CN114958871B - 一种高粱分蘖调控基因SbTR1及其应用 - Google Patents

一种高粱分蘖调控基因SbTR1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高粱分蘖调控基因SbTR1及其应用，属于植物基因工程领域。本发明利用河农16(HN)与冀早糯1号(JZN)构建的F2:3群体，克隆了一个高粱分蘖基因SbTR1，通过构建过表达载体将基因SbTR1转化至拟南芥和水稻中，利用生物信息学、qRT‑PCR、转录组测序、转基因、激素测定及单倍型分析等技术研究了解该基因的功能及调控机制，结果表明，基因SbTR1参与多个激素途径，最终得出基因SbTR1可以负调控植物分枝的结论，为少分蘖高粱品种的培育垫定了基础。

Description

一种高粱分蘖调控基因SbTR1及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种高粱分蘖调控基因SbTR1及其应用。
背景技术
分蘖是影响禾本科作物产量的重要构成因素之一，在现代绿色革命中发挥着重要作用。作物中表现出两种分枝策略：一是增强顶端优势，降低侧枝伸出，如玉米(Zea maysL.)和高粱(Sorghum bicolor L.Moench)等；二是减弱顶端优势，增加侧枝产量，如水稻(Oryza sativa L.)、小麦(Triticum aestivum L.)以及谷子(Setaria italica)等。在高粱育种进程中，随着环境与人为驯化的选择压力，从野生高粱到驯化高粱，分蘖减少，使主茎仅保留一个顶穗，以满足对高粱产量、品质以及成熟一致性等方面的需求。因此，揭示高粱调控分蘖的分子机制对现代高粱品种选育具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高粱分蘖调控基因SbTR1克隆方法及其应用。本发明利用河农16(HN)与冀早糯1号(JZN)构建的F2:3群体，克隆了一个高粱分蘖基因SbTR1，通过构建过表达载体将基因SbTR1转化至拟南芥和水稻中，利用生物信息学、qRT-PCR、转录组测序、转基因、激素测定及单倍型分析等技术研究了解该基因的功能及调控机制，结果表明，基因SbTR1参与多个激素途径，最终得出基因SbTR1可以负调控植物分枝的结论，为少分蘖高粱品种的培育垫定了基础。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了一种高粱分蘖调控基因SbTR1，所述基因的碱基序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种所述高粱分蘖调控基因SbTR1在少分蘖高粱育种中的应用。
本发明还提供了一种所述高粱分蘖调控基因SbTR1编码的氨基酸序列。
本发明还提供了一种含有所述高粱分蘖调控基因SbTR1的重组表达载体。
本发明还提供了一种所述重组表达载体在少分蘖高粱育种中的应用。
本发明还提供了一种含有所述高粱分蘖调控基因SbTR1或所述重组表达载体的宿主菌。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌。
本发明还提供了一种所述宿主菌在少分蘖高粱育种中的应用。
本发明还提供了一种培育少分蘖高粱品种的方法，所述方法为将所述高粱分蘖调控基因SbTR1转染到高粱株系中进而得到少分蘖高粱品种。
本发明还提供了一种培育少分蘖高粱品种的方法，所述方法为通过杂交方法使杂交后代获得所述高粱分蘖调控基因SbTR1进而获得少分蘖高粱品种。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
(1)本发明首次发现基因SbTR1调控高粱分蘖，并且具体的调控方向为负调控。
(2)本发明发现基因SbTR1参与多个激素途径，并与生长素与独角金内酯间的相互作用有关，通过构建过表达SbTR1转拟南芥多分枝突变体d27及GR24喷施试验发现，基因SbTR1可以参与多个途径对植物分枝或分蘖进行调控。
(3)本发明利用188份高粱种质资源对SbTR1进行单倍型分析，发现5个SNP位点与高粱分蘖紧密连锁。连锁不平衡分析结果表明，这5个SNP位点构成3种不同的单倍型，分别命名为HAP1、HAP2和HAP3，携带HAP2的高粱品种分蘖数显著高于携带HAP1和HAP3的种质。由此可知，SbTR1中的5个SNP位点是导致分蘖数量变化的原因位点，并且认为sbi20975309和sbi20975313这两个错义突变位点是导致不同单倍型分蘖数差异的主要原因。
(4)本发明有助于加快少分蘖高粱品种的育种进程。
附图说明
图1是本发明实施例2中利用F2隐性单株对目的基因进行精细定位的过程图；
图2是本发明实施例2中精细定位区间内8个基因的qRT-PCR结果图；
图3是本发明实施例4中目的基因的扩增片段；
图4是本发明实施例4中转基因拟南芥表型比较图，其中A为野生型、空载体、过表达SbTR1-HN与过表达SbTR1-JZN 4种拟南株系表型比较图，B为4种拟南芥分枝数统计图，数值为平均值±标准差(n＝6)，采用Duncan多量程检验进行统计学分析，P<0.05；
图5是本发明实施例4中SbTR1二级结构对比图，其中黑色圆圈中为两个蛋白之间的差异，长条状为α-螺旋，中等条状为β-折叠，短条状为无规则卷曲；
图6是本发明实施例4中各个器官中SbTR1组织的特异性表达对比图；
图7是本发明实施例4中35S::SbTR1::GFP融合蛋白在烟草原生质体中的亚细胞共定位图；其中A为融合蛋白荧光通道；B为植物定位细胞核Marker荧光通道；C为明场；D为叠加图；
图8是本发明实施例4中WT与OE-SbTR1中测定激素含量的对比图；
图9是本发明实施例4中RNA-seq与qRT-PCR中与分枝相关基因的对比图；
图10是本发明实施例4中WT与OE-SbTR1中激素相关基因表达水平的对比图；
图11是本发明实施例5中转SbTR1水稻的功能分析图；
图12是本发明实施例6中SbTR1的等位变异分析图，其中A为SbTR1的5个遗传变异与多样性自交系分蘖存在关联，纵坐标的横线为p≤1×10-4时显著关联的阈值，B为5个显著变异的连锁不平衡分析，方格颜色(从深到浅)表示连锁不平衡值(R2)，C为携带3个单倍型的自交系分蘖统计，p值使用Student的t检验计算，D为188个高粱种质资源来源统计。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
实施例1群体构建及遗传分析
选用由河北农大大学育成的无分蘖品种河农16(HN)为母本，有分蘖品种冀早糯1号(JZN)为父本，杂交获得的F1代杂种，统计F1代杂种的分蘖数，结果如表1所示。
表1两亲本及F1代杂种分蘖数
由表1可知：父母本杂交获得的F1代杂种表现为中间型少分蘖。
F2群体于2019年5月种植在河北农业大学育种中心(河北保定)，每穴3粒，后间苗，衍生出800株，成熟后单株收获；F2:3家系于2020年5月种植在河北沧州，每个株系种植1行，行长5m，行距30cm，株距15cm，单穴播种，每穴3粒，间苗后每个家系剩余25个单株。试验田常规水肥管理，期间灌溉、除草等由经过专业指导的农民完成。2020年7月对672个F2:3家系的分蘖数(TN)进行鉴定，分别记录下纯合有分蘖株系(YT)、杂合株系以及纯合无分蘖株系(NT)，并计算分蘖性状在F2:3代株系间的分离比，结果如表2所示。
表2 F2:3家系分蘖性状分离
卡方检验结果х2＝1.345<х20.05＝5.99，即符合孟德尔遗传定律，说明在该群体中，高粱分蘖是由单基因控制的。
实施例2高粱分蘖基因SbTR1的精细定位和克隆
目的基因初定位
分别从F2:3家系中选出27个纯合有分蘖与26个纯合无分蘖株系构建DNA混池，用于BSA-seq测序。将过滤后的有效数据与参考基因组进行比对，在两亲本与子代混池之间分别发现3591556个SNP和544815个InDel多态性位点。结合ED法与SNP/InDel-index法对所有多态性位点进行关联分析，根据Fisher精确检验共计有7692个SNP位点与2222个InDel位点与高粱分蘖呈现显著关联，最终将目的基因所在区间锁定到3个QTL内，高粱4号染色体(55130000-55130000，55160000-55190000)与7号染色体(0-1650000)共计1.68Mb的物理区间内。
根据NCBI搜索结果，4号染色体上30kb的区间内无基因存在，认为候选基因更可能存在于7号染色体的1.65Mb内，基于此1.65Mb内的InDel位点与SSR位点设计引物对目的基因进行精细定位。以F2分离群体中252株隐性单株作为精细定位群体，将目的基因定位在TIM29与TIM98的70kb之间。定位所用的引物参见表3，定位结果如图1所示。
表3定位所用引物
参照NCBI中高粱基因组数据，在精细定位结果的区间内存在8个基因，根据这8个基因在两亲本间茎基部腋芽处的qRT-PCR结果，仅有2个基因的表达在亲本间存在显著差异(图2)。结合功能注释，其中基因Sobic.007G009300编码Aux/IAA蛋白，参与激素信号转导通路，与生长素信号转导，植物生长发育及形态建成等密切相关，且已有多个Aux/IAA蛋白被证实参与植物分蘖或分枝的生长发育。因此将Sobic.007G009300确定为调控高粱分蘖的候选基因，并将其命名为Sorghun Tillering regulation 1(SbTR1)。
实施例3过表达目的基因拟南芥株系、水稻株系构建
A大肠杆菌培养及质粒提取
取实验室保存的pBWA(V)HS甘油菌500μl放入5ml液体LB培养基中进行活化，放置37℃培养箱中过夜，培养基提前放入0.1％的卡那霉素。取活化后的新鲜菌液100μl加入到10ml液体LB中，放入37℃培养箱中，8h后取出。利用质粒小提试剂盒(康为试剂)对pBWA(V)HS质粒进行提取。
B载体构建
(1)目的片段扩增
通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载候选基因的CDS序列，利用高保真酶(TaKaRa)及针对候选基因的特异性引物(IAA25-CDSF/R)，对去掉终止密码子后的IAA25进行特异性PCR扩增，特异性引物如表4所示。
将PCR体系进行琼脂糖凝胶电泳，选择具有单一且明亮条带，利用手术刀片将条带切下，利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。20μl PCR体系配置方法如表5所示，PCR反应程序配置如表6所示。
表4候选基因克隆特异性引物
表5 PCR反应体系
表6 PCR反应程序
(2)重组质粒构建
pBWA(V)HS-3Glosgfp载体分别利用BsaI和Eco31I进行双酶切，切开的质粒进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段进行胶回收。将目的基因的CDS序列与胶回收后的pBWA(V)HS线性载体利用无缝克隆试剂盒(USEVERBRIGHT,UE)进行连接，构建35S::IAA25::GLosgfp过表达载体(OE-SbTR1)。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，酶切检查阳性克隆，送公司进一步测序验证，将准确无误的重组质粒转入农杆菌GV3101中获得HN-TR1基因植物表达载体，用于转化拟南芥。
C拟南芥转化
利用农杆菌介导法将HN-TR1转入盛花期的拟南芥中。收获T0代种子后，将T0种子于4℃冰箱春化5d，然后将种子均匀的放置于加入了0.1％潮霉素的1/2MS培养基中，待转基因种子萌发后，移栽至蛭石与营养土混合物(1：1)中，收获T1种子后，将单株阳性苗培育成株系，用上述方法培育至T3纯合株系，用于后续试验。
D水稻转化
取上述构建好的35S::IAA25::GLosgfp过表达载体(OE-SbTR1)，转化大肠杆菌DH5α，酶切检查阳性克隆，送公司进一步测序验证，取1μL测序无误的质粒加入50μL EHA105农杆菌感受态细胞中；充分混匀后吸取至电转杯中进行电转，电转后加1mL LB液体培养基于摇床30℃、180rpm振荡培养30min进行活化，将活化好的农杆菌菌液吸取50μL接种于LB固体培养基上，30℃暗培养48h。
转化水稻
挑选无霉斑、芽口正常的日本晴种子进行彻底消毒；消毒后的日本晴种子接种于诱导培养基，26℃光照培养7天；挑取农杆菌于侵染液中，制备OD600＝0.2的农杆菌重悬液，挑取愈伤于三角瓶中，加入农杆菌重悬液，侵染10-15min后弃菌液，将愈伤接种于共培培养基，20℃共培养48-72h；将的愈伤接种于筛选培养基，26℃暗培养20-30天。将阳性愈伤挑至二筛选培养基，26℃暗培养7-10天。将阳性愈伤接种至分化培养基，25-27℃光照培养15-20天，待分化出2-5cm的芽后接种至生根培养基，30℃光照培养7-10天。采用CTAB法提取水稻基因组DNA，进行PCR检测。
实施例4转SbIAA25拟南芥的功能分析
(1)目的基因的克隆
分别以HN与JZN为模板，提取植物总RNA，随后利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，分别从双亲中扩增SbTR1，结果如表7和图3所示。
表7父母本cDNA碱基序列
结果显示，双亲中克隆得到的SbTR1片段大小与参考基因组中大小一致，为726bp。SbTR1基因组DNA全长5267bp，含有3个外显子，编码区长726bp，编码241个氨基酸。
将PCR产物切下后进行胶回收，随后连接到载体pBWA(V)HS上，构建过表达SbTR1载体。将空载体pBWA(V)HS、OE-SbTR1-HN(OE-HI)与OE-SbTR1-JZN(OE-JI)转入到野生型拟南芥中(WT)，相同环境条件下进行培养。选取具有代表性的T3代转基因拟南芥株系，统计除主茎外的分枝数，结果如图4-A所示。结果显示，WT、35S、OE-JI与OE-HI的分枝数分别为2.6、2.7、2.3与0.3。利用邓肯测验对其进行统计学分析，结果如图4-B所示。结果显示，BOE-HI的分枝数显著少于其他3个株系，且其他3个株系间无显著差异。
挑选出T3代纯合OE-HI1和OE-HI2株系与WT进行比较，同源分析发现拟南芥AtIAA18与SbTR1的相似性最高。荧光定量PCR检测SbTR1的表达量，发现在两个过表达株系中SbTR1的表达量约为AtIAA18表达量的33倍，说明目的基因能够正常进行转录。结合分枝表型鉴定，发现WT平均分枝数为2.67个，而OE-HI1与OE-HI2的分枝数分别为0.33与0.5个。表明过表达SbTR1转基因株系在同等环境下的分枝数显著低于野生型。
(2)理化性质
如表8所示，将双亲中扩增出的cDNA序列翻译为氨基酸序列后，发现在双亲中SbTR1编码的氨基酸序列相似度99.17％。
表8父母本氨基酸序列
基因的理化性质和结构与其功能密切相关，单个碱基的变化也很大可能导致基因功能发生改变，甚至丧失。通过对比SbTR1在HN和JZN间的结构差异，分析导致其功能发生改变的原因。利用Expasy对SbTR1的理化性质分析可知(表9)：
表9 SbTR1理化性质比较
与SbTR1-HN相比，SbTR1-JZN分子量、等电点、总原子数和亲水性较高。此外，SbTR1-HN为偏酸性蛋白，而SbTR1-JZN为中性蛋白。虽同为不稳定蛋白，但SbTR1-JZN不稳定系数较低。
利用Jpred4对两个蛋白的α-螺旋、β-折叠及无规则卷曲进行二级结构预测，结果(图5)可知：相比于SbTR1-HN，SbTR1-JZN的α-螺旋数减少，无规则卷曲增多，导致蛋白质结构发生变异。
(3)SbTR1的组织特异性分析
为了研究SbTR1基因在高粱各组织中的表达模式，取拔节期高粱的叶、茎基部、根、叶鞘、茎和腋芽的样品，用于荧光定量PCR进行组织特异性分析，结果如图6所示。由图6可知：SbTR1具有明显的组织特异性表达，其在腋芽表达量最高、其次是茎基部、根和叶鞘，在叶和茎中表达量极低，几乎不表达。
(4)亚细胞定位荧光信号观察
我们以HN为模板，对SbTR1去掉终止密码子的CDS序列进行克隆，利用琼脂糖凝胶电泳检测其条带大小，PCR产物胶回收后连接到载体PSuper1300-GFP上，构建融合蛋白35S::SbTR1::GFP并将其转入本式烟草。
利用激光共聚焦显微镜检测其荧光信号，结果(图7)可知：融合蛋白35S::SbTR1::GFP发出的绿色荧光信号，与植物定位细胞核Marker发出的红色荧光信号发生重叠，出现黄色荧光，表明该蛋白定位于细胞核中。
(5)SbTR1转基因植株激素含量测定
在植物生长发育过程中，激素在植物形态构成中起到重要作用，微量的激素变化就可导致植株某种表型发生变化。为了研究SbTR1与激素间的关系，我们利用LC-MS/MS对WT和OE-HI茎基部中的GA3、IAA、ZR与ABA进行测定。具体为：取拟南芥茎基部0.5g新鲜样品，用液氮研磨成粉末，利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)分别测定吲哚乙酸(IAA)、玉米核素(ZR)、赤霉素3(GA3)和脱落酸(ABA)。取HN与JZN的高粱种子置于放有湿润滤纸的培养皿中萌发，5天后将具有相同活力的高粱幼苗移栽于霍格兰营养液中，移栽10天后，对幼苗喷施喷洒不同浓度的IAA溶液(0、50、100、150和200μM/L)，并且在喷施后0、3、6、9、12和15h进行取样，用于测定两亲本中候选基因对生长素的响应能力。取30天龄的拟南芥植株，对其茎基部施加5μl的人工合成独角金内酯溶液GR24。15天后，观察拟南芥植株的表型。每个样本取3个重复。IAA与GR24分别用少量丙酮溶解后，再加ddH2O稀释至相应浓度，结果如图8所示。
由图8-A可知：WT中茎基部GA3含量仅2.39ng/g，而OE-HI中GA3含量极显著低于WT，为1.80ng/g；由图8-B可知：WT中IAA含量(61.63ng/g)极显著高于OE-HI(42.91ng/g)，约为1.43倍；由图8-C可知：WT中ZR含量(3.8ng/g)显著低于OE-HI(4.49ng/g)中的含量；由图8-D可知：WT中ABA含量(63.76ng/g)极显著高于OE-HI(34.41ng/g)，约为1.85倍。
经多次测定WT和OE-HI的根分泌物中SL的水平，结果发现4-deoxyorobanchol(4DO)或20-EPI-5-deoxystrigol(5DS)的水平太低而无法检测到。但由于β-胡萝卜素是SL和ABA生物合成的共同前体，因此推测当ABA合成减少时的同时SL合成应增多。
(6)分蘖相关基因的qRT-PCR分析
分蘖是由复杂的基因调控网络进行控制的，转录组数据表明，野生型与过表达SbTR1植株的差异表达基因最大富集于植物激素信号转导通路中，我们挑选了一些通过激素途径调控植物分枝或分蘖且在转录组数据中存在显著差异的基因进行qRT-PCR检测，结果如图9所示。
由图9-A、9-B、9-C可知，转录组数据中WUSCHEL-related homeobox(WOX)家族多个基因表达量呈显著下调，其中WOX9为差异表达基因多次qRT-PCR结果显示WUS、WOX3和WOX9的表达量在WT与OE-SbTR1中存在显著差异，分别下调2.86、6.71和4.03倍。由图9-D可知，作为维持茎尖分生组织干细胞平衡的重要基因，WOX家族基因表达量下调可能是SbTR1负调控植株分枝或分蘖的原因之一。利用SMART在线软件预测了多个ARF转录因子与SbTR1之间的潜在相互作用，qRT-PCR结果显示，OE-SbTR1中ARF3的表达量显著高于WT。IAA、SbTR1、WUS、AFR基因间的相互作用可能是SbTR1负调控分枝的原因。
结合激素测定结果，我们推测OE-SbTR1分枝数减少的原因还与独角金内酯有关。多次qRT-PCR结果显示OE-SbTR1中独角金内酯合成基因D27表达量上调7.95倍。图9-F显示，拟南芥SMXL6与水稻D53同源，参与独角金内酯信号转导，qRT-PCR结果表明，相较于WT，OE-SbTR1中SMXL6表达量上调7.12倍。图9-G显示，BRC1编码TCP家族的一个转录因子，对植物分枝进行负调控，转录组结果中，OE-SbTR1中BRC1的转录水平上调2.72倍；qRT-PCR结果与转录组趋势一致，OE-SbTR1中BRC1的表达量较WT上调5.17倍。
基于激素测定结果，我们提取整株WT与OE-SbTR1的RNA作为模板，挑选了一些参与激素通路并与植物分枝相关的基因进行qRT-PCR。结果如图10所示。
由图10-A、图10-B可知：参与生长素极性运输的AXR1在OE-SbTR1中表达量下调42.33倍，而IAA合成基因YUCCA1表达上调，说明SbTR1的过表达不抑制IAA合成，而是影响生长素极性运输，导致转基因植株OE-SbTR1茎基部IAA含量下降。由图10-C、图10-D可知：独角金内酯信号转导通路中D14和MAX4在OE-SbTR1中相较于WT显著上调。由图10-E、图10-F可知：ABA合成正向调控基因ABA1和ABA2的转录水平显著下调。此结果与OE-SbTR1中脱落酸含量变化一致。可见，SbTR1的调控还与独角金内酯途径有关。
实施例5转SbTR1水稻的功能分析
为了进一步验证SbTR1在单子叶植物中的功能，我们创建了一个过表达SbTR1载体并将其转移到水稻-日本晴中，然后计算OE-HI转基因水稻植株、NP和35S的分蘖数，结果如图11-A所示。结果表明，OE-HI转基因水稻的分蘖数显著低于NP和35S，NP和35S的分蘖数几乎没有差异。
由于高粱SbTR1和水稻OsIAA25的cDNA序列相似性高达60％，因此以OsIAA25为对照检测SbTR1的相对表达量。然后随机选取3个转基因株系，以OsIAA25为对照基因进行qRTPCR，结果如图11-B、11-C所示。结果显示，三个菌株中SbTR1的表达水平显著高于NP。
总之，转SbTR1水稻的功能分析结果也可显示，SbTR1可以抑制分蘖。
实施例6单倍型分析
为研究SbTR1基因的等位变异是否与高粱分蘖差异有关，利用高粱种质资源数据库中的变异信息，在高粱SbTR1的5267bp基因组区域鉴定出18个高置信度SNP位点(MAF≥0.05)。选取本实验室保存的32份高粱资源进行PCR扩增。利用TASSEL 5.0软件中的通用线性模型(General Linearmodel,GLM)对188个高粱资源进行分析。采用bonferroni校正的显著性阈值(p≤0.0001)识别显著相关性，采用R版本4.1.2计算并绘制连锁不平衡图，结果如表10以及图12所示。
表10 5个SNP变异形成的3个单倍型
由表10和图12-A可知：18个SNP位点中有5个位点与分蘖数呈显著关联(p≤0.0001)，其中1个位点位于基因5’UTR区，另外4个全部位于CDS区。由图12-B中的连锁不平衡结果可知：5个SNP位点形成3种单倍型，分别命名为HAP1、HAP2和HAP3。由表10与图12-C可知：在3个单倍型中，HN16中携带HAP1基因型，JZN中携带HAP2基因型。我们统计了不同单倍型高粱资源的分蘖数，携带HAP2的高粱品种分蘖数显著高于携带HAP1和HAP3的种质。因此，我们推断SbTR1中的5个SNP位点可能是导致分蘖数量变化的原因位点，并且认为sbi20975309和sbi20975313这两个错义突变位点是导致不同单倍型分蘖数差异的主要原因。
在育种过程中，农作物种质资源通常经历由野生型到农家种再到育成品种的过程。通过对三种单倍型不同资源类型的分析，结果如表11和图12-D所示。
表11 3种单倍型种质资源类型统计
由表11和图12-D可知：具有HAP1和HAP3等位基因的高粱比例增加，具有HAP2等位基因的高粱比例减少。这与野生高粱一般具有多分蘖而现代高粱育种通常只保留0-2个分蘖的情况一致。这些结果表明，HAP1等位基因可能在高粱育种改良过程中受到了积极的选择。
综上可知，本发明利用河农16(HN)与冀早糯1号(JZN)构建的F2:3群体，通过构建过表达载体将基因SbTR1转化至拟南芥和水稻中，利用生物信息学、qRT-PCR、转录组测序、转基因、激素测定及单倍型分析等技术研究了解该基因的功能及调控机制，结果表明，基因SbTR1参与多个激素途径，得出基因SbTR1可以负调控植物分枝的结论，为少分蘖高粱品种的培育垫定了基础。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 一种高粱分蘖调控基因SbTR1及其应用
<130> 2022.05.26
<141> 2022-06-08
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 河农16(Sorghum bicolor L. Moench)
<400> 1
atgaagagct cctcttcagc tgcacaaagg ctgaaactga aacaggagca ggcagacgat 60
tgcagcgaga tgcagggaag tcatcgtggc ctgatgagca gccttgagct caggctgggc 120
atctcttcag acaatggcgg cggcagcggc gatccatggc ttggtgttgg agtgcaccca 180
tggagccttg ccggcaggca agcagagaag gtagccctgg agcaagacca ccagcggcct 240
ccacctccgc agccggtggg atggcccccg gtgggtgcgt tccgcaggag ccacctgcag 300
gtgggcgcga aggccgttga ggaaccgacg agcaaggtga agctcggcga gcaggggccg 360
gcgccggctc ggtccaccat gttcgtgaag gtgaacatgg agggctgcgc cgttgggagg 420
aaggtggacc tgcaggcgca ctgtgggtat gcgtcgctgt cgcgcgcgct gcaggccatg 480
ttccatggct tcctgtcaga tggtcagtgg aggatcgctg gcagagaaga agatgacgac 540
gacgacgatg agcagccgga gccgacgaag aagggggaga ataagagcaa caagaaggcg 600
tacatccttc tatacgagga caacgagggc gaccggatgc tcgtcggcga cgtgccgtgg 660
gagctgttca tggcttcggt gaagaggctg tacatcgcac aggacccgag gaagacgaag 720
aactag 726
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> 冀早糯1号(Sorghum bicolor L. Moench)
<400> 2
atgaagagct cctcttcagc tgcacaaagg ctgaaactga aacaggagca ggcagacgat 60
tgcagcaaga tgcagggcag tcatcgtggc ctgatgagca gccttgagct caggctgggc 120
atctcgtcag acaatggcag cggcagcggc gatccatggc ttggtgttgg agtgcaccca 180
tggagccttg ccggcaggca agcagagaag gtagccctgg agcaagacca ccagcggcct 240
ccacctccgc agccggtggg atggcccccg gtgggtgcgt tccgcaggag ccacctgcag 300
gtgggcgcga aggccgttga ggaaccgacg agcaaggtga agctcggcga gcaggggccg 360
gcgccggctc ggtccaccat gttcgtgaag gtgaacatgg agggctgcgc cgttgggagg 420
aaggtggacc tgcaggcgca ctgtgggtat gcgtcgctgt cgcgcgcgct gcaggccatg 480
ttccatggct tcctgtcaga tggtcagtgg aggatcgctg gcagagaaga agatgacgac 540
gacgacgatg agcagccgga gccgacgaag aagggggaga ataagagcaa caagaaggcg 600
tacatccttc tatacgagga caacgagggc gaccggatgc tcgtcggcga cgtgccgtgg 660
gagctgttca tggcttcggt gaagaggctg tacatcgcac aggacccgag gaagacgaag 720
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
aacaccataa agagccacaa gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
tcctgtttca gtttcagcct tt 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
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<210> 9
<211> 22
<212> DNA
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<400> 9
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<212> DNA
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<400> 12
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 55
<212> DNA
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<400> 17
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<211> 55
<212> DNA
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<400> 18
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<210> 19
<211> 241
<212> PRT
<213> 河农16(Sorghum bicolor L. Moench)
<400> 19
Met Lys Ser Ser Ser Ser Ala Ala Gln Arg Leu Lys Leu Lys Gln Glu
1 5 10 15
Gln Ala Asp Asp Cys Ser Glu Met Gln Gly Ser His Arg Gly Leu Met
20 25 30
Ser Ser Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ile Ser Ser Asp Asn Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Asp Pro Trp Leu Gly Val Gly Val His Pro Trp Ser Leu Ala
50 55 60
Gly Arg Gln Ala Glu Lys Val Ala Leu Glu Gln Asp His Gln Arg Pro
65 70 75 80
Pro Pro Pro Gln Pro Val Gly Trp Pro Pro Val Gly Ala Phe Arg Arg
85 90 95
Ser His Leu Gln Val Gly Ala Lys Ala Val Glu Glu Pro Thr Ser Lys
100 105 110
Val Lys Leu Gly Glu Gln Gly Pro Ala Pro Ala Arg Ser Thr Met Phe
115 120 125
Val Lys Val Asn Met Glu Gly Cys Ala Val Gly Arg Lys Val Asp Leu
130 135 140
Gln Ala His Cys Gly Tyr Ala Ser Leu Ser Arg Ala Leu Gln Ala Met
145 150 155 160
Phe His Gly Phe Leu Ser Asp Gly Gln Trp Arg Ile Ala Gly Arg Glu
165 170 175
Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Gln Pro Glu Pro Thr Lys Lys Gly
180 185 190
Glu Asn Lys Ser Asn Lys Lys Ala Tyr Ile Leu Leu Tyr Glu Asp Asn
195 200 205
Glu Gly Asp Arg Met Leu Val Gly Asp Val Pro Trp Glu Leu Phe Met
210 215 220
Ala Ser Val Lys Arg Leu Tyr Ile Ala Gln Asp Pro Arg Lys Thr Lys
225 230 235 240
Asn
<210> 20
<211> 241
<212> PRT
<213> 冀早糯1号(Sorghum bicolor L. Moench)
<400> 20
Met Lys Ser Ser Ser Ser Ala Ala Gln Arg Leu Lys Leu Lys Gln Glu
1 5 10 15
Gln Ala Asp Asp Cys Ser Lys Met Gln Gly Ser His Arg Gly Leu Met
20 25 30
Ser Ser Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ile Ser Ser Asp Asn Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Gly Asp Pro Trp Leu Gly Val Gly Val His Pro Trp Ser Leu Ala
50 55 60
Gly Arg Gln Ala Glu Lys Val Ala Leu Glu Gln Asp His Gln Arg Pro
65 70 75 80
Pro Pro Pro Gln Pro Val Gly Trp Pro Pro Val Gly Ala Phe Arg Arg
85 90 95
Ser His Leu Gln Val Gly Ala Lys Ala Val Glu Glu Pro Thr Ser Lys
100 105 110
Val Lys Leu Gly Glu Gln Gly Pro Ala Pro Ala Arg Ser Thr Met Phe
115 120 125
Val Lys Val Asn Met Glu Gly Cys Ala Val Gly Arg Lys Val Asp Leu
130 135 140
Gln Ala His Cys Gly Tyr Ala Ser Leu Ser Arg Ala Leu Gln Ala Met
145 150 155 160
Phe His Gly Phe Leu Ser Asp Gly Gln Trp Arg Ile Ala Gly Arg Glu
165 170 175
Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Gln Pro Glu Pro Thr Lys Lys Gly
180 185 190
Glu Asn Lys Ser Asn Lys Lys Ala Tyr Ile Leu Leu Tyr Glu Asp Asn
195 200 205
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210 215 220
Ala Ser Val Lys Arg Leu Tyr Ile Ala Gln Asp Pro Arg Lys Thr Lys
225 230 235 240
Asn

Claims (5)

1.一种高粱分蘖调控基因SbTR1在少分蘖高粱育种中的应用，其特征在于，所述高粱分蘖调控基因SbTR1的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种含有权利要求1所述的高粱分蘖调控基因SbTR1的重组表达载体在少分蘖高粱育种中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的高粱分蘖调控基因SbTR1或含有权利要求2所述的重组表达载体的宿主菌在少分蘖高粱育种中的应用，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。
4.一种培育少分蘖高粱品种的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的高粱分蘖调控基因SbTR1转染到高粱株系中进而得到少分蘖高粱品种。
5.一种培育少分蘖高粱品种的方法，其特征在于，所述方法为通过杂交方法使杂交后代获得权利要求1所述的高粱分蘖调控基因SbTR1进而获得少分蘖高粱品种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105985954A (zh) * 2015-01-27 2016-10-05 华中农业大学 水稻miR160b基因在调控分蘖角度中的应用

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PREDICTED: Sorghum bicolor auxin-responsive protein IAA25 (LOC8068536), transcript variant X9, mRNA，XM_021464365.1.NCBI GenBank.2017,第1-2页. *

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