CN114948943B - 大萼变型甲素的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大萼变型甲素的新应用，具体是大萼变型甲素在制备诱导铁死亡的制剂中的应用及作为分子胶促进癌蛋白ETS1降解的应用，并通过生物实验得以验证。这些发现开拓了大萼变型甲素的用途领域，为新型预防与治疗肿瘤药物的开发提供了解决方案。

Description

大萼变型甲素的新应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种大萼变型甲素的新应用。
背景技术
乳腺癌已成为全球第一高发癌症，2020年全球肿瘤统计数据显示，全球范围内，每年有新发乳腺癌患者2261419例。中国女性乳腺癌新发病例42万，位居2020年中国女性新发癌症首位，并且我国乳腺癌发病率仍呈上升趋势。手术的创伤、放化疗的不良反应及靶向治疗的经济负担等都成为乳腺癌治疗中亟待解决的难题，而寻找新的治疗策略和药物以延长乳腺癌患者的生存期至关重要。
铁死亡是一种铁依赖，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式，形态上主要表现为线粒体的体积缩小、双层膜密度增加、嵴减少或消失。在生化方面，发生铁死亡的细胞会出现谷胱甘肽耗竭、GPX4活性下降，并且脂质氧化产物不能经GPX4催化的谷胱甘肽还原反应进行代谢，继而Fe2+以与芬顿反应类似的方式氧化脂质并产生大量活性氧，最终促使细胞发生铁死亡。在细胞发生铁死亡的过程中，细胞膜上的多不饱和脂肪酸在酯氧合酶和铁的催化下产生脂质活性氧，而脂质活性氧的清除主要由GPX4完成。当胱氨酸谷氨酸反向转运体被抑制时，阻碍胱氨酸向细胞内导入，使合成谷胱甘肽所必需的半胱氨酸减少，谷胱甘肽合成受阻导致谷胱甘肽依赖性GPX4失活，造成细胞内脂质活性氧堆积，从而引起细胞的氧化性损伤，其中抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白System Xc-及GPX4失活、谷胱甘肽耗竭成为诱导细胞发生铁死亡的关键环节。铁死亡与肿瘤治疗密切相关，因此，全面认识肿瘤铁死亡的调控机制具有重要的治疗意义和广泛的应用前景。
ETS1(E26 transformation specific-1)是一种调控多种癌基因表达的转录因子。研究发现，ETS1在乳腺癌等恶性肿瘤中呈高表达，其可通过增强癌细胞的侵袭性、上皮间质转化以及耐药性等特性促进癌症的发展。蛋白磷酸酶2A的癌性抑制剂CIP2A(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A)是近年新发现的一种人类癌蛋白，研究发现ETS1是调控CIP2A基因转录的关键转录因子，在肿瘤细胞中促进CIP2A的转录表达。因此，通过抑制ETS1-CIP2A信号及其转录机制对于乳腺癌治疗不失为一种新策略。
大萼变型甲素是从唇形科香茶菜属植物中分离出的一种全新的二萜类化合物，在肿瘤中的作用及机制尚未见任何报道。
发明内容
基于此，本发明提供了一种大萼变型甲素的新应用，具体是大萼变型甲素在制备诱导铁死亡的制剂中的应用。
本发明通过如下技术方案实现。
大萼变型甲素在制备诱导铁死亡的制剂中的应用。
在其中一个实施例中，诱导铁死亡的介导通路包括抑制GPX4表达、抑制xCT表达与诱导转铁蛋白表达中的一种或多种。
在其中一个实施例中，诱导铁死亡的介导通路还包括诱导活性氧的产生和/或积累、抑制谷胱甘肽的产生和/或积累、诱导脂质氧化与诱导铁积累中的一种或多种。
在其中一个实施例中，诱导铁死亡为诱导细胞铁死亡，所述细胞包括乳腺癌细胞。
本发明还提供大萼变型甲素在制备抑制ETS1-CIP2A信号通路的制剂中的应用。
在其中一个实施例中，抑制ETS1-CIP2A信号通路包括直接结合ETS1并抑制ETS1蛋白的表达。
在其中一个实施例中，在直接结合ETS1并抑制ETS1蛋白的表达中，大萼变型甲素作为分子胶连接ETS1与E3连接酶SYVN1，从而促进ETS1蛋白降解。
本发明还提供大萼变型甲素在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
在其中一个实施例中，预防和/或治疗肿瘤的机理包括诱导铁死亡与抑制ETS1-CIP2A信号通路中的一种或两种。
在其中一个实施例中，所述预防和/或治疗肿瘤药物包含大萼变型甲素以及药学上可以接受的辅料。
在其中一个实施例中，所述预防和/或治疗肿瘤药物的剂型为片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液或注射剂。
在其中一个实施例中，所述预防和/或治疗肿瘤药物为预防和/或治疗乳腺癌药物。
与现有技术相比较，本发明的大萼变型甲素在制备诱导铁死亡的制剂中的应用具有如下有益效果：
本发明通过研究发现大萼变型甲素对铁死亡具有明显诱导作用，并且该诱导作用通过生物实验得以验证。进一步地，大萼变型甲素可以诱导细胞内活性氧、脂质氧化物以及铁离子的积累，并耗竭细胞内的谷胱甘肽；同时，大萼变型甲素可以抑制xCT与GPX4的表达，从而促进细胞的铁死亡。本发明还发现大萼变型甲素可以抑制ETS1-CIP2A信号通路，可作为ETS1和/或CIP2A的抑制剂。针对上述发现，开拓了大萼变型甲素的用途领域，为新型预防与治疗肿瘤药物的开发提供了解决方案。
附图说明
图1为本发明提供的大萼变型甲素对人源性乳腺癌细胞株MCF-7、人源性乳腺癌细胞株MDA-MB-231与人源性乳腺癌细胞株BT-474细胞中活性氧影响的结果；其中，A是流式细胞仪分析结果；B是活性氧统计结果图；**p<0.01，***p<0.001；
图2是本发明提供的大萼变型甲素对人源性乳腺癌细胞株MCF-7、人源性乳腺癌细胞株MDA-MB-231与人源性乳腺癌细胞株BT-474细胞中谷胱甘肽、脂质过氧化产物MDA和亚铁离子含量的影响结果；**p<0.01，***p<0.001；
图3是本发明提供的大萼变型甲素对人源性乳腺癌细胞株MCF-7、人源性乳腺癌细胞株MDA-MB-231与人源性乳腺癌细胞株BT-474中xCT、GPX4与TF蛋白表达影响的免疫印迹结果；
图4是本发明提供的大萼变型甲素对人源性乳腺癌细胞株MCF-7、人源性乳腺癌细胞株MDA-MB-231与人源性乳腺癌细胞株BT-474增殖影响的结果；
图5是本发明提供的大萼变型甲素对人源性乳腺癌细胞株MCF-7、人源性乳腺癌细胞株MDA-MB-231与人源性乳腺癌细胞株BT-474中ETS1和CIP2A蛋白表达影响的免疫印迹结果；
图6是本发明提供的大萼变型甲素和ETS1蛋白间的相互作用表征图；其中，A是大萼变型甲素与ETS1蛋白的ETS domain二聚体的最优对接构象；B是在最优对接构象图中，大萼变型甲素与ETS1蛋白的ETS domain二聚体结合的关键氨基酸残基；C是检测大萼变型甲素与ETS1蛋白直接结合作用的基于靶点稳定的药物亲和反应实验；D是检测大萼变型甲素与肿瘤细胞的中ETS1蛋白直接结合作用的微尺度热泳动实验；
图7是本发明提供的大萼变型甲素作为分子胶连接ETS1与E3连接酶SYVN1的实验图；其中，A是检测大萼变型甲素与SYVN1蛋白直接结合作用的基于靶点稳定的药物亲和反应实验；B是检测大萼变型甲素与SYVN1蛋白直接结合作用的微尺度热泳动实验；C是检测ETS1与E3连接酶SYVN1蛋白直接结合作用的微尺度热泳动实验；D是大萼变型甲素作为分子胶连接ETS1与E3连接酶SYVN1的分子对接结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了大萼变型甲素在制备诱导铁死亡的制剂中的应用。
大萼变型甲素的分子式为C20H24O6，分子量为360.40，CAS号为85287-60-1，在药学上可以接受盐、酯、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。其结构式如下所示：
在一个具体的示例中，诱导铁死亡的介导通路包括抑制GPX4表达。
抑制GPX4表达为抑制GPX4蛋白表达。更具体地，抑制细胞内GPX4蛋白表达。
具体地，大萼变型甲素在制备GPX4抑制剂中的应用。
在一个具体的示例中，诱导铁死亡的介导通路包括抑制xCT表达。抑制xCT表达为抑制xCT蛋白表达。更具体地，抑制细胞内xCT蛋白表达。
具体地，大萼变型甲素在制备xCT抑制剂中的应用。
在一个具体的示例中，诱导铁死亡的介导通路包括诱导转铁蛋白表达。具体地，诱导细胞内转铁蛋白表达。
具体地，大萼变型甲素在制备转铁蛋白诱导剂中的应用。
在一个具体的示例中，诱导铁死亡的介导通路还包括诱导活性氧的产生和/或积累、抑制谷胱甘肽的产生和/或积累、诱导脂质氧化与诱导铁积累中的一种或多种。
在一个具体的示例中，诱导铁死亡为诱导细胞铁死亡。
更具体地，细胞包括乳腺癌细胞。
优选地，细胞为人源性乳腺癌细胞株MCF-7、人源性乳腺癌细胞株MDA-MB-231与人源性乳腺癌细胞株BT-474中的一种或多种。
优选地，大萼变型甲素的浓度为15nmol/L～50nmol/L。
本发明还提供大萼变型甲素在制备抑制ETS1-CIP2A信号通路的制剂中的应用。
过表达ETS1及CIP2A能够拮抗大萼变型甲素诱导的铁死亡，敲减ETS1及CIP2A能够增强大萼变型甲素诱导的铁死亡。
在一个具体的示例中，抑制ETS1-CIP2A信号通路包括抑制ETS1蛋白的表达。
在一个具体的示例中，抑制ETS1-CIP2A信号通路包括抑制CIP2A蛋白的表达。
在一个具体的示例中，抑制ETS1-CIP2A信号通路包括直接结合ETS1并抑制ETS1蛋白的表达。
更具体地，直接结合ETS1并抑制ETS1蛋白的表达，指的是大萼变型甲素作为分子胶连接ETS1与E3连接酶SYVN1，从而促进ETS1蛋白降解。
更具体地，抑制ETS1-CIP2A信号通路的细胞包括乳腺癌细胞。
优选地，细胞为人源性乳腺癌细胞株MCF-7、人源性乳腺癌细胞株MDA-MB-231与人源性乳腺癌细胞株BT-474中的一种或多种。
优选地，大萼变型甲素的浓度为15nmol/L～50nmol/L。
本发明还提供大萼变型甲素在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
在一个具体的示例中，预防和/或治疗肿瘤药物为预防和/或治疗乳腺癌药物。
在一个具体的示例中，预防和/或治疗肿瘤的机理包括诱导铁死亡与抑制ETS1-CIP2A信号通路中的一种或两种。
在一个具体的示例中，预防和/或治疗肿瘤药物包含大萼变型甲素以及药学上可以接受的辅料。
“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内适于施用患者且与合理益处/风险比相称的那些配体、材料、组合物和/或剂型。
“药学上可接受的辅料”指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。如本文所用，语言“药学上可接受的辅料”包括与药物施用相容的缓冲剂、注射用无菌水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及诸如此类。在与配制物中其他成分兼容且对患者无害的意义上，每种辅料必须为“药学上可接受的”。合适的实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉及经取代或未经取代的β-环糊精；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素及乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂及栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油及大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁及氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；及(21)药物配制物中所采用的其他无毒兼容物质。
本发明的化合物或其药物组合物的剂型和施用方式没有特别限制。
代表性的施用方式包括但并不限于：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)注射、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，具体例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。如悬浮液可包含悬浮剂，具体例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。由活性成分在无菌条件下与药学上可接受的辅料及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合而成。
在一个具体的示例中，预防和/或治疗肿瘤药物的剂型为片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液或注射剂。
以下结合具体实施例对本发明的大萼变型甲素的新应用做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。
大萼变型甲素(Sculponeatin A,STA)：购自上海源叶生物科技有限公司，纯度经高效液相色谱(HPLC)测定大于98％。使用二甲基亚枫(DMSO)配置成10mmol/L的储液，冻于-20℃，每次使用时用培养基稀释至工作浓度。
细胞系：各实施例中所用细胞系均购自ATCC或中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
抗体：购自美国Santa Cruz公司或者Cell Signaling Technology(CST)公司。
三种乳腺癌细胞的STA处理：
(1)将MCF-7细胞在含10％FBS的DMEM培养基中以1.5×105个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，于5％CO2的37℃培养箱中培养。24小时后，以0nmol/L、15nmol/L、20nmol/L、25nmol/L四个浓度梯度的STA处理细胞24小时。
(2)将MDA-MB-231细胞在含10％FBS的DMEM培养基中以1.2×105个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，于5％CO2的37℃培养箱中培养。24小时后，以0nmol/L、20nmol/L、25nmol/L、30nmol/L四个浓度梯度的STA处理细胞24小时。
(3)将BT-474细胞在含10％FBS的DMEM培养基中以1.8×105个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，于5％CO2的37℃培养箱中培养。24小时后，以0nmol/L、30nmol/L、40nmol/L、50nmol/L四个浓度梯度的STA处理细胞24小时。
实施例1
本实施例提供大萼变型甲素(STA)诱导乳腺癌细胞铁死亡的实验，具体如下：
1、荧光探针DCFH-DA(碧云天，上海)检测活性氧变化。
收集上述三种经过不同浓度的STA处理的人源乳腺癌细胞株MCF-7，人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人源乳腺癌细胞株BT-474，在含10μmol/L DCFH-DA的无血清培养基中，在37℃、5％CO2培养箱中孵育20min，PBS清洗两遍后在流式细胞仪上检测并分析，结果如图1所示：在STA的刺激下，MCF-7、MDA-MB-231、BT-474细胞内活性氧含量随着STA浓度的增加而增加。
2、用谷胱甘肽检测试剂盒(碧云天，上海)检测谷胱甘肽(GSH)的变化。
收集上述三种经过不同浓度的STA处理的人源乳腺癌细胞株MCF-7，人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人源乳腺癌细胞株BT-474，RIPA裂解液裂解细胞，按照谷胱甘肽检测试剂盒的步骤检测谷胱甘肽含量，酶标仪分析荧光强度。结果如图2A所示：在STA的刺激下，MCF-7、MDA-MB-231、BT-474细胞内谷胱甘肽含量随着STA浓度的增加而降低。
3、脂质氧化检测试剂盒(碧云天，上海)检测脂质氧化产物丙二醛(MDA)的变化。
收集上述三种经过不同浓度的STA处理的人源乳腺癌细胞株MCF-7，人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人源乳腺癌细胞株BT-474，RIPA裂解液裂解细胞，按照脂质氧化检测试剂盒的步骤检测MDA含量，酶标仪分析荧光强度。结果如图2B所示：在STA的刺激下，MCF-7、MDA-MB-231、BT-474细胞内MDA含量随着STA浓度的增加而增加。
4、Iron Assay Kits试剂盒(abcam，美国)检测细胞内亚铁离子(Fe2+)变化
收集上述三种经过不同浓度的STA处理的人源乳腺癌细胞株MCF-7，人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人源乳腺癌细胞株BT-474，每管加入100μL iron assay buffer，在液氮和37℃温水中反复冻融裂解细胞，按照Iron Assay Kits试剂盒的步骤检测Fe2+含量，酶标仪分析荧光强度。结果如图2C所示：在STA的刺激下，MCF-7、MDA-MB-231、BT-474细胞内Fe2+含量随着STA浓度的增加而增加。
5、Western blot检测铁死亡相关蛋白xCT、GPX4、TF的表达
用RIPA裂解液裂解三种经过不同浓度的STA处理的人源乳腺癌细胞株MCF-7，人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人源乳腺癌细胞株BT-474，蛋白溶液使用蛋白质印迹法(Western blot)上样。根据检测蛋白的分子量大小配制10-13％聚丙烯酰胺凝胶，加样后电泳，根据分子量分离后的蛋白质转移至PVDF膜上。转膜后用5％的脱脂奶粉封闭PVDF膜1小时，4℃过夜。孵育相应的一抗xCT(CST,12691)、GPX4(CST,52455)、TF(abcam,ab82411)、GAPDH(Santa Cruz,365062)，第二天用洗膜缓冲液TBST(1:5000)每5分钟洗膜1次，共5次，TBST稀释相对应的二抗，室温孵育1.5小时，TBST每5分钟洗膜1次，共5次。室温孵育PVDF膜2分钟，ECL试剂盒暗室检测曝光，检测细胞中xCT、GPX4、TF蛋白的表达量的变化。结果如图3所示，xCT、GPX4的表达量随STA作用浓度的增高而降低，TF的表达量随着STA作用浓度的增高而有升高趋势。
实施例2
本实施例提供一种大萼变型甲素抑制抑制乳腺癌细胞生长的实验，具体如下：
分别将处于对数生长期的人源乳腺癌细胞株MCF-7，人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人源乳腺癌细胞株BT-474接种于96孔板(每孔接种约5000个细胞，90μL培养基)，培养(37℃，5％CO2培养箱)24小时后用不同浓度梯度(0-150nmol/L)的STA处理3种细胞。分别培养20小时和44小时后每孔加入10μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，继续培养4小时。终止反应后，吸掉培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡充分溶解，然后用酶标仪测定490nm处的吸光值(OD490)，计算生存率。
实验结果参图4，结果表明，不同浓度的本发明的STA对人源乳腺癌细胞株MCF-7，人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人源乳腺癌细胞株BT-474具有不同程度的抑制。
实施例3
本实施例提供一种大萼变型甲素抑制ETS1-CIP2A信号通路的实验，具体如下：
1、细胞处理和检测同实施例1，如图5所示，Western blot结果显示，ETS1、CIP2A的蛋白水平随着STA作用浓度的增高而有降低趋势，说明STA能够抑制ETS1-CIP2A信号通路上蛋白的水平。
2、通过计算机模拟筛选，分子对接结果如图6A-B所示。
3、通过基于靶点稳定的药物亲和反应实验检测大萼变型甲素与肿瘤细胞中靶蛋白ETS1的相互结合作用
将三种乳腺癌细胞分别加入适量的裂解液裂解，离心后取上清。每组取250μg蛋白进行反应。大萼变型甲素按照细胞IC50的5-10倍加入，并设置对照DMSO组，摇床上37℃孵育30min。按照1:300浓度比值加入适当浓度的蛋白酶。混匀样品后，摇床上37℃孵育30min。用等体积2×SDS上样缓冲液终止反应。99℃裂解10min,Western blot检测靶蛋白ETS1变化。结果如图6C所示。
4、通过微尺度热泳动实验检测大萼变型甲素与ETS1蛋白的相互作用
靶点分子(ETS1)克隆到含有His标签的载体中。经测序验证后，将重组质粒转化到大肠杆菌菌株中，表达纯化。将重组蛋白进行荧光标记后，梯度稀释，互作仪检测解离常数(Kd)和信噪比(S/N)，明确先导药物与靶点的直接相互作用。结果如图6D所示。
5、通过基于靶点稳定的药物亲和反应实验检测大萼变型甲素与E3泛素连接酶SYVN1的相互结合作用
具体实施步骤同3，结果如图7A所示。
6、通过微尺度热泳动实验检测大萼变型甲素与E3泛素连接酶SYVN1的相互作用
具体实施步骤同4，结果如图7B所示。
7、通过微尺度热泳动实验检测肿瘤细胞中靶蛋白ETS1与E3泛素连接酶SYVN1的相互作用
具体实施步骤同4，结果如图7C所示。
8、通过分子对接模拟大萼变型甲素与ETS1、SYVN1三分子结合，分子对接结果如图7D所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (4)

1.大萼变型甲素在制备抑制人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的机理包括诱导铁死亡与抑制ETS1-CIP2A信号通路中的一种或两种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液或注射剂。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物包含大萼变型甲素以及药学上可以接受的辅料。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Hua-Yi Jiang 等.Enmein-type 6,7-seco-ent-Kauranoids from Isodon sculponeatus.《J. Nat. Prod.》.2013,第76卷第2113−2119页. *

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