CN114957290A - 一种用于检测hno的epr探针及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测HNO的EPR探针及其制备方法与应用。该探针基于EPR自旋技术高度的特异性，以Trityl自由基为报告基团，Cu(II)络合物为识别基团，构建一种基于Trityl‑Cu(II)结构的新型的用于检测HNO的EPR探针。Trityl‑Cu(II)结构中均因分子内有较强的自旋‑自旋相互作用呈现宽EPR信号；与HNO反应后会导致顺磁性Cu(II)的转变成无顺磁性的Cu(I)，产生具有狭窄EPR信号。本发明利用反应前后EPR信号强度变化(EPR信号从弱到强，EPR信号无重叠，提高检测准确性和灵敏性)以及反应动力学理论实现高效检测HNO。因此在HNO检测方面具有良好的应用前景。

Description

一种用于检测HNO的EPR探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种利用EPR成像技术检测HNO的探针，具体涉及一种用于检测HNO的EPR探针及其制备方法与应用。

背景技术

亚硝酰氢(Nitroxyl，HNO)是一氧化氮(NO)的单电子还原并质子化的衍生物，是生物体内重要的活性氮物种，在生命体的生理和病理过程中起着关键性作用。HNO所具有的生理和病理作用特征与NO迥然不同，主要体现在调节心血管系统、免疫系统和神经系统等方面，包括：与蛋白质上的巯基直接反应从而抑制乙醛脱氢酶的活性；通过激活哺乳动物的血管系统中电压控制的钾离子通道调节心血管功能；增加正常及心力衰竭时心肌的收缩力，同时改善心肌舒张功能，抑制血小板聚集；与细胞内抗氧化清除剂硫醇直接发生反应，进而调控生物体内的氧化/还原态环境；具有抗肿瘤活性和抗炎活性。但是HNO水平过高会加剧缺血再灌注损伤并导致神经毒性。尽管有关HNO生物活性的研究不断被报道，但是内源性HNO产生的具体途径及病理生理功能仍未明确。且生物体内HNO浓度较低，活性较高，能够自发形成二聚体并脱水形成N₂O，其精准检测成为生物医学领域的关键技术难题。

当前普遍使用的荧光检测法虽然具有高灵敏性、高分辨率等优点，但是由于荧光背景信号干扰强和组织不充分的光穿透性等问题同样限制了荧光检测法在活体的使用。相比之下，核磁共振(NMR)和电子顺磁共振(EPR)具有极好的组织穿透性能力，因此在活体成像方面有巨大的应用前景，但是核磁共振(NMR)缺乏特异性，且容易受到其他自旋核的干扰、灵敏性较低等，这些缺点限制了其在活体方面的适用性。

电子顺磁共振(EPR)是专门检测和表征顺磁性物质的独特技术，对自由基检测具有高度的特异性。EPR联合顺磁性探针可定性、定量检测或成像生理参数如pH、分子氧、氧化还原态和活性氧等。EPR具有以下优点：与NMR相比，EPR对探针分子的检测浓度高3个数量级；同时对检测体系无干扰、无创性、高选择性且可重复连续检测等优点，适用于体外及活体监测和成像；最近发展的低场EPR技术已经实现器官以及小动物的活体检测。EPR探针在HNO检测方面的研究逐渐受到国内外学者的广泛关注。

目前，基于EPR探针的活性氮检测技术逐渐成为分析方法中比较热门的领域，但是近些年来尚无该类型探针报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高选择性和高灵敏度的HNO的识别EPR探针。

本发明的第一个方面，提供一种EPR探针，该探针具有如下结构式：

式中黑点表示自由基。

本发明的第二个方面，提供所述EPR探针的制备方法，包括以下步骤：

将所述化合物TD1溶于无水乙醇中，滴入CuCl₂.2H₂O乙醇溶液，室温反应1-1.2h，反应结束后加入正己烷，析出蓝绿色固体，即所述EPR探针；所述化合物TD1与CuCl₂.2H₂O的摩尔比为1∶1，所述化合物TD1具有如下结构式：

进一步的，所述化合物TD1由以下步骤制备而成：

在氩气条件下，将化合物6溶于DCM/TFA体系，室温搅拌反应0.8-1h，吹干溶液，残留固体用饱和NaHCO₃溶液溶解，用反相柱分离，得墨绿色固体，即所述化合物TD1；所述化合物6的结构式如下所示：

更进一步的，所述化合物6由以下步骤制备而成：

按摩尔比为1∶0.2∶2∶10称取化合物5、KI、二甲基吡啶胺、无水K₂CO₃，用无水DMF作溶剂，氮气保护下，100℃反应30-35min，反应结束后，加入DCM，用水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤旋干，经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物，即所述化合物6；所述化合物5的结构式如下所示：

更进一步的，所述化合物5由以下步骤制备而成：

将化合物4和DIPEA溶于DCM中，在冰浴条件下滴加甲磺酰氯，完毕后撤去冰浴，在氩气保护下室温反应10-12h，旋蒸除去溶剂，经正向硅胶柱纯化得淡黄色固体，即所述化合物5；所述化合物4、DIPEA和甲磺酰氯的摩尔比为1∶3∶2；所述化合物4的结构式如下所示：

更进一步的，所述化合物4由以下步骤制备而成：

在无水THF溶液中加入化合物3，得到浑浊液，-20℃条件下，将LiAlH₄滴加到所述浑浊液中，反应4-5h后，加入EA淬灭反应，混合液使用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤旋干，经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物，即所述化合物4；所述化合物3和LiAlH₄的摩尔比为1∶2，所述化合物3的结构式如下所示：

更进一步的，所述化合物3由以下步骤制备而成：

在氩气氛围下，向化合物2中依次加入无水THF和TMEDA，得到混合液，-20℃条件下，将n-BuLi滴加到所述混合液，混合液恢复至室温，搅拌反应3-4h后，将反应液加入到二碳酸二叔丁酯中，室温下搅拌24-26h，反应结束后，冰浴下使用饱和NaH₂PO₄淬灭反应，真空旋干，使用DCM溶解，有机相用水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，粗品经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物，即所述化合物3，所述化合物2、THF、TMEDA、n-BuLi和二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1∶10∶10∶10∶70；所述化合物2的结构式如下所示：

更进一步的，所述化合物2由以下步骤制备而成：

在氩气氛围下，向化合物1加入重蒸的乙醚，室温下溶解澄清后，滴入n-Bu Li，室温下搅拌3-4h，再以0.1-0.12mL/h的速度滴入碳酸二甲酯，室温搅拌24-26h后，将反应液加入到饱和NaH₂PO₄的水溶液中，EA萃取，水相使用DCM萃取，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，真空旋干，得到黄色粗品，石油醚重结晶灰白色粉末状化合物，即所述化合物2；所述化合物1、n-Bu Li和碳酸二甲酯的摩尔比为1∶0.2∶0.33；所述化合物1的结构式如下所示：

本发明的第三个方面，提供所述的EPR探针在检测HNO中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明制备的探针为首个应用于HNO检测的EPR探针，结构得到核磁、质谱的表征证实，在均相体系中可高灵敏、高选择性地实现对HNO的检测。

附图说明

附图说明

图1为实施例1中EPR探针合成的路线模式图；

图2为所述EPR探针对HNO浓度响应变化图(A)以及浓度与EPR强度的线性关系(B)；

图3为所述EPR探针与HNO的时间响应变化图(A)以及时间与EPR强度的线性关系(B)；

图4为所述EPR探针的检测选择性结果；

图5为TD1(1μM)的无氧EPR实验谱图和EPR模拟谱图(PBS buffer(50mM，pH 7.4))；

图6为TD1和Cu^II[TD1]的HPLC谱图(HPLC条件：20mM醋酸铵∶乙腈＝30∶70(v∶v)(pH7.4)，流速：1ml/min T-D，检测波长：254nm)；

图7-8为实施例1中TD1和Cu^II[TD1]的质谱图(条件：甲醇)；

图9-13依次为实施例1中化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的核磁氢谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下涉及化合物1商品名为2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d：4，5-d’]双([1，3]二硫醇)，购买自安耐吉化学。

实施例1：EPR探针(命名为Cu^II[TD1])的合成(合成路线如图1所示)

(1)将化合物1(20g，69.8mmol，1eq)加入到1L的Schlenk反应瓶中，抽真空充氩气，重复三次。加入重蒸的乙醚(600mL)，室温下溶解澄清后，逐滴加入n-Bu Li(2.5M inhexane，33.5mL，83.8mmol，1.2eq)室温下搅拌4h。将碳酸二甲酯(2.0mL，23.3mmol，0.33eq)以0.1mL/h的速度加入上述混合液中。室温搅拌24h后，将反应液加入到饱和NaH₂PO₄的水溶液中，EA萃取，水相使用DCM萃取，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，真空旋干，得到黄色粗品，石油醚重结晶灰白色粉末状化合物2(9.39g，80％)。¹H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.17(s，3H)，6.21(s，1H)，1.82(s，9H)，1.80(s，9H)，1.72(s，9H)，1.68(s，9H)，化合物2的核磁氢谱检测结果如图9所示。

(2)将化合物2(10g，11.29mmol，1eq)加入到500mL的Schlenk反应瓶中，抽真空充氩气，重复三次。依次加入无水THF(250mL)，TMEDA(17.0mL，112.9mmol，10eq)。-20℃下，将n-BuLi(2.5M in hexane，45.2mL，112.9mmol，10eq)逐滴加入到上述混合液。混合液恢复至室温，搅拌反应4h后，将红棕色的反应液逐滴加入到装有二碳酸二叔丁酯(172.6g，790.3mmol，70eq)的1L圆底烧瓶中，随后恢复室温搅拌24h。冰浴下使用饱和NaH₂PO₄溶液淬灭反应，真空旋干，使用DCM溶解，有机相用水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，粗品经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物3(6.6g，50％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ6.73(s，1H)，1.77(s，9H)，1.74(s，9H)，1.66-1.65(m，45H)，化合物3的核磁氢谱检测结果如图10所示。

(3)将化合物3(3g，2.8mmol，1eq)装入到250mL的平底烧瓶中，加入无水THF(100mL)溶液，-20℃条件下将LiAlH₄(1M in THF，5.6mL，5.6mmol，2eq)逐滴加入到上述浑浊液中，反应4h后，加入EA淬灭反应，混合液使用饱和NaCl洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤旋干，经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物4(1.1g，40％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.69(s，1H)，4.72(d，J＝12.5Hz，1H)，4.66(d，J＝12.4Hz，1H)，1.94(s，1H)，1.79(m，15H)，1.75-1.69(m，9H)，1.64(m，30H)，化合物4的核磁氢谱检测结果如图11所示。

(4)在20mL圆底烧瓶中加入化合物4(0.8g，0.72mmol，1eq)，DIPEA(376μL，2.16mmol，3eq)，再加入5mL干燥DCM溶解样品。在冰浴条件下缓慢滴加120μL甲磺酰氯(1.44mmol，2eq)，滴加完毕后撤去冰浴，在氩气保护下室温反应12h。旋蒸除去溶剂，经正向硅胶柱纯化得淡黄色固体5(0.667g，83％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ6.69(s，1H)，4.72-4.55(d，J＝2.4，2H)，1.79(m，16H)，1.73(d，J＝2.7Hz，8H)，1.69-1.59(m，30H)，化合物5的核磁氢谱检测结果如图12所示。

(5)按物质的量比为1∶0.2∶2∶10称取化合物5(0.15g，0.13mmol)、KI(21.58mg，0.13mmol)、二甲基吡啶胺(50μL，0.26mmol)、无水K₂CO₃(179mg，1.3mmol)于10mL圆底烧瓶中，用无水DMF作溶剂，氮气保护下，100℃反应30min。反应结束后，加入DCM，用水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤旋干，经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物6(0.13g，80％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.51(s，2H)，7.65(d，J＝6.7Hz，2H)，7.55(d，J＝7.5Hz，2H)，7.15(d，J＝5.1Hz，2H)，6.66(s，1H)，3.77(m，6H)，1.76(s，18H)，1.64(s，36H)，化合物6的核磁氢谱检测结果如图13所示。

(6)氩气条件下，将化合物6(60mg，0.046mmol)溶于DCM/TFA，室温搅拌反应1h。吹干溶液，残留固体用反相柱分离，得墨绿色固体TD1(20.2mg，0.017mmol，37％)。MS(ESI，[M-H]^-)：1165.0532(observed)，1165.0534(calcd)。HPLC保留时间，16.10min.经过EPR谱图模拟，得到以下参数：a_N＝0.902G，a_H＝2.638G。

(7)在5mL圆底烧瓶中加入化合物TD1(10mg，0.85μmol，1eq)，0.5mL无水乙醇溶解样品，逐滴加入CuCl₂.2H₂O(2.19mg，1.28μmol，1eq)乙醇溶液，室温反应1h。反应结束后加入5mL正己烷，析出蓝绿色固体Cu^II[TD1](9.45mg，0.76μmol，90％)，MS(ESI，[M-H]^-)：1226.9742(observed)，1226.9757(calcd)。HPLC保留时间，10.47min。化合物TD1和Cu^II[TD1]的HPLC以及质谱检测结果如图6-7所示。

实施例2：溶液状态(均相)下对HNO离子的检测

图2为所述EPR探针对HNO浓度响应变化图。将Cu^II[TD1](1μmol)溶解于PBS buffer(50mM，pH 7.4))，分别加入0-30μmol HNO，可以发现0-20μmol之间，HNO浓度与EPR强度呈很好的线性关系，当加入20当量HNO时，EPR信号强度达到最强(EPR信号增强16.1倍)。

图3为所述EPR探针与HNO的时间响应变化图。将Cu^II[TD1](1μmol)与30μmol HNO进行孵育，检测0-6分钟内信号变化情况，从结果可以看出，在5min以内，EPR信号强度就快速达到了最高值，可见所述EPR探针对HNO响应速度很快。

图4为所述EPR探针的检测选择性实验，从结果可以看到，其它活性氮和活性氧对该探针都没有响应，唯独HNO有响应，增强倍数为16.1，体现了探针的专一性。

图5为TD1(1μM)的无氧EPR实验谱图和EPR模拟谱图(PBS buffer(50mM，pH 7.4))，通过对TD1的EPR谱图进行模拟，得到以下参数：a_N＝0.902G，a_H＝2.638G。

综上所述，本发明的探针可以通过EPR方式检测HNO。所述一种EPE探针作为高灵敏、高选择性地实现对HNO的检测。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种EPR探针，其特征在于，该探针具有如下结构式：

式中黑点表示自由基。

2.权利要求1所述的一种EPR探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述化合物TD1溶于无水乙醇中，滴入CuCl₂.2H₂O乙醇溶液，室温反应1-1.2h，反应结束后加入正己烷，析出蓝绿色固体，即所述EPR探针；所述化合物TD1与CuCl₂.2H₂O的摩尔比为1∶1，所述化合物TD1具有如下结构式：

3.根据权利要求2所述的一种EPR探针的制备方法，其特征在于，所述化合物TD1由以下步骤制备而成：

在氩气条件下，将化合物6溶于DCM/TFA体系，室温搅拌反应0.8-1h，吹干溶液，残留固体用饱和NaHCO₃溶液溶解，用反相柱分离，得墨绿色固体，即所述化合物TD1；所述化合物6的结构式如下所示：

4.根据权利要求3所述的一种EPR探针的制备方法，其特征在于，所述化合物6由以下步骤制备而成：

按摩尔比为1∶0.2∶2∶10称取化合物5、KI、二甲基吡啶胺、无水K₂CO₃，用无水DMF作溶剂，氮气保护下，100℃反应30-35min，反应结束后，加入DCM，用水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤旋干，经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物，即所述化合物6；所述化合物5的结构式如下所示：

5.根据权利要求4所述的一种EPR探针的制备方法，其特征在于，所述化合物5由以下步骤制备而成：

将化合物4和DIPEA溶于DCM中，在冰浴条件下滴加甲磺酰氯，完毕后撤去冰浴，在氩气保护下室温反应10-12h，旋蒸除去溶剂，经正向硅胶柱纯化得淡黄色固体，即所述化合物5；所述化合物4、DIPEA和甲磺酰氯的摩尔比为1∶3∶2；所述化合物4的结构式如下所示：

6.根据权利要求5所述的一种EPR探针的制备方法，其特征在于，所述化合物4由以下步骤制备而成：

在无水THF溶液中加入化合物3，得到浑浊液，-20℃条件下，将LiAlH₄滴加到所述浑浊液中，反应4-5h后，加入EA淬灭反应，混合液使用饱和NaCl洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤旋干，经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物，即所述化合物4；所述化合物3和LiAlH₄的摩尔比为1∶2，所述化合物3的结构式如下所示：

7.根据权利要求6所述的一种EPR探针的制备方法，其特征在于，所述化合物3由以下步骤制备而成：

在氩气氛围下，向化合物2中依次加入无水THF和TMEDA，得到混合液，-20℃条件下，将n-BuLi滴加到所述混合液，混合液恢复至室温，搅拌反应3-4h后，将反应液加入到二碳酸二叔丁酯中，室温下搅拌24-26h，反应结束后，冰浴下使用饱和NaH₂PO₄淬灭反应，真空旋干，使用DCM溶解，有机相用水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，粗品经正相硅胶柱分离，得到黄色粉末状化合物，即所述化合物3，所述化合物2、THF、TMEDA、n-BuLi和二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1∶10∶10∶10∶70；所述化合物2的结构式如下所示：

8.根据权利要求7所述的一种EPR探针的制备方法，其特征在于，所述化合物2由以下步骤制备而成：

在氩气氛围下，向化合物1加入重蒸的乙醚，室温下溶解澄清后，滴入n-Bu Li，室温下搅拌3-4h，再以0.1-0.12mL/h的速度滴入碳酸二甲酯，室温搅拌24-26h后，将反应液加入到饱和NaH₂PO₄的水溶液中，EA萃取，水相使用DCM萃取，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，真空旋干，得到黄色粗品，石油醚重结晶灰白色粉末状化合物，即所述化合物2；所述化合物1、n-Bu Li和碳酸二甲酯的摩尔比为1∶0.2∶0.33；所述化合物1的结构式如下所示：

9.权利要求1所述的EPR探针在检测HNO中的应用。

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