CN114965631A - 一种用于检测铅离子的光电化学传感器的构建方法 - Google Patents

一种用于检测铅离子的光电化学传感器的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测铅离子的光电化学传感器的构建方法，步骤依序包括：获取自给电子型光电材料PTB7‑Th溶液；将该溶液修饰到电极上得修饰电极；在修饰电极表面沉积金纳米颗粒；在电极表面滴加标记有猝灭剂的引物S1‑Biotin，并孵育过夜；将1‑己硫醇HT孵育在电极表面，并在室温下培养预设时间；在电极表面孵育引物酶S2，引物S1与引物酶S2发生碱基互补配对，使引物酶S2被固载于传感界面；向上述传感界面加入目标物铅离子，直到完成循环剪切；测定不同铅离子浓度对应的PEC信号，并建立标准曲线。本发明具有操作工序简单，操作时间短，实施成本低的优势，能够快速、高灵敏、高选择性检测铅离子，且能够在检测过程中获得稳定的光电流信号。

Description

一种用于检测铅离子的光电化学传感器的构建方法
技术领域
本发明涉及铅离子检测技术领域，具体涉及一种用于检测铅离子的光电化学传感器的构建方法。
背景技术
铅离子(Pb2+)是一种普遍存在的且不可生物降解的剧毒污染物，被广泛应用于矿冶、制造、能源和建筑等行业，对工业发展极为重要。研究表明，Pb2+会通过农业灌溉、渗透等方式进入土壤，导致土壤质量下降，降低农作物质量以及产量等，它还可以通过空气和地表水等途径对人体的神经、造血、心血管和内分泌系统造成不利影响。通过被污染的水、食物或者通过包装材料，Pb2+还会迁移到食品中，从而进入人体，其在人体内能够使蛋白质、酶等物质失去活性，也可能在人体的某些器官中堆积，从而造成慢性中毒。因此，对Pb2+污染的预防和治理迫在眉睫，研究和建立铅的准确、灵敏检测方法，实现对Pb2+的准确、灵敏检测，对预防和控制由铅引起的污染和危害有着重要的意义。
目前，如光谱分析法、荧光法、表面增强拉曼散射法和电化学法被用来测定铅离子。其中：光谱分析法检测铅离子的灵敏度有限，难以消除其他共存离子的干扰，且需要的样品量大，一般作为定性检测方法；荧光法中荧光染料的荧光强度较低、易被光漂白等限制了其应用；表面增强拉曼散射法具有检测准确及灵敏等优点，但在金属离子的痕量检测中具有拉曼光谱信噪比低、容易受到其他未知组分的干扰等缺点；电化学分析方法的检测灵敏度不够高，限制了其广泛应用。另外，前述检测铅离子的方法所需仪器昂贵，操作繁锁、费时，并且对分析人员的技术水平要求较高。
与传统的分析方法相比，光电化学(PEC)分析方法是一种新兴的检测技术，其激发源(光)和检测信号(电流)完全分离，具有更低的成本、更低的背景噪声和更高的灵敏度，逐渐成为痕量目标物检测中最具有潜力的手段。
北京农业质量标准与检测技术研究中心开发了基于光电化学DNA生物传感器的铅离子测定方法(CN105758922B)，将含有部分能够特异性识别Pb2+的DNA序列组装于ITO电极表面，并以Ru(bpy)2(dppz)2+作为光电化学信号探针，当Pb2+与电极表面DNA作用后，探针从DNA链中脱离，导致光电化学信号的降低，实现Pb2+的光电化学检测。
针对传统分析方法存在的问题，本发明则是为了从另一技术路线，开发一种简单、低成本且能够快速、高灵敏、高选择性检测铅离子的光电化学分析方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种简单、低成本且能够快速、高灵敏、高选择性检测铅离子的光电化学传感器的构建方法。
本发明目的是采用如下技术方案实现的。
一种用于检测铅离子的光电化学传感器的构建方法，其特征在于，步骤包括：
步骤1，获取自给电子型光电材料PTB7-Th溶液；
步骤2，将PTB7-Th修饰到电极上，得修饰电极；
步骤3，在所得修饰电极表面沉积金纳米颗粒；
步骤4，在步骤3结束后的电极表面滴加标记有猝灭剂的引物S1-Biotin，并孵育过夜；
步骤5，将1-己硫醇HT孵育在步骤4结束后的电极表面，并在室温下培养预设时间；
步骤6，在步骤5结束后的电极表面孵育引物酶S2，引物S1与引物酶S2发生碱基互补配对，使引物酶S2被固载于传感界面；
步骤7，向上述传感界面加入目标物铅离子，直到完成循环剪切；
步骤8，测定不同铅离子浓度对应的PEC信号，并建立标准曲线。
检测时，将未知浓度的铅离子样品，按上述方法(步骤1-7)测得PEC信号，代入标准曲线计算得到样品中的铅离子浓度。
进一步地，所述标记有猝灭剂的引物S1-Biotin、所述引物酶S2序列如下：
Figure BDA0003735544400000021
进一步地，
步骤1具体为：将PTB7-Th通过连续超声分散到氯仿CHCl3中，以获得呈现黑绿色的PTB7-Th溶液；
步骤2具体为：将PTB7-Th溶液滴到清洁的玻碳电极GCE表面，并在37℃的烘箱中干燥以形成均匀的膜；
步骤3具体为：将所得修饰电极浸入氯金酸HAuCl4溶液中，使其在-0.2V的恒定电位下运行4s，完成电沉积金纳米颗粒dep Au，得到金纳米沉积电极GCE/PTB7-Th/dep Au；
步骤4具体为：向所得金纳米沉积电极表面滴加标记有猝灭剂的引物S1-Biotin，在4℃下孵育12小时，使得S1-Biotin通过Au-N键稳定地固定于电极表面；
作为优选方案，所述氯仿CHCl3的浓度为99％，所述氯金酸HAuCl4的浓度为1％，
作为更优选方案，步骤5中，将1-己硫醇HT在室温下孵育40分钟；步骤6中，引物酶S2在37℃下孵育2小时，与S1-Biotin杂交；步骤7中，不同浓度的Pb2+在37℃下孵育2小时后，记录传感器的光电流。
本发明中，标记有猝灭剂的引物S1包含三个功能区：3'氨基末端、Pb2+依赖性DNA酶的底物链序列以及5'末端标记信号猝灭剂生物素(Biotin)；通过Au-N键将S1的3'端固定，以此引入了标记在5'末端的信号猝灭剂生物素(Biotin)，使得PEC信号显著降低；
本发明中，引物酶S2是Pb2+依赖性DNA酶序列，引物酶S2的引入引发铅离子循环放大反应，进一步提高了检测灵敏度；标记有猝灭剂的引物S1的Pb2+依赖性DNA酶的底物链序列功能区与S2能够结合，铅离子的存在可激活引物酶S2，使引物酶S2具有DNA酶的活性，引物酶S2能够在特定位点将标记有猝灭剂的引物S1链剪切成两段，标记有猝灭剂生物素的DNA片段脱落，只留下S1的残链在传感界面，同时引物酶S2和铅离子将在传感界面进行下一次杂交、识别、剪切，从而实现循环剪切。
本发明中，还通过1-己硫醇HT占据GCE/PTB7-Th/dep Au/S1-Biotin表面剩余活性位点，去除引物酶S2的非特异性吸附。
本发明基于自给电子型光电材料与铅离子依赖性酶辅助的目标物循环放大的光电化学生物传感器检测铅离子的方法得到测定的线性及检测限，取浓度范围从50fmol/L-500nmol/L的铅离子进行测试，所测得光电信号与铅离子浓度之间呈较好的线性，其检测限为16.7fmol/L。
本发明基于自给电子型光电材料PTB7-Th、铅离子Pb2+循环放大反应及信号猝灭剂生物素Biotin，构建信号on-off-on模式的生物传感器，实现了对Pb2+的灵敏检测。具体地，用PTB7-Th作为光电材料，得到第一个信号on；接着首次将Biotin作为信号猝灭剂用于该发明，得到显著的信号off；铅离子Pb2+循环放大反应的进行能够将标记猝灭剂Biotin的S1链剪断，使得Biotin脱离传感界面，猝灭剂的脱离可使信号得到恢复，产生第二个信号on；目标物Pb2+浓度越大，信号越大。
本发明具有操作工序简单，操作时间短，实施成本低的优势，能够快速、高灵敏、高选择性检测铅离子，且能够在检测过程中获得稳定的光电流信号。
附图说明
图1是实施例中用于检测铅离子的光电化学传感器构建示意图。
图2是实施例中不同Pb2+浓度下的光电流响应情况；
图3是实施例中光电流响应与Pb2+浓度对数之间的线性关系。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进一步说明，应当理解，此次所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
如图1所示，一种用于检测铅离子的光电化学传感器的构建方法，步骤如下：
步骤1，获取/制备自给电子型光电材料PTB7-Th溶液：将PTB7-Th通过连续超声分散到氯仿(CHCl3)中，以获得呈现黑绿色的PTB7-Th溶液；
步骤2，将PTB7-Th修饰到电极上：将PTB7-Th溶液滴到清洁的玻碳电极(GCE)表面上，并在37℃的烘箱中干燥以形成均匀的膜，得修饰电极，此时，该修饰电极可在无任何电子供体的情况下呈现出较大的PEC信号；
步骤3，在所得修饰电极表面沉积金纳米颗粒：将步骤2得到的修饰有PTB7-Th的电极浸入氯金酸(HAuCl4)溶液中，使其在-0.2V的恒定电位下运行4s，以电沉积金纳米颗粒(dep Au)，得到金纳米沉积电极GCE/PTB7-Th/dep Au；
步骤4，向所得金纳米沉积电极表面滴加标记有猝灭剂的引物S1-Biotin，在4℃下孵育12小时，使得S1-Biotin通过Au-N键稳定地固定于电极表面，得GCE/PTB7-Th/dep Au/S1-Biotin，猝灭剂Biotin的存在，PEC信号显著降低；
其中，记有猝灭剂的引物S1-Biotin序列如下：
Figure BDA0003735544400000041
步骤5，将1-己硫醇HT孵育在步骤4结束后的电极(即GCE/PTB7-Th/dep Au/S1-Biotin)表面，并在室温下培养40分钟以阻断非特异性吸附位点，通过1-己硫醇HT占据GCE/PTB7-Th/dep Au/S1-Biotin表面剩余活性位点，去除了引物酶S2的非特异性吸附；
步骤6，在步骤5结束后的电极表面孵育引物酶S2，引物S1与引物酶S2发生碱基互补配对，引物酶S2在37℃下孵育2小时，与S1-Biotin杂交，使引物酶S2被固载于传感界面，此过程中，引物酶S2能够稳定地固载于传感界面；
其中，引物酶S2序列如下：
Figure BDA0003735544400000042
步骤7，向上述传感界面加入目标物铅离子，直到完成循环剪切；本步骤中，向传感界面加入的目标物铅离子可激活引物酶S2链，使引物酶S2具有DNA酶的活性，引物酶S2能够在特定位点将标记有猝灭剂的引物S1链剪切成两段，标记有猝灭剂Biotin的DNA片段脱落，只留下引物S1的残链在传感界面，同时引物酶S2和铅离子将在传感界面进行下一次杂交、识别、剪切，从而实现循环剪切；
步骤8，测定不同铅离子浓度对应的PEC信号，并建立标准曲线；具体地，经过步骤7的多次循环剪切后，信号猝灭剂Biotin从传感界面脱落，PEC信号恢复，目标物铅离子浓度越大，PEC信号恢复越多，基于此测定不同铅离子浓度所对应的PEC信号，以建立标准曲线；
步骤9，将未知浓度的铅离子样品，按上述方法(步骤1-步骤7)检测，测得PEC信号，代入标准曲线得到样品中的铅离子浓度。
为证实所构建的传感器的检测性能，在最优条件下对不同浓度(50fmol/L-500nmol/L)Pb2+的PEC响应进行检测。结果如图2和图3所示：结果表明随着Pb2+浓度的增加，光电流呈现上升趋势，见图2；通过在50fmol/L至500nmol/L范围内的线性拟合获得了Pb2+浓度对数与光电流之间的校准曲线，其线性回归方程为I＝-0.0209lgc-0.227，相关系数r＝0.994，检测限为16.7fmol/L，见图3。此外，检测Pb2+的不同方法进行比较，结果见表1，这些结果证实了所设计传感器对Pb2+的检测具有高灵敏度和宽线性范围，为实际样品中Pb2+的检测提供了潜在的应用途径。
表1比较不同的Pb2+检测方法
Figure BDA0003735544400000051
本实施例中，标记有猝灭剂的引物S1包含三个功能区：3'氨基末端、Pb2+依赖性DNA酶的底物链序列以及5'末端标记信号猝灭剂生物素(Biotin)；通过Au-N键将S1的3'端固定，以此引入了标记在5'末端的信号猝灭剂生物素(Biotin)，使得PEC信号显著降低；
本实施例中，引物酶S2是Pb2+依赖性DNA酶序列，引物酶S2的引入引发铅离子循环放大反应，进一步提高了检测灵敏度；标记有猝灭剂的引物S1的Pb2+依赖性DNA酶的底物链序列功能区与S2能够结合，铅离子的存在可激活引物酶S2，使引物酶S2具有DNA酶的活性，引物酶S2能够在特定位点将标记有猝灭剂的引物S1链剪切成两段，标记有猝灭剂生物素的DNA片段脱落，只留下S1的残链在传感界面，同时引物酶S2和铅离子将在传感界面进行下一次杂交、识别、剪切，从而实现循环剪切。
本实施例基于自给电子型光电材料、铅离子依赖性酶辅助的目标物循环放大及信号猝灭剂生物素Biotin的光电化学生物传感器检测铅离子的方法得到测定的线性及检测限，取浓度范围从50fmol/L-500nmol/L的铅离子进行测试，所测得光电信号与铅离子浓度之间呈较好的线性，其检测限为16.7fmol/L。
本实施例基于自给电子型光电材料PTB7-Th、铅离子Pb2+循环放大反应及信号猝灭剂生物素Biotin，构建信号on-off-on模式的生物传感器，实现了对Pb2+的灵敏检测。具体地，用PTB7-Th作为光电材料，得到第一个信号on；接着首次将Biotin作为信号猝灭剂用于该发明，得到显著的信号off；铅离子Pb2+循环放大反应的进行能够将标记猝灭剂Biotin的S1链剪断，使得Biotin脱离传感界面，猝灭剂的脱离可使信号得到恢复，产生第二个信号on；目标物Pb2+浓度越大，信号越大。
本实施例中，首先将光电材料PTB7-Th溶液滴在干净的GCE表面，在37℃的烘箱中干燥，形成均匀的薄膜；接着，将PTB7-Th修饰的GCE浸入1％的氯金酸(HAuCl4)溶液中进行金纳米粒子(dep Au)的电沉积，在-0.2V的恒定电位下运行4s；随后，滴加S1-Biotin在4℃下孵育12小时；之后，将1-己硫醇HT在室温下孵育40分钟，阻断非特异性吸附点；将S2在37℃下孵育2小时，与S1-Biotin杂交；最后，滴加不同浓度的Pb2+在37℃下孵育2小时后，记录所构建的传感器的光电流。

Claims (5)

1.一种用于检测铅离子的光电化学传感器的构建方法，其特征在于，步骤包括：
步骤1，获取自给电子型光电材料PTB7-Th溶液；
步骤2，将PTB7-Th修饰到电极上，得修饰电极；
步骤3，在所得修饰电极表面沉积金纳米颗粒；
步骤4，在步骤3结束后的电极表面滴加标记有猝灭剂的引物S1-Biotin，并孵育过夜；
步骤5，将1-己硫醇HT孵育在步骤4结束后的电极表面，并在室温下培养预设时间；
步骤6，在步骤5结束后的电极表面孵育引物酶S2，引物S1与引物酶S2发生碱基互补配对，使引物酶S2被固载于传感界面；
步骤7，向上述传感界面加入目标物铅离子，直到完成循环剪切；
步骤8，测定不同铅离子浓度对应的PEC信号，并建立标准曲线。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述标记有猝灭剂的引物S1-Biotin、所述引物酶S2序列如下：
Figure FDA0003735544390000011
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
步骤1具体为：将PTB7-Th通过连续超声分散到氯仿CHCl3中，以获得呈现黑绿色的PTB7-Th溶液；
步骤2具体为：将PTB7-Th溶液滴到清洁的玻碳电极GCE表面，并在37℃的烘箱中干燥以形成均匀的膜；
步骤3具体为：将所得修饰电极浸入氯金酸HAuCl4溶液中，使其在-0.2V的恒定电位下运行4s，完成电沉积金纳米颗粒dep Au，得到金纳米沉积电极GCE/PTB7-Th/dep Au；
步骤4具体为：向所得金纳米沉积电极表面滴加标记有猝灭剂的引物S1-Biotin，在4℃下孵育12小时，使得S1-Biotin通过Au-N键稳定地固定于电极表面。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述氯仿CHCl3的浓度为99％，所述氯金酸HAuCl4的浓度为1％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于：步骤5中，将1-己硫醇HT在室温下孵育40分钟；步骤6中，引物酶S2在37℃下孵育2小时，与S1-Biotin杂交；步骤7中，不同浓度的Pb2+在37℃下孵育2小时后，记录传感器的光电流。
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