CN114965638B - 一种具有内参信号的比率型生物传感器及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有内参信号的比率型生物传感器及制备方法，包括Au‑g‑C3N4纳米片/H1/GCE电极的制备和PtNCs/H2复合物的制备。采用了目标诱导催化发卡组装的信号放大策略，实现了高灵敏度、高特异性的microRNA‑21检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有内参信号的比率型生物传感器及制备方法，属于生物传感器技术领域。
背景技术
人体中的miRNAs针对在细胞过程中发挥重要作用的超过30％的人类基因组，是几种生物过程如造血功能，细胞增殖和细胞凋亡中的重要调节因子。miRNA的异常表达与各种癌症的发生密切相关，它可以作为早期癌症诊断的候选基因。因此开发一种高灵敏，高特异性且高精度的技术来检测miRNA是非常重要的。
近年来，基于双信号响应的比率测定方法因其良好的可靠性和重现性而受到广泛关注。与传统的单信号输出不同，比率分析是基于双信号的比值。在大多数双信号定量技术中，在电化学氧化还原对和荧光供体-受体对作为信号输出的帮助下，信号变化被设计为同步信号开(或关)或反向信号开/关变化。这些双信号策略已被应用于各种分析技术，并被证实具有良好的检测可行性，特别是对复杂样品的生物分子分析。
但是，在复杂环境下，很难确定双信号波动是由目标结合还是传感器表面损坏引起的，以至于难以提供准确的检测结果。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域普通技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种具有内参信号的比率型生物传感器及制备方法，采用了目标诱导催化发卡组装的信号放大策略，实现了高灵敏度、高特异性的microRNA-21检测。
为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：
一方面，本发明提供了一种具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极的制备：合成Au-g-C3N4纳米片；将所述Au-g-C3N4纳米片修饰到预处理后的GCE电极上，得到Au-g-C3N4纳米片/GCE电极；将所述Au-g-C3N4纳米片/GCE电极与预处理后的DNA链H1进行孵育，得到Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极；
PtNCs/H2复合物的制备：合成PtNCs；将所述PtNCs与预处理后的DNA链H2进行反应，得到PtNCs/H2复合物。
进一步的，所述Au-g-C3N4纳米片的合成步骤如下：
采用三聚氰胺为原料，制备g-C3N4溶液；
在所述g-C3N4溶液中加入HAuCl4溶液、NaBH4溶液和柠檬酸钠溶液，经离心洗涤处理，得到Au-g-C3N4纳米片。
进一步的，所述制备的g-C3N4溶液质量浓度为0.05～0.15mg/mL；
所述HAuCl4溶液、NaBH4溶液和柠檬酸钠溶液的物质的量比为2:5:2。
进一步的，所述GCE电极的预处理步骤如下：
使用Al2O3粉末对GCE电极进行抛光，之后用乙醇和水分别进行超声清洗，再使用氮气吹干。
进一步的，所述Au-g-C3N4纳米片/GCE电极的制备步骤如下：
将所述Au-g-C3N4纳米片分散于水中，得到Au-g-C3N4悬浮液；
将所述Au-g-C3N4悬浮液滴到预处理后的GCE电极表面，干燥后得到Au-g-C3N4纳米片/GCE电极。
进一步的，所述Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极的制备步骤如下：
采用TCEP对DNA链H1进行预处理，切断S-S键，得到预处理后的DNA链H1；
将所述Au-g-C3N4纳米片/GCE电极与所述DNA链H1进行孵育，孵育完成后，封闭多余的活性位点，得到Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极。
进一步的，所述TCEP与DNA链H1的物质的量比为1：1。
进一步的，所述PtNCs/H2复合物的制备步骤如下：
在H2PtCl6·6H2O溶液中加入PEI和抗坏血酸(AA)，得到PtNCs；
将DNA链H2与EDC和NHS进行孵育，得到预处理后的DNA链H2；
将所述PtNCs与DNA链H2进行反应，得到PtNCs/H2复合物。
进一步的，所述PEI、H2PtCl6·6H2O与抗坏血酸(AA)的浓度比为1：1：2；
所述EDC与NHS的浓度比为4：1。
另一方面，本发明提供了一种上述的具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法制得的生物传感器，包括Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极和PtNCs/H2复合物。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
本发明采用了目标诱导催化发卡组装的信号放大策略，制得的生物传感器实现了高灵敏度、高特异性的microRNA-21检测，检测的microRNA-21线性范围为1fM～100pM，检测限可达0.1fM。
本发明采用Au-g-C3N4作为生物分子的载体构建生物传感器的活性界面，使得制备的生物传感器具有高度稳定的物理化学特性和良好的生物相容性。
本发明制得的生物传感器，可以通过自校准两个发射光谱消除系统中的干扰，从而在复杂环境下提供非常准确的检测结果。
附图说明
图1是本发明的目标诱导催化发卡组装的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征示意图。
图2是本发明的比率电致化学生物传感器不同阶段的循环伏安图；
图3是本发明的比率电致化学生物传感器不同阶段的电化学阻抗图；
图4是本发明的生物传感器对不同浓度的目标物的ECL信号响应结果；
图5是microRNA-21的浓度与鲁米诺分子的ECL信号增值/Au-g-C3N4ECL信号(ΔIluminol/IAu-g-C3N4)的线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例1提供了一种具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)铂金属纳米簇PtNCs的制备：采用一步水热法合成了稳定的PtNCs。首先，将0.1668g PEI作为稳定剂加入到20mL 2.5mM的H2PtCl6·6H2O溶液中；室温搅拌2h后，加入1.8mg抗坏血酸(AA)。用HCl溶液调节pH为5后，90℃水热反应1h，得到了含有大量PEI的PtNCs溶液。最后，合成的PtNCs溶液经透析膜纯化后,4℃保存。
其中，PEI/H2PtCl6·6H2O/AA的浓度比为1:1:2，HCl的浓度为0.05～0.5M，优先0.1M。若pH偏低，可以用NaOH调节pH。透析膜的截留分子量为14kDa，纯化时间为24～48h，优选48h。
(2)PtNCs/H2复合物的制备：首先将1mL 2μM的DNA链H2溶液与EDC(40mM)和NHS(10mM)孵育，激活DNA链H2链末端修饰的羧基。然后加入1mL纯化的Pt NCs溶液，在4℃反应4h。用超滤管离心去除未结合的DNA链H2链以及溶液中的EDC和NHS，得到Pt NCs/H2复合物。最后，将PtNCs/H2复合物重新分散于PBS溶液(pH 7.4)中。
其中，超滤管的截留分子量为10-30kDa，优选10kDa；离心速度为7000-8000rpm，优选7000rpm。
(3)g-C3N4纳米片的合成：该过程需要将20g的三聚氰胺放入有盖子的氧化铝坩埚中，然后以3℃/min的速度加热至600℃，在600℃的温度下加热2小时，直到产生黄色粉末，该黄色粉末为g-C3N4粉末。将1mg g-C3N4粉末分散于6mL水中，连续超声后进行离心处理，以去除残留和未脱落的g-C3N4，得到g-C3N4溶液。
其中，连续超声时间为10～16h，离心速度为4000～6000rpm，制得的g-C3N4溶液质量浓度为0.05-0.15mg/mL。优选的连续超声时间为16h，离心速度为5000rpm，优选的g-C3N4溶液质量浓度为0.1mg/mL。
(4)Au-g-C3N4纳米片的制备：首先，对(1)中制备的0.1mg/mL的g-C3N4溶液进行超声处理。然后加入30μL HAuCl4(0.01M)溶液，搅拌1分钟左右。在冰浴条件下快速注入75μL新鲜制备的NaBH4溶液(0.01M)，搅拌20min。然后滴入30μL柠檬酸钠溶液(0.01M)，持续搅拌。5分钟后，移除冰浴，混合物在25℃下继续保存30分钟。将得到的纳米杂化材料离心，并用超纯水洗涤三次，去除多余的NaBH4、柠檬酸钠和没有与g-C3N4纳米片结合的金纳米颗粒。将最终离心得到的沉淀物重新分散到水中，保存在4℃下，以供后续实验过程使用。
其中，超声处理的时间为8～12h，优选10h。HAuCl4/NaBH4/柠檬酸钠的物质的量比为2:5:2。
(5)Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极的组装：
用1μm和0.5μmAl2O3粉末先后对GCE电极进行抛光，之后用乙醇和水分别进行超声清洗，氮气吹干。
将10μL Au-g-C3N4悬浮液滴到GCE电极表面，在室温下干燥，得到Au-g-C3N4纳米片膜修饰的GCE电极。
先用10mM TCEP预处理H1，切断S-S键，再将修饰完的GCE电极浸泡在50μL 0.5μM的发夹DNAH1溶液中，37℃孵育6h。
将孵育完的电极用PBS缓冲液冲洗后在2％(wt)BSA溶液中37℃浸泡1h，也可用1mMMCH溶液取代BSA溶液封闭活性位点。
其中，Al2O3粉末也可以选用0.3μm和0.05μm的先后抛光。TCEP与H1的物质的量比为1:1。
实施例2
本实施例2提供了一种使用实施例1的具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法制得的生物传感器，包括Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极和Pt NCs/H2复合物。
检测方法如下：
使用PBS缓冲液冲洗Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极表面后，将其浸泡于含有50μLPtNCs-H2复合物，和不同浓度的miRNA-21的混合物中37℃浸泡2h。
其中，Pt NCs-H2复合物和不同浓度的miRNA-211:1混合，miRNA-21浓度为1fM～10nM，PBS缓冲液含有鲁米诺分子和过量H2O2。
将制备的Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。在含鲁米诺和过量H2O2的0.1M PBS缓冲液(pH＝7.4)中，利用电致化学发光工作站记录和检测电致化学发光信号；根据microRNA-21浓度与ECL信号的对应关系，实现对microRNA-21的检测。
具体原理如下，将Au-g-C3N4纳米片修饰在GCE电极表面，选用Au-g-C3N4纳米片的阴极ECL信号作为内部参考，而游离的鲁米诺分子的阳极ECL作为报告信号，并使用过量的H2O2作为共反应物。在microRNA-21存在的情况下，它会与Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极表面的DNA链H1杂交，因此打开H1的发卡结构，而H1未杂交的部分能打开H2的发卡结构，与PtNCs/H2复合物互补配对，引发链置换反应，使microRNA-21从原本与H1的双链结构中置换出来，形成新的PtNCs-H2-H1的双链结构，置换出的microRNA-21与下一个H1继续反应。N次循环后，一定含量的PtNCs标记的探针链被带入电极。在优化条件下，PtNCs催化H2O2对鲁米诺的阳极信号强度随microRNA-21浓度的增加而增强，而Au-g-C3N4纳米片的阴极ECL信号保持不变。通过监测报告信号增强强度与参考信号强度的比值响应，检测目标microRNA-21的浓度。
检测结果如图4所示，图中c中的microRNA-21浓度大于b中的microRNA-21浓度，b中的microRNA-21浓度大于a中的microRNA-21浓度。对不同浓度的microRNA-21，阴极发光信号的ECL强度随着峰值电位的移动而保持在一个稳定的值，而阳极ECL强度随着microRNA-21浓度的增加而增强。
如图5所示，microRNA-21的浓度与鲁米诺分子的ECL信号增值/Au-g-C3N4ECL信号(ΔI鲁米诺分子/IAu-g-C3N4)的线性关系曲线为ΔI鲁米诺分子/IAu-g-C3N4＝6.231+0.355lgC，在信噪比(S/N)为3时，计算得microRNA-21的检测极限为0.1fM。
实施例3
本实施例3通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和成像来确定目标识别和循环中链的组装。
在新制备的聚丙烯酰胺凝胶(8％)凹槽中滴入制备好的DNA链，然后在1×TBE缓冲液中，电位为70V，进行电泳80min。用溴化乙锭(EB)染色后，用生物凝胶成像系统进行拍摄成像。
如图1所示，泳道1表示目标链(含有microRNA-21)，泳道2表示DNA链H1，泳道3表示DNA链H2，泳道4表示DNA链H1和DNA链H2的混合物，泳道5表示DNA链H1和目标链的混合物，泳道6表示目标链和DNA链H2的混合物，泳道7表示目标链、DNA链H1和DNA链H2的混合物。其中，目标链、DNA链H1和DNA链H2均为2μM。
当DNA链H1和DNA链H2混合在一起时，没有发生杂化反应，由于单个条带位置较近，条带在4号泳道简单重叠成一条宽条带。只有以microRNA-21为靶点打开H1的发夹环结构，才能触发杂交-置换-释放循环，产生H1-PtNCs杂化复合物和多余的目标链，验证了本发明生物传感器检测的可行性。
实施例4
本实施例4提供了在5mM[Fe(CN)6 3-/4-]为氧化还原探针的条件下，采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)验证生物传感器在电极上的逐步修饰是否成功。
如图2和3所示，曲线a表示未修饰的GCE电极，曲线b表示Au-g-C3N4修饰后的电极，曲线c表示Au-g-C3N4和H1依次修饰后的电极，曲线d表示Au-g-C3N4、H1和BSA依次修饰后的电极，曲线e表示组装PtNCs/H2复合物的Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极。
未修饰的GCE电极在CV曲线上呈现出标准的氧化还原峰对并且在EIS中半圆直径相对较小(曲线a,Ret＝180Ω)。Au-g-C3N4、H1和BSA依次修饰后，电极表面的峰值电流强度依次减小，峰值电位发生偏移，表明电极表面修饰成功。同时，电子转移阻抗Ret从Ret＝2000Ω(曲线b)逐渐增加到4560Ω(曲线c)，并逐渐增加到6680Ω(曲线d)。最后，在目标microRNA存在的情况下，将所制备的Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极与Pt NCs/H2复合物孵育，将Pt NCs组装到电极表面，电阻显著下降达到160Ω左右(曲线e)。同时，峰值电流强度恢复较好，接近裸电极曲线。CV和EIS的表征证实了电极的逐步修饰，也验证了该生物传感器检测的可行性。
终上所述，本发明以Au-g-C3N4作为生物分子的载体构建生物传感器的活性界面，使本发明制备的生物传感器具有高度稳定的物理化学特性和良好的生物相容性。
本发明提供的生物传感器，可以通过自校准两个发射光谱消除系统中的干扰，从而在复杂环境下提供非常准确的检测结果。
本发明的电致化学发光生物传感器，采用了目标诱导催化发卡组装的信号放大策略，实现了高灵敏度、高特异性的microRNA-21检测，检测的microRNA-21线性范围为1fM～100pM，检测限可达0.1fM，为microRNA的检测提供了一种新方法。
本申请中设计的名词解释如下：
microRNA：微小核糖核酸；g-C3N4：类石墨相氮化碳；TCEP：三(2-羧乙基)膦；BSA：牛血清白蛋白；ECL：电致化学发光；PBS：磷酸盐缓冲液；PEI：聚乙烯亚胺；EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基丁二酰亚胺；CV：循环伏安法；EIS：电化学阻抗谱。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法，其特征是，
所述比率型生物传感器具体原理如下，将Au-g-C3N4纳米片修饰在GCE电极表面，选用Au-g-C3N4纳米片的阴极ECL信号作为内部参考，而游离的鲁米诺分子的阳极ECL作为报告信号，并使用过量的H2O2作为共反应物；通过监测报告信号增强强度与参考信号强度的比值响应，检测目标microRNA-21的浓度；
所述制备方法包括如下步骤：
Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极的制备：合成Au-g-C3N4纳米片；将所述Au-g-C3N4纳米片修饰到预处理后的GCE电极上，得到Au-g-C3N4纳米片/ GCE电极；将所述Au-g-C3N4纳米片/GCE电极与预处理后的DNA链H1进行孵育，得到Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极；
Pt NCs/H2复合物的制备：合成Pt NCs；将所述Pt NCs与预处理后的DNA链H2进行反应，得到Pt NCs/H2复合物；
其中，所述Au-g-C3N4纳米片的合成步骤如下：
采用三聚氰胺为原料，制备g-C3N4溶液；
在所述g-C3N4溶液中加入HAuCl4溶液、NaBH4溶液和柠檬酸钠溶液，经离心洗涤处理，得到Au-g-C3N4纳米片；
所述Au-g-C3N4纳米片/ GCE电极的制备步骤如下：
将所述Au-g-C3N4纳米片分散于水中，得到Au-g-C3N4悬浮液；
将所述Au-g-C3N4悬浮液滴到预处理后的GCE电极表面，干燥后得到Au-g-C3N4纳米片/GCE电极；
所述Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极的制备步骤如下：
采用TCEP对DNA链H1进行预处理，切断S−S键，得到预处理后的DNA链H1；
将所述Au-g-C3N4纳米片/ GCE电极与所述DNA链H1进行孵育，孵育完成后，封闭多余的活性位点，得到Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极；
所述Pt NCs/H2复合物的制备步骤如下：
在H2PtCl6∙6H2O溶液中加入PEI和抗坏血酸，得到Pt NCs；
将DNA链H2与EDC和NHS进行孵育，得到预处理后的DNA链H2；
将所述Pt NCs与DNA链H2进行反应，得到Pt NCs/H2复合物。
2. 根据权利要求1所述的具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法，其特征是，所述制备的g-C3N4溶液质量浓度为0.05~0.15 mg/mL；
所述HAuCl4溶液、NaBH4溶液和柠檬酸钠溶液的物质的量比为2:5:2。
3.根据权利要求1所述的具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法，其特征是，所述GCE电极的预处理步骤如下：
使用Al2O3粉末对GCE电极进行抛光，之后用乙醇和水分别进行超声清洗，再使用氮气吹干。
4.根据权利要求1所述的具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法，其特征是，所述TCEP与DNA链H1的物质的量比为1：1。
5.根据权利要求1所述的具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法，其特征是，所述PEI、H2PtCl6∙6H2O与抗坏血酸的浓度比为1：1：2；
所述EDC与 NHS的浓度比为4：1。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的具有内参信号的比率型生物传感器的制备方法制得的生物传感器，其特征是，包括Au-g-C3N4纳米片/H1/GCE电极和Pt NCs/H2复合物。
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