CN114980916A

CN114980916A - 用于2型糖尿病的长效glp1类似物药物

Info

Publication number: CN114980916A
Application number: CN202180001518.5A
Authority: CN
Inventors: 魏洋
Original assignee: Individual
Current assignee: Hangzhou Sipeng Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2022-08-30
Also published as: WO2022066212A1; EP4216987A1; US20220267402A1; US20220389071A9

Abstract

本发明提供了包含经修饰胰高血糖素样肽(GLP1)多肽的经修饰GLP1融合蛋白及其使用方法。在本发明的各种实施方案中，所述融合蛋白是包含融合至稳定结构域诸如细胞外结构域(ECD)或抗体的经修饰GLP1的GLP1受体激动剂。在一些实施方案中，所述包含经修饰GLP1的融合蛋白可用于治疗或改善血糖障碍诸如肥胖症和糖尿病的症状或适应症。

Description

用于2型糖尿病的长效GLP1类似物药物

优先权声明

本申请要求2020年9月22日提交的美国临时申请63/081,363的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

背景技术

肥胖已成为美国的主要健康问题。按照现代标准，有超过40％的美国人被认为是超重或肥胖的，这归因于饮食不良、缺乏运动或其他不健康的行为。肥胖症是发展其他疾病(诸如心脏病、中风和糖尿病)的重要潜在风险因素。通常，过重体重的适度降低会降低发展某些与肥胖症相关疾病(诸如心脏病和糖尿病)的风险。

糖尿病是身体无法产生足够的胰岛素或无法正常响应于胰岛素，从而导致血糖水平异常高的疾病。长期的高血糖水平常常导致不希望的长期健康后果，包括心脏病、中风、整体循环不良，并且在严重的情况下导致下肢截肢。糖尿病的治疗通常涉及通过定期运动和饮食控制以及某些药物(诸如胰岛素和/或二甲双胍)的组合来控制和/或降低血糖水平。

用于治疗糖尿病和血糖控制的方法之一涉及使用靶向肠降血糖素途径的胰高血糖素样肽(GLP)-1受体激动剂。胰高血糖素样肽(GLP)-1是由肠的肠内分泌细胞分泌的肽激素。GLP1通过刺激从胰岛的葡萄糖依赖性胰岛素释放而发挥其主要作用。它也已经显示出减缓胃排空、抑制不适当的餐后胰高血糖素释放和减少食物摄入。

然而，GLP1被酶二肽基肽酶4(DPP4)快速灭活和/或降解，从而导致约1.5分钟的非常短的半衰期。这是不希望的，因为它严重限制了其调控血糖水平的有效性。GLP1的较长效衍生物以及包括含GLP1的融合蛋白的GLP1受体激动剂提供改善的肠降血糖素作用，且因此已经被研究用于糖尿病控制。此类GLP1类似物、融合蛋白和GLP1受体激动剂在本领域中是熟知的，示例性实例在例如以下中公开：美国专利号9,409,966，以及包括US20160194371、US20170114115、US20170112904、US20160361390、US20150259416、WO2017074715、WO2016127887、EP3034514、EP2470198和EP2373681的已公开申请。

也已经探索了对DPP4和其他因子的降解具有抗性的GLP1肽变体和GLP1受体激动剂。先前的工作已经显示，在GLP1(7-37)的位置8处的多种氨基酸取代使此肽对DPP4更具抗性，从而赋予更长的半衰期。然而，这种方法仍然只是接近于基本上完全保护GLP1免受DPP4酶切，GLP1分子的中间部分仍然遭受到其他蛋白酶的切割。

某些此类GLP1变体和GLP1受体激动剂公开于授予Wei等人的US2019/0091296A1中，所述专利以引用的方式整体并入本文。尽管这些变体提供了针对DPP4酶切的保护，但GLP1的中间部分仍然遭受血液中的其他蛋白酶降解。

因此，需要开发对DPP4和其他蛋白酶降解具有进一步抗性、具有改善的药代动力学特性并且在血糖控制方面具有增加的效力和持续的体内活性的GLP1肽变体和GLP1受体激动剂。

因此，将期望提供对降解具有进一步抗性、具有改善的药代动力学特性并且在血糖控制方面具有增加的效力和持续的体内活性的GLP1肽变体和GLP1受体激动剂。

因此，将期望提供具有保护序列的GLP1肽变体，所述保护序列包含人GLP1受体的细胞外结构域(ECD)以保护所述GLP1肽变体免受蛋白酶切。

因此，将期望提供具有保护序列的GLP1肽变体，所述保护序列包含可以结合GLP1肽变体并保护其免受蛋白酶切的抗GLP1抗体，优选抗体的Fab部分、纳米抗体或BiTE。

因此，将期望提供具有抗GLP1R靶向抗体的受保护的GLP1肽变体，其在血糖控制方面具有增加的效力和持续的体内活性。

发明概述

本发明的一个方面提供了用于保护基于肽的药物的分子技术。胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)是通常在胰腺β细胞和脑神经元上发现的受体蛋白。它通过增强胰岛素分泌参与血糖水平的控制。在人类中，它是由6号染色体上存在的基因GLP1R合成的。它是G蛋白偶联受体的胰高血糖素受体家族的成员。

GLP1R包括两个结构域，与GLP-1的C末端螺旋结合的一个细胞外结构域(ECD)和与GLP-1的N末端区域结合的一个跨膜结构域(TMD)。在TMD结构域中，存在调控受体的偏向性信号传导的极性残基支点，而跨膜螺旋边界和细胞外表面是偏向性激动作用的触发物。

根据本发明的一个实施方案，提供了融合蛋白，其中可以将结合肽的肽受体细胞外结构域(ECD)或保护抗体(例如，在某些优选实施方案中，抗体的Fab区、纳米抗体或双特异性T细胞衔接体“BiTE”抗体)通过含有蛋白酶切位点(即因子Xa)的接头融合至所述肽的N末端。使用该方法，融合的受体ECD或保护抗体可以与所述肽结合并且保护其免受DPP4和其他蛋白酶的降解，从而赋予更长的半衰期。在此类实施方案中，所述融合蛋白是非活性的，并且在因子Xa消化去除所述受体ECD或保护抗体之前的时段内保持为非活性的。

在一个实施方案中，将符合本发明的hGLP1R ECD结构通过3xG4S接头连接至GLP1类似物(例如，Eli Lily的Trulicity^TM药物，但如果期望可以使用其他药物)的N末端，所述3xG4S接头之后为蛋白酶切位点(例如因子Xa)。在这种融合蛋白中，所述GLP1R ECD结合GLP1，这赋予两个主要优点：1)大幅减少或消除DPP4酶切，和2)保护GLP1分子的中间部分不受血液中其他蛋白酶的降解。

因为可以通过修饰因子Xa消化序列来控制因子Xa释放GLP-1类似物的速率，所以可以实现更恒定的GLP-1类似物在血液中的水平，从而减少与血糖水平变化相联系的不希望的副作用。

可以实现此的一种特定方式包括对因子Xa消化序列的部分(例如RKRR、RGER、RKR、RR等)进行某些修饰。此外，如果期望，也可以在人GLP1R ECD中进行点突变(例如，R131G)或缺失(位置R131至E139)以去除内部的因子Xa酶切位点。

在因子Xa消化之前和之后，测试了本发明的融合蛋白在稳定表达人GLP1受体的HEK细胞系中刺激cAMP产生的能力，展示了其与先前已知的分子结构和方法相比的显著改善。

本发明的另一些方面涉及通过施用包含治疗有效量的本文所述一种或多种融合蛋白的药物组合物来降低血糖水平的方法。

这种方法可以用于治疗和/或预防代谢性障碍，包括糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、2型糖尿病、1型糖尿病、糖尿病前期、心血管疾病、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、冠心病、动脉硬化、外周动脉疾病、中风、呼吸功能障碍、肾脏疾病、脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和代谢综合征。

上述方法还可以包括施用所述药物组合物与第二治疗剂或疗法的组合，所述第二治疗剂或疗法可以包括胰岛素或胰岛素类似物、二甲双胍、噻唑烷二酮、磺酰脲、双胍、氯磺丙脲、格列萘(glinide)、α葡糖苷酶抑制剂、那格列奈(nateglinide)、DPP4抑制剂、普兰林肽(pramlintide)、西他列汀(sitagliptin)、溴麦角环肽、SGLT2抑制剂、卡格列净(canagliflozin)、抗高血压药物、他汀类、阿司匹林、饮食调整、运动和饮食补充剂。

附图说明

在结合附图考虑以下详细描述时，本发明的以上和其他目的和优点将变得显而易见，在附图中，相同的参考字符始终指代相同的部分，并且其中：

图1是本发明的一般图形表示，其示出了本发明的融合蛋白的一些实施方案的一般构建。

图2是本发明的一般图形表示，其示出了根据本发明的一个方面从保护序列释放GLP1类似物的1型分子。

图3是本发明的一般图形表示，其示出了根据本发明的一个方面从保护序列释放GLP1类似物的2型分子。

图4是示出GLP类似物对照分子和代表本发明的多种实施方案的分子的EC50值的图。

图5是示出显示本发明的一些实施方案在消化期间释放GLP1类似物之后的活性的cAMP测定的条形图。

图6是示出根据本发明的一些实施方案构建的两种分子在7天内的药代动力学谱的图。

图7是示出测试受试者在第2天响应于本发明的一个实施方案的分子的葡萄糖水平的图。

图8是示出与对照相比，测试受试者在第2天响应于本发明的一个实施方案的分子的葡萄糖AUC的图。

图9是示出测试受试者在第6天响应于本发明的一个实施方案的分子的葡萄糖水平的图。

图10是示出与对照相比，测试受试者在第6天响应于本发明的一个实施方案的分子的葡萄糖AUC的图。

图11a是展示患糖尿病的测试受试者在第3天响应于本发明分子的两种分子变体的IPGTT测试结果的图。

图11b是展示患糖尿病的测试受试者在第6天响应于本发明分子的两种分子变体的IPGTT测试结果的图。

图11c是展示患糖尿病的测试受试者在第14天响应于本发明分子的两种分子变体的IPGTT测试结果的图。

发明详述

下面含有根据本发明的一些方面的方法和化合物的示例性描述。然而，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解的是，本文所用的术语仅是出于描述某些实施方案的目的，而不意图是限制性的，但仅作为用于表达本发明的新颖概念的手段，并且本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与在提交时本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在实施或测试本发明时可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均以引用的方式以其整体并入本文，包括但不限于授予Wei等人的美国专利公开2019/0091296A1，所述出版物尤其阐述了常用的定义并且阐述了通常理解的现有技术术语和理解(将其在本文中一致地使用)，包括对生物等效性的公认理解的概念。

本发明的一个目的是改善GLP-1类似物类型的药物抵抗基于消化的降解的能力，从而在使用者中提供更持久的有效葡萄糖管理。某些已知的GLP-1受体激动剂(诸如Trulicity^TM)是融合蛋白，其包含两条基本相同的由二硫键连接的链，每个链含有通过小肽接头共价连接至经修饰人免疫球蛋白G4(IgG4)重链的Fc部分的N末端GLP-1类似物序列，并且通常使用哺乳动物细胞(例如，仓鼠卵巢)培养产生。

此类分子的GLP-1类似物部分与天然人GLP-1(7-37)同源。在负责与DPP-4相互作用的分子的GLP-1部分中引入结构修饰。在具有潜在T细胞表位的区域中以及负责结合高亲和力Fc受体和半抗体形成的分子的IgG4 Fc部分(在本文中通称为“Fc部分”)的区域中进行了另外修饰。这种配置激活了GLP-1受体(即与胰β细胞中的腺苷酸环化酶偶联的膜结合细胞表面受体)并增加了β细胞中的细胞内环化AMP(cAMP)，从而导致半衰期延长的葡萄糖依赖性胰岛素释放。

图1中示出了展示根据本发明的融合蛋白概念的一些方面的一般图形表示100。如图所示，分子102是基础GLP-1激动剂分子，其可以通过氨基酸接头区域110融合至保护序列104(在某些优选的实施方案中，GLP1R的ECD或抗体的Fab区、纳米抗体或双特异性T细胞衔接体“BiTE”抗体)，它们一起可以共同形成受保护的GLP-1分子106。在操作中，然后可以将受保护的分子106通过氨基酸接头区(例如，3xG4S)融合至IgG4 Fc部分108以产生融合蛋白114(1型)，或融合至合适的抗GLP1R抗体112以产生融合蛋白116(2型)。

应当理解，如果期望，可以将任何合适的GLP-1激动剂用于分子102，诸如任何胰高血糖素/分泌素超家族分子，其可以包括但不限于：胰高血糖素、GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、PACAP、艾塞那肽-4、GLP1/GIP双重激动剂和GLP1/GIP/胰高血糖素三重激动剂或其他合适的肽药物等。

本领域普通技术人员将容易理解和认识到，使用上文所述且在图1中展示的基础构建体和元件，如果期望，可以产生本发明的融合蛋白的至少几十种变体。

例如，在实施方案1中，本发明可以包括包含GLP1R ECD的GLP1变体，所述GLP1RECD通过3xG4S接头和因子Xa蛋白酶消化位点融合至Trulicity的N末端。

在实施方案2中，本发明可以包括实施方案1的融合蛋白，其中所述GLP1ECD含有在位置131处从Arg至Gly或至其他氨基酸的突变以消除因子Xa酶切位点。

在实施方案3中，本发明可以包括实施方案1的融合蛋白，其中所述GLP1ECD含有在C末端处从位置131至139(RGERSSPEE)的9个氨基酸缺失，以去除因子Xa酶切位点。

在实施方案4中，本发明可以包括包含抗GLP1R抗体的Fab部分的GLP1变体，所述Fab部分通过3xG4S接头和因子Xa蛋白酶消化位点融合至Trulicity的N末端。

在实施方案5中，本发明可以包括包含保护GLP1的纳米抗体的GLP1变体，所述保护GLP1的纳米抗体通过3xG4S接头和因子Xa蛋白酶消化位点融合至Trulicity的N末端。

在实施方案6中，本发明可以包括包含呈BiTE形式的抗GLP1抗体的GLP1变体，所述抗GLP1抗体通过3xG4S接头和因子Xa蛋白酶消化位点融合至Trulicity的N末端。

在实施方案7中，本发明可以包括实施方案1至6中任一项中所述的融合蛋白，其中所述接头是1xG4S、2xG4S或3xG4S加上因子Xa消化位点或其变体(即，RKRR、RGER、RKR、RR等)或其他合适的蛋白酶消化位点。

在实施方案8中，本发明可以包括实施方案1至7中任一项的融合蛋白，其中Trulicity的GLP1部分选自包括但不限于以下的胰高血糖素/分泌素超家族之一：胰高血糖素、GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、PACAP、艾塞那肽-4、GLP1/GIP双重激动剂和GLP1/GIP/胰高血糖素三重激动剂。

在实施方案9中，本发明可以包括实施方案1至8中任一项中所述的融合蛋白，其中Trulicity的Fc部分是抗GLP1R抗体、或针对对应于被使用激动剂的受体的抗体，或者在使用GLP1/GIP双激动剂时可以是双特性抗体。

如图1中所示，提供了受保护的融合蛋白106，其中可以将通过含有蛋白酶切位点(例如因子Xa)的接头110结合肽102的肽的受体细胞外结构域(ECD)或保护抗体104融合至与人Fc融合的GLP1变体(例如，Trulicity)的N末端，以形成1型融合蛋白114，或融合至与抗体112融合的GLP1变体，以形成2型融合蛋白116。因此，受体ECD或保护抗体104可以结合肽102并且保护其免受DPP4和其他蛋白酶降解，从而赋予其更长的半衰期。在此类实施方案中，融合蛋白是非活性的，并且在消化去除受体ECD或保护抗体104之前的时段内保持为非活性的。

如图2中所示，描绘了图1的1型分子的更具体化形式。如图所示，根据本发明构建了1型分子214，其中GLP1R ECD 204通过接头210(3xG4S，之后是蛋白酶切位点(例如，因子Xa))连接至GLP-1类似物208(例如，Eli Lily的Trulicity^TM药物，但如果期望，可以使用其他药物诸如Ozempic^TM)的N末端。这些包括SEQ ID 6、7、8、9、10和11。在这种融合蛋白中，GLP1R ECD结合GLP1，这赋予两个主要优点：1)大幅减少或消除DPP4酶切，和2)保护GLP1分子的中间部分不受血液中其他蛋白酶的降解。

因为可以通过修饰因子Xa序列而改变因子Xa消化来控制GLP-1类似物的释放速率，所以可以实现更恒定的GLP-1类似物血液水平，且从而减少与血糖水平变化相联系的不希望的副作用。这大体描绘于图2中，图2从左至右示出了受hGLP1R ECD保护的1型分子214随着消化的进行以受控且预定方式脱除保护序列204，从而产生释放的GLP1-hFc(Trulicity)分子，向使用者提供基本上恒定的药物浓度，如在下面讨论的图4-11中所示的。

可以实现此的一种特定方式包括对因子Xa消化序列的部分进行某些修饰(例如RKRR、RGER、RKR、RR等)。此外，如果期望，也可以在人GLP1R ECD中进行点突变(R131G)或缺失(位置R131至E139)以去除内部的因子Xa酶切位点。

类似地，如图3中所示，描绘了图1的2型分子的更具体化形式。如图所示，根据本发明构建了2型分子314。将保护序列304(例如，hGLP1R ECD或抗GLP1抗体)通过含有蛋白酶切位点(例如，因子Xa)的3xG4S接头310连接至GLP-1激动剂302的N末端以形成分子306，然后将分子306连接至抗GLP1R靶向抗体312的轻链的N末端以形成融合蛋白314。在这种融合蛋白中，GLP1R ECD结合GLP1，在图3中，这如上文所述赋予两个主要优点：1)大幅减少或消除DPP4酶切，和2)保护GLP1分子的中间部分不受血液中其他蛋白酶的降解。

因为可以通过修饰因子Xa序列而改变因子Xa消化来控制GLP-1类似物的释放速率，所以可以实现更恒定的GLP-1类似物血液水平，从而减少与血液药物浓度水平变化相联系的不希望的副作用。这大体描绘于图3中，图3从左至右示出了2型分子314随着消化的进行以受控且预定的方式脱除保护序列304，从而产生释放的GLP1-抗体分子318，向使用者提供基本上恒定的血液药物浓度，如在下面的图表中所示的。

实施例1

以下实施例反映了在2019年8月1日至2019年12月31日进行的实验，所述实验由外包CRO公司进行。

使用的试剂和批号：

Eli Lilly Trulicity(批号02448599)

pTG1：hFc(批号U6443DH140S05/P90011809)

pTG3：hGLP1R ECD-3xG4S-RKRR-Trulicity(批号U5585DH140S05/P90011809)

p7：hGLP1R ECD(R108G)-3xG4S-RGER-Trulicity(批号U2243DL140-4/P9EA001)

p8：hGLP1R ECD(R108G)-3xG4S-Trulicity(批号U2243DL140-9/P9EA001)

p9：hGLP1R ECD(1-116)-3xG4S-RGER-Trulicity(批号U2243DL140-14/P9EA001)

p10：hGLP1R ECD(R108G)-3xG4S-RR-Trulicity(批号U2243DL140-19/P9EA001)

p11：hGLP1R ECD(R108G)-3xG4S-RKR-Trulicity(批号U2243DL14024/P9EA001)

实验程序(包括相关细胞系、蛋白质、试剂以及仪器类型和模型的描述)：

将hGLP1R ECD分子(SEQ ID NO 3)通过含有3xG4S和蛋白酶切位点(因子Xa，NEB批号P8010S)的接头连接至Trulicity的N末端。

为了更佳地控制活性Trulicity的释放时间，对因子Xa酶切序列进行一些修饰(例如，RGER、RKR、RR等)。在人GLP1R ECD中进行点突变(R108G)(SEQ ID NO 4)或缺失(位置R108至E116)(SEQ ID NO 5)以去除因子Xa酶切位点。

对于cAMP生物测定，将HEK293-CNG-HuGLP1R稳定细胞以70,000个细胞/孔接种至96孔测定板中的补充有10％FBS的OPTIMEM中，然后在5％CO2中在37℃下孵育过夜。第二天，添加在1x膜电位染料(Creative Biogene，批号FMD10)中的50uM磷酸二酯酶抑制剂R020-1724并且在37℃下孵育2小时，然后用荧光读板器(F0，激发/发射＝530nm/570nm)(MDParadigm)读取。

为了确定测试蛋白质的剂量反应，将基本上所有蛋白质用因子Xa进行预消化以释放活性Trulicity。接下来，将Trulicity和所释放的pTG3、p7、p8、p9、p10和p11(分别为SEQID 6-11)以0.001nM至100nM范围的浓度添加至细胞，在37℃下孵育25分钟，之后用荧光读板器(F25)读取。用Prism 6软件(GraphPad)使用非线性回归(三参数)分析结果以获得EC50值。

对于ELISA，将板用4ug/ml的小鼠抗人IgG(Fc)(CELLWAYLAB批号C010202)4℃包被过夜，用0.2％BSA/0.1％PC/0.1％在室温下封闭一小时，然后添加由小鼠血清制备的样品并且在室温下孵育1小时。使用Trulicity作为标准曲线。将抗GLP-1抗体(ThermoFisher，目录号：ABS03310B005)用于检测有活性的Trulicity。接下来，在添加TMB 10分钟之后，通过2M H2SO4停止反应，并且用读板器(CMax Plus，Molecular Devices)在450nm下读取。

在皮下(SC)施用200nmol/kg药物之后研究p9和p11(分别地SEQ ID 9和11)在C57/BL小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)中的药代动力学谱。在给药后6h、第1、2、4和7天的不同时间从测试受试者(每组4只小鼠)抽取血液。从每个样品收集血清，并且通过仅检测有活性的Trulicity的N末端特异性ELISA进行分析。在每个时间点的血液药物浓度如图6中所示。

在C57/BL和BKS/DB小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)中测定p9和p11对葡萄糖耐受性的影响。使每组(每组4只小鼠)接受200nmol/kg的hFc对照pTG1、p9、p11和Trulicity的单一皮下注射。第3天、第6天和第14天进行腹膜内葡萄糖耐受性测试(IPGTT)，其中在禁食过夜后在0、15、30、60和120分钟进行血糖测量。针对每个组计算在每个时间点的血糖水平的平均值±SEM和葡萄糖曲线下面积(AUC)，并且将其示于图7-11中。使用Excelt检验来评估相对于对照组的显著性，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001

体外结果汇总和结论

如表1和图4中所示，对于GLP1R激活，Trulicity^TM、以及所释放的p7、p9和p11分别显示出22nM、25nM、17.6nM和26.9nM的EC50值。所释放的pTG3和p10的EC50仅是617nM和120nM，这表明因子Xa消化不是在所预测位点处。通过N末端氨基酸序列分析确认了这一点。由于没有因子Xa消化位点因此无法释放有活性的Trulicity，未检测到p8的EC50。

如图5中所示，p7、p9、p10和p11仅在因子Xa消化(释放)之后显示出活性。p8(SEQID8)阴性对照没有显示出cAMP活性，因为它不含有Xa因子消化位点，并且无法释放活性Trulicity。

表1所释放的GLP1融合蛋白的EC50

体内结果汇总和结论

图6示出了在皮下(SC)施用200nmol/kg之后所释放的p9和p11在C57/BL小鼠中的药代动力学谱。所释放的p11的半衰期是6天，p9的半衰期长于7天，因为在第7天仍检测到75％的所释放的p9。从第1天至第7天，两种蛋白质均显示出相对恒定的血液药物浓度。

图7-10示出了在C57/BL小鼠中的有利的IPGTT结果，即，单次施用本发明的p11变体在第2天和第6天提供了显著的葡萄糖降低。

类似地，图11a、11b和11c示出了在患糖尿病的BKS/DB小鼠中的IPGTT结果，即，单次施用本发明的p9和p11变体在第3天、第6天和第14天提供了显著的葡萄糖降低。

生物等效物

本发明的GLP1受体激动剂可以包括这样的蛋白质，所述蛋白质具有可与所述GLP1受体激动剂的氨基酸序列不同的氨基酸序列，但保留结合GLP1受体的能力。当与亲本序列相比时，此类变体GLP1受体激动剂可以包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但是表现出与所述GLP1受体激动剂的生物学活性基本上等效的生物学活性。类似地，本发明的编码GLP1受体激动剂的DNA序列可以涵盖这样的序列，所述序列与所公开的序列相比包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代，但是编码与本发明的GLP1受体激动剂基本上生物等效的GLP1受体激动剂。

如果例如两种蛋白质是药学等效物或药学替代物，当在相似的实验条件下以相同的摩尔剂量(其可以包括单剂量或多剂量)施用时，其吸收的速率和程度基本上相同，不展现出显著差异，则它们可以被认为是生物等效的。如果一些蛋白质在其吸收程度上等效而在其吸收速率上不等效，但又因为吸收速率的此类差异是有意的并且反映在标记中，对于例如长期使用而达到有效体内药物浓度而言不是必需的，并且对于所研究的特定药物产品而言被认为是医学上无关紧要的而又可以被认为是生物等效的，则它们将被认为是等效物或药学替代物。

在一个实施方案中，如果两种GLP1受体激动剂蛋白在其安全性、纯度、效力或功效方面没有临床上有意义的差异，则它们是生物等效的。

在一个实施方案中，如果患者可以在参考产品与生物学产品之间切换一次或多次而与没有这种切换的持续疗法相比没有预期的不利影响风险的增加(包括免疫原性的临床显著改变或减弱的有效性)，则两种GLP1受体激动剂蛋白是生物等效的。

在一个实施方案中，如果两种GLP1受体激动剂蛋白对于使用条件均通过共同的作用机制起作用，达到此类机制已知的程度，则它们是生物等效的。

可以通过体内和/或体外方法证明生物等效性。生物等效性测量包括例如(a)在人或其他哺乳动物中的体内试验，其中在血液、血浆、血清或其他生物流体中测量蛋白质或其代谢物的浓度随时间的变化；(b)与人体内生物利用度数据相关并可合理预测人体内生物利用度数据的体外试验；(c)在人或其他哺乳动物中的体内试验，其中测量蛋白质(或其靶标)的适当急性药理作用随时间的变化；以及(d)在具有良好对照的临床试验中，确立抗原结合蛋白的安全性、功效或生物利用度或生物等效性。

本发明的GLP1受体激动剂蛋白的生物等效变体可以通过例如残基或序列的多种取代或缺失生物学活性不需要的末端或内部残基或序列来构建。例如，可以缺失或用其他氨基酸替换对于生物学活性不是必需的半胱氨酸残基，以防止在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫桥。在另一些情况下，生物等效蛋白质可以包括包含氨基酸变化的变体，所述氨基酸变化改变蛋白质的糖基化特征，例如消除或去除糖基化的突变。

治疗性施用和制剂

本发明提供了包含GLP1受体激动剂的治疗性组合物。根据本发明的治疗性组合物将与合适的载体、赋形剂和掺入制剂中以提供改善的传递、递送、耐受性等的其他试剂一起施用。在所有药物化学家都知道的配方中可以找到许多适当的制剂：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(诸如LIPOFECTIN.TM.)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液卡波蜡(carbowax)(具有不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有卡波蜡的半固体混合物。还参见Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。

GLP1受体激动剂的剂量可以根据待施用的受试者的年龄和身材、目标疾病、病症、施用途径等而变化。当将本发明的抗原结合蛋白用于治疗成人患者中的疾病或障碍或用于预防这种疾病时，有利的是，通常以约0.001至约100mg/kg体重，更优选地约0.001至约60、约0.01至约10、或约0.01至约1mg/kg体重的单一剂量施用本发明的抗原结合蛋白。根据病症的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以作为至少约0.001mg至约100mg、约0.001至约50mg、约0.005至约50mg、约0.01至约40mg、至约30mg、或至约10mg的初始剂量施用。在某些实施方案中，在初始剂量之后，可以施用第二或多个后续剂量的GLP1受体激动剂，其量可以与初始剂量的量大致相同或小于初始剂量的量，其中后续剂量相隔至少1天至3天；至少一个周、至少2个周；至少3个周；至少4个周；至少5个周；至少6个周；至少7个周；至少8个周；至少9个周；至少10个周；至少12个周；或至少14个周。

各种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达突变型病毒的重组细胞，受体介导的内吞作用(参见例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、经皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径施用组合物，例如通过输注或团注(bolus injection)、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，以及可以将其与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部的。还可以在囊泡、特别是脂质体中递送药物组合物(参见，例如Langer(1990)Science249:1527-1533)。

本文还考虑了用纳米颗粒递送本发明的GLP1受体激动剂。蛋白质缀合的纳米颗粒可用于治疗性和诊断性应用两者。可以开发纳米颗粒并将其与药物组合物中所含的抗原结合蛋白缀合以靶向细胞。用于药物递送的纳米颗粒也在例如美国专利号8,257,740或美国专利号8,246,995中进行了描述，每一篇专利整体并入本文。

如果期望，可以在受控释放系统中递送本发明的药物组合物或治疗。在一个实施方案中，可以使用泵。在另一些实施方案中，可以使用聚合物材料。在又一些实施方案中，受控释放系统可以被放置成接近组合物的靶标，因此只需要全身剂量的一部分。

可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内、颅内、腹膜内和肌内注射、点滴输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公共已知的方法来制备。例如，可以通过例如将上述抗原结合蛋白或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备可注射制剂。作为用于注射的水性介质，例如有生理盐水、含葡萄糖的等渗溶液和其他辅助剂等，其可以与以下组合使用：适当的增溶剂，诸如醇(例如，乙醇)；多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)；非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与诸如苯甲酸苄酯、苄醇等的增溶剂组合使用。优选地将由此制备的注射剂填充在适当的安瓿中。

可以将本发明的药物组合物用标准针和注射器皮下或静脉内递送。此外，对于皮下递送，笔或棒型递送装置容易地应用于递送本发明的药物组合物。这种笔型递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔型递送装置通常利用含有药物组合物的可更换药筒。一旦施用了药筒内的所有药物组合物并且药筒是空的，就可以容易地丢弃空药筒并用含有药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用所述笔型递送装置。在一次性笔型递送装置中，没有可更换的药筒。相反，所述一次性笔型递送装置预装有保持在装置内贮存器中的药物组合物。一旦贮存器内的药物组合物排空，则丢弃整个装置。

许多可重复使用的笔型和自动注射器递送装置可应用于本发明的药物组合物的皮下递送。实例包括但当然不限于AUTOPEN.TM.(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONIC.TM.笔(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOGMIX 75/25.TM.笔、HUMALOG.TM.笔、HUMALIN70/30.TM.笔(Eli Lilly和Co.,Indianapolis,Ind.)、NOVOPEN.TM.I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPENJUNIOR.TM.(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BD.TM.笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、OPTIPEN.TM.、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIK.TM.(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)，仅举几例。可用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔型递送装置的实例包括但当然不限于SOLOSTAR.TM.笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPEN.TM.(Novo Nordisk)和KWIKPEN.TM.(Eli Lilly)、SURECLICK.TM.自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,Calif.)、PENLET.TM.(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRA.TM.笔(Abbott Labs,Abbott Park,Ill.)，仅举几例。

有利地，将上述的用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适于配合活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的此类剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的GLP1受体激动剂的量通常是约0.001至约100mg/单位剂量的剂型；尤其是呈注射剂的形式，GLP1受体激动剂优选以约0.001至约100mg包含于其中，对于其他剂型优选的是以约0.01至约100mg包含于其中。

GLP1受体激动剂的治疗性用途

本发明的GLP1受体激动剂可用于治疗和/或预防与高血糖症相关的某些不利医学病症，包括糖尿病。这对于减轻与此类病症相关的至少一种症状的严重程度也可是有用的。这可以包括例如将其以治疗剂量施用至患有糖尿病(例如2型糖尿病)的患者。

此外，在一些实施方案中，本发明的GLP1受体激动剂可用于治疗患有来自包括以下项的组的健康问题的受试者：糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、2型糖尿病、1型糖尿病、糖尿病前期、心血管疾病、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、冠心病、动脉硬化、外周动脉疾病、中风、呼吸功能障碍、肾脏疾病、脂肪肝疾病、代谢综合征和类似或相关病症。

在一些实施方案中，本发明的GLP1受体激动剂可用于治疗超重、肥胖的受试者和/或预防或治疗一种或多种肥胖症相关障碍，诸如心脏病、中风和糖尿病。

在一些实施方案中，本发明的GLP1受体激动剂可用于治疗患有糖尿病的受试者和/或预防与糖尿病相关的一种或多种并发症，诸如心脏病、中风、肾脏疾病、视网膜病、失明和外周神经损伤。

应当理解，本发明的一种或多种GLP1受体激动剂融合蛋白可用作对具有发展糖尿病的危险(例如，来自2型糖尿病)的患者的预防措施。此类风险包括但不限于高龄患者、孕妇和/或其他风险因素，包括肥胖家族史、高血胆固醇、吸烟、过量酒精摄入和/或缺乏运动。

在另一个实施方案中，本发明的蛋白质可用于制备药物组合物或药物，所述药物组合物或药物用于治疗患有诸如糖尿病和肥胖症的疾病或障碍的患者。在本发明的另一些实施方案中，GLP1受体激动剂可以用作本领域技术人员已知的可用于治疗或改善与高血糖症相关的疾病或障碍(诸如糖尿病(例如，2型糖尿病))的任何其他合适疗法的辅助或补充疗法。

组合疗法

由本发明考虑的组合疗法可以包括本发明的GLP1受体激动剂和可以与其(诸如本发明的GLP1受体激动剂、或本领域的普通技术人员将理解的本发明的生物活性片段)有利地组合的任何合适的另外治疗剂。另外的组合可以包括本发明的GLP1受体激动剂与一种或多种用于治疗与高血糖症相关的任何疾病或障碍(例如，糖尿病)的药物或疗法协同组合。在一些实施方案中，本发明的GLP1受体激动剂可以与一种或多种其他治疗剂组合以降低受试者的血糖水平或改善糖尿病的一种或多种症状。

本发明的GLP1受体激动剂可以与以下组合使用：胰岛素(胰岛素或胰岛素类似物)、胰岛素增敏剂诸如双胍类(例如，二甲双胍)和噻唑烷二酮(例如，罗格列酮))、胰岛素促分泌剂诸如磺脲类(例如，氯磺丙脲)和格列奈类(例如，那格列奈)、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖)、二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂(例如，西他列汀)、普兰林肽、溴麦角环肽、钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT-2)抑制剂(例如，卡格列净)、抗高血压药物(例如，血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、利尿剂、钙通道阻滞剂、α-肾上腺素受体阻滞剂、内皮素-1受体阻滞剂、有机硝酸盐和蛋白激酶C抑制剂)、他汀类、阿司匹林、不同的GLP1受体激动剂、饮食补充剂或治疗或管理糖尿病的任何其他疗法(例如，运动)。

在又一些实施方案中，GLP1受体激动剂可以与一种或多种治疗剂组合施用，所述治疗剂包括：胰岛素、胰岛素类似物、二甲双胍、罗格列酮、吡格列酮、氯磺丙脲、格列苯脲、格列美脲、格列吡嗪、妥拉磺脲(tolazamide)、甲苯磺丁脲、那格列奈、瑞格列奈、阿卡波糖、米格列醇、艾塞那肽、利拉鲁肽(liraglutide)、阿比鲁肽(albiglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide)、西他列汀、沙格列汀(saxagliptin)、利格列汀(linagliptin)、阿格列汀(alogliptin)、普兰林肽、溴麦角环肽速释、卡格列净、达格列净(dapagliflozin)、恩格列净(empagliflozin)、饮食调整和运动。

如本文所用，术语“组合”意指另外的治疗活性组分可以在本发明的GLP1受体激动剂的施用之前、同时或之后施用。术语“组合”还包括将GLP1受体激动剂和第二治疗剂依次或同时施用。

另外的治疗活性组分可以在本发明的GLP1受体激动剂的施用之前向受试者施用。例如，如果第一组分在第二组分的施用之前1周、之前72小时、之前60小时、之前48小时、之前36小时、之前24小时、之前12小时、之前6小时、之前5小时、之前4小时、之前3小时、之前2小时、之前1小时、之前30分钟、之前15分钟、之前10分钟、之前5分钟或之前小于1分钟施用，则可以认为第一组分在第二组分“之前”施用。在另一些实施方案，另外的治疗活性组分可以在本发明的GLP1受体激动剂的施用之后向受试者施用。例如，如果第一组分在第二组分的施用之后1分钟、之后5分钟、之后10分钟、之后15分钟、之后30分钟、之后1小时、之后2小时、之后3小时、之后4小时、之后5小时、之后6小时、之后12小时、之后24小时、之后36小时、之后48小时、之后60小时、之后72小时施用，则可以认为第一组分在第二组分“之后”施用。在又一些的实施方案中，另外的治疗活性组分可以与本发明的GLP1受体激动剂的施用同时向受试者施用。出于本发明的目的，“同时”施用包括例如将GLP1受体激动剂和另外的治疗活性组分以单一剂型向受试者施用，或以单独剂型在彼此的约30分钟或更短的时间内向受试者施用。如果以单独剂型施用，则每种剂型可以通过相同的途径施用(例如，GLP1受体激动剂和另外的治疗活性组分均可以静脉内等施用)；可替代地，每种剂型可以通过不同的途径施用(例如，GLP1受体激动剂可以静脉内施用，并且另外的治疗活性组分可以口服施用)。在任何情况下，出于本公开的目的，以单一剂型、通过相同的途径以单独剂型或通过不同途径以单独剂型施用组分均被认为是“同时施用”。出于本公开的目的，在施用另外的治疗活性组分“之前”、“同时”或“之后”(术语如以上在本文中所定义的)施用GLP1受体激动剂被认为GLP1受体激动剂与另外的治疗活性组分“组合”施用。

本发明包括其中将本发明的GLP1受体激动剂与本文其他地方所述的一种或多种另外的治疗活性组分共同配制的药物组合物。

本文公开的或提及的所有出版物和专利文献均以引用的方式整体并入本文。仅出于说明和描述的目的呈现了以上描述。该描述并不旨在将本发明限制为所公开的精确形式。确实，除了本文描述的那些之外，根据以上描述和附图，本发明的各种修改将对于本领域技术人员而言变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

应当理解，本文公开的分子结构和方法仅是说明性的，并不意味着是全面的或必须以所示的顺序或精确方式执行。本领域技术人员将理解，本发明可以按照不同于所描述的实施方案(其出于说明而非限制的目的而呈现)的方式来实践，并且本发明仅由以下所附权利要求来限制。

下面的序列ID还以命名为“YW-001_SEQ”的ASCII文本文件提交并且明确地以引用的方式并入本文。

Claims

1.一种融合蛋白，其包含：

胰高血糖素样肽(GLP-1)的保护序列，所述保护序列用于阻止体内切割、失活或降解；

含有蛋白酶切位点的氨基酸接头区，所述氨基酸接头区用于将所述保护序列与GLP-1类似物连接。

2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述保护序列还包含胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体细胞外结构域(ECD)。

3.权利要求2所述的融合蛋白，其中所述GLP1R ECD包括131位置处的从Arg至Gly的突变以消除因子Xa酶切位点。

4.权利要求2所述的融合蛋白，其中所述GLP1R ECD含有在C末端处从位置131至139的9个氨基酸缺失(RGERSSPEE)，以去除因子Xa酶切位点。

5.权利要求2所述的融合蛋白，其通过接头融合至Trulicity的N末端。

6.权利要求5所述的融合蛋白，其中所述接头包含1xG4S(GGGGS)、2xG4S(GGGGSGGGGS)或3XG4S(GGGGSGGGGSGGGGS)和之后的蛋白酶切序列。

7.权利要求6所述的融合蛋白，其中优选的蛋白酶序列针对因子Xa及其变体，所述变体来自包括RKRR、RGER、RKR、RR的组。

8.权利要求5所述的融合蛋白，其中Trulicity的Fc部分被抗GLP1R靶向抗体和双特异性抗体之一替换。

9.权利要求8所述的融合蛋白，其中所述双特异性抗体靶向两种受体形式胰高血糖素/分泌素超家族(例如，GLP1R和GIPR)中的任一种。

10.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述保护序列包含结合GLP1并保护其免受蛋白酶切的抗GLP1抗体(在某些优选的实施方案中，抗体的Fab区、纳米抗体或双特异性T细胞衔接体“BiTE”抗体)。

11.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述GLP1肽可以是胰高血糖素/分泌素超家族中的其他类似肽或其杂合体。

12.权利要求11所述的融合蛋白，其中所述胰高血糖素/分泌素超家族包括以下项中的至少一种：胰高血糖素、GLP-1、GLP-2、GIP、VIP、PACAP、艾塞那肽-4、GLP1/GIP双重激动剂和GLP1/GIP/胰高血糖素三重激动剂。

13.一种药物，其包含权利要求1所述的融合蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。

14.一种降低血糖水平的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1所述的蛋白质。

15.权利要求14所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或障碍：糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、2型糖尿病、1型糖尿病、糖尿病前期、心血管疾病、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、冠心病、动脉硬化、外周动脉疾病、中风、呼吸功能障碍、肾脏疾病、脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和代谢综合征。

16.一种预防、治疗或改善2型糖尿病的至少一种症状、适应症或并发症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1所述的蛋白质。

17.权利要求16所述的方法，其中所述至少一种症状、适应症或并发症选自：高血糖水平、过度口渴、排尿增加、尿液中存在酮、疲劳、体重波动、视力模糊、疮口愈合缓慢、频繁感染、牙龈肿胀或敏感、肥胖症、心脏病、中风、肾脏疾病、眼病、神经损害和高血压。

18.权利要求14和16所述的方法，其中所述药物组合物与第二治疗剂或疗法组合施用。

19.权利要求18所述的方法，其中所述第二治疗剂或疗法选自：胰岛素或胰岛素类似物、二甲双胍、噻唑烷二酮、磺酰脲、双胍、氯磺丙脲、格列奈、α葡糖苷酶抑制剂、那格列奈、DPP4抑制剂、普兰林肽、西他列汀、溴麦角环肽、SGLT2抑制剂、卡格列净、抗高血压药物、他汀类、阿司匹林、饮食调整、运动和饮食补充剂。

20.权利要求14和16所述的方法，其中所述药物组合物通过皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服或肌内施用。