有活性剂都能同时发挥其生物活性的时间段内连续施用。本领域技术人员可以基于所治疗的受试者的需要，容易确定用于组合施用本文所述的Claudin18.2结合部分或相关生物药物和另外的疗法的适当方案，包括组合疗法中使用的另外的剂的时间和剂量。
在一些具体实施方案中，本文提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用包含如上文第5.2节所述的结合于Claudin18.2的单结构域抗体的结合分子，所述单结构域抗体包括例如具有表2中的CDR的单结构域抗体，包含SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一序列的氨基酸序列的单结构域抗体，以及包含与SEQ ID NO:38-51和77-85具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的单结构域抗体。在一些实施方案中，疾病或病症是Claudin18.2相关疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是表达Claudin18.2的肿瘤或癌症。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是实体瘤或非实体瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性胃腺癌。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是食管癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃食管癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是涉及Claudin18.2表达的任何癌症或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是涉及Claudin18.2异位激活的任何癌症或肿瘤(例如，胰腺、食管、卵巢和肺肿瘤)。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性癌症或肿瘤(例如，胃肿瘤)。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性癌症或肿瘤的转移。作为非限制性实例，在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃癌腺癌的淋巴结转移或远处转移。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤位于卵巢(例如，库肯勃氏瘤)。在某些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤与组织学亚型相关。作为非限制性实例，在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是食管腺癌(但不是鳞状细胞癌)、粘液性(但不是浆液性)卵巢癌或导管胰腺癌(但不是胰岛癌)。
在其它实施方案中，本文提供了一种用于治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用如第5.4节中提供的工程化免疫效应细胞(例如T细胞)，包括例如第5.3节中提供的包含CAR的细胞。在一些实施方案中，施用于受试者的工程化免疫细胞包括包含多肽的CAR，所述多肽包含：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含一种或多种抗Claudin18.2 sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中该抗Claudin18.2 sdAb如上文第5.2节所述，包括例如具有表2中的CDR的单结构域抗体，包含SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一序列的氨基酸序列的单结构域抗体，以及包含与SEQ ID NO:38-51和77-85具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的单结构域抗体。在一些实施方案中，施用于受试者的工程化免疫细胞包含CAR，所述CAR包含选自由SEQ ID NO:53-66和86-93组成的组的氨基酸序列，或包含与选自由SEQID NO:53-66和86-93组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，疾病或病症是Claudin18.2相关疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是表达Claudin18.2的肿瘤或癌症。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是实体瘤或非实体瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性胃腺癌。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是食管癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃食管癌或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是涉及Claudin18.2表达的任何癌症或肿瘤。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是涉及Claudin18.2异位激活的任何癌症或肿瘤(例如，胰腺、食管、卵巢和肺肿瘤)。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性癌症或肿瘤(例如，胃肿瘤)。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是原发性癌症或肿瘤的转移。作为非限制性实例，在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是胃癌腺癌的淋巴结转移或远处转移。在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤位于卵巢(例如，库肯勃氏瘤)。在某些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤与组织学亚型相关。作为非限制性实例，在一些实施方案中，表达Claudin18.2的癌症或肿瘤是食管腺癌(但不是鳞状细胞癌)、粘液性(但不是浆液性)卵巢癌或导管胰腺癌(但不是胰岛癌)。
5.7.2.诊断和检测方法以及用途
在另一方面，本文提供了涉及使用本文提供的结合分子，例如结合Claudin18.2的VHH和含有这类VHH的分子(例如缀合物和复合物)的方法，例如通过Claudin18.2的检测和/或被抗体识别的其表位的存在，用于检测、预后、诊断、分期、确定特定治疗与一种或多种组织或细胞类型的结合，和/或告知受试者的治疗决策。
在一些实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的抗Claudin18.2抗体(例如本文所述的任一种抗Claudin18.2单结构域抗体)。在另一方面，提供了检测生物样品中Claudin18.2的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括检测生物样品中Claudin18.2蛋白的存在。在某些实施方案中，Claudin18.2是人Claudin18.2。在一些实施方案中，所述方法是与表达Claudin18.2的疾病或病症相关的诊断和/或预后方法。在一些实施方案中，方法包括将生物样品与抗体一起孵育和/或用抗体探测和/或将抗体施用于受试者。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织或其部分，例如肿瘤或癌组织或其活检或切片。在某些实施方案中，接触是在允许抗Claudin18.2抗体与样品中存在的Claudin18.2结合的条件下进行的。在一些实施方案中，所述方法还包括检测抗Claudin18.2抗体与样品中的Claudin18.2之间是否形成复合物，例如检测这种结合的存在或不存在或水平。这类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗Claudin18.2抗体用于选择有资格用抗Claudin18.2抗体或工程化抗原受体治疗的受试者，例如其中Claudin18.2是用于选择患者的生物标志物。
在一些实施方案中，样品，例如细胞、组织样品、溶解产物、组合物或源自它们的其它样品与抗Claudin18.2抗体接触，并测定或检测抗体与样品(例如，样品中的Claudin18.2)之间的结合或复合物的形成。当与相同组织类型的参考细胞相比，证明或检测到测试样品中的结合时，可能表明存在相关疾病或病症，和/或包含抗体的治疗剂将特异性结合于与该组织或细胞或样品来源的其它生物材料相同或类型相同的组织或细胞。在一些实施方案中，样品来自人体组织并且可以来自病变组织和/或正常组织，例如来自患有要治疗的疾病或病症的受试者和/或来自与这类受试者相同物种但未患要治疗的疾病或病症的受试者。在一些情况下，正常组织或细胞来自患有要治疗的疾病或病症的受试者，但本身不是病变细胞或组织，例如来自与给定受试者中存在的癌症相同或不同器官的正常组织。
可以使用本领域已知的用于检测特异性抗体-抗原结合的各种方法。示例性免疫测定包括荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、浊度抑制免疫测定(NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。可以使用指示剂部分或标记基团以满足该方法的各种用途的需要，通常由测定设备的可用性和兼容的免疫测定程序决定。示例性标记包括放射性核素(例如125I、131I、35S、3H或32P和/或铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y))、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶或β-半乳糖苷酶)、荧光部分或蛋白质(例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、GFP或BFP)或发光部分(例如、QdotTM纳米颗粒，由Quantum DotCorporation，Palo Alto，Calif.提供)。用于进行上述各种免疫测定的各种通用技术是已知的。
在某些实施方案中，提供了标记抗体(例如抗Claudin18.2单结构域抗体)。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色团、电子致密、化学发光和放射性标记)以及间接检测(例如，通过酶促反应或分子相互作用)的部分，例如酶或配体。在其它实施方案中，抗体没有被标记，并且可以使用与任何抗体结合的标记抗体来检测其存在。
5.8.试剂盒和制品
还提供了包含本文所述的单结构域抗体、嵌合抗原受体或工程化免疫效应细胞中的任一种的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施方案中，提供了包含任一种本文所述的药物组合物并优选提供其使用说明的试剂盒。
本申请的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供例如缓冲剂和解释性信息等额外组件。本申请因此还提供了制品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、软包装等。
该制品可包含容器和在所述容器上或与所述容器相关联的标签或包装说明书。适合容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。所述容器可由例如玻璃或塑料的各种材料制成。通常，容器装有有效治疗本文所述的疾病或病症(例如癌症)的组合物，并且可具有无菌接入端口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装说明书表明该组合物用于治疗个体的特定病症。标签或包装说明书将进一步包含用于向个体施用组合物的说明。标签可指示复原和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多用途小瓶，其允许复原制剂的重复施用(例如2-6次施用)。包装说明书是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明，其含有关于使用这类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。此外，制品还可以包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer's)溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括在商业和使用者看来所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
试剂盒或制品可以包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明，以足以在药房如医院药房和配制药房中存储和使用的量包装。
为了简洁起见，本文使用了某些缩写。一个实例是代表氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸和其对应的三字母和单字母缩写如下：
氨基酸 三字母 单字母 氨基酸 三字母 单字母
丙氨酸 Ala (A) 亮氨酸 Leu (L)
精氨酸 Arg (R) 赖氨酸 Lys (K)
天冬酰胺 Asn (N) 甲硫氨酸 Met (M)
天冬氨酸 Asp (D) 苯丙氨酸 Phe (F)
半胱氨酸 Cys (C) 脯氨酸 Pro (P)
谷氨酸 Glu (E) 丝氨酸 Ser (S)
谷氨酰胺 Gln (Q) 苏氨酸 Thr (T)
甘氨酸 Gly (G) 色氨酸 Trp (W)
组氨酸 His (H) 酪氨酸 Tyr (Y)
异亮氨酸 Ile (I) 缬氨酸 Val (V)
本公开在本文中通常使用肯定性语言描述众多实施方案来公开。本公开还具体包括全部或部分排除特定主题，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析的实施方案。因此，即使本公开在本文中通常未根据本公开不包括的内容来表达，但未明确包括在本公开中的方面仍然在本文中公开。
已经描述了本公开的大量实施方案。然而，应理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，以下实施方案旨在说明但不限制权利要求书中描述的公开范围。
6.实施例
以下描述了研究中使用的各种方法和材料，提出这些实施例以便为本领域普通技术人员提供如何进行和使用本公开的完整公开和描述，既不意图限制发明人视为其公开内容的范围，也不意图表示仅进行以下实验或以下实验是可以进行的所有实验。应当理解，不一定执行以现在时写的示例性描述，而是可以执行这些描述来生成与本公开的教授内容相关联的数据等。已经努力确保关于所使用的数值(例如量、温度等)的准确性，但也应考虑一些实验误差和偏差。
6.1.实施例1-抗Claudin18.2抗体的产生
为了开发含有对Claudin18.2具有高结合亲和力的结合部分的抗体，对骆驼进行免疫接种并构建噬菌体展示文库以鉴定抗Claudin18.2VHH前导。
细胞系构建
Dubca.huCLDN18.2.Luc细胞系是按照以下简要描述的方法在内部开发的。合成人CLDN18.2编码序列(NM_001002026.2)并亚克隆到EcoRI和BamHI限制性位点之间的pLVX-puro(Clontech，目录号632164)以获得转移载体pLVX-huCLDN18.2.Luc.Puro。慢病毒通过用包括psPAX2、pMD.2G和pLVX-huCLDN18.2.Luc.Puro在内的质粒混合物瞬时转染Lenti-X293T宿主细胞进行包装。用100μL获得的LV-huCLDN18.2.Luc.PuroR慢病毒转导0.5×106个Dubca细胞(
Figure BDA0003709776140001801
CRL2276TM)。并通过每2-3天更新选择培养基(伊格尔氏最小必需培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)补充10％FBS和2μg/mL嘌呤霉素)，用嘌呤霉素选择转导的细胞，以获得Dubca.huCLDN18.2.Luc细胞。3轮选择后，通过胰蛋白酶消化收获所获得的细胞克隆。将获得的细胞保存完好，供进一步使用。
通过流式细胞术，使用来自GenScript的小鼠抗人Claudin18.2抗体，验证人CLDN18.2在Dubca.huCLDN18.2.Luc细胞系上的表达。简单地说，将2.0×105Dubca.huCLDN18.2.Luc细胞或Dubca细胞与抗人Claudin18.2一抗在4℃下孵育30分钟，然后用DPBS进行洗涤-离心-去除上清液-细胞洗涤的循环3次。洗涤后，将细胞沉淀用DPBS重悬，并与二抗(PE抗人IgG Fc抗体，Biolegend，目录号409304)在4℃下避光孵育30分钟。然后通过用DPBS进行洗涤-离心-去除上清液-细胞洗涤的循环3次来处理细胞。然后在Attune NXT流式细胞仪(Thermo Fisher)上运行细胞以检测人Claudin18.2的表达水平。标记的Dubca.huCLDN18.2的平均荧光强度(MFI)比Dubca细胞高641.59倍。
还根据上述Dubca.huCLDN18.2.Luc细胞系产生和制备程序开发了几种其它细胞系来表达人CLDN18.1(NM_016369.3)或人CLDN18.2蛋白(NM_001002026.2)。这类细胞系包括胃癌细胞系，包括KATOIII(ATCC#HTB-103)和NUGC4(JCRB0834)；胰腺癌细胞系PANC1(ATCC#CRL-1469TM)；和HEK293T(Clontech，目录号632180)。用内部制备的慢病毒LV-huCLDN18.1.Luc.Puro或LV-huCLDN18.2.Luc.Puro原液转导宿主细胞。并且用嘌呤霉素选择转导的细胞以获得稳定细胞。简单地说，KATOIII是一种人胃癌细胞系，可表达低水平的人Claudin18.2。开发KATOIII.huCLDN18.2.Luc细胞系用于共表达通过2A肽连接的人Claudin18.2和萤火虫荧光素酶。开发KATOIII.huCLDN18.1.Luc细胞用于共表达通过2A肽连接的人Claudin18.1和萤火虫荧光素酶。开发KATOIII.Luc细胞系单独过表达萤火虫荧光素酶。PANC1是一种胰腺癌细胞系，不表达人Claudin18.1或人Claudin18.2蛋白。表达人Claudin18.1(NM_016369.3)或人Claudin18.2(NM_001002026.2)的细胞系是基于PANC1细胞开发的，分别命名为PANC1.huCLDN18.1.Luc和PANC1.huCLDN18.2.Luc。类似地，开发NUGC4.Luc细胞系表达荧光素酶报告基因。开发HEK293T.huCLDN18.1.Luc和HEK293T.huCLDN18.2.Luc稳定细胞分别共表达人Claudin18.1和荧光素酶以及共表达人Claudin18.2和荧光素酶。
动物免疫和免疫反应测定
将包含如上制备的Dubca.huCLDN18.2细胞的免疫原与佐剂或PBS混合并注射到成年雄性双峰骆驼中。以约1周至2周的时间间隔，将动物免疫接种五次，通常每次使用或不用CFA(完全弗氏佐剂)。在免疫接种前的阶段和每次免疫接种后收集外周血样品。通过梯度离心从约100mL外周血中分离淋巴细胞，并补充RNALaterTM并且存储在-80℃下。通过离心抗凝血样获得血清并存储在-80℃下。
多轮免疫接种后，通过HEK293T.CLDN18.2.Luc细胞结合测量抗原特异性抗体滴度，数据表明抗体滴度随着免疫接种明显升高。
VHH噬菌体展示文库构建
使用
Figure BDA0003709776140001821
试剂(Thermofisher，目录号15596026)，根据制造商的说明书，从分离的淋巴细胞中提取总RNA，并使用PrimeScriptTM第1链cDNA合成试剂盒(Takara，目录号6110A)，根据制造商的方案，用寡(dT)20引物逆转录成cDNA。正向和反向特异性简并引物(参见中国专利CN105555310B)被设计用于扩增引入了两个SfiI限制性位点的VHH片段。VHH片段使用两步聚合酶链式反应(PCR)扩增，并将PCR产物用SfiI消化并进行凝胶纯化，然后插入噬菌粒载体pFL249中(参见CN105555310B)，电转移至大肠杆菌细胞中，产生噬菌体展示VHH免疫文库。
将一小部分转化的细胞稀释并在补充有100μg/mL氨苄西林的2×YT平板上划线。对菌落进行计数以计算文库的大小。随机挑选阳性克隆并测序以评估文库的质量。将剩余转化的细胞划线到补充有100μg/mL氨苄西林和2％葡萄糖的245mm YT平板上。从平板上刮下菌苔。一小部分细胞用于文库质粒分离。其余补充甘油并存储在-80℃下，作为储备。
噬菌体展示淘选
如下所述进行两轮淘选。将上面制备的KATOIII.huCLDN18.2.Luc细胞、HEK293T.huCLDN18.2.Luc细胞和NUGC4.huCLDN18.2.Lu c细胞分别与噬菌体文库一起孵育。充分洗涤后，结合的噬菌体颗粒被洗脱并用1mg/mL胰蛋白酶来收集。在第二轮选择中，将所获得的噬菌体颗粒与KATOIII.CLDN18.2.Luc细胞一起孵育，并使用1mg/mL胰蛋白酶洗脱和收集结合的噬菌体。
淘选后，使用100mM三甲胺(TEA)洗脱和收集结合的噬菌体颗粒，并用1M Tris-HCl(pH 7.4)中和洗脱液。然后将一半的洗脱液用于感染呈指数生长的大肠杆菌TG1细胞(OD600＝0.4-0.6)用于输出滴定。
进行噬菌体ELISA以鉴定对靶抗原具有特异性的克隆。使单个输出噬菌体克隆在96深孔板中生长，并由M13KO7辅助噬菌体拯救过夜。为了鉴定与抗原蛋白结合的克隆，将96孔ELISA微量滴定板分别用包被缓冲液中的重组人HEK293T.huCLDN18.1.Luc和HEK293T.huCLDN18.2.Luc细胞在4℃下包被过夜，然后将平板用封闭缓冲液封闭。封闭后，将来自过夜细胞培养物的噬菌体上清液以每孔约50μL添加到平板中，在4℃下孵育1.5小时。将平板洗涤四次，并将HRP缀合的抗M13单克隆抗体添加到板中，在4℃下孵育45分钟。将平板再次洗涤五次并将底物溶液添加到孔中用于显色。测量每个孔在450nm下的吸光度。
为了进一步鉴定结合HEK293T.huCLDN18.2.Luc细胞的克隆，将HEK293T.CLDN18.2.Luc细胞在室温下用封闭缓冲液封闭1小时。封闭后，将来自过夜细胞培养物的噬菌体上清液以每孔约20μL添加到细胞溶液中，在室温下孵育1小时。将细胞洗涤4次后，添加HRP缀合的抗M13单克隆抗体，在室温下孵育30分钟。将细胞洗涤五次，然后添加底物溶液进行显影。测量450nm下的吸收。
筛选后，选择具有高结合能力的克隆并测序。表2中总结了CDR和VHH序列。
6.2.实施例2-嵌合抗Claudin18.2抗体的制备
使用GenScript OptimumGeneTM-密码子优化将所选抗体的VHH编码序列针对人密码子偏好的表达进行优化，合成并与人IgG1Fc编码序列(SEQ ID NO:76)融合，以呈嵌合格式进行瞬时表达。将嵌合抗体编码序列克隆到基于pcDNA3.4的哺乳动物表达系统质粒中，并通过GenScript目录服务对质粒进行最大程度的制备用于产生蛋白质。构建质粒以表达对照抗体175DX-hIgG1Fc，该对照抗体含有与人IgG1Fc融合的具有IMAB362的重链可变区和轻链可变区的单链可变片段(SEQ ID NO:52)。IMAB362(克劳昔单抗(Claudiximab)、佐妥昔单抗(Zolbetuximab))是一种嵌合单克隆IgG1抗体，已经在许多用于治疗晚期胃食管癌患者的临床试验中进行了研究(Sahin等人，Journal of Hematology&Oncology，10:105(2017))。
嵌合抗体在用嵌合VHH-hIgG1Fc或175DX-hIgG1Fc编码质粒转染的Expi293F细胞(Thermofisher，目录号A14527)中表达。简单地说，在转染前一天，将Expi293FTM细胞以适当的密度接种在带有无血清Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher Scientific)的锥形瓶(Corning)中，并在轨道式振荡器(VWR Scientific)上在37℃与8％CO2下生长。在转染当天，将含有嵌合抗体编码序列的质粒和ExpiFectamineTM 293试剂以最佳比率混合，然后添加到准备转染的细胞的烧瓶中。转染后大约16-18小时，将ExpiFectamineTM 293转染增强剂1和ExpiFectamineTM 293转染增强剂2添加到每个烧瓶中。
在第6天，将细胞培养液离心并随后过滤。将获得的细胞培养上清液以适当的流速加载到亲和纯化柱上。在用适当的缓冲液洗涤和洗脱后，将洗脱的级分汇集并将缓冲液交换为最终的制剂缓冲液。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析纯化的蛋白质以确定分子量和纯度。浓度用A280法测定。示例性CAR和相应的序列显示在表5中。
6.3.实施例3-嵌合抗Claudin18.2抗体的表征
通过基于细胞的流式细胞术测试抗Claudin18.2抗体与PANC1.huCLDN18.1.Luc和PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞的结合能力。简单地说，将DPBS(pH 7.2)中的5.0×105个PANC1.huCLDN18.1.Luc或PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞与连续稀释的抗Claudin18.2 VHH-hIgG1Fc在4℃下孵育45分钟，然后用DPBS进行洗涤-离心-去除上清液-洗涤细胞的循环3次。洗涤后，将细胞沉淀重悬在DPBS中，并与二抗(1:200，Alexa FluorTM 488山羊抗人IgG(H+L)抗体，Invitroge n，目录号A11013)在4℃下避光孵育30分钟。然后细胞用DPBS进行洗涤-离心-去除上清液-洗涤细胞的循环3次。然后在Attune NXT流式细胞仪上运行细胞以检测抗体-PANC1.huCLDN18.1.Luc或PAN C1.huCLDN18.2.Luc结合水平。每种测试抗体的结合能力被描述为结合百分比，用(具有抗体结合的细胞/总细胞)×100％计算。如实施例2中制备的175DX-hIgG1Fc用作测定中的基准。结果示于图1和表6中。
表6.嵌合抗体对PANC1.huCLDN18.1.Luc或PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞的结合能力
Figure BDA0003709776140001851
Figure BDA0003709776140001861
“n.s.”表示无显著结合。
如图1和表6所示，本公开的嵌合抗体显示以剂量依赖性方式与PANC1.huCLDN18.2.Luc有效结合，但不与PANC1.huCLDN18.1.Luc细胞结合，表明它们与人CLDN18.2的结合特异性。嵌合抗体对PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞的结合效力(EC50值在0.71nM至10.92nM范围内)比基准175DX-hIgG1Fc(EC50＝13.51nM)高大约1.24至19.03。此外，本公开的每种嵌合抗体在101nM的浓度下的最大结合％几乎为100％，而基准在相同浓度下的结合％约为40％。
6.4.实施例4-制备含有嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞
合成编码嵌合抗原受体(CAR)骨架多肽的核苷酸分子并在下游克隆到预先修饰的慢病毒载体(pLSINK-BBzBB)中并且可操作地连接于组成型hEF1α启动子，或在下游克隆到克隆载体(PT7-0985)中并连接于T7启动子以进行体外转录，该多肽从N端到C端包含C端CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:68)、CD8α跨膜结构域(SEQ ID NO:69)、CD137共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:70)和CD3ζ细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:72)。载体中的多克隆位点(MCS)允许包含科扎克序列(Kozak sequence)的核酸序列插入到CAR骨架载体中，在上游并且可操作地连接于CAR骨架序列，该科扎克序列可操作地连接于与抗Claudin18.2 VHH片段的N端融合的编码CD8α信号肽(SEQ ID NO:67)的核酸序列。化学合成编码CD8α信号肽的核酸序列和抗Claudin18.2 VHH片段，并通过本领域已知的分子克隆技术经由MluI(5′-ACGCGT-3′)和SpeI(5′-ACTAGT-3′)限制性位点克隆到PT7-0985或者经由EcoRI(5′-GAATTC-3′)和SpeI(5′-ACTAGT-3′)限制性位点克隆到pLSINK-BBzBB CAR骨架中。
CAR构建体RNA通过使用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒和多聚(腺苷酸)加尾试剂盒(Thermo Fisher AM1344和AM1350)进行体外转录来制备。简单地说，将纯化的质粒按照试剂盒的说明书进行体外转录反应和孵育。然后使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN，目录号75144)纯化转录的RNA(IVT-RNA)。最后，IVT-RNA以10μL/小瓶液化，立即存储于-80℃或直接用于CAR-T制备。
将含有pMDLg.pRRE(Addgene#12251)、pRSV-REV(Addgene#12253)和pMD2.G(Addgene#12259)的慢病毒包装质粒混合物与表达CAR构建体的载体以预先优化的比率与聚醚酰亚胺(PEI)预混合，然后在25℃下孵育5分钟。然后将HEK293细胞添加到转染混合物中。之后，将细胞在细胞孵育箱中在5％CO2下在37℃下孵育过夜。在4℃和3000g下离心15分钟后收集上清液，并通过0.45μm PES过滤器过滤，然后超离心以浓缩慢病毒。然后小心弃去上清液，用预冷的DPBS小心冲洗病毒团块。将病毒适当地液化，并存储在-80℃下。经由转导CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系，通过滴定法测定病毒滴度。
通过单采血液成分术从健康供体中收集白细胞，并在TexMACS GMP培养基&1L(Miltenyi#170-076-309)中将细胞浓度调整为5×106个细胞/毫升。然后将白细胞与0.9％NaCl溶液以1:1(v/v)比率混合。将3mL lymphoprep培养基添加到15mL离心管中，然后将6mL稀释的淋巴细胞混合物缓慢分层堆积在lymphoprep培养基的顶部。将淋巴细胞混合物在20℃下以800g离心30分钟，无需中断。然后用200μL移液管收集淋巴细胞血沉棕黄层。用0.9％NaCl或R10将收获的级分稀释至少6倍以降低溶液的密度。然后将收获的级分在20℃下以250g离心10分钟。完全吸出上清液，将10mL R10添加到细胞沉淀中以重悬细胞沉淀。将混合物在20℃下以250g进一步离心10分钟。再次吸出上清液。将2mL 37℃预热的具有300IU/mLIL-2的TexMACS GMP培养基&1L(Miltenyi#170-076-309)添加到细胞沉淀中，并将细胞沉淀轻轻重悬。在台盼蓝(Trypan Blue)染色后确定细胞数目，该PBMC样品准备好用于以后的实验。
使用Miltenyi全T细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)，根据如下所述的制造商的方案，从PBMC中纯化人T细胞。首先确定细胞数目，并将细胞悬浮液以300g离心10分钟。然后完全吸出上清液，将细胞沉淀每107个总细胞重新悬浮在40μL MACS缓冲液(补充8μMEDTA+0.5％FBS的DPBS)中。每107个总细胞添加10μL全T细胞生物素-抗体混合物，充分混合，并在冰箱中孵育约5分钟(2-8℃)。然后每107个细胞添加30μL MACS缓冲液。每107个细胞添加20μL全T细胞MicroBead混合物。将细胞悬浮液混合物充分混合并在冰箱中再培养10分钟(2-8℃)。磁分离至少需要500μL。对于磁分离，将LS柱置于合适的MACS分离器的磁场中。通过用3mL缓冲液冲洗来准备柱。然后将细胞悬浮液施加到柱上，并收集含有未标记细胞的流出物，这代表了富集T细胞部分。通过用3mL缓冲液洗涤柱并收集通过的未标记细胞来收集额外的T细胞。这些未标记的细胞再次代表富集T细胞，并与上一步的流出物组合。然后将合并的富集T细胞离心并重新悬浮在TexMACS GMP培养基&1L(Miltenyi#170-076-309)+300IU/mL IL-2中。
随后用人T细胞TransActTM(Miltenyi#130-111-160)，根据制造商的方案，预活化制备的T细胞48-96小时，其中抗CD3/CD28MACSiBead颗粒以1:2的珠粒:细胞比率添加。
通过将慢病毒原液直接添加到培养基(TexMACS GMP培养基)中，用慢病毒原液以感染复数(MOI)10转导预活化的T细胞。48小时后，将转导的细胞转移到细胞培养孵育箱中，在细胞培养孵育箱中在5％CO2下在37℃下进行转基因表达。
或者，使用CAR IVT-RNA对预活化的T细胞进行电穿孔，方案如下所述。通过在室温下以300g离心10分钟来收获预活化的T细胞。完全去除上清液后，将细胞沉淀重悬于Celetrix 103缓冲液中，并通过台盼蓝染色评估细胞浓度，并以每120μL 4-6×106个人T细胞分装。通过将10μg CAR-mRNA添加到预活化的T细胞的每个等分试样中来制备电穿孔混合物。然后，通过使用Celetrix电穿孔仪，在预先优化的电压和脉冲(820V/20ms)下进行电穿孔。电穿孔过程后立即将细胞转移到新的预热培养基中，并在加湿的37℃与5％CO2孵育箱中培育过夜，直至分析。
在IVT-RNA电穿孔后的第2天至第4天，收获电穿孔的T细胞。通过流式细胞术评估CAR表达水平。简单地说，从每组收集1×106个电穿孔的T细胞，然后针对基于VHH的CAR-T，与FITC标记的MonoRabTM兔抗骆驼科VHH抗体(iFluor 647)mAb(Genscript目录号A01994)在4℃下孵育30分钟。孵育完成后，收获细胞并用DPBS洗涤，然后在20℃下以300g离心10分钟。UnT代表未用CAR转导的T细胞。
在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上读取制备的CAR-T细胞的表达水平，并且数据总结在表7中。
表7.CAR-T细胞的表达水平
Figure BDA0003709776140001891
6.5.实施例5-工程化CAR-T细胞的表征
进行细胞毒性测定。将实施例4中制备的CAR-T细胞与实施例1中制备的PANC1.huCLDN18.2.Luc、PANC1.huCLDN18.1.Luc、NUGC4.Luc和KATOIII.Luc细胞分别在10:1或2:1效应细胞(CAR-T细胞)与靶细胞的比率(E:T)下共同孵育20-24小时。为测定CAR-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，根据制造商的方案制备One-glo发光荧光素酶测定试剂(Promega#E6120)，并添加到共培养的细胞中以检测孔中剩余的荧光素酶活性。剩余的荧光素酶活性与孔中活靶细胞的数目直接相关。特异性细胞毒性由下式计算：特异性细胞毒性％＝100％×(1-(RLU样品-RLU最小)/(RLUUnT-RLU最小))。RLU样品表示如在含有具有本公开的抗Claudin18.2 CAR的CAR-T细胞的孔中测量的荧光素酶活性。RLU最小是指当细胞毒性测定开始时在添加了最终浓度为1％的Triton X-100的孔中测定的荧光素酶活性，并且RLUUnT是指在未用CAR转导的T细胞的孔中测定的荧光素酶活性。
如图2(a和b部分)和图3(a和b部分)所示，LIC182501 CAR-T细胞至LIC182514CAR-T细胞对稳定过表达人Claudin18.2(如通过流式细胞术所测定，大约98.5％人CLDN18.2表达水平)的PANC1.CLDN18.2.Luc细胞显示出有效杀伤作用，而这些CAR-T细胞对稳定过表达人Claudin18.1的PANC1.CLDN18.1.Luc细胞没有显示出显著的细胞毒性。在10:1的E/T比率下，LIC182501 CAR-T细胞至LIC182514 CAR-T细胞对PANC1.CLDN18.2.Luc细胞显示出高细胞毒性。在2:1较低的E/T比率下，LIC182501 CAR-T细胞(37.443％±2.951％)对PANC1.CLDN18.2.Luc细胞显示出比本公开的其它基于VHH的CAR-T更高的细胞毒性。
KATOIII.Luc细胞具有低CLDN18.2表达水平。杀伤表达低抗原(CLDN18.2)水平的细胞的能力可能会在允许更多患者参与治疗方面提供更多的临床益处。如图2(d部分)所述，在10:1的E/T比率下，LIC182501 CAR-T细胞至LIC182510 CAR-T细胞(从43.26％±2.35％至56.22％±1.58％)对KATOIII.Luc细胞显示出良好的杀伤效力。在2:1较低的E/T比率下，LIC182501 CAR-T细胞至LIC182510 CAR-T细胞对KATOIII.Luc细胞仍然显示出有效的杀伤效力(从4.59％±2.84％至21.85％±12.4％)。如图3(d部分)所述，在10:1的E/T比率下，LIC182513-LIC182514 CAR-T细胞的杀伤效力略高于LIC182511CAR-T细胞和LIC182512CAR-T细胞。在2:1的E/T比率下，LIC182512CAR-T细胞和LIC182514 CAR-T细胞显示出比LIC182511 CAR-T细胞和LIC182513 CAR-T细胞更强的细胞毒性。
又如图2(c部分)和图3(c部分)所示，所有测试的CAR-T细胞均能有效杀死NUGC4.Luc细胞(如通过流式细胞术测定，大约67.1％人CLDN18.2蛋白表达)。在10:1的E/T比率下，LIC182501 CAR-T细胞至LIC182510 CAR-T细胞(从95.06％±0.43％至99.17％±0.12％)对NUGC4细胞显示出高杀伤效力。在2:1较低的E/T比率下，LIC182501 CAR-T细胞至LIC182509CAR-T细胞(从48.90％±1.13％至74.18％±2.78％)也显示出对NUGC4细胞的杀伤力高于LIC182510CAR-T细胞。在10:1的E/T比率下，LIC182511至LIC182514 CAR-T细胞显示出可比的细胞毒性效力。在2:1的E/T比率下，LIC182512CAR-T细胞和LIC182514 CAR-T细胞显示出略高的细胞毒性效力。
6.6.实施例6-Claudin18.2 CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效研究
在NUGC4.Luc胃癌系统性NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl)小鼠模型中评估Claudin18.2 CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效。
如上所述，使用慢病毒转导制备CAR-T细胞。
每只小鼠用3×106个NUGC4.Luc细胞皮下注射免疫缺陷小鼠NCG。12天后，通过静脉内途径，向具有皮下异种移植瘤的NCG小鼠注射CLDN18.2特异性CAR-T细胞或CD19特异性CAR-T细胞(1×106个/小鼠)。CD19特异性CAR-T(CD19 CAR-T)是靶向人CD19抗原的CAR-T细胞，其包含来自FMC63的scFv(NCBI登录号#ADM64594.1)和与测试的其它CAR相同的CAR框架(CD8α信号肽-抗原结合结构域-CD8α铰链和跨膜结构域-CD137共刺激信号传导结构域-CD3ζ细胞内信号传导结构域)。监测这些小鼠的肿瘤体积以评估在施用T细胞后大约4周的抗肿瘤功效。通过GraphPad prism 6，使用单向ANNOVA，进行多重比较。
如图4(a部分)所示，Claudin18.2 CAR-T细胞在体内对移植NUGC4细胞的异种移植模型显示出抗肿瘤作用。与CD19 CAR-T相比，Claudin18.2 CAR-T有效控制或消除该胃癌异种移植模型中的肿瘤生长。如图4(a部分)和表8所示，与基准CAR-T(基于IMAB362的175DXCAR-T)相比，基于VHH的候选CAR-T，包括LIC182508、LIC182511、LIC182513和LIC182514CAR-T细胞，显示出明显更强的体内抗肿瘤作用。
表8.CAR-T处理后不同天数的抗肿瘤功效差异的显著性
组/CAR-T处理后天数 第23天 第25天 第27天
175DX CAR-T对比LIC182508 CAR-T ** *** ****
175DX CAR-T对比LIC182511 CAR-T ** *** ****
175DX CAR-T对比LIC182513 CAR-T ** *** ****
175DX CAR-T对比LIC182514 CAR-T * ** ***
(****：p<0.0001；***：0.0001<p<0.001；**：0.001<p<0.01；*：0.01<p<0.05)
在体内研究结束时，收集肿瘤组织并称重，以评估测试的候选CAR-T的抗肿瘤功效。如图4(b部分)所示，从LIC182508、LIC182511、LIC182513、LIC182514和175DX CAR-T救援的小鼠中收集的肿瘤重量明显低于用CD19 CAR-T处理的小鼠。与175DX CAR-T相比，基于VHH的CAR-T细胞在体内减少或消除胃癌细胞的能力明显更强。
总之，数据表明CLDN18.2特异性CAR-T能有效抑制体内胃癌的生长。并且测试的基于VHH的Claudin18.2 CAR-T似乎显示出比175DX CAR-T明显更强的抗肿瘤效力。
6.7.实施例7-人源化嵌合抗Claudin18.2抗体的产生和表征
为了将含有对Claudin18.2具有高结合亲和力的结合部分的抗体人源化，根据Ce′cile Vincke等人(J.Biol.Chem.2009，284:3273-3284)或通过重修VHH抗体框架的方法，将抗Claudin18.2 VHH抗体氨基酸残基人源化。
采用Cécile Vincke等人设计的通用人源化VHH框架h-NbBcII10FGLA(蛋白质数据库(PDB)代码:3EAK)进行基于序列同源性的人源化设计。根据规范结构和残基取代偏好，从骆驼科VHH182513或VHH182511序列中恢复移植的人源化序列上的多个位点。
使用建模软件MODELLER对骆驼科VHH182513和VHH182511进行同源建模。VHH182513的参考同源序列是与锌结合的骆驼科单结构域抗体(PDB代码:6KSN)，VHH182511是骆驼科VHH HL6抗体(PDB代码:1OP9)。根据与人种系基因的比对，IGHV3-30*01被选为VHH182513的人受体，并且IGHV3-23*05被选为VHH182511的人受体。氨基酸的相对溶剂可及性根据蛋白质的三维结构来计算。如果VHH的一个氨基酸暴露于溶剂，则它就会被原始氨基酸替换。人源化抗Claudin18.2 VHH和其亲本VHH的序列ID号列于表10。
使用GenScript OptimumGeneTM-密码子优化将选定的人源化单结构域抗体克隆的编码序列针对人密码子偏好的表达进行密码子优化。合成所得到的编码DNA片段，并与编码人IgG1 Fc部分的核苷酸(SEQ ID NO:76)融合，以呈嵌合格式进行瞬时表达。将构建体克隆到合成信号肽(SEQ ID NO:112：MGWSCIILFLVATATGVHS)下游的单个基于pcDNA3.4的质粒中，用于分泌表达。使用实施例2中描述的方法获得人源化嵌合抗Claudin18.2抗体。测量人源化嵌合抗体与PANC1.huCLDN18.1.Luc或PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞的结合能力。结果在图5和表9中示出。
表9.嵌合抗体与PANC1.huCLDN18.1.Luc或PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞的结合能力
Figure BDA0003709776140001941
“ns”表示没有显著结合；“低”表示低结合且不饱和，无法计算EC50值。
对成功表达并以合理蛋白质产量获得的嵌合抗体与huCLDN18.2对比huCLDN18.1的结合进行测试。如图5和表9所示，嵌合人源化或非人源化VHH抗体显示出以剂量依赖性方式与PANC1.huCLDN18.2.Luc有效结合，但不与PANC1.huCLDN18.1.Luc细胞结合，表明它们与huCLDN18.2的结合特异性。这些嵌合抗体对PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞的结合效力(EC50值在0.2862nM至25.45nM范围内)比基准175DX-hIgG1Fc(EC50＝49.22nM)高大约1.93至171.98倍。
6.8.实施例8-人源化Claudin18.2 CAR-T细胞的制备和表征
使用实施例4中描述的CAR骨架并遵循实施例4中描述的制备CAR的方法。获得了具有人源化抗Claudin18.2 VHH的CAR构建体，包括LIC182513H4、LIC182513H7、LIC182513H8、LIC182513H9、LIC182513H10、LIC182511H6、LIC182511H8和LIC182511H9(表10)。表10中还示出了亲本CAR的序列ID号，即LIC182513和LIC182511。
表10.CAR的氨基酸序列和相应的VHH结构域
CAR代码 AA SEQ ID NO. VHH代码 AA SEQ ID NO.
LIC182513 SEQ ID NO:65 VHH182513 SEQ ID NO:50
LIC182513H4 SEQ ID NO:86 VHH182513H4 SEQ ID NO:78
LIC182513H7 SEQ ID NO:87 VHH182513H7 SEQ ID NO:79
LIC182513H8 SEQ ID NO:88 VHH182513H8 SEQ ID NO:80
LIC182513H9 SEQ ID NO:89 VHH182513H9 SEQ ID NO:81
LIC182513H10 SEQ ID NO:90 VHH182513H10 SEQ ID NO:82
LIC182511 SEQ ID NO:63 VHH182511 SEQ ID NO:48
LIC182511H6 SEQ ID NO:91 VHH182511H6 SEQ ID NO:83
LIC182511H8 SEQ ID NO:92 VHH182511H8 SEQ ID NO:84
LIC182511H9 SEQ ID NO:93 VHH182511H9 SEQ ID NO:85
实施例4中示出了转导产生CAR-T细胞的步骤。细胞转导12天后，通过在室温下以300g离心10分钟收获细胞。将细胞沉淀用细胞培养基或DPBS重悬，并分装并在室温下以300g再次离心10分钟。然后将细胞沉淀使用细胞培养基或DPBS重悬以供进一步使用。处理DPBS重悬细胞的等分试样，用于通过流式细胞术评估CAR表达水平。
CAR-T细胞体外细胞毒性测定
在制备CAR-T细胞并与PANC1.huCLDN18.2.Luc、PANC1.huCL DN18.1.Luc和NUGC4.Luc细胞分别在8:1或2:1效应细胞(CAR-T细胞)与靶细胞的比率(E:T)下共同孵育20-24小时后，进行细胞毒性测定。未转导的T细胞用作对照。175DX CAR-T细胞用作基准对照。靶向人CD19抗原的CD19 CAR-T细胞用作阴性对照。
如图6(a-c部分)所示，人源化CAR-T细胞对稳定过表达人Claudin18.2的PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞(参见图6，a部分)和对人Claudin18.2表达也呈阳性的胃癌细胞系NUGC4.Luc(参见图6，c部分)显示出有效杀伤作用。然而，这些人源化CAR-T对PANC1.huCLDN18.1.Luc细胞没有显示出显著的细胞毒性，PANC1.huCLDN18.1.Luc细胞对人Claudin18.2表达呈阴性但对人Claudin18.1表达呈阳性(参见图6，b部分)。这些结果表明，这种人源化CAR-T细胞对人Claudin18.2具有特异性，对人Claudin18.1没有特异性。基准对照(175DX CAR-T细胞)也显示出这种趋势。阴性对照CD19 CAR-T细胞对这3种CD19阴性靶细胞中的任何一种均未显示出细胞毒性。
如图6(a-c部分)所示，尤其是在较低E:T比率(E:T＝2:1)下，基于VHH的CAR-T细胞，包括LIC182513、LIC182513H4、LIC182513H7、LIC182513H8、LIC182513H9、LIC182513H10、LIC182511和LIC182511H9 CAR-T细胞，对NUGC4.Luc(基于VHH的CAR-T的范围为21.45±2.61％至61.68±3.45％，对比175DX CAR-T的14.00±4.64％)和PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞(基于VHH的CAR-T的范围为40.44±1.79％至65.44±1.70％对比175DX CAR-T的30.10±3.78％)显示出更高的杀伤效率。有趣的是，LIC182513 CAR-T细胞的人源化型式，包括LIC182513H4、LIC182513H7、LIC182513H8、LIC182513H9和LIC182513H10 CAR-T细胞，对NUGC4.Luc(人源化基于VHH的CAR-T的范围为32.08±4.45％至61.68±3.45％，对比亲本CAR-T的21.45±2.61％)和PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞(基于VHH的CAR-T的范围为43.12±2.37％至65.44±1.70％对比亲本CAR-T的42.14±1.05％)显示出更高的靶向杀伤效率。而在人源化后，LIC182511H9 CAR-T对NUGC4.Luc细胞的杀伤效率与其亲本克隆LIC182511 CAR-T相当，或者对PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞的效力低于其亲本克隆LIC182511 CAR-T；然而，其余的克隆没有显示出对其亲本克隆LIC182511 CAR-T的效力提高。
CAR-T细胞的细胞因子释放的评估
从体外共培养测定中收集上清液，以使用HTRF试剂盒(Cisbio，目录号62HIFNGPEG)分析CAR特异性细胞因子的释放(干扰素γ或IFNγ)。简单地说，在测定前使HTRF试剂升温到室温，保持至少30分钟。将16μL/孔来自共培养测定的上清液转移到384孔测定板(Greiner Bio-One，#784075)，然后添加4μL/孔根据试剂盒手册制备的预混合HTRF试剂。然后将平板用封口膜密封并在室温下孵育过夜。第二天，在兼容HTRF的读数器TecanSpark 10M上读取平板。参照通过试剂盒提供的标准曲线得到的信号来计算IFNγ浓度。
如图7(a和c部分)所示，所有这些Claudin18.2 CAR-T在与PANC1.huCLDN18.2.Luc细胞(基于VHH的CAR-T的范围为6597.11±112.14pg/mL至23019.15±242.28pg/mL对比CD19 CAR-T的208.00±28.05pg/mL)或NUGC4.Luc细胞(基于VHH的CAR-T的范围为868.16±41.09pg/mL至5753.65±66.88pg/mL对比CD19CAR-T的155.10±6.86pg/mL)共培养时均显示出显著的IFNγ释放。除了具有比UnT或CD19 CAR-T略高的自发IFNγ释放的LIC182513H10和LIC182511H9 CAR-T细胞外，所有测试的CAR-T细胞均显示出低水平的自发IFNγ释放(参见图7，d部分)。这些结果表明，这些基于VHH的CAR-T细胞可以以人Claudin18.2特异性方式释放IFNγ。
本文所引用的所有专利、公布的申请以及参考文献的教授内容均以引用的方式整体并入本文中。
虽然已经具体展示和描述了示例实施方案，但是本领域技术人员应了解，可在不脱离由随附权利要求书所涵盖的实施方案的范围的情况下在其中在形式和细节方面做出各种改变。
从前述内容可以理解，尽管为了说明的目的在本文中描述了特定实施方案，但是可以在不偏离本文所提供的精神和范围的情况下进行各种修改。所有参考文献均以引用的方式整体并入本文中。
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Gly Ser
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Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asp Tyr
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Gly Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
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Arg Gly Ser Pro Trp Trp Asn Ser Val Val Ala Leu Glu Ser Tyr Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Tyr
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<220>
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Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr
1 5 10
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 37
Asp Arg Phe Thr Tyr Pro Tyr Gly Val Ile Cys Gly Gly Ile Ser Ala
1 5 10 15
Asn Tyr Arg Tyr
20
<210> 38
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182501氨基酸序列
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Thr Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Ala Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ile Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Val Lys Lys Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Ala Tyr Thr Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182502氨基酸序列
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe Arg Ala Lys
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val
35 40 45
Ala Thr Ile Gln Ser Gly Tyr Tyr Arg Pro Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Ala Asp Lys Asn Arg Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Phe Thr Tyr Pro Pro Gly Val Ile Cys Gly Gly Ile
100 105 110
Ser Glu Asn Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182503氨基酸序列
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Thr Ile Tyr Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu His Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Val Ile Pro Gly Gly Thr Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Thr Tyr Leu Val Gly Ser Ala Pro Leu Ser Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 41
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182504氨基酸序列
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Thr Ser Tyr Thr Val Arg Leu Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Asp Ser Glu Lys Ala Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Tyr Tyr Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Arg Thr Ser Trp Cys Ser Val Ser Phe Asn Gly Tyr Asp Asp
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182505氨基酸序列
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ala Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala
35 40 45
Leu Ile Gly Arg Thr Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Asp Cys Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182506氨基酸序列
<400> 43
Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Ala Glu Tyr Tyr Ser Gly
20 25 30
Asp Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Arg Ala Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Ser Ala Arg Thr Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gly Thr Tyr Cys Arg Met Ala Leu Phe Gly Ala Cys Asn Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182507氨基酸序列
<400> 44
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ile Cys Thr Ala Ser Arg Ala Thr Asp Cys Asn Tyr
20 25 30
Met Ser Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
35 40 45
Arg Ile Phe Pro Ser Gly Lys Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Met Lys Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr Leu Leu
65 70 75 80
Met Val Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Lys Tyr Tyr Cys Gln Gly
85 90 95
Ser Cys Arg Gly Pro Gly Ser Ile Trp Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182508氨基酸序列
<400> 45
Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Thr Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Gln Gly Asn Ala Gly Ala Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Glu Gly Leu Cys Gly Trp Gly Gly Trp Glu Ser Ala Val
100 105 110
Arg Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 46
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182509氨基酸序列
<400> 46
Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Thr Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Ala Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Leu Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Val Lys Lys Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Ala Tyr Gly Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182510氨基酸序列
<400> 47
Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182511氨基酸序列
<400> 48
Gln Val Gln Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Thr Tyr Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Arg Val Ala Asn Val
35 40 45
Tyr Met Arg Asn Gly Asp Thr Trp Leu Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Thr Arg Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
85 90 95
Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182512氨基酸序列
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Glu Ala Ser Arg Ser Thr Ala Asn Met Ala
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala
35 40 45
His Ser Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Lys Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Arg Met Asn
65 70 75 80
Gly Leu Lys Pro Glu Glu Gly Val Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Gly
85 90 95
Ser Pro Trp Trp Asn Ser Val Val Ala Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182513氨基酸序列
<400> 50
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182514氨基酸序列
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Phe His Ser Lys
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val
35 40 45
Ala Thr Ile Gln Ser Gly Tyr Tyr Arg Pro Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Asp Lys Asn Arg Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Phe Thr Tyr Pro Tyr Gly Val Ile Cys Gly Gly Ile
100 105 110
Ser Ala Asn Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 52
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 175DX氨基酸序列
<400> 52
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
130 135 140
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
180 185 190
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
195 200 205
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 53
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182501氨基酸序列
<400> 53
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Arg Tyr Gly Met Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Ala Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Phe Val Ser Ser Ile Ser Ile Ser Gly Ser Thr Glu Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Val Lys
85 90 95
Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Met Tyr Tyr Cys Ser Phe Tyr Asn Ala Tyr Thr Gln Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
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Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
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Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
165 170 175
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
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Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
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Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
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Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
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Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp
35 40 45
Thr Phe Arg Ala Lys Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Val Val Ala Thr Ile Gln Ser Gly Tyr Tyr Arg Pro Tyr
65 70 75 80
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195 200 205
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210 215 220
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 62
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165 170 175
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225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> LIC182511氨基酸序列
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His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser
35 40 45
Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu
50 55 60
Arg Val Ala Asn Val Tyr Met Arg Asn Gly Asp Thr Trp Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Thr Arg Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 64
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182512氨基酸序列
<400> 64
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Glu Ala Ser Arg Ser
35 40 45
Thr Ala Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu
50 55 60
Gly Val Ala Ala Ala His Ser Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu
85 90 95
Tyr Leu Arg Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Glu Gly Val Met Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Ala Arg Gly Ser Pro Trp Trp Asn Ser Val Val Ala Leu Glu
115 120 125
Ser Tyr Ala Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
145 150 155 160
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
165 170 175
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
180 185 190
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
195 200 205
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
210 215 220
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
225 230 235 240
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
245 250 255
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
275 280 285
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
290 295 300
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
305 310 315 320
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
325 330 335
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
340 345 350
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
355 360 365
Pro Arg
370
<210> 65
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182513氨基酸序列
<400> 65
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Gln Val Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Arg Ser Ser Val Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
50 55 60
Arg Glu Arg Val Ala Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 66
<211> 375
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182514氨基酸序列
<400> 66
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp
35 40 45
Thr Phe His Ser Lys Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Val Val Ala Thr Ile Gln Ser Gly Tyr Tyr Arg Pro Tyr
65 70 75 80
Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Asp
85 90 95
Lys Asn Arg Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Phe Thr Tyr Pro Tyr Gly Val
115 120 125
Ile Cys Gly Gly Ile Ser Ala Asn Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
130 135 140
Arg Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
165 170 175
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
180 185 190
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
195 200 205
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
210 215 220
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
225 230 235 240
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
245 250 255
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
260 265 270
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
275 280 285
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
290 295 300
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
325 330 335
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
340 345 350
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
355 360 365
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375
<210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 67
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 68
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α铰链
<400> 68
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 69
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8α跨膜结构域
<400> 69
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 70
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BB (CD137)胞质结构域
<400> 70
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 71
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28胞质结构域
<400> 71
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 72
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3ζ (CD3z)胞质结构域
<400> 72
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头1
<400> 73
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 74
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头2
<400> 74
Thr Ser
1
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头3
<400> 75
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 76
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgG1Fc氨基酸
<400> 76
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 77
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182513H1氨基酸序列
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182513H4氨基酸序列
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182513H7氨基酸序列
<400> 79
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Ser Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 80
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182513H8氨基酸序列
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 81
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182513H9氨基酸序列
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182513H10氨基酸序列
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala
35 40 45
Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182511H6氨基酸序列
<400> 83
Gln Val Gln Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Thr Tyr Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala Asn Val
35 40 45
Tyr Met Arg Asn Gly Asp Thr Trp Leu Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
85 90 95
Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182511H8氨基酸序列
<400> 84
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Thr Tyr Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala Asn Val
35 40 45
Tyr Met Arg Asn Gly Asp Thr Trp Leu Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
85 90 95
Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 85
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VHH182511H9氨基酸序列
<400> 85
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Thr Tyr Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala Asn Val
35 40 45
Tyr Met Arg Asn Gly Asp Thr Trp Leu Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Thr Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
85 90 95
Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182513H4氨基酸序列
<400> 86
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Arg Ser Ser Val Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Arg Val Ala Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 87
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182513H7氨基酸序列
<400> 87
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Gln Val Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Arg Ser Ser Val Cys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 88
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182513H8氨基酸序列
<400> 88
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Arg Ser Ser Val Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Arg Val Ala Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 89
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182513H9氨基酸序列
<400> 89
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Arg Ser Ser Val Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Arg Val Ala Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 90
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182513H10氨基酸序列
<400> 90
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Arg Ser Ser Val Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Arg Val Ala Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 91
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182511H6氨基酸序列
<400> 91
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser
35 40 45
Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Arg Val Ala Asn Val Tyr Met Arg Asn Gly Asp Thr Trp Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 92
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182511H8氨基酸序列
<400> 92
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser
35 40 45
Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Arg Val Ala Asn Val Tyr Met Arg Asn Gly Asp Thr Trp Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 93
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LIC182511H9氨基酸序列
<400> 93
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser
35 40 45
Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Arg Val Ala Asn Val Tyr Met Arg Asn Gly Asp Thr Trp Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala
85 90 95
Val Tyr Leu Gln Met Thr Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 94
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头1
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(2)
<223> 'GS'可以重复至少1次、2次、3次、4次、5次或6次
<400> 94
Gly Ser
1
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头2
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 'GSGGS'可以重复至少1次、2次、3次、4次、5次或6次
<400> 95
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 96
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头3
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(4)
<223> 'GGGS'可以重复至少1次、2次、3次、4次、5次或6次
<400> 96
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 97
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头4
<400> 97
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 98
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头5
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 'GGGGS'可以重复至少1次、2次、3次、4次、5次或6次
<400> 98
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头6
<400> 99
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头7
<400> 100
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 101
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头8
<400> 101
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 102
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头9
<400> 102
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 103
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头10
<400> 103
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 104
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头11
<400> 104
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头12
<400> 105
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头13
<400> 106
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 107
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头14
<400> 107
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 108
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头15
<400> 108
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 109
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头16
<400> 109
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
<210> 110
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头17
<400> 110
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly
1 5 10
<210> 111
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性肽接头18
<400> 111
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 112
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成信号肽
<400> 112
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 113
Gly Tyr Thr Thr Ser Arg Tyr Gly Met Thr
1 5 10
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 114
Gly Asp Thr Phe Arg Ala Lys Cys Met Ala
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 115
Gly Thr Ile Tyr Ser Ala Tyr Tyr Met Gly
1 5 10
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 116
Thr Ser Tyr Thr Val Arg Leu Tyr Cys Met Gly
1 5 10
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 117
Gly Tyr Arg Ala Ser Val Cys Met Gly
1 5
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 118
Gly Ala Glu Tyr Tyr Ser Gly Asp Met Asn
1 5 10
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 119
Arg Ala Thr Asp Cys Asn Tyr Met Ser
1 5
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 120
Arg Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Cys Met Ser
1 5 10
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 121
Gly Tyr Ile Thr Ser Arg Tyr Gly Met Thr
1 5 10
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 122
Gly Tyr Arg Ser Ser Val Cys Met Gly
1 5
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 123
Arg Ser Thr Tyr Cys Met Gly
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 124
Arg Ser Thr Ala Asn Met Ala
1 5
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR1
<400> 125
Gly Asp Thr Phe His Ser Lys Cys Met Ala
1 5 10
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 126
Phe Tyr Asn Ala Tyr Thr Gln Tyr
1 5
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 127
Ala Asp Arg Phe Thr Tyr Pro Pro Gly Val Ile Cys Gly Gly Ile Ser
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Arg Tyr
20
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 128
Ala Thr Tyr Leu Val Gly Ser Ala Pro Leu Ser Pro Ser Arg Phe Arg
1 5 10 15
Tyr
<210> 129
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 129
Ser Arg Arg Thr Ser Trp Cys Ser Val Ser Phe Asn Gly Tyr Asp Asp
1 5 10 15
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 130
Ala Gly Leu Gly Tyr Trp Asp Cys Asp Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 131
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 131
Gly Thr Tyr Cys Arg Met Ala Leu Phe Gly Ala Cys Asn Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 132
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 132
Gly Ser Cys Arg Gly Pro Gly Ser Ile Trp Pro Ser Asp Tyr
1 5 10
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
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Ala Ala Glu Gly Leu Cys Gly Trp Gly Gly Trp Glu Ser Ala Val Arg
1 5 10 15
Phe Gly Ser
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 134
Phe Tyr Asn Ala Tyr Gly Gln Tyr
1 5
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
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Ala Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 136
Ala Gly Arg Ser Ser Cys Leu Glu Ala Ser Ile Ser Tyr
1 5 10
<210> 137
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 137
Ala Arg Gly Ser Pro Trp Trp Asn Ser Val Val Ala Leu Glu Ser Tyr
1 5 10 15
Ala Tyr Ser Tyr
20
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 138
Ala Gly Leu Gly Tyr Trp Ala Cys Glu Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 139
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR3
<400> 139
Ala Asp Arg Phe Thr Tyr Pro Tyr Gly Val Ile Cys Gly Gly Ile Ser
1 5 10 15
Ala Asn Tyr Arg Tyr
20

Claims (39)

1.一种特异性结合于Claudin18.2的结合部分，所述结合部分包括包含以下的单结构域抗体或其抗原结合片段：
(i)包含选自由SEQ ID NO:1-11和113-125组成的组的氨基酸序列的CDR1；
(ii)包含选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的氨基酸序列的CDR2；以及
(iii)包含选自由SEQ ID NO:24-37和126-139组成的组的氨基酸序列的CDR3。
2.根据权利要求1所述的结合部分，其中所述单结构域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:126的氨基酸序列的CDR3；
(2)包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:127的氨基酸序列的CDR3；
(3)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR3；
(4)包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR3；
(5)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR3；
(6)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:118的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR3；
(7)包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:119的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR3；
(8)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR3；
(9)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR3；
(10)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR3；
(11)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR3；
(12)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDR3；
(13)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2；以及包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR3；或
(14)包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDR3。
3.一种特异性结合于Claudin18.2的结合部分，所述结合部分包括包含以下的单结构域抗体或其抗原结合片段：
(i)分别具有如SEQ ID NO:38中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(ii)分别具有如SEQ ID NO:39中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(iii)分别具有如SEQ ID NO:40中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(iv)分别具有如SEQ ID NO:41中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(v)分别具有如SEQ ID NO:42中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(vi)分别具有如SEQ ID NO:43中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(vii)分别具有如SEQ ID NO:44中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(viii)分别具有如SEQ ID NO:45中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(ix)分别具有如SEQ ID NO:46中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(x)分别具有如SEQ ID NO:47中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xi)分别具有如SEQ ID NO:48中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xii)分别具有如SEQ ID NO:49中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xiii)分别具有如SEQ ID NO:50中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xiv)分别具有如SEQ ID NO:51中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xv)分别具有如SEQ ID NO:77中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xvi)分别具有如SEQ ID NO:78中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xvii)分别具有如SEQ ID NO:79中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xviii)分别具有如SEQ ID NO:80中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xix)分别具有如SEQ ID NO:81中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xx)分别具有如SEQ ID NO:82中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xxi)分别具有如SEQ ID NO:83中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；
(xxii)分别具有如SEQ ID NO:84中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3或
(xxiii)分别具有如SEQ ID NO:85中所示的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
4.如权利要求3所述的结合部分，其中所述CDR1、CDR2或CDR3根据Kabat编号方案、IMGT编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案、Contact编号方案或它们的组合来确定。
5.如权利要求1至4中任一项所述的结合部分，所述结合部分还包含如以下中所示的一个或多个FR区：SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84和/或SEQ ID NO:85。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的结合部分，其中所述单结构域抗体或抗原结合片段是骆驼科的、嵌合的、人的或人源化的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的结合部分，其中所述单结构域抗体或抗原结合片段包含VHH结构域。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的结合部分，其中所述单结构域抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:38-51和77-85中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的结合部分，其中所述单结构域抗体或其抗原结合片段包含IgG、IgM或IgA重链恒定区或它们的片段。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的结合部分，其中所述单结构域抗体或其抗原结合片段与剂进行基因融合或化学缀合。
11.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至9中任一项所述的结合部分。
12.一种载体，所述载体包含根据权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求11所述的多核苷酸或根据权利要求12所述的载体。
14.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包括包含以下的多肽：
(a)细胞外抗原结合结构域，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的结合部分；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
15.如权利要求14所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域还包含一个或多个额外的抗原结合结构域。
16.如权利要求14所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域还包含一个额外的抗原结合结构域；或其中所述细胞外抗原结合结构域还包含两个额外的抗原结合结构域。
17.如权利要求14至16中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域来源于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。
18.如权利要求17所述的CAR，其中所述跨膜结构域来源于CD8α。
19.如权利要求14至18中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的主要细胞内信号传导结构域。
20.如权利要求19所述的CAR，其中所述主要细胞内信号传导结构域来源于CD3-ζ。
21.如权利要求19或权利要求20所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域还包含共刺激信号传导结构域。
22.如权利要求21所述的CAR，其中所述共刺激信号传导结构域来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体和它们的组合。
23.如权利要求22所述的CAR，其中所述共刺激信号传导结构域来源于CD137。
24.如权利要求14至23中任一项所述的CAR，所述CAR还包含位于所述细胞外抗原结合结构域的C端与所述跨膜结构域的N端之间的铰链结构域。
25.如权利要求24所述的CAR，其中所述铰链结构域来源于CD8α。
26.如权利要求14至25中任一项所述的CAR，所述CAR还包含位于所述多肽的N端的信号肽。
27.如权利要求26所述的CAR，其中所述信号肽来源于CD8α。
28.根据权利要求14至27中任一项所述的CAR，其中所述多肽从N端到C端包含信号肽、包含VHH结构域的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、主要细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。
29.根据权利要求28所述的CAR，其中所述多肽从N端到C端包含源自CD8α的信号肽、包含VHH结构域的抗原结合结构域、源自CD8α的铰链结构域、源自CD8α的跨膜结构域、CD137胞质结构域和CD3-ζ胞质结构域。
30.根据权利要求29所述的CAR，其中所述多肽从N端到C端包含SEQ ID NO:67的信号肽、包含VHH结构域的抗原结合结构域、SEQ ID NO:68的铰链结构域、SEQ ID NO:69的跨膜结构域、SEQ ID NO:70的CD137胞质结构域和SEQ ID NO:72的CD3-ζ胞质结构域。
31.根据权利要求14所述的CAR，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:53-66和86-93具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
32.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求14至31中任一项所述的CAR。
33.一种载体，所述载体包含根据权利要求32所述的多核苷酸。
34.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求32所述的多核苷酸或根据权利要求33所述的载体。
35.一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞重组表达根据权利要求14至31中任一项所述的CAR。
36.根据权利要求35所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是T细胞。
37.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1-10中任一项所述的结合部分、根据权利要求14至31中任一项所述的嵌合抗原受体、根据权利要求11或32所述的多核苷酸、根据权利要求12或33所述的载体、根据权利要求13或34所述的宿主细胞或根据权利要求35或36所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的赋形剂。
38.一种用于治疗有需要的受试者的表达Claudin18.2的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求37所述的药物组合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述表达Claudin18.2的肿瘤或癌症是胃、食管、胃食管、胰腺、卵巢或肺的肿瘤或癌症。
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