CN114945379A - 用于微生物群系调节的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于调节哺乳动物受试者(例如，人受试者)的微生物群系的技术。本公开尤其提供了治疗性组合物以及其使用方法，其中所述治疗组合物包含工程化的治疗性细菌群体，所述治疗性细菌(i)是非致病性的并且在待施用的受试者中共生；和(ii)对一种或多种靶噬菌体具有抗性。在一些实施方案中，此类治疗性组合物能够用于治疗患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患(例如，炎症性肠病)的受试者。

Description

用于微生物群系调节的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月18日提交的美国临时专利申请号62/902,327优先权和权益，所述临时专利申请的内容特此以引用的方式整体并入本文。

背景技术

近期研究证明，哺乳动物胃肠道含有多种有益的共生细菌菌种。人类微生物群系中共生细菌的丰度和多样性减少一直与多种疾病有关，包括炎症性肠病、代谢病症、过敏、哮喘和自闭症谱系障碍。动物研究证实了这一点，进一步表明将疾病相关微生物群转移至健康小鼠可诱发疾病表型。Garrett，W.S.等人Cell 131，33–45(2007)；Ellekilde，M.等人Sci Rep 4，5922(2014)；Sharon，G.等人Cell 177，1600–1618.e17(2019)。近几十年来，大量的努力和资源一直致力于开发细菌疗法，以治疗与肠道微生物群系的生态失调相关的疾病。这些疗法通常旨在补充被发现在疾病状态下减少的有益细菌群体。然而，大多数益生菌在治疗慢性疾患方面的益处有限，并且系统评价报告了益生菌对粪便微生物群组成没有影响。Kristensen，N.B.等人Genome Med 8，52(2016)。

发明内容

尽管迄今为止的大部分焦点都集中在微生物群系的细菌组分上，但噬菌体、感染细菌的病毒构成了微生物群系中至少一半的生物体。虽然现有研究可能表明在某些疾病状态下存在病毒群体的增加，但疾病相关病毒的细菌靶标是未知的，并且存在于例如人肠道中的噬菌体对例如人肠道中的有益细菌的影响尚未得到表征。此外，有人提出人肠道中的噬菌体与细菌之间普遍缺乏捕食性相互作用。Reyes，A.等人Nature 466，334–338(2010)；Chehoud，C.等人MBio 7，e00322(2016)。

本公开尤其提供了与本领域已知观点相反的见解，在某些人体部位中的噬菌体与细菌之间存在捕食性相互作用。这种见解部分地基于目前的发现，即存在于人肠道中的噬菌体能够消耗健康有益、细菌的群体。特别地，本发明人发现，添加含有从个体(例如，患有微生物群系功能障碍相关疾病，例如在一些实施方案中炎症性肠病(IBD)的患者)的粪便样品中富集的噬菌体的病毒级分消耗了也从同一个体的样品中富集的有益细菌菌种。

除其它事项之外，本公开还提供了一种见解，即感染梭状芽孢杆菌细菌的噬菌体在患有IBD(一种微生物群系相关疾病)的患者中显著更丰富。尚未在疾病背景下研究噬菌体与有益细菌之间的捕食性相互作用。患有IBD的患者中存在攻击有益细菌的噬菌体的发现提供了一种见解，即此类噬菌体的丰度或存在可能有助于或驱动患有微生物群系功能障碍相关疾病(例如IBD)的患者中有益细菌(例如梭状芽孢杆菌细菌)群体的减少。因此，本公开进一步提供了一种见解，即施用有益细菌不一定对治疗微生物群系功能障碍相关疾病有效，因为患有微生物群系功能障碍相关疾病的患者中噬菌体的存在能够消耗此类施用的细菌。

本文提出的技术解决了与某些基于施用有益细菌的微生物群系功能障碍相关疾病的常规治疗方法相关的一个或多个问题的根源。例如，本发明尤其提供由抗噬菌体的非致病性共生细菌组成或包含抗噬菌体的非致病性共生细菌的治疗性组合物，以及与其相关的各种方法和/或材料，包括例如施用此类组合物例如以治疗与微生物群系功能障碍有关的疾病或病症的方法。

在一些方面中，提供了包括以下步骤的方法：使患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者暴露于治疗性细菌群体，所述治疗性细菌(i)是非致病性的并且在所述受试者中共生和(ii)对一种或多种噬菌体具有抗性。

在一些实施方案中，暴露于有需要的受试者(例如，患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者)的治疗性细菌各自包含靶向一种或多种噬菌体的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)间隔区。在一些实施方案中，暴露于有需要的受试者(例如，患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者)的治疗性细菌各自包含细菌细胞表面上的噬菌体受体的至少一种或多种突变体。

在一些实施方案中，将此类治疗性细菌群体暴露于患有或易患肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者。示例性肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患包括但不限于炎症性肠病(IBD)或肠易激综合征、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、免疫疗法相关结肠炎。在一些此类实施方案中，暴露于患有或易患肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者的治疗性细菌对一种或多种噬菌体具有抗性，所述噬菌体可以是或包括有尾噬菌体目。

在一些实施方案中，使有需要的受试者暴露于治疗性细菌群体(例如，如本文所述的治疗性细菌群体)的步骤包括向这样的受试者施用包含治疗性细菌群体(例如，如本文所述的治疗性细菌群体)的组合物。

在一些实施方案中，使有需要的受试者暴露于治疗性细菌群体(例如，如本文所述的治疗性细菌群体)的步骤包括向这样的受试者施用包含用于改变所述受试者中的宿主共生细菌的基因组的核酸序列的组合物，以使所述宿主共生细菌被遗传工程化为对目标噬菌体具有抗性。这种组合物被递送至有需要的受试者中的宿主共生细菌以产生本文所述的治疗性细菌。用于递送包含核酸序列的组合物的方法是本领域已知的；本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，这样的核酸序列可通过重组噬菌体递送，而在一些实施方案中，这样的核酸序列可通过载体递送。在一些实施方案中，用于改变宿主共生细菌的基因组的核酸序列包含靶向一种或多种靶噬菌体的一个或多个CRISPR间隔区。

在涉及本文描述的治疗性细菌的一些实施方案中，此类治疗性细菌对其有抗性的噬菌体与微生物群系功能障碍相关疾病相关。在一些实施方案中，此类治疗性细菌对其有抗性的噬菌体是温和或非裂解性噬菌体。

在涉及本文所述的治疗性细菌的一些实施方案中，此类治疗性细菌群体包含选自由以下组成的组的至少一种或多种(包括，例如，至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种)分离的、纯化的或培养的共生细菌：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、粪球菌属、梭菌属、柯林斯菌属、脱硫单胞菌属、多尔氏菌属、埃希氏菌属、真杆菌属、梭杆菌属、吉米菌属、乳杆菌属、乳球菌属、念珠菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、瘤胃球菌属以及它们的组合。在一些实施方案中，治疗性细菌群体包含拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属或它们的组合。在一些实施方案中，此类细菌可以是自体的。在一些实施方案中，此类细菌可以是同种异体的。

本文所述的另一方面涉及治疗性组合物，所述治疗性组合物包含工程化的治疗性细菌群体，所述治疗性细菌(i)是非致病性的并且在待施用的受试者中共生和(ii)对一种或多种噬菌体具有抗性。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性组合物中包含的治疗性细菌各自包含靶向一种或多种靶噬菌体的一个或多个CRISPR间隔区。

在一些此类实施方案中，本文所述的治疗性组合物中包含的治疗性细菌各自被遗传工程化为表达靶向一种或多种靶噬菌体的一个或多个CRISPR间隔区。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性组合物中包含的治疗性细菌各自包含细菌细胞表面上的噬菌体受体的至少一种或多种突变体。在一些此类实施方案中，本文所述的治疗性组合物中包含的治疗性细菌各自被遗传工程化为表达细菌细胞表面上的噬菌体受体的至少一种或多种突变体。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性组合物中包含的治疗性细菌包含选自由以下组成的组的至少一种或多种(包括，例如，至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种)分离的、纯化的或培养的细菌：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、粪球菌属、梭菌属、柯林斯菌属、脱硫单胞菌属、多尔氏菌属、埃希氏菌属、真杆菌属、梭杆菌属、吉米菌属、乳杆菌属、乳球菌属、念珠菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、瘤胃球菌属以及它们的组合。在一些实施方案中，本文所述的治疗性组合物中包含的治疗性细菌包括拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属或它们的组合。在一些实施方案中，此类细菌可以是自体的。在一些实施方案中，此类细菌可以是同种异体的。

本文提供的技术可用于治疗和/或预防微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患。因此，本文提供的技术适用于患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者。在一些实施方案中，本文提供的技术适用于患有或易患肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者。示例性肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患包括但不限于炎症性肠病(IBD)或肠易激综合征、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、免疫疗法相关结肠炎。在一些实施方案中，施用了本文所述的治疗性细菌的受试者可先前施用益生菌疗法、粪便微生物群移植(FMT)和/或免疫疗法(例如，结肠炎相关免疫疗法)。

本公开所涵盖的这些和其他方面在下文和权利要求书中更详细地描述。

附图说明

图1A-1B是示出用于鉴定噬菌体和细菌宿主的示例性体外测定的示意图。图1A示出从患有炎症性肠病(IBD)的患者或健康患者分离细菌以制备细菌培养物。图1B示出在丝裂霉素C(一种诱导温和噬菌体的剂)存在下，将来自相同患者的分离病毒样颗粒(VLP)添加至细菌培养物中。作为阳性对照，将大肠杆菌和T7噬菌体添加至培养物亚群中。使培养物在厌氧条件下生长72小时。然后分离培养物的细菌级分和病毒级分以进行16s测序。

图2A-2C是示出人肠道中的噬菌体与细菌之间的捕食性相互作用的图。图2A示出从16s测序确定的细菌群体的丰度。VLP11-15是指包含细菌组合物但不添加噬菌体的一组样品。VLP21-25是指包含培养物的细菌组合物且添加了噬菌体的一组样品。添加噬菌体导致闪烁梭菌和长双歧杆菌菌种减少。VLP31-35是指包含不含噬菌体的细菌组合物且添加了丝裂霉素C的一组样品。VLP41-45是指包含具有噬菌体的细菌组合物且添加了丝裂霉素C的一组样品。添加丝裂霉素C导致细菌群落发生显著改变，从而表明诱导攻击这些细菌的原噬菌体。VLP51-55是指包含掺入了大肠杆菌的细菌群落的一组样品。VLP61-65是指包含掺入了大肠杆菌和T7噬菌体的细菌群落的一组样品。在T7噬菌体存在下，大肠杆菌被消除，从而表明所述测定是有效的。图2B-2C示出肠道中存在消耗“有益”肠道细菌的噬菌体：闪烁梭菌(图2B)和长双歧杆菌(图2C)

图3是示出用于鉴定噬菌体和细菌宿主的示例性计算方法的示意图。病毒序列与来自已知细菌宿主的CRISPR间隔区匹配，以鉴定推定细菌宿主。

图4是示出感染梭状芽孢杆菌细菌的噬菌体群体在患有炎症性肠病(IBD)的患者中更丰富的图。针对存在于一系列肠道细菌中的CRISPR间隔序列的精选集合，对患有IBD的个体中存在的噬菌体序列进行了查询。

图5A-5C是示出感染各种梭状芽孢杆菌细菌菌株菌种的噬菌体群体存在于患有炎症性肠病(IBD)的患者的肠道中的图。针对存在于一系列肠道细菌中的CRISPR间隔序列的精选集合，对患有IBD的个体中存在的噬菌体序列进行了查询。

某些定义

施用：如本文所用，术语“施用(administering)”或“施用(administration)”通常是指将组合物施用于受试者以实现将剂递送至受试者。在一些实施方案中，所述剂是组合物或包含于组合物中。本领域普通技术人员将了解在适当的情况下可用于施用于受试者(例如人)的多种途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是眼部、口服、胃肠外、局部等。在本公开所提供的许多实施方案中，施用是口服施用。在一些实施方案中，施用可仅涉及单次剂量。在一些实施方案中，施用可涉及应用固定数量的剂量。在一些实施方案中，施用可涉及间歇性(例如，在时间上分开的多个剂量)和/或周期性(例如，由相同的时间段分开的个人剂量)给药的给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)至少选定的时间段。细胞的施用可通过任何适当的途径进行，所述途径使得递送至受试者中的所需位置，其中所递送的细胞或所述细胞的组分的至少一部分保持存活。

相关：如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个事件或实体的存在、水平和/或形式关联，则两个事件或实体彼此“相关”，如本文所用的术语。例如，如果特定实体(例如，噬菌体)或特定事件(例如，微生物群系功能障碍)的存在、水平和/或活性与疾病、病症或疾患的发生率或易感性关联，则认为所述特定实体或特定事件与所述疾病、病症或疾患相关。

噬菌体(Bacteriophage)：如本文所用，与术语“噬菌体(phage)”同义的术语“噬菌体(bacteriophage)”具有本领域所理解的常规含义，即感染或选择性地感染原核生物如细菌并在原核生物内复制的病毒。噬菌体包括野生型、天然存在的、分离的或重组的噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体对细菌的特定属或种或菌株具有特异性。

抗噬菌体的细菌：如本文所用，术语“抗噬菌体的”是指对一种或多种噬菌体部分或完全抗性的细菌菌株。部分抗性的细菌菌株是并不总是防御或抑制噬菌体感染的细菌菌株。例如，部分抗性的细菌菌株是防御或抑制至少60％或更多(包括例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多)噬菌体感染发生率的细菌菌株。完全抗性的细菌菌株是防御或抑制所有噬菌体感染发生率的细菌菌株。

特征序列元件：如本文所用，短语“特征序列元件”是指存在于噬菌体中的基因序列元件，其代表所述噬菌体的将被CRISPR间隔区靶向的特征部分并且区别于宿主序列(例如，在对噬菌体敏感的细菌细胞中发现的序列，和/或在暴露于本文所述的治疗性细菌的受试者中发现的序列)。在一些实施方案中，特征序列元件的存在与噬菌体的存在、特定活性的水平或性质关联。在一些实施方案中，特征序列元件的存在(或不存在)将特定噬菌体菌株定义为此类噬菌体的特定家族或组的成员(或非成员)。特征序列元件通常包含至少两个单体(例如，核苷酸)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个单体(例如，连续连接的单体)。在一些实施方案中，特征序列元件是指噬菌体的原型间隔区的序列(例如，CRISPR间隔区所特异性地靶向的噬菌体中的序列)。

组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指其中受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方案中，两种或更多种方案可同时施用；在一些实施方案中，此类方案可依序施用(例如，第一方案的所有“剂量”在第二方案的任何剂量施用之前施用)；在一些实施方案中，此类剂以重叠的给药方案施用。在一些实施方案中，组合疗法的“施用”可涉及向受试者施用一种或多种剂或剂型，所述受试者正接受组合中的另一种或多种剂或方式。为清楚起见，组合疗法不要求单独的剂在单一组合物中一起施用(或甚至必须同时施用)，但在一些实施方案中，两种或更多种剂或其活性部分可在组合组合物中一起施用。

可比较的：如本文所用，术语“可比较的”是指两个或更多个剂、实体、情形、条件组等，它们可能彼此不相同但足够相似以允许它们之间进行比较，使得本领域技术人员将理解，可基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方案中，可比较的条件组、环境、个体或群体的特征在于多个基本上相同的特征和一个或少量的不同特征。本领域的普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定情况下，对于两种或更多种此类剂、实体、情况、条件组等需要怎样的一致性程度才被认为是可比较的。例如，本领域普通技术人员将理解，当以足够数量和类型的基本相同的特征为特征时，环境、个体或群体组彼此可比，以保证合理结论，即在不同的环境、个体或群体组的情况下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些变化的特征的变化引起或指示的。

共生：如本文所用，术语“共生”是指对宿主受试者非致病性并且是宿主受试者的正常微生物群落的一部分的微生物。术语“共生细菌”是指从哺乳动物受试者的微生物群系获得、并且适于或配置用于哺乳动物受试者的微生物群系的细菌细胞或细菌细胞群体。共生细菌适于定殖或配置用于定殖哺乳动物受试者，例如，在身体排泄物(例如唾液、粘液、尿液或粪便)、表面(例如粘膜胃肠道、口/咽/鼻孔、泌尿生殖道、皮肤、肛门/直肠、脸颊/口或眼睛)中，并且不适于或配置用于实验室环境中的培养。

互补：如本文所用，术语“互补”用于指通过碱基配对规则相关的寡核苷酸杂交。例如，序列“C-A-G-T”与序列“G-T-C-A”互补。互补性可为部分的或全部的。因此，只要部分互补性允许寡核苷酸杂交，任何程度的部分互补性都旨在包括在术语“互补性”的范围内。部分互补性是其中根据碱基配对规则，一个或多个核酸碱基不匹配。核酸之间的全部或完全互补性是其中每个核酸碱基在碱基配对规则下与另一个碱基匹配。

CRISPR间隔区：如本文所用，“CRISPR”间隔区代表“成簇规律间隔的短回文重复序列”间隔区，并且是指存在于CRISPR阵列的多个(例如，两个或更多个)短的正向重复序列(即，CRISPR重复序列)之间的核苷酸序列，其中这样的核苷酸序列对应于(例如，互补于)侵入噬菌体的特征序列元件。在一些实施方案中，CRISPR间隔区位于两个相同的CRISPR重复序列之间。在一些实施方案中，通过对位于两个CRISPR重复序列之间的DNA链段的序列分析来鉴定CRISPR间隔区。

剂型：本领域技术人员将理解，术语“剂型”可用于指用于施用至受试者的剂(例如，包含治疗性细菌群体的治疗剂，例如如本文所述的治疗剂)的物理离散单元。通常，每个这样的单元含有预定量的剂。在一些实施方案中，这种量是适合根据给药方案施用的单位剂量的量(或其整个部分)，所述单位剂量的量已被确定为与当施用至相关群体时的所需或有益结果(即，与治疗剂量方案)相关。本领域普通技术人员了解，向特定受试者施用的治疗性组合物或剂的总量由一名或多名主治医师确定并且可能涉及多种剂型的施用。

给药方案：本领域技术人员将理解，术语“给药方案”可用于指通常相隔时间段来单独施用于受试者的一组单位剂量(通常多于一个)。在一些实施方案中，给定的剂具有推荐的给药方案，其可涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，每个剂量在时间上与其它剂量分开。在一些实施方案中，单独剂量彼此间隔相同长度的时间段；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，并且单独剂量间隔至少两个不同的时间段。在一些实施方案中，给药方案内的所有剂量都具有相同单位给药量。在一些实施方案中，给药方案内的不同给药具有不同的量。在一些实施方案中，给药方案包括以第一给药量施用的第一剂量，继之以一个或多个以不同于所述第一给药量的第二给药量施用的其他剂量。在一些实施方案中，给药方案包括第一给药量的第一剂量，之后是一个或多个与所述第一给药量相同的第二给药量的其他剂量。在一些实施方案中，当跨相关群体施用时，给药方案与所需或有益的结果相关。

有效量：“有效量”是足以引起所需生物反应的量，例如治疗受试者可能遭受的病症。如本领域普通技术人员将理解的，组合物或包含在组合物中的剂(例如，如本文所述的治疗性细菌群体)的有效量可根据诸如以下的因素而变化：所需的生物终点、组合物中剂的物理、化学和/或生物特征(例如，药代动力学和/或细胞活力)、所治疗的疾患、以及受试者的年龄和健康状况。有效量包括治疗性和预防性治疗。例如，在治疗微生物群系功能障碍相关疾病或病症(例如，生态失调)时，有效量可预防或减轻与微生物群系功能障碍相关疾病或病症(例如，生态失调)相关的至少一种症状。在一些实施方案中，有效量可在待治疗的受试者的微生物群系中重建微生物群的健康平衡。在一些实施方案中，有效量可减轻或抑制待治疗受试者的微生物群系中的炎症。在一些实施方案中，有效量可减少或破坏噬菌体对非致病性共生细菌的感染。本领域技术人员将理解有效量不必包含在单一剂型中。相反，有效量的施用可涉及可能随时间(例如，根据给药方案)施用多个剂量。

工程化：一般而言，术语“工程化”是指已经被人手工操纵的方面。例如，在一些实施方案中，如果细胞或微生物(例如细菌)群体已被操纵以形成合乎需要的细胞或微生物(例如，如本文所述的治疗性细菌)的富集或纯化群体，则认为所述细胞或微生物群体是“工程化的”。在一些实施方案中，如果细胞或微生物(例如细菌)群体中的细胞或微生物(例如细菌)的遗传信息被改变(例如，先前不存在的新遗传物质已经例如通过转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其他机制引入，或先前存在的遗传物质被改变或除去，例如通过取代或缺失突变，或通过交配方案)，则所述细胞或微生物群体被认为是“工程化”的。按照惯例并且被本领域技术人员理解，工程化群体中细胞的后代通常仍被称为“工程化的”，即使实际操纵是在先前实体上进行的。

富集的：如本文所用，术语“富集的”是指组合物的一种或多种组分的比例增加。例如，本文所述的治疗性组合物富含治疗性细菌，所述治疗性细菌是非致病性的并且在待施用的受试者中共生并且对一种或多种靶噬菌体具有抗性。在一些此类实施方案中，本文所述的治疗性组合物含有比参考组合物(例如，粪便样品组合物)更高比例的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)，例如高至少10％，包括例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。在一些实施方案中，本文所述的治疗性组合物含有相对于这种治疗性组合物中存在的所有微生物至少70％或更多，包括例如至少80％、至少90％、至少95％或高达100％的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)。

宿主：术语“宿主”在本文用于指将暴露于治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)群体或治疗性组合物(例如，本文所述的治疗性组合物)的受试者。在一些实施方案中，宿主是患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者。在一些实施方案中，宿主是患有或易患与疾病、病症或疾患相关的特定噬菌体感染的受试者。在一些实施方案中，宿主是其中某些内源性非致病性共生细菌被工程化为变得对一种或多种噬菌体具有抗性的受试者。

增加、诱导或减少：如本文所用，这些术语或语法上可比较的比较术语表示相对于可比较的参考测量的值。例如，在一些实施方案中，用治疗性细菌实现的评估值或性质可相对于用可比较的参考细菌(例如，对一种或多种靶噬菌体不具有抗性的细菌)获得的评估值或性质有所“增加”。替代地或另外，在一些实施方案中，在受试者中实现的评估值或性质可相对于在不同条件下(例如，在事件之前或之后；或事件的存在或不存在，诸如施用本文所述的治疗性细菌群体和/或治疗性组合物)在同一受试者中，或在不同的、可比较的受试者中(例如在先前暴露于一种状况中与目标受试者不同的可比较的受试者中，所述状况例如不施用本文所述的治疗性细菌群体和/或治疗性组合物等)获得的评估值或性质有所“增加”。在一些实施方案中，比较术语是指统计上相关的差异(例如，其流行率和/或量级足以达到统计上的相关性)。在给定的上下文中，本领域技术人员将意识到或将能够容易地确定对于实现这种统计显著性所需或足够的差异的程度和/或流行率。

抑制：在微生物群系功能障碍相关疾病或噬菌体感染的风险和/或发生率的背景下，术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibition)”不仅限于完全抑制。因此，在一些实施方案中，部分抑制或相对减少包括在术语“抑制”的范围内。在一些实施方案中，所述术语是指将微生物群系功能障碍相关疾病或噬菌体感染的风险或发生率降低至可再现和/或统计学显著低于初始或其他适当参考水平的水平，所述参考水平可以例如是在不存在施用本文所述的组合物情况下或在施用本文所述的组合物之前，微生物群系功能障碍相关疾病或噬菌体感染的风险或发生率的基线水平。在一些实施方案中，所述术语是指将微生物群系功能障碍相关疾病或噬菌体感染的风险或发生率降低至初始水平的小于75％、小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％或小于0.0001％的水平，所述初始水平可以例如是在不存在施用本文所述的组合物情况下或在施用本文所述的组合物之前，微生物群系功能障碍相关疾病或噬菌体感染的风险或发生率的基线水平。

分离的或纯化的：如本文所用，术语“分离的”或“纯化的”是指物质和/或实体已(1)与它在最初产生时(无论在天然界中和/或在实验环境中)与其缔合的至少一些组分分离，和/或(2)手动设计、产生、制备和/或制造。在一些实施方案中，可富集分离的物质或实体；在一些实施方案中，分离的物质或实体可以是纯的。在一些实施方案中，分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或多于约99％的它们最初与其缔合的其它组分分离。在一些实施方案中，分离的剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或高于约99％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其它组分，则所述物质为“纯的”。在一些实施方案中，如本领域技术人员将理解的，在与某些其它组分例如像一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)组合后，物质仍可被认为是“富集的”、“分离的”或甚至“纯的”；在此类实施方案中，在不包括此类载体或赋形剂的情况下计算物质的分离百分比或纯度。本领域技术人员意识到用于分离(例如，富集或纯化)物质或剂(例如，使用分馏、萃取、沉淀或其他分离中的一种或多种)的多种技术。

微生物群：如本文所用，术语“微生物群”是指受试者的身体部位被微生物多样性集合体集体定殖。人类在身体的不同部位具有细菌簇，如在皮肤表层或深层(皮肤微生物群)、口(口腔微生物群)、阴道(阴道微生物群)等中。参见Huttenhower C.等人“Structure，function and diversity of the healthy human microbiome”Nature(2012)486:207-14，所述文献的全部内容出于本文所述的目的以引用的方式整体并入本文。例如，在一些实施方案中，微生物群包括“肠道微生物群”或“肠道菌群”，其是指驻留于受试者消化道中的微生物群体。这样的肠道微生物群通常含有数以万亿计的微生物，包括至少1000种不同种类的已知细菌，具有超过300万个基因(比人类基因多150倍)。如本领域技术人员将理解的，人肠道微生物群的某些菌种是人受试者群体共有的，而某些其他菌种可能是个体特有的。

调节：在调节微生物群系的上下文中使用的术语“调节(modulate)”或“调节(modulation)”是指与在不存在这种调节时在其他方面可比较的条件下观察到的活性相比，在观察到目标活性的系统中其存在或水平与所述活性的水平和/或性质的变化相关的实体。在一些实施方案中，调节是指在治疗性细菌群体和/或治疗性组合物(例如，如本文所述的治疗性细菌群体和/或治疗性组合物)存在下，与在不存在这样的治疗性细菌群体和/或治疗性组合物(例如，如本文所述的治疗性细菌群体和/或治疗性组合物)时在其他方面可比较的条件下观察到的相比，增加一个或多个特定非致病性共生细菌群体的活性和/或水平。在一些实施方案中，调节是指在治疗性细菌群体和/或治疗性组合物(例如，如本文所述的治疗性细菌群体和/或治疗性组合物)存在下，与在不存在这样的治疗性细菌群体和/或治疗性组合物(例如，如本文所述的治疗性细菌群体和/或治疗性组合物)时在其他方面可比较的条件下观察到的相比，降低消耗非致病性共生细菌的靶噬菌体的活性和/或水平。在一些实施方案中，调节是指与其活性令人感兴趣的靶实体的直接相互作用。在一些实施方案中，调节是指与其活性令人感兴趣的靶实体的间接相互作用(即，与同靶实体相互作用的中间剂的直接相互作用)。在一些实施方案中，调节是指目标靶实体的水平的变化；可替代地或另外地，在一些实施方案中，调节是指在不影响靶实体的水平的情况下改变目标靶实体的活性。在一些实施方案中，调节是指目标靶实体的水平和活性两者的变化，使得观察到的活性差异不完全由观察到的水平差异解释或与观察到的水平差异相称。

突变体：如本文所用，术语“突变体”是指与参考生物体、细胞或生物分子相比包含遗传变异的生物体、细胞或生物分子(例如，核酸或蛋白质)。例如，在一些实施方案中，与参考核酸分子相比，突变型核酸可包含突变，例如核碱基取代、一个或多个核碱基的缺失、一个或多个核碱基的插入、两个或更多个核碱基的倒位或截短。类似地，与参考多肽相比，突变型蛋白质可包含氨基酸取代、插入、倒位或截短。另外的突变(例如，融合和插入缺失)是本领域技术人员已知的。包含或表达突变型核酸或多肽的生物体或细胞有时在本文也称为“突变体”。在一些实施方案中，突变体包含与基因产物的功能丧失相关的遗传变体。功能丧失可以是功能的完全消除，例如酶的酶活性消除；或功能的部分丧失，例如酶的酶活性降低。在一些实施方案中，突变体包含与功能获得相关，例如，与基因产物中的特征或活性的负面或不期望的改变相关的遗传变体。在一些实施方案中，突变体的特征在于与参考相比期望水平或活性的降低或丧失；在一些实施方案中，突变体的特征在于与参考相比不期望的水平或活性增加或获得。在一些实施方案中，参考生物体、细胞或生物分子是野生型生物体、细胞或生物分子。

非致病性：如本文所用，术语“非致病性”是指被认为无害且与疾病、病症或疾患不相关的微生物(例如，细菌)。在一些实施方案中，非致病性微生物是驻留于受试者的某个身体部位，例如肠道或皮肤中的有益细菌。在一些实施方案中，非致病性微生物可以成为机会病原体，例如在免疫受损宿主中。在一些实施方案中，非致病性细菌不是大肠杆菌。在一些实施方案中，非致病性细菌不是链球菌属。

核酸：如本文所用，术语“核酸”是指至少三个核苷酸的聚合物。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中包含RNA。在一些实施方案中，核酸是单链的。在一些实施方案中，核酸是双链的。在一些实施方案中，核酸包含单链部分和双链部分。在一些实施方案中，核酸包含含有一个或多个磷酸二酯键联的主链。在一些实施方案中，核酸包含含有磷酸二酯键联和非磷酸二酯键联的主链。例如，在一些实施方案中，核酸可包含含有一个或多个硫代磷酸酯或5'-N-亚磷酰胺键联和/或一个或多个肽键的主链，例如，如在“肽核酸”中。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个或所有天然残基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个或所有非天然残基。在一些实施方案中，非天然残基包含核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮杂鸟苷-氧代腺苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、插入的碱基以及它们的组合)。在一些实施方案中，与天然残基中的糖相比，非天然残基包含一种或多种修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能基因产物诸如RNA或多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸具有包含一个或多个内含子的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸可通过从天然来源分离、酶促合成(例如，通过基于互补模板的聚合，例如在体内或体外)、在重组细胞或系统中复制或化学合成来制备。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。

可操作地缔合：如本文所用，术语“可操作地缔合”是指并置，其中所描述的组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。例如，与功能性元件“可操作地缔合”的控制元件以这样的方式缔合，即使得功能性元件的表达和/或活性在与控制元件相容的条件下实现。在一些实施方案中，“可操作地缔合的”控制元件与目标编码元件相邻(例如，共价连接)；在一些实施方案中，控制元件以相反地或以其他方式作用于目标功能性元件。在CRISPR系统(例如，CRISPR-Cas系统)的背景下，与CRISPR基因座中的Cas(CRISPR相关)多肽可操作地缔合的CRISPR间隔区以这样的方式缔合，即产生包含这种CRISPR间隔区的功能性向导RNA以与Cas多肽相互作用，用于裂解和降解与所述CRISPR间隔区互补的靶序列。

药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指其中活性剂(例如，本文所述的治疗性细菌群体)与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的组合物。在一些实施方案中，活性剂(例如，本文所述的治疗性细菌群体)是以适于在对相关群体施用时显示达成预定治疗作用的统计显著概率的治疗方案中施用的单位给药量存在。在一些实施方案中，药物组合物可被特别配制来以固体或液体形式施用，所述形式包括适合于以下的那些：经口施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂(例如以经颊、舌下和全身性吸收为目标的那些)、大丸剂、粉末、颗粒剂、用于向舌施加的糊剂、胶囊、粉末等。在一些实施方案中，活性剂可以是或包括治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)或治疗性细菌群体(例如，单一治疗性细菌菌种的群体或不同治疗性细菌菌种的混合物)。在一些实施方案中，活性剂可以是或包括分离的、纯化的或纯的治疗性细菌群体(例如，单一治疗性细菌菌种的群体或不同治疗性细菌菌种的混合物)。在一些实施方案中，活性剂可以是或包括天然产物(无论是从其天然来源中分离的还是在体外产生的)。

药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”例如可用于指用于配制如本文公开的药物组合物的载体、稀释剂或赋形剂，是指所述载体、稀释剂或赋形剂与所述组合物的其他成分相容且对其接受者无害。

药学上可接受的载体：如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运输至身体的另一器官或部分时涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂囊封材料。各载体在可与制剂的其它成分相容并且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽糖；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer’s solution)；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及其它用于药物制剂中的非毒性可相容材料。

预防：如本文所用，术语“预防”是指延迟特定疾病、病症或疾患的发作，和/或降低所述疾病、病症或疾患的一种或多种症状的频率和/或严重性。在一些实施方案中，预防是在群体基础上评估的，因此如果在易患特定疾病、病症或疾患的群体中观察到所述疾病、病症或疾患的一种或多种症状的发展、频率和/或强度在统计学上显著降低，则认为剂“预防”所述疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，例如当疾病、病症或疾患的发作已延迟预定时间段时，可认为预防是完全的。

纯的：如本文所用，如果细胞群体基本上不含其他细胞和/或组分，则它为“纯的”。例如，含有超过约90％的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的制剂通常被认为是纯制剂。在一些实施方案中，如果治疗性组合物含有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％的治疗性细菌，则认为所述治疗性组合物是“纯的”。

参考：如本文所用，术语“参考”描述相对于其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方案中，将目标剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，在进行目标测试或测定的情况下基本上地同时对参考或对照进行测试和/或测定。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。典型地，如本领域技术人员所理解的，参考或对照是在与评估中的那些相当的条件或情况下确定或表征的。本领域技术人员将理解何时存在足够的相似性来证明对特定可能的参考或对照的依赖和/或比较。在一些实施方案中，参考是阴性对照参考；在一些实施方案中，参考是阳性对照参考。

多肽：如本文所用，术语“多肽”通常具有至少三个或更多个氨基酸的聚合物的领域公认的含义。本领域普通技术人员将理解，术语“多肽”旨在足够通用，以便不仅涵盖具有本文所述的完整序列的多肽，而且还涵盖表示此类完整多肽的功能性、生物活性或特征性片段、部分或结构域(例如，保留至少一种活性的片段、部分或结构域)的多肽。在一些实施方案中，多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者和/或可含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合(例如，可以是或包括拟肽)。

预防有效量：“预防有效量”是足以预防(例如，显著延迟一种或多种症状或特征的发作或复发，例如，使得在预期它们不施用该量的时间点检测不到它/它们)病症的量。组合物的预防有效量是指在病症的预防中提供预防益处的单独或与其他剂组合的治疗剂的量。术语“预防有效量”可涵盖改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。本领域技术人员将理解预防有效量不必包含在单一剂型中。相反，有效量的施用可涉及可能随时间(例如，根据给药方案)施用多个剂量。

样品：如本文所用，术语“样品”通常是指从关注的来源获得或衍生的材料的等分试样。在一些实施方案中，目标来源是生物或环境来源。在一些实施方案中，目标来源可以是或包括细胞或生物体，诸如微生物、植物、动物或受试者(例如，人)。在一些实施方案中，目标来源是或包括生物样品。在一些实施方案中，生物样品可以是或包括羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、母乳、脑脊液、耳垢、乳糜、食糜(chime)、精液(ejaculate)、内淋巴、渗出物、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、胸膜液、脓液、泪水、唾液、皮脂、精液(semen)、血清、包皮垢、痰、滑液、汗液、眼泪、尿液、阴道分泌物、玻璃体液、呕吐物和/或它们的组合或一种或多种组分。在一些实施方案中，生物流体可以是或包括细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、间质液、淋巴液和/或跨细胞液。在一些实施方案中，生物流体可以是或包括植物分泌物。在一些实施方案中，生物组织或样品可通过例如抽吸、活检(例如，细针或组织活检)、拭子(例如，口腔、鼻、皮肤或阴道拭子)、刮擦、手术、洗涤或灌洗(例如，支气管肺泡、导管、鼻、眼、口腔、子宫、阴道或其他洗涤或灌洗)获得。在一些实施方案中，生物样品是或包括从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当的方式直接从关注的来源获得的“原始样品”。在一些实施方案中，从上下文中将清楚，术语“样品”是指通过处理原始样品(例如，通过去除其中的一种或多种组分和/或通过向其中添加一种或多种剂)获得的制剂。例如，使用本领域中的适当手段(例如离心和/或半透膜)进行过滤。这种“加工的样品”可包括例如从样品分离的某些细菌级分或病毒级分。在一些实施方案中，“加工的样品”可包括例如从样品提取或通过使初级样品经受诸如核酸的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等的一种或多种技术获得的核酸或蛋白质。

受试者：预期被施用的“受试者”包括但不限于人(即任何年龄组的男性或女性，例如儿科受试者(例如婴儿、儿童、青少年)或成年受试者(例如青年、中年或老年))和/或非人动物，例如哺乳动物(例如灵长类动物(例如食蟹猴、恒河猴)；家畜，诸如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和/或狗；和/或鸟(例如，鸡、鸭、鹅和/或火鸡)。在某些实施方案中，动物是哺乳动物(例如处于任何发育阶段)。在一些实施方案中，动物(例如，非人动物)可以是转基因或遗传工程化动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者(例如，人受试者)。在一些实施方案中，受试者是患有生态失调相关疾病、病症或疾患的哺乳动物受试者。

患有：“患有”疾病、病症和/或疾患的个体已被诊断为患有和/或表现出疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状。

易患：“易患”疾病、病症和/或疾患的个体是发展所述疾病、病症和/或疾患的风险高于公众成员的个体。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或疾患的个体可能未被诊断为患有所述疾病、病症和/或疾患。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或疾患的个体可表现出所述疾病、病症和/或疾患的症状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或疾患的个体可不表现出所述疾病、病症和/或疾患的症状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或疾患的个体将发展所述疾病、病症和/或疾患。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或疾患的个体不会发展所述疾病、病症和/或疾患。

症状减轻：如本文所用，当特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状的量级(例如，强度、严重性等)或频率降低时，“症状减轻”。为了清楚起见，特定症状发作的延迟被认为是所述症状的频率减小的一种形式。

治疗性细菌：如本文所用，短语“治疗性细菌”是指当施用于受试者时具有治疗作用和/或引发所需生物和/或药理学作用的细菌。在一些实施方案中，治疗性细菌或治疗性细菌群体包括可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟与生态失调或微生物群系功能障碍相关的疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征的发作、降低其严重性和/或降低其发病率的非致病性共生细菌。

治疗有效量：“治疗有效量”是足以在病症的治疗中提供治疗益处的量，所述治疗益处可以是或包括例如与病症相关的一种或多种特征或症状的频率和/或严重性的降低、和/或发作的延迟。治疗有效量意指在疾患的治疗中提供治疗益处的单独或与其他疗法组合的治疗剂(例如，治疗性细菌)的量。术语“治疗有效量”可涵盖改善整体疗法、减少或避免病症的症状或病因、或增强另一治疗剂的治疗功效的量。本领域技术人员将理解，治疗有效量不必包含在单一剂型中。相反，有效量的施用可涉及可能随时间(例如，根据给药方案)施用多个剂量。

治疗：术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指逆转、减轻、延迟本文所述的“病理学疾患”(例如，疾病、病症或疾患，包括其一种或多种体征或症状)(例如，与生态失调或微生物群系功能障碍相关的疾病、病症或疾患，包括例如炎症性肠病)的发作或抑制其进展。在一些实施方案中，治疗可以在已发展或已观察到一种或多种体征或症状之后施用。也可以在症状已消退后继续治疗，例如以延迟或防止复发和/或扩散。

变体：如文中所用，术语“变体”是指显示出与参考实体的显著结构同一性但与参考实体相比在一个或多个化学部分的存在或水平上与参考实体在结构上不同的实体。在许多实施方案中，变体在功能上也与其参考实体不同。通常，是否将特定实体适当地认为是参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性的程度。如本领域技术人员将理解的，任何生物学或化学参考实体都具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是共享一个或多个此类特征性结构元件的独特化学实体。仅举几个例子，小分子可以具有特征性核心结构元件(例如，大环核心)和/或一个或多个特征性侧基部分，使得所述小分子的变体是共享核心结构元件和特征性侧基部分但在其他侧基部分和/或核心内存在的键类型(单键对双键，E对Z等)方面的小分子，多肽可以具有由多个具有在线性或三维空间中相对于彼此指定的位置和/或贡献于特定生物学功能的氨基酸构成的特征性序列元件，核酸可以具有由多个具有在线性或三维空间中相对于彼此指定的位置的核苷酸残基构成的特征性序列元件。例如，由于一种或多种结构修饰(例如但不限于化学部分的增加、去除和/或修饰)，变体治疗性细菌可能不同于参考治疗性细菌，条件是变体治疗性细菌对靶向与疾病、病症或疾患相关的细菌的噬菌体具有抗性，例如当用于本文所述的方法中时。在一些实施方案中，变体治疗性细菌的特征在于，当在体外通过在一种或多种靶噬菌体存在下培养这种变体治疗性细菌群体评估时，在24小时或更长时间(包括，例如48小时、72小时或更长时间)之后，这种变体治疗性细菌的细胞活力为当在一种或多种靶噬菌体存在下培养参考治疗性细菌时观察到的细胞活力的至少60％或更多(例如，包括例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或达100％)。在一些实施方案中，变体治疗性细菌的特征在于，当在体外通过在一种或多种靶噬菌体存在下培养这种变体治疗性细菌群体评估时，在24小时或更长时间(包括，例如48小时、72小时或更长时间)之后，这种变体治疗性细菌的细胞活力为当在一种或多种靶噬菌体存在下培养参考治疗性细菌时观察到的细胞活力的至少1.1倍或更多(例如，包括例如，至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍或更多倍)。在一些实施方案中，变体治疗性细菌表现出与参考治疗性细菌的物理特征不同的至少一种物理特征。例如，在一些实施方案中，与参考治疗性细菌相比，变体治疗性细菌可在生物途径中具有遗传改变。在一些实施方案中，变体与参考相比具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个结构修饰。在一些实施方案中，变体具有少量(例如，少于5、4、3、2或1个)结构修饰。在一些实施方案中，与参考相比，变体具有不超过5、4、3、2或1个化学部分的增加或去除，并且在一些实施方案中没有增加或去除。在一些实施方案中，变体是可以通过化学操作从参考生成的实体。在一些实施方案中，变体是可通过执行与生成参考的合成过程基本相似(例如，与其共享多个步骤)的合成过程来生成的实体。

载体：如本文所用，术语“载体”是指能够将另一核酸转运至它已连接的核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其是指其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所可操作地连接的基因的表达。

标准技术可用于重组DNA、核酸合成，例如DNA模板合成和/或RNA合成，以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述来进行。前述技术和程序通常可根据本领域众所周知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，所述文献出于任何目的以引用的方式并入本文。

具体实施方式

本公开尤其提供与由抗噬菌体的细菌组成或包含抗噬菌体的细菌的治疗性组合物有关的技术，以及与其相关的各种方法和/或材料，包括例如施用此类组合物例如以治疗与微生物群系相关的疾病或病症的方法。

在一些实施方案中，所提供的技术在治疗微生物群系相关疾病或病症方面比某些现有技术(包括例如施用常规益生菌和/或有益细菌)更有用。例如，本公开认识到，许多此类常规基于益生菌(细菌)的疗法在治疗或预防与生态失调或微生物群系功能障碍相关的疾病或病症方面可能不太有效或甚至无效。具体而言，本公开尤其认识到驻留于人肠道中的噬菌体能够感染和消耗驻留于患有炎症性肠病(IBD)的人肠道中的健康有益细菌群体。因此，本公开尤其提供了以下剪接：在某些人体部位的噬菌体与细菌之间存在捕食性相互作用，并且因此，感染并消耗有益共生细菌的噬菌体的存在会显著损害常规基于益生菌(细菌)的疗法的功效。本公开尤其提供了解决此类问题的技术，包括治疗性细菌、组合物和方法，包括例如通过使有需要的受试者特异性地暴露于对与生态失调或微生物群系功能障碍相关疾病或病症相关的一种或多种靶噬菌体具有抗性的非致病性共生细菌群体。

I.治疗性细菌

本公开提供了治疗性细菌，所述治疗性细菌(i)是非致病性的并且在待治疗的受试者中共生，并且(ii)对靶向受试者中的(例如，选择性地靶向)相应非致病性和共生宿主细菌的一种或多种噬菌体具有抗性。阅读本公开的本领域技术人员将认识到所提供的治疗性细菌可用于治疗和/或预防生态失调或微生物群系相关疾病或病症。

A.非致病性和共生细菌

微生物群系可包含多种非致病性和共生细菌菌种，其中任一者可根据本公开使用。在一些实施方案中，非致病性共生细菌细胞的属和/或种可能取决于噬菌体的特异性(例如，噬菌体宿主范围)。例如，一些噬菌体表现出对特定细菌菌种的向性或优先靶向特定细菌菌种。

细菌通常较小(典型的线性尺寸为约1微米)，非区室化，具有环状DNA和70S的核糖体。在一些实施方案中，非致病性和共生细菌包括来自真细菌和古细菌的亚门的细菌。真细菌可进一步细分为革兰氏阳性和革兰氏阴性真细菌，这取决于细胞壁结构的差异。本文还包括仅基于总体形态分类的那些(例如，球菌、杆菌)。在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括革兰氏阴性细胞。在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括革兰氏阳性细胞。根据本公开有用的非致病性和共生细菌的非限制性实例包括以下的组中的细菌：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、梭菌属、肠球菌属、大肠杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、酵母属和葡萄球菌属，例如，凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、枯草拟杆菌、多形拟杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、丁酸梭菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳酸乳球菌(Sonnenborn等人，2009；Dinleyici等人，2014；美国专利号6,835,376；美国专利号6,203,797；美国专利号5,589,168；美国专利号7,731,976。

在一些实施方案中，用于治疗性细菌中的非致病性和共生细菌可以是或包括以下细菌中的一者或多者(例如，两者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者)：共生梭菌(Clostridium symbiosum)、哈氏梭菌(Clostridium hathewayi)、柠檬酸梭菌(Clostridium citroniae)、鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)、瘤胃球菌属M-1、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、布劳特菌属犬类口腔分类群143、粪厌氧棒状菌(Anaerostipes caccae)、乳酸发酵梭菌(Clostridium lactatifermentans)、链状粪芽孢菌(Coprobacillus cateniformis)、多枝梭菌、参见梭菌属MLG055、无害梭菌(Clostridiuminnocuum)、链状真杆菌(Eubacterium desmolans)、圆环梭菌(Clostridiumorbiscindens)、瘤胃球菌属16442、人结肠厌氧棍状菌(Anaerotruncus colihominis)、多氏拟杆菌(Bacteroides dorei)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)假长亚种、短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)、梭状梭菌(Clostridium clostridioforme)、胶原蛋白梭菌(Clostridium collagenovorans)、天门冬型梭菌、闪烁梭菌、减醋酸梭菌(Clostridium acetireducens)、藻酸梭菌(Clostridium algidicarnis)、争论梭菌(Clostridium paradoxum)、噬糖梭菌、多枝梭菌JCM1298、梭状芽孢杆菌细菌UC5.1-1A9、天门冬型梭菌、纤维素梭菌、鲍氏梭菌、柠檬酸梭菌、梭状梭菌、吲哚梭菌、耳蜗形梭菌、无害梭菌、拉瓦氏梭菌(Clostridium lavalense)、解糖梭菌、闪烁梭菌、共生梭菌、丁酸梭菌、梭状芽孢杆菌细菌UC5.1-1A9、吉达氏梭菌(Clostridium jeddahense)、Clostridiumnigeriense、新生儿梭菌(Clostridium neonatale)、产气荚膜梭菌、Clostridiumphoceensis、梭菌属1_1_41A1FAA、梭菌属316002/08、梭菌属7_3_54FAA、梭菌属ATCC BAA-442，梭菌属C105KSO14、梭菌属CL-6、梭菌属D5、梭菌属FS41、梭菌属HGF2、梭菌属IODB-O3、梭菌属KLE 1755、梭菌属L2-50、梭菌属M62/1、梭菌属MSTE9、梭菌属VE202-10、梭状芽孢杆菌细菌UC5.1-2G4、梭状芽孢杆菌细菌UC5.1-2H11、梭菌目细菌1_7_47FAA、梭菌目细菌JGI000176CP_D02、梭菌目细菌VE202-03、梭菌目细菌VE202-06、梭菌目细菌VE202-07、梭菌目细菌VE202-09、梭菌目细菌VE202-15、梭菌目细菌VE202-16、梭菌目细菌VE202-21、梭菌目细菌VE202-26、梭菌目细菌VE202-27、梭菌目细菌VE202-28、梭菌目细菌VE202-29、梭菌属C8、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、梭菌属VE202-10、Lachnoclostridium属An131、Lachnoclostridium属YL32、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、毛螺菌科细菌A4、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌VE202-23、毛螺菌科细菌VE202-23、减醋酸梭菌、胶原蛋白梭菌和它们的组合。

在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括一种或多种梭状芽孢杆菌菌种。梭状纲的示例性菌种包括但不限于闪烁梭菌、梭菌目、共生梭菌(Clostridiumsymbosium)、梭菌目细菌、Clostridium phoceensis、无害梭菌以及它们的组合。在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括闪烁梭菌。

在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括一种或多种双歧杆菌菌种。在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括长双歧杆菌。

在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括一种或多种乳杆菌属菌种，包括但不限于加氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、布氏乳杆菌、清酒乳杆菌。

在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括一种或多种艾克曼菌属的菌种。在一些实施方案中，非致病性和共生细菌是或包括嗜粘蛋白艾克曼菌(AkkermansiaMuciniphila)。

在一些实施方案中，治疗性细菌包括被发现通常驻留于人受试者的身体部位(例如，粘膜胃肠道、口/咽/鼻孔、泌尿生殖道、皮肤、肛门/直肠、脸颊/口或眼睛)中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)非致病性和共生细菌。在一些实施方案中，治疗性细菌包括被发现通常驻留于人受试者的身体部位(例如，粘膜胃肠道、口/咽/鼻孔、泌尿生殖道、皮肤、肛门/直肠、脸颊/口或眼睛)中的非致病性和共生细菌的一种或多种变体(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种变体)。

在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌包含选自由以下组成的组的至少一种或多种(包括，例如，至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种)分离的、纯化的或培养的共生细菌：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、粪球菌属、梭菌属、柯林斯菌属、脱硫单胞菌属、多尔氏菌属、埃希氏菌属、真杆菌属、梭杆菌属、吉米菌属、乳杆菌属、乳球菌属、念珠菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、瘤胃球菌属以及它们的组合。在一些实施方案中，治疗性细菌群体包含拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属或它们的组合。在一些实施方案中，此类细菌可以是自体的(例如，本文所述的治疗性细菌是从易受靶噬菌体感染的待治疗受试者的细菌遗传工程化的)。在一些实施方案中，此类细菌可以是同种异体的。

B.噬菌体

除其它事项之外，本公开提供了一种非致病性和共生细菌的治疗性组合物，所述细菌已确立或另外已知对否则将感染此类非抗性非致病性和共生细菌的一种或多种噬菌体具有抗性。

噬菌体(也称为噬菌体)通常由包封DNA或RNA基因组的蛋白质组成，所述基因组可能仅编码几个或数百个基因，从而产生具有相对简单或复杂结构的病毒粒子。因此，噬菌体是生物圈中最常见和最多样化的实体之一。噬菌体根据国际病毒分类委员会(ICTV)考虑形态和核酸类型(DNA或RNA、单链或双链、线性或环状)进行分类。迄今为止，已识别了感染细菌和/或古生菌(以前归类为古细菌的原核领域)的大约19个噬菌体家族。许多噬菌体对细菌细胞的特定属或种或菌株具有特异性。

在一些实施方案中，本文所述的组合物和/或方法中使用的非致病性和共生细菌可对裂解性噬菌体具有抗性。裂解性噬菌体是通过完成裂解周期遵循裂解途径而不是进入溶原途径的噬菌体。裂解性噬菌体经历病毒复制，从而导致细胞膜裂解，细胞破坏，以及能够感染其他细胞的后代噬菌体颗粒的释放。

在一些实施方案中，本文所述的组合物和/或方法中使用的非致病性和共生细菌可对溶原性噬菌体具有抗性。溶原性噬菌体是能够进入溶原途径的噬菌体，其中噬菌体在其裂解周期完成之前成为细胞基因组的休眠、被动部分。

在一些实施方案中，本文所述的组合物和/或方法中使用的非致病性和共生细菌可对温和噬菌体具有抗性。温和噬菌体是可为裂解性或溶原性的噬菌体。当溶原性时，这种噬菌体通常将其核酸整合到宿主细胞基因组中并保持静止，仅在宿主基因组复制时复制。在其裂解或营养增殖噬菌体中，噬菌体核酸从宿主基因组中切除自身，或者不将自身整合到宿主细胞基因组中，而是以牺牲细胞组分为代价接管宿主细胞的蛋白质合成机制并引起噬菌体后代组装。当细胞裂解时，新的噬菌体从受感染的宿主细胞中释放。

在一些实施方案中，本文所述的组合物和/或方法中使用的非致病性和共生细菌对在这种细菌细胞被感染后在其生命周期的某一时刻对细菌细胞具有毒性的噬菌体具有抗性。

尽管根据本公开可使用赋予针对任何靶噬菌体(包括例如野生型、天然存在的、分离的或重组的噬菌体)的抗性的非致病性和共生细菌，但在一些实施方案中，针对(例如，能够感染)哺乳动物受试者(例如，人)中的微生物群系的一种或多种非致病性共生细菌菌株具有活性的靶噬菌体是特别令人感兴趣的。仅举例来说，在一些实施方案中，非致病性和共生细菌对其具有抗性的靶噬菌体包括但不限于能够感染来自以下属中的至少一种或多者的细菌的那些噬菌体：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、柯林斯菌属、粪球菌属、脱硫单胞菌属、多尔氏菌属、埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、真杆菌属、梭杆菌属、吉米菌属、念珠菌属、乳杆菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、艾克曼菌属和瘤胃球菌属。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌对选自由尾噬菌体目或微小噬菌体科噬菌体组成的组的一种或多种噬菌体具有抗性。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌对人受试者的肠道微生物群系中存在的一种或多种噬菌体具有抗性。例如，在一些此类实施方案中，本文所述的治疗剂对一种或多种噬菌体具有抗性，所述噬菌体可以是或包括尾噬菌体目。

C.示例性抗噬菌体的细菌

根据本公开使用的治疗性细菌对一种或多种噬菌体(例如，本文所述的噬菌体)具有抗性。在一些实施方案中，治疗性细菌对一种或多种噬菌体具有抗性，所述噬菌体否则在没有这种噬菌体抗性的情况下将感染相应的细菌。在一些此类实施方案中，治疗性细菌表现出针对其的抗性的噬菌体与生态失调和/或微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患相关。

在一些实施方案中，可从受试者(例如，哺乳动物受试者)的生物组织或流体样品中分离抗噬菌体的细菌。例如，在一些实施方案中，可从哺乳动物受试者的身体排泄物，包括例如但不限于唾液、粘液、尿液和/或粪便(例如，粪便样品)中分离抗噬菌体的细菌。在一些实施方案中，可在体外或离体对抗噬菌体的细菌进行遗传工程化。在一些实施方案中，可在体内产生抗噬菌体细菌，例如，通过向受试者施用包含核酸序列的组合物，其中将核酸序列递送至对此类噬菌体敏感的宿主细菌以进行遗传操作以变成对此类噬菌体具有抗性。

1.CRISPR系统(例如，CRISPR-Cas系统)

在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和/或方法中的治疗性细菌各自包含成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统，所述系统包含靶向一个或多个噬菌体序列的CRISPR间隔区和CRISPR相关(Cas)多肽。在一些此类实施方案中，CRISPR系统的特征在于足够的灵活性，以使得当治疗性细菌被含有靶向间隔区序列(原型间隔区)或这种靶向间隔区序列的相关变体的噬菌体(例如，在一些实施方案中，从亲本或靶噬菌体进化出至少一个或多个，例如至少两个、至少三个、至少四个或更多个突变的具有原型间隔区的突变型噬菌体；或在一些实施方案中，从亲本或靶噬菌体进化出1-4个突变的具有原型间隔区的突变型噬菌体)感染时，相对于针对不包含靶向噬菌体的CRISPR间隔区或其相关变体的在其他方面可比较的细菌所观察到的对感染的抗性，治疗性细菌显示出对感染的增加的抗性。在一些实施方案中，相对于针对不包含靶向噬菌体的CRISPR间隔区或其相关变体的在其他方面可比较的细菌所观察到的对感染的抗性，这种治疗性细菌可显示对噬菌体感染的抗性增加至少30％或更多(包括例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高)。在一些此类实施方案中，噬菌体抗性可通过如下文题为“用于表征噬菌体抗性的示例性方法”的部分中描述的一种或多种方法来表征。

CRISPR-Cas系统在细菌中进化以提供针对外来遗传元件(包括噬菌体)的适应性免疫。CRISPR通常是24-65bp的短的部分回文序列，其含有内部和末端反向重复序列。尽管已检测到分离的元件，但它们通常排列成通过独特的20-58bp插入序列间隔开的重复单元的簇(每个基因组最多约20个或更多个)。

CRISPR系统分别存在于大约40％和90％的已测序细菌和古生菌基因组中。在非致病性和共生细菌中也发现了各种各样的CRISPR系统。Rho，M.，等人PLoS Genet.8，e1002441(2012)；Soto-Perez，P.等人Cell Host Microbe 26，325–335.e5(2019)。存在于可根据本公开进行操作的非致病性和共生细菌中的CRISPR系统包括例如I-A型、I-B型、I-C型、I-D型、I-E型、I-F型、III-A型、III-B型、II-A型或II-B型。在一些实施方案中，存在于可根据本公开进行操作的非致病性和共生细菌中的CRISPR系统是I型(例如，I-C型)或III型(例如，III-A型、III-B型)。各种计算机软件和网络资源可用于分析和鉴定可用于本文所述的组合物和/或方法中的CRISPR系统和CRISPR阵列。这些工具包括但不限于用于CRISPR检测的软件，如PILERCR、CRISPR识别工具和CRISPRFinder；预先分析的CRISPR的在线存储库，如CRISPRdb；以及用于浏览微生物基因组中的CRISPR的工具，如Pygram。如本领域技术人员将理解的，可根据本公开使用来自此类CRISPR系统中的任一者的CRISPR阵列。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌可采用内源性CRISPR阵列来调节细胞对靶噬菌体的抗性。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌可包含引入其中以调节细胞对靶噬菌体的抗性的异源CRISPR阵列，包括至少一种Cas蛋白(例如，本文所述的Cas蛋白)、至少一个CRISPR间隔区(例如，本文所述的CRISPR间隔区)和至少两个CRISPR重复序列(例如，本文所述的CRISPR重复序列)。

CRISPR间隔区：根据本公开使用的治疗性细菌各自包含一个或多个CRISPR间隔区，所述一个或多个CRISPR间隔区靶向一个或多个噬菌体序列，例如噬菌体的一个或多个特征序列元件。在一些实施方案中，这样的CRISPR间隔区可靶向一种或多种噬菌体的特征性核酸序列元件或其转录产物。此类CRISPR间隔区可在细菌细胞中天然存在或内源性表达或通过本领域已知的方法引入这种细胞中。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌包含至少一个或多个，包括例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个CRISPR间隔区，所述一个或多个CRISPR间隔区各自靶向同一靶噬菌体的不同特征序列元件(例如，特征型核酸序列元件或其转录产物)。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌包含至少一个或多个，包括例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个CRISPR间隔区，所述一个或多个CRISPR间隔区各自靶向不同靶噬菌体的特征序列元件(例如，特征型核酸序列元件或其转录产物)。

CRISPR间隔区通常是或包含与靶噬菌体的特征序列元件(例如，特征性核酸序列元件或其转录产物或原型间隔区)互补的序列，使得其能够结合至一种或多种噬菌体的特征序列元件或其相关变体，从而导致在适当的Cas多肽存在下这种特征序列元件的裂解。在一些实施方案中，CRISPR间隔区是或包含与参考噬菌体的特征序列元件(例如，特征性核酸序列元件或其转录产物或原型间隔区)互补(例如，100％互补)的序列。在一些实施方案中，CRISPR间隔区是或包含与参考噬菌体的特征序列元件(例如，特征性核酸序列元件或其转录产物或原型间隔区)具有至少一个碱基对错配(包括例如，至少两个碱基对错配、至少三个碱基对错配、至少四个碱基对错配或更多)的序列。在一些实施方案中，CRISPR间隔区是或包含与参考噬菌体的特征序列元件(例如，特征性核酸序列元件或其转录产物或原型间隔区)具有1-4个碱基对错配的序列。

在一些实施方案中，CRISPR间隔区是或包括作为CRISPR间隔区存在于人肠道中发现的非致病性和共生细菌的CRISPR基因座内的序列，其中这种CRISPR间隔区与通常在人肠道中发现的噬菌体的特征序列元件匹配。例如，在一些实施方案中，CRISPR间隔区是或包括作为CRISPR间隔区存在于迟缓埃格特菌(一种人肠道放线细菌)的CRISPR基因座内的序列，例如，如Soto-Perez等人Cell Host&Microbes(2019)26:1-11中所述，其内容以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，CRISPR间隔区是或包含通过计算方法确定的序列。例如，如实施例2中所述，根据一些实施方案的CRISPR间隔区可通过将噬菌体序列的部分与从细菌宿主(例如，肠道细菌)鉴定的已知CRISPR间隔区序列匹配来确定。

Cas多肽或编码所述Cas多肽的基因：CRISPR结构或阵列通常位于CRISPR相关(Cas)基因附近。本领域已知的多种Cas基因或多肽可用于本文所述的组合物和/或方法中，并且Cas多肽的选择可随待由本文所述的组合物和/或方法靶向的噬菌体而变化。在一些实施方案中，可基于其在赋予噬菌体群体抗性方面的功效来选择Cas蛋白。可用于本文所述的组合物和/或方法中的Cas多肽的实例包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10以及它们的组合。在一些实施方案中，治疗性细菌可包含III型Cas多肽，例如Cas10多肽。在一些实施方案中，治疗性细菌可包含Cas RNA核酸酶。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌可采用内源性Cas多肽。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌可包含异源Cas多肽。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌可包含对这种治疗性细菌而言内源的一种或多种Cas基因或多肽和与此类一种或多种Cas基因或多肽可操作地缔合的一个或多个异源CRISPR间隔区。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌可包含与这种治疗性细菌异源的一种或多种Cas基因或多肽和可与这种治疗性细菌同源或异源的一个或多个CRISPR间隔区。在一些此类实施方案中，一个或多个CRISPR间隔区可与此类一种或多种Cas基因或多肽可操作地缔合。

用于调节细胞中CRISPR介导的免疫的方法是本领域已知的，例如，如U.S.9,879,269和US 2016/0348120中所述，所述专利各自的内容出于本文所述的目的以引用的方式整体并入本文。阅读本公开的熟练技术人员将认识到，本领域中已知的此类方法和其他方法可用于产生根据本文所述的一些实施方案的治疗性细菌。

2.噬菌体受体的突变体

在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和/或方法中的治疗性细菌各自包含细菌细胞表面上的噬菌体受体的至少一种或多种突变体。在一些实施方案中，可通过使细菌群体暴露于噬菌体并选择显示出提高的存活率的那些细菌来鉴定噬菌体受体中赋予抗性的一种或多种突变。这种策略允许分离在细菌细胞表面上具有噬菌体受体的突变的一些抗噬菌体的细菌。然后可将这些突变工程化至所需的细菌菌株中以赋予抗性。在一些此类实施方案中，治疗性细菌各自被遗传工程化为表达细菌细胞表面上的噬菌体受体的至少一种或多种突变体。在一些此类实施方案中，治疗性细菌从来自受试者的生物样品中分离或纯化。在一些实施方案中，此类治疗性细菌可从来自被确定对炎症性肠病较不敏感的个体(例如，健康个体)的粪便样品中分离或纯化。

D.工程化的细菌群体

本公开尤其提供了对一种或多种噬菌体具有抗性的治疗性细菌(例如，如本文所述的治疗性细菌)的工程化群体。此类治疗性细菌群体可用于治疗微生物群系功能障碍相关疾病或病症。

在一些实施方案中，治疗性细菌的工程化群体是或包含治疗性细菌(例如，如本文所述的治疗性细菌)的富集或纯化群体。例如，在一些实施方案中，天然存在的抗噬菌体的细菌细胞从混合细菌群体中富集或纯化。在一些实施方案中，此类天然存在的抗噬菌体的细菌细胞可包含靶向一种或多种噬菌体的CRISPR间隔区。在一些实施方案中，此类天然存在的抗噬菌体的细胞也可具有影响细胞壁性质的抑制噬菌体感染的突变。在一些实施方案中，此类天然存在的抗噬菌体的细菌细胞可从人受试者或人受试者群体的生物样品中分离或纯化。在一些实施方案中，此类分离的或纯化的抗噬菌体的细菌细胞可在体外培养以用于克隆选择和/或细胞扩增。

在一些实施方案中，可通过使易感细菌培养物暴露于靶噬菌体来分离抗噬菌体的细菌细胞。通常，大多数细菌细胞(>90％)可在存在靶噬菌体的情况下被消除(例如，在24小时或更长时间，包括例如，48小时、72小时或更长时间后)。存活的细菌细胞可被认为是抗噬菌体的候选物。在一些实施方案中，此类存活细菌细胞(在第一次暴露于靶噬菌体之后)可经受至少第二次噬菌体暴露，例如暴露于相同的靶标或不同的噬菌体，并且在这样的第二次或更多次噬菌体暴露后存活的细菌细胞可被表征为抗噬菌体的。此类抗噬菌体的细胞可在体外培养以用于克隆选择和/或细胞扩增。

在一些实施方案中，可对分离的抗噬菌体的细菌细胞进行测序以鉴定赋予抗性的突变或CRISPR间隔区。在一些实施方案中，这种信息可用于遗传工程化抗噬菌体的细菌。因此，在一些实施方案中，治疗性细菌的工程化群体是或包括治疗性细菌(例如，如本文所述的治疗性细菌)群体，所述群体包含经遗传工程化以对一种或多种靶噬菌体具有抗性的非致病性和共生细菌，例如，如上述题为“示例性抗噬菌体的细菌”的部分中所述。

在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)都来自单个菌株。在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)都来自单个克隆。在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)包括细菌菌株的集合。在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)包括在人微生物群系中发现的至少一种或多种菌株。在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)包括遗传工程化的变体。在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)包含多种细菌菌株，所述细菌菌株中的每一者都存在于人微生物群系中；在一些此类实施方案中，所提供的这样的群体包含与人群体(平均，和/或特别是亚群体，和/或特别是人或其集合)中发现的相比处于不同相对量(例如，与彼此和/或与参考菌株)的单个菌株。

在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)属于相同的细菌菌种，其中此类治疗性细菌的至少两个或更多个(例如，至少三个、至少四个、至少五个或更多个)亚群包含赋予对一种或多种噬菌体的抗性的一种或多种不同的遗传修饰(例如，不同的CRISPR间隔区和/或不同的噬菌体受体突变体)。

在一些实施方案中，群体中的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)属于不同的细菌属和/或种，其中不同细菌属和/或种的每个亚群包含赋予对一种或多种噬菌体的抗性的一种或多种不同的遗传修饰(例如，不同的CRISPR间隔区和/或不同的噬菌体受体突变体)。

E.用于表征噬菌体抗性的示例性方法

可评估或表征细菌细胞(例如，无论是从生物样品中分离还是通过遗传操作分离的)的噬菌体抗性，以鉴定和选择抗噬菌体的细菌。

在一些实施方案中，推测或预期由于分离和/或工程化而对噬菌体产生抗性的细菌群体(例如，克隆群体)可在适当的液体培养基中培养，并用单一表征/未表征的噬菌体、多种表征/未表征的噬菌体的混合物、或可能包含表征/未表征的噬菌体的生物组合物激发，所述噬菌体已显示在实验干预之前感染克隆细菌群体。具有在统计上与未用噬菌体激发的细菌培养物相似的生长的噬菌体激发的细菌培养物可被认为已经对激发噬菌体群体产生了完全抗性。噬菌体激发的抗噬菌体的培养物在统计上也可能比噬菌体敏感培养物具有更高的生长速率，并且这些培养物将被表征为部分抗性。这种方法可适用于克隆和非克隆细菌群体可在培养之前或在滞后阶段用噬菌体激发的情况。

另外或可替代地，可使用固体培养基通过噬斑测定来鉴定细菌的抗噬菌体表型和/或基因型。例如，推测或预期由于实验干预(例如，分离和/或工程化)而对噬菌体产生抗性的细菌在固体培养基上生长，并用包含用单一表征/未表征的噬菌体、多种表征/未表征的噬菌体的混合物、或可能包含表征/未表征的噬菌体的生物组合物的适当缓冲液的连续稀释液激发，所述噬菌体已显示在实验干预之前感染克隆细菌群体。当在实验干预之前包含细菌的对照普遍形成噬斑时，在噬菌体激发后存活的细菌菌落可被认为是抗噬菌体的。

在一些实施方案中，细菌对噬菌体群体的抗性的潜在遗传机制可使用比较基因组学来确定。例如，在一些实施方案中，将显示出噬菌体抗性的细菌分离物的基因组与相同细菌菌株的噬菌体敏感群体进行比较。

II.示例性组合物

除其他事项外，本公开还提供了对噬菌体(例如，与微生物群系功能障碍相关疾病或病症或生态失调相关的噬菌体)表现出细菌抗性的组合物。在一些实施方案中，与某些现有技术相比，此类组合物在治疗微生物群系相关疾病或病症中可能更有用，所述现有技术包括例如施用常规益生菌和/或有益细菌，所述常规益生菌和/或有益细菌仍可被待治疗的受试者的微生物群系中存在的噬菌体感染和消耗。

A.包含治疗性细菌的药物组合物

本文所述的一个方面涉及药物组合物或治疗性组合物，所述药物组合物或治疗性组合物包含工程化的治疗性细菌群体(例如，如本文所述的治疗性细菌)，所述治疗性细菌(i)是非致病性的并且在待施用的受试者中共生；和(ii)对一种或多种噬菌体具有抗性。在一些实施方案中，药物组合物或治疗性组合物包含如上文题为“工程化的细菌群体”的部分中所述的工程化的细菌群体。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物或治疗性组合物中包含的治疗性细菌包含选自由以下组成的组的至少一种或多种(包括，例如，至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种)分离的、纯化的或培养的细菌：芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、粪球菌属、梭菌属、柯林斯菌属、脱硫单胞菌属、多尔氏菌属、埃希氏菌属、真杆菌属、梭杆菌属、吉米菌属、乳杆菌属、乳球菌属、念珠菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌属、瘤胃球菌属以及它们的组合。在一些实施方案中，本文所述的治疗性组合物中包含的治疗性细菌包括拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属或它们的组合。在一些实施方案中，此类细菌可以是自体的。在一些实施方案中，此类细菌可以是同种异体的。

B.用于对宿主细菌进行体内遗传操作以使其变得抗噬菌体的包含核酸的药物组合物

虽然可将包含外源治疗性细菌(例如，如本文所述的治疗性细菌)的药物组合物施用于有需要的受试者，但在一些实施方案中，可例如通过施用包含用于调节此类宿主细菌的抗性的核酸序列的药物组合物对此类受试者的对一种或多种靶噬菌体敏感的微生物群的内源性细菌进行体内遗传工程化以对此类靶噬菌体产生抗性。因此，本文提供的另一个方面涉及包含核酸序列的药物组合物，所述核酸序列用于改变有需要的受试者中的宿主非致病性和共生细菌的遗传信息，以使此类宿主细菌被遗传工程化为对靶噬菌体产生抗性。

在一些实施方案中，用于改变宿主共生细菌的遗传信息的核酸序列包含靶向一种或多种靶噬菌体的一个或多个CRISPR间隔区。在一些实施方案中，用于改变宿主共生细菌的遗传信息的核酸序列包含编码一种或多种Cas多肽(例如，本文所述的Cas多肽)的一个或多个核苷酸序列。

在一些实施方案中，用于改变宿主共生细菌的遗传信息的核酸序列包含一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个核苷酸序列编码细菌细胞表面上的噬菌体受体的一种或多种突变体。

用于递送包含核酸序列的组合物的方法是本领域已知的；本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，这样的核酸序列可通过重组噬菌体(例如，作为载体)递送，而在一些实施方案中，这样的核酸序列可通过载体、粘粒、噬菌粒或转座子递送。

在一些实施方案中，根据本公开的核酸序列可通过表达载体递送。可用于递送用于调节细菌细胞对噬菌体的抗性的核酸序列的表达载体包括但不限于基于，基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒)的病毒载体，以及源自逆转录病毒如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体和其他重组载体。

在一些实例中，载体可包含一种或多种转录和/或翻译控制元件。取决于所使用的宿主/载体系统，可在表达载体中使用任何许多适合的转录和翻译控制元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。

在一些实施方案中，载体可在宿主细胞中自主复制(附加型载体)，或者可整合到宿主细胞的基因组中，并与宿主基因组一起复制(非附加型哺乳动物载体)。整合载体通常含有至少一个与细菌染色体同源的序列，所述序列允许在载体中的同源DNA与细菌染色体之间发生重组。整合载体还可包含噬菌体或转座子序列。附加型载体或质粒是环状双链DNA环，额外的DNA片段可连接至所述环中。在一些实施方案中，当使用重组DNA技术时，能够在宿主中稳定维持的质粒被用作表达载体。

调控序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的那些以及仅在某些环境条件下指导核苷酸序列的诱导型表达的那些。细菌启动子是能够结合细菌RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)的下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区，其通常位于编码序列的5'端附近。这种转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称为操纵子的第二结构域，所述第二结构域可与RNA合成开始的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子允许负调控的(诱导型)转录，因为基因阻遏蛋白可结合操纵子，且由此抑制特定基因的转录。组成型表达可在不存在负调控元件(如操纵子)的情况下发生。另外，可通过基因激活蛋白结合序列来实现正调控，所述基因激活蛋白结合序列(如果存在的话)通常在RNA聚合酶结合序列的近端(5')。

在一些实施方案中，根据本公开的核酸序列可通过重组噬菌体递送。在一些此类实施方案中，重组噬菌体可以是噬菌粒颗粒，例如包含噬菌粒的噬菌体来源的颗粒，所述噬菌粒包含用于调节细菌细胞对靶噬菌体的抗性但不含噬菌体基因组的核酸序列(例如，如本文所述)。例如，在一些实施方案中，噬菌粒可包含编码CRISPR间隔区(例如，如本文所述的CRISPR间隔区)的核酸序列。另外或可替代地，噬菌粒可包含编码相关Cas多肽的核酸序列。

本文提供的药物组合物可包括适于口服(包括经颊和舌下)、鼻内、局部、透皮、透皮贴剂、肺部、阴道、直肠、栓剂、粘膜、全身或胃肠外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、真皮内、腹膜内、皮下和静脉内)施用或呈适于通过气溶胶化、吸入或吹入施用的形式的那些。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可包含载体和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、脂质、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、金属(例如铁、钙)、盐、维生素、矿物质、水、油(包括石油、动物来源、植物来源或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐水溶液、右旋糖和甘油水溶液、调味剂、着色剂、防粘剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂、必要时接近生理条件的其他药学上可接受的辅助物质如pH缓冲剂、张力调节剂、乳化剂、湿润剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、丙三醇、丙烯、丙二醇、水、乙醇等。

适于根据本公开使用的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括制粒剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、助流剂、抗粘附剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、树胶、包衣剂、着色剂、调味剂、分散促进剂、崩解剂、包衣剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、植物纤维素材料和滚圆剂，以及它们的任何组合。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可基本上不含防腐剂。在一些应用中，所述组合物可包含至少一种防腐剂。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可包封在合适的媒介物，例如脂质体、微球体或微粒中。可定制由聚合物或蛋白质形成的微球体以通过胃肠道直接进入血流。或者，可掺入化合物并植入微球或微球的复合物用于在几天至几个月的时间段内缓释。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可配制为无菌溶液或悬浮液。这种药物组合物可通过常规技术灭菌或可进行无菌过滤。所得水溶液可按原样包装使用，或冻干。治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的冻干制剂可包装成适合口服施用的形式，例如胶囊或丸剂。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可局部施用并且可配制成多种可局部施用的组合物，如溶液、悬浮液、洗剂、凝胶、糊剂、药棒、香膏、乳膏和软膏。此类药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可配制成直肠组合物，如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气雾剂、栓剂、果冻栓剂或保留灌肠剂，其含有常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯以及合成聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、PEG等。在组合物的栓剂形式中，可使用低熔点蜡，如脂肪酸甘油酯的混合物，任选地与可可脂组合。

在实践本文提供的治疗或使用方法时，将治疗有效量的本文所述的微生物群系合物(例如，治疗性细菌)和/或药物组合物施用于患有待治疗的微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者(例如，人受试者)。治疗有效量可根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、制剂的效力和其他因素而广泛变化。受试者可以是例如人、老年人、成人、青少年、青春期前的儿童、儿童、幼儿、婴儿或新生儿。受试者可以是患者。受试者可以是参加临床研究的个体。受试者可以是实验动物，例如哺乳动物或啮齿动物。

可使用一种或多种生理学上可接受的载体来配制药物组合物，所述载体包括赋形剂和助剂，它们有助于将微生物加工成可在药学上使用的制剂。可根据所选择的施用途径修改制剂。本文所述的药物组合物可以常规方式制造，例如通过常规混合、溶解、制粒、玻璃化、喷雾干燥、冻干、糖衣丸制造、研磨、包封、包埋、乳化或压缩过程。

在一些实施方案中，药物组合物以干燥形式制造，例如通过喷雾干燥或冻干。在一些实施方案中，将药物组合物配制为液体胶囊以维持治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的液体形式。

C.其他组合物和制剂

本文所述的组合物可配制用于涉及微生物群系的各种应用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可配制为如上所述的药物或治疗性组合物。在一些实施方案中，本文所述的组合物可包含在化妆品组合物中。在一些实施方案中，本文所述的组合物可包含在食品或饮料产品中。在一些实施方案中，本文所述的组合物可包含在营养补充剂中。

在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的组合物可配制为营养或膳食补充剂。例如，在一些实施方案中，治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)可与维生素补充剂结合。在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的那些)的组合物可配制成可咀嚼形式，如益生菌软糖。

在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，如本文所述的治疗性细菌)的组合物可掺入食物和/或饮料的形式中。可在其中掺入治疗性细菌的食品和饮料的非限制性实例包括，例如，棒、奶昔、果汁、婴儿配方食品、饮料、冷冻食物产品、发酵食物产品和培养乳制品，如酸奶、酸奶饮料、奶酪、嗜酸菌饮料和开菲尔。

在一些实施方案中，可配制包含治疗性细菌(例如，如本文所述的治疗性细菌)的组合物以用于化妆品(例如，护肤产品或彩妆产品)中。本文所述的一种或多种治疗性细菌可用于产生包含有效量的治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的化妆品制剂，以用于治疗患有或易患涉及微生物群系的皮肤病症的受试者。在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的组合物可包含在洗剂、乳膏、保湿剂、粉末等中。

在一些实施方案中，本文所述的组合物可通过合适的方法施用以递送至受试者的胃肠道的任何部分，包括口腔，口，食道，胃，十二指肠，包括十二指肠、空肠、回肠的小肠区域，以及包括盲肠、结肠、直肠和肛管的大肠区域。在一些实施方案中，本文所述的组合物可被配制用于递送至胃肠道的回肠和/或结肠区域。

在一些实施方案中，本文所述的组合物可例如通过被设计为在胃肠道中释放此类组合物的胶囊、丸剂、粉末、片剂、凝胶或液体来口服施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可通过注射施用，例如对于包含丁酸盐、丙酸盐、乙酸盐和/或短链脂肪酸的制剂而言。在一些实施方案中，本文所述的组合物可例如以乳膏、液体或贴剂的形式施加至皮肤。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以栓剂和/或灌肠剂的形式施用。在一些实施方案中，可使用施用途径的组合。

在一些实施方案中，本文所述的组合物可作为粪便移植过程的一部分施用。例如，在一些实施方案中，这样的组合物可通过管，例如鼻胃管、鼻空肠管、鼻十二指肠管、口腔胃管、口腔空肠管或口腔十二指肠管施用于受试者。在一些实施方案中，可通过结肠镜检查、内窥镜检查、乙状结肠镜检查和/或灌肠剂将组合物施用于受试者。

在一些实施方案中，配制包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的细菌组合物，使得一种或多种治疗性细菌一旦被递送至靶栖息地(例如肠道)就可复制。在一个非限制性实例中，将这种细菌组合物配制成丸剂，使得丸剂具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月的保质期。在另一个非限制性实例中，细菌组合物的储存被配制为使得其中包含的治疗性细菌一旦进入肠道就可繁殖。在一些实施方案中，可添加其他组分以有助于这种细菌组合物的保质期。在一些实施方案中，一种或多种治疗性细菌可以能够在非天然环境中存活的方式配制。例如，肠道原生的细菌可能无法在富氧环境中存活。为了克服这一限制，可将这种细菌配制成丸剂，丸剂可减少或消除对氧气的暴露。其他增强治疗性细菌的保质期的策略可包括其他微生物(例如，如果细菌聚生体包含一种或多种菌株有助于一种或多种菌株的存活的组合物)。

在一些实施方案中，将包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的细菌组合物冻干(例如，冷冻干燥)并配制为可通过任何合适的途径施用于受试者的粉末、片剂、肠溶包衣胶囊(例如，用于递送至回肠/结肠)或丸剂。这种冻干制剂可在施用前与盐水或其他溶液混合。

在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的细菌组合物被配制用于口服施用，例如作为肠溶包衣胶囊或丸剂，以用于将这种制剂的内容物递送至受试者的回肠和/或结肠区域。

在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的细菌组合物被配制用于口服施用。在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的细菌组合物被配制为用于口服施用的肠溶包衣丸剂或胶囊。在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的细菌组合物被配制用于将这种治疗性细菌递送至受试者的回肠区域。在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的细菌组合物被配制用于将这种治疗性细菌递送至受试者的结肠区域(例如，上结肠)。在一些实施方案中，包含治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的细菌组合物被配制用于将此类治疗性细菌递送至受试者的回肠和结肠区域。

在一些实施方案中，肠溶包衣可用于保护口服制剂(例如丸剂或胶囊)的内容物免受胃酸度的影响，并提供递送至回肠和/或上结肠区域的。肠溶包衣的非限制性实例包括pH敏感性聚合物(例如，eudragit FS30D)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸纤维素琥珀酸酯、羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(例如醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯)、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、虫胶、乙酸偏苯三酸纤维素、海藻酸钠、玉米蛋白、其他聚合物、脂肪酸、蜡、虫胶、塑料和植物纤维。在一些实施方案中，肠溶包衣由pH敏感性聚合物形成。在一些实施方案中，肠溶包衣由eudragit FS30D形成。

在一些实施方案中，肠溶包衣可被设计成在任何合适的pH下溶解。在一些实施方案中，肠溶包衣被设计成在大于约pH 6.5至约pH7.0的pH下溶解。在一些实施方案中，肠溶包衣被设计成在大于约pH 6.5的pH下溶解。在一些实施方案中，肠溶包衣被设计成在大于约pH 7.0的pH下溶解。在一些实施方案中，肠溶包衣可被设计成在大于约：5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5pH单位的pH下溶解。

在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，药物组合物)被配制用于将细菌群体(例如，本文所述的细菌群体)递送至结肠。此类制剂的实例包括但不限于pH敏感型组合物，更具体地，缓冲小药囊制剂或肠溶聚合物，所述肠溶聚合物在通过胃之后当pH变为碱性时释放它们的内容物。当使用pH敏感型组合物配制药物制品时，pH敏感型组合物优选是组合物分解的pH阈值在约6.8与约7.5之间的聚合物。这样的数值范围是在胃的远端部分当pH向碱性侧转变时的范围，并因此是用于递送到结肠的合适范围。

可用于将细菌组合物递送至结肠的制剂(例如，药物制剂)的另一个实施方案是通过使内容物(例如，细菌组合物)的释放延迟大约3至5小时(其对应于小肠通过时间)来确保递送至结肠的制剂。在用于延迟释放的药物制品的实施方案中，使用水凝胶作为壳。水凝胶在与胃肠液接触后水化并溶胀，从而有效释放内容物(主要在结肠中释放)。延迟释放剂量单位包括具有包衣或选择性包衣待施用的药物或活性成分的材料的含药物的组合物。此类选择性包衣材料的实例包括体内降解聚合物、可逐渐水解的聚合物、可逐渐水溶的聚合物和/或可酶降解的聚合物。各种各样的有效延迟释放的包衣材料是可获得的，并且包括例如基于纤维素的聚合物如羟丙基纤维素、丙烯酸聚合物和共聚物如甲基丙烯酸聚合物和共聚物，以及乙烯聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮。

能够递送到结肠的组合物的实例还包括特异地粘附到结肠粘膜的生物粘附性组合物(例如，美国专利号6,368,586的说明书中描述的聚合物)，和并入了蛋白酶抑制剂以保护特定的生物药物制品在胃肠道中不会由于蛋白酶的活性而分解的组合物。

能够递送至结肠的系统的另一个实例是通过压力变化将组合物递送到结肠的系统，方式是通过利用由在胃的远端部分的细菌发酵中的气体产生引起的压力变化释放内容物。此类系统没有特别限制，并且其更具体的实例是内容物分散在栓剂基质中并且用疏水性聚合物(例如，乙基纤维素)包衣的胶囊。

能够递送到结肠的系统的另一个实例是将组合物递送到结肠的系统，所述系统被结肠中存在的酶(例如，碳水化合物水解酶或碳水化合物还原酶)特异性地分解。此类系统没有特别限制，且其更具体的实例包括使用食品组分如非淀粉多糖、直链淀粉、黄原胶和偶氮聚合物的系统。

在一些实施方案中，治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)被配制为孢子群体。可通过本文所述的任何合适的途径施用含孢子制剂。口服施用的含孢子制剂可在胃的低pH环境中存活。所采用的孢子的量可以是，例如，整个制剂的约1％w/w至约99％w/w。

在一些实施方案中，制剂包含一种或多种重组细菌或已进行了遗传修饰的细菌。在其他实施方案中，一种或多种细菌未经修饰或重组。在一些实施方案中，制剂包含可被调控的细菌，例如，包含操纵子或启动子以控制细菌生长的细菌。可使用任何合适的方法，包括重组方法来产生、生长或修饰细菌。

可为受试者定制制剂。定制制剂可包含例如益生元、益生菌、抗生素或本文所述的活性剂的组合。包括例如年龄、性别和体重在内的受试者特有的数据可与分析结果相结合，以提供针对受试者定制的治疗剂。例如，可向相对于年龄和性别匹配的健康受试者的亚群体被发现特定噬菌体含量高的受试者的微生物群系提供治疗和/或美容制剂，所述制剂包含靶向鉴定的噬菌体的分离的或富集的抗噬菌体的细菌群体。

本文提供的组合物可在任何合适的温度下储存。制剂可储存在冷藏库中，例如，在约-80℃、约-20℃、约-4℃或约4℃的温度下。在一些实施方案中，制剂可被制备用于约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约12℃、约14℃、约16℃、约20℃、约22℃或约25℃的储存温度。在一些实施方案中，储存温度介于约2℃至约8℃之间。在一些实施方案中，微生物群系合物(例如，包含本文所述的治疗性细菌)在低温例如约2℃至约8℃下的储存可保持微生物存活并提高组合物的效率，例如，当存在于液体或凝胶制剂中时。在一些实施方案中，在低于0℃的冷冻温度下与冷冻保护剂一起储存可进一步延长稳定性。

本文所述的组合物的pH可取决于应用(例如，递送至肠道对比递送至皮肤)在约3至约12的范围内。这种组合物的pH可以是例如约3至约4、约4至约5、约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9、约9至约10、约10至约11或约11至约12pH单位。组合物的pH可以是例如约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12pH单位。组合物的pH可以是例如至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11或至少12pH单位。组合物的pH可以是例如至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11或至多12pH单位。如果pH超出配方设计师所需的范围，则可通过使用足量的药学上可接受的酸和碱来调节pH。在一些实施方案中，组合物的pH介于约4与约6之间。

D.任选的添加剂

在一些实施方案中，本文所述的组合物可包含益生元。在一些实施方案中，益生元可以是或包括菊糖。菊糖可充当细菌制剂的能量源。

在一些实施方案中，本文所述的组合物可包含一种或多种活性剂或治疗剂。示例性活性剂或治疗剂可包括但不限于抗生素、益生元、益生菌、聚糖(例如，作为可限制特定细菌/病毒与肠壁结合的诱饵)、噬菌体、微生物等。

在一些实施方案中，本文所述的组合物可包含一种或多种用于增强细菌制剂的稳定性和/或存活的剂。此类稳定剂的非限制性实例包括遗传元件、甘油、抗坏血酸、脱脂乳、乳糖、吐温、藻酸盐、黄原胶、角叉菜胶、甘露醇、棕榈油、聚-L-赖氨酸(POPL)以及它们的组合。

E.示例性剂型

待施用的药物组合物的适当量、治疗次数和单位剂量可根据受试者和/或受试者的疾病状态而变化。

本文所述的药物组合物可呈适合单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，本文所述的药物制剂可分成含有适量的一种或多种微生物群系组合物的单位剂量。单位剂量可呈含有离散量的制剂的包装形式。非限制性实例是小瓶或安瓿中的液体。水性悬浮液组合物可包装在单剂量不可重新封闭的容器中。所述组合物可呈多剂量形式。多剂量可重新封闭的容器可例如与防腐剂组合使用。用于胃肠外注射的制剂可以单位剂型来呈现，例如，在安瓿或多剂量容器中，其中添加防腐剂。

在一些实施方案中，剂量可呈固体、半固体或液体组合物的形式。适于根据本公开使用的剂型的非限制性实例包括饲料、食品、丸剂、锭剂、液体、酏剂、气雾剂、吸入剂、喷雾剂、粉末、片剂、丸剂、胶囊、凝胶、凝胶片、纳米悬浮液、纳米颗粒、微凝胶、栓剂锭剂、水性或油性悬浮液、软膏、贴剂、洗剂、洁齿剂、乳液、乳膏、滴剂、可分散粉末或颗粒剂、硬胶囊或软胶囊中的乳液、糖浆、植物性药物、营养药品、膳食补充剂以及它们的任何组合。

治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)可以合适的浓度存在于药物组合物中。治疗性细菌的浓度可以是例如约10¹至约10¹⁸个菌落形成单位(CFU)。治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的浓度可以是例如至少10¹、至少10²、至少10³、至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰、至少10¹¹、至少10¹²、至少10¹³、至少10¹⁴、至少10¹⁵、至少10¹⁶、至少10¹⁷或至少10¹⁸CFU。治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的浓度可以是例如至多10¹、至多10²、至多10³、至多10⁴、至多10⁵、至多10⁶、至多10⁷、至多10⁸、至多10⁹、至多10¹⁰、至多10¹¹、至多10¹²、至多10¹³、至多10¹⁴、至多10¹⁵、至多10¹⁶、至多10¹⁷或至多10¹⁸CFU。在一些实施方案中，治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)的浓度是约10⁸CFU至约10⁹CFU。

本文所述的药物组合物可与合适的治疗有效浓度的益生元一起配制。例如，益生元的治疗有效浓度可以是至少约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约125mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml。例如，益生元的治疗有效浓度可以是至多约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约125mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml。例如，益生元的治疗有效浓度可以是约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约125mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物例如每天施用1、2、3、4、5次或更多次。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可例如每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次或以其他适当的间隔施用以治疗疾患。

F.药盒

本文所述的组合物可包装为药盒。在一些实施方案中，药盒包括关于组合物的施用/使用的书面说明书。例如，书面材料可以是标签。书面材料可提出施用的条件方法。说明书为受试者和监督医师提供了最佳指导，以通过施用疗法获得最佳临床结果。书面材料可以是标签。在一些实施方案中，标签可由监管机构，例如美国食品与药品管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)或其他监管机构批准。

III.示例性用途

包括本文提供的治疗性细菌、组合物和方法的技术可用于治疗和/或预防微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患。因此，本文提供的技术适用于患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者。在一些实施方案中，本文提供的技术适用于患有或易患肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者。

在一些方面，提供了包括以下步骤的方法：使患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者暴露于治疗性细菌(例如，本文所述的治疗性细菌)群体或本文所述的组合物(包括例如药物组合物、化妆品组合物、食品或饮料或营养补充剂)。

在一些实施方案中，暴露于有需要的受试者(例如，患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者)的治疗性细菌各自包含靶向一种或多种噬菌体的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)间隔区。在一些实施方案中，暴露于有需要的受试者(例如，患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者)的治疗性细菌各自包含细菌细胞表面上的噬菌体受体的至少一种或多种突变体。

在一些实施方案中，将此类治疗性细菌群体暴露于患有或易患肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者。示例性肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患包括但不限于炎症性肠病(IBD)或肠易激综合征、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、免疫疗法相关结肠炎。在一些此类实施方案中，暴露于患有或易患肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者的治疗性细菌对一种或多种噬菌体具有抗性，所述噬菌体可以是或包括有尾噬菌体目。

在一些实施方案中，使有需要的受试者暴露于治疗性细菌群体(例如，如本文所述的治疗性细菌群体)的步骤包括向这样的受试者施用包含治疗性细菌群体(例如，如本文所述的治疗性细菌群体)的组合物。

在一些实施方案中，使有需要的受试者暴露于治疗性细菌群体(例如，如本文所述的治疗性细菌群体)的步骤包括向这样的受试者施用包含用于改变所述受试者中的宿主共生细菌的基因组的核酸序列的组合物，以使所述宿主共生细菌被遗传工程化为对目标噬菌体具有抗性。在一些实施方案中，用于改变宿主共生细菌的基因组的核酸序列包含靶向一种或多种靶噬菌体的一个或多个CRISPR间隔区。

在一些实施方案中，使有需要的受试者暴露于治疗性细菌(例如，如本文所述的治疗性细菌)群体的步骤包括向这样的受试者施用本文所述的任一种组合物(包括例如，药物组合物、化妆品组合物、食品或饮料或营养补充剂)。

在一些实施方案中，在用抗微生物剂如抗生素治疗之前、期间和/或之后施用治疗性细菌群体或本文所述的组合物(包括例如，药物组合物、化妆品组合物、食品或饮料或营养补充剂)。例如，在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物可在用抗生素治疗之前和/或之后至少约1小时、2小时、5小时、12小时、1天、3天、1周、2周、1个月、6个月或1年施用。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物可在用抗生素治疗之前和/或之后至多1小时、2小时、5小时、12小时、1天、3天、1周、2周、1个月、6个月或1年施用。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物(包括例如，药物组合物、化妆品组合物、食品或饮料或营养补充剂)在用抗生素治疗之后施用。例如，在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物可在整个抗生素方案或疗程完成后施用。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物(包括例如，药物组合物、食品或饮料或营养补充剂)在受试者食物摄入之前、期间和/或之后施用。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物与受试者的食物摄入一起施用。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物与食物摄入一起(例如同时)施用。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物(包括例如，药物组合物、食品或饮料或营养补充剂)在受试者食物摄入之前施用。在一些实施方案中，当在食物摄入之前施用时，本文所述的治疗性细菌群体或组合物在治疗细菌疾患(例如，与微生物群系功能障碍相关的细菌疾患)方面可能更有效或强效。例如，在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物可在受试者食物摄入之前至少约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时或约1天施用。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物可在受试者食物摄入之前至多约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时或约1天施用。

在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物(包括例如，药物组合物、食品或饮料或营养补充剂)在受试者食物摄入之后施用。在一些实施方案中，当在食物摄入之后施用时，本文所述的治疗性细菌群体或组合物在治疗细菌疾患(例如，与微生物群系功能障碍相关的细菌疾患)方面更有效或强效。例如，在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物可在受试者食物摄入之后至少约1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时或1天施用。在一些实施方案中，本文所述的治疗性细菌群体或组合物可在受试者食物摄入之后至多约1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时或1天施用。

治疗性细菌的多个属或种可以任何顺序或同时施用。如果同时，则治疗性细菌的多个属或种可以单一、统一的形式或以多种形式，例如，以多个单独的丸剂形式提供。在一些实施方案中，治疗性细菌的多个属或种可一起或单独包装在单个包装或多个包装中。在一些实施方案中，可以多个剂量给予治疗性细菌的一种或全部属或种。如果不是同时，则多个剂量之间的时间可能变化多达大约一个月。

本文所述的组合物可在与微生物群系功能障碍相关的疾病或疾患发生之前、期间或之后施用，并且施用本文所述的此类组合物的时间可变化。例如，在一些实施方案中，本文所述的组合物可用作预防剂并且可连续地施用于具有与微生物群系功能障碍相关的疾患或疾病倾向的受试者，以降低此类疾病或疾患发生的可能性。在一些实施方案中，本文所述的组合物可在症状发作期间施用或症状发作之后尽快施用于受试者。在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，包含治疗性细菌)的施用可在一种或多种症状发作的前48小时内、一种或多种症状发作的前24小时内、一种或多种症状发作的前6小时内或一种或多种症状发作的3小时内开始。在一些实施方案中，初始施用可通过任何可行的途径，如使用本文所述的组合物通过本文所述的任何途径进行。在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，包含治疗性细菌)可在检测到或怀疑与微生物群系功能障碍相关的疾病或疾患发作后尽快施用，并施用适合治疗这种疾病或疾患的时间长度，例如约1个月至约3个月。每个受试者的治疗时间可能会有所不同。

本文所述的组合物和/或方法可用于治疗和/或预防微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，本文所述的组合物和/或方法通常适用于动物，特别是人和具有经济意义的家畜。

在一些实施方案中，可利用本文所述的组合物和/或方法的微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患是与异常肠道微生物群落的存在相关的慢性病症。此类病症包括但不限于以下类别的那些疾患：

-胃肠道疾病，包括肠易激综合征或痉挛性结肠、功能性肠病(FBD)，包括便秘型FBD、疼痛型FBD、上腹部FBD、非溃疡性消化不良(NUD)、胃食管反流、炎症性肠病，包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎、胶原性结肠炎、显微镜下结肠炎、慢性艰难梭菌感染、伪膜性结肠炎、粘液性结肠炎、抗生素相关结肠炎、特发性或单纯性便秘、憩室病、AIDS肠病、小肠细菌过度生长、乳糜泻、息肉病大肠杆菌、结肠息肉、慢性特发性假性梗阻综合征；

-特定病原体(包括细菌、病毒、真菌和原生动物)的慢性肠道感染；

-病毒性胃肠病症，包括病毒性胃肠炎、诺瓦克病毒性胃肠炎、轮状病毒性胃肠炎、AIDS相关胃肠炎；

-肝脏病症，如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、脂肪肝或隐源性肝硬化；

-风湿性病症，如类风湿性关节炎、非类风湿性关节炎、非类风湿因子阳性关节炎、强直性脊柱炎、莱姆病和赖特综合征；

-免疫介导的疾病，如肾小球肾炎、溶血性尿毒症综合征、青少年糖尿病、混合性冷球蛋白血症、多动脉炎、家族性地中海热、淀粉样变性、硬皮病、系统性红斑狼疮和白塞氏综合征；

-自身免疫性病症，包括系统性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、斯耶格伦综合征、溶血性尿毒症综合征或硬皮病；

-神经系统综合征，如慢性疲劳综合征、偏头痛、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、重症肌无力、格林-巴利综合征、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病和其他变性病症；

-精神病症，包括慢性抑郁症、精神分裂症、精神病症、躁狂抑郁症；

-退行性病症，包括Asbergers综合征、雷特综合征、注意力缺陷多动障碍(ADHD)和注意力缺陷障碍(ADD)；

-退行性病症，自闭症；

-婴儿猝死综合征(SIDS)、神经性厌食症；

-皮肤疾患，如慢性荨麻疹、痤疮、疱疹样皮炎和血管炎病症。

在一些实施方案中，可利用本文所述的组合物和/或方法的微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患是与哺乳动物宿主的胃肠道中存在异常或异常微生物群落分布相关的慢性病症。示例性肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患包括但不限于炎症性肠病(IBD)或肠易激综合征、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、免疫相关结肠炎(例如，已患结肠炎的免疫治疗患者)。在一些实施方案中，施用了本文所述的治疗性细菌的受试者可先前施用了益生菌疗法(包括例如，正在接受益生菌疗法或已经遭受益生菌疗法失败的患者)、粪便微生物群移植(FMT)(包括例如，正在接受FMT或已经遭受FMT失败的患者)和/或免疫疗法(例如，结肠炎相关免疫疗法)。

在一些实施方案中，本文所述的组合物可与另一种疗法组合施用，所述另一种疗法包括例如抗生素疗法、免疫疗法、化学疗法、放射疗法、抗炎剂、抗病毒剂、抗微生物剂、抗真菌剂、益生菌疗法、粪便微生物群移植以及它们的组合。在一些实施方案中，本文所述的组合物可在另一种疗法(例如，本文所述的另一种疗法)之前施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可在另一种疗法(例如，本文所述的另一种疗法)之后施用。例如，在一些实施方案中，可在用本文所述的组合物治疗之前施用短期抗生素，例如以清除源自肠腔的组织侵入性病原体。例如，在克罗恩氏病的治疗中，在一些实施方案中，在施用本文所述的组合物之前可能需要抗结核治疗六至十二周，以便清除肠道并将菌群内容物交换为预定菌群。

在一些实施方案中，本文所述的组合物的施用可先于例如结肠清洁方法，如结肠灌洗/水疗法、抗生素疗法、灌肠法、施用泻药、膳食补充剂、膳食纤维、酶和镁。

实施方案

实施例1.微生物群系的噬菌体和细菌的体外共培养

如本文所述，本公开涵盖以下见解：噬菌体(或噬菌体)可存在于消耗有益细菌群体的某些人体器官或组织(例如，肠道)中。根据这一见解，噬菌体级分从健康个体的粪便样品中分离出来，并添加质源自同一个体的肠道微生物群系的细菌培养物中。然后进行16srRNA测序以表征添加噬菌体后细菌群落组成的变化。参见例如，图1A-1B。本发明人发现，噬菌体的添加导致已知对维持健康重要的非致病性共生细菌的消耗。特别地，发现长双歧杆菌和闪烁梭菌在噬菌体添加后被消耗(图2B-2C)。因此，鉴定能够消耗此类细菌的噬菌体证实了本公开所提供的见解，即出人意料地，噬菌体可驱动生态失调并直接感染和消耗益生菌疗法。这种方法可适用于确定噬菌体对体内有益细菌群体的影响，例如，通过从个体的粪便样品中分离噬菌体级分并将其添加至小鼠中，所述小鼠被源自同一个体或其他个体的肠道微生物群系培养的细菌定殖，并表征噬菌体对细菌群落的影响。

还发现感染梭状芽孢杆菌的噬菌体在IBD患者群体中比在健康群体中更普遍(图4)。

以下是梭状芽孢杆菌细菌的示例性列表，针对所述细菌鉴定了感染患有IBD的患者肠道中存在的这些菌种/菌株的噬菌体：

示例性方法：

将粪便样品在50ml锥形容器中的12ml无菌20％甘油/1X PBS中均质化，并将连续稀释液涂铺在0.1％粘蛋白BHI琼脂上。将板刮擦，在PBS中稀释。将5ul的稀释样品添加至5ml的0.1％BHI培养基中。将来自同一样品的2ul分离的病毒样颗粒(VLP)添加至板培养物中。作为阳性对照，将大肠杆菌和T7噬菌体添加至培养物亚群中。使培养物在厌氧条件下生长72小时。然后将样品离心并准备好进行测序。

实施例2.用于鉴定存在于患有炎症性肠病的额患者中的噬菌体及其细菌宿主的 计算方法

基于CRISPR的方法可用于预测个体中存在的细菌靶标或噬菌体宿主。分析了从广泛范围的肠道细菌中提取的CRISPR间隔区序列的精选列表。Gregory等人“The human gutvirome database”bioRxiv 655910(2019年5月)。细菌群体中给定CRISPR间隔区序列的存在提供了还有所述序列的噬菌体感染所述细菌的证据。此外，可通过将病毒序列与来自已知细菌宿主的CRISPR间隔区序列相匹配来鉴定存在于个体中攻击非致病性共生细菌的噬菌体的推定非致病性共生细菌宿主和/或噬菌体。参见例如，图3。此类信息可用于开发抗噬菌体的非致病性共生细菌。

实施例3.工程化示例性抗噬菌体的非致病性共生细菌

工程化的抗噬菌体的非致病性共生细菌在体外阻断感染性肠道噬菌体。

如实施例1和2中所述，本文呈现的数据表明感染性噬菌体(例如，存在于肠道中)消耗微生物群系中的细菌，并且靶向有益细菌的噬菌体在患有IBD的患者中显著更普遍。在这些发现的基础上，共生细菌被工程化为对靶向肠道细菌的感染性噬菌体具有抗性。然后评估这些细菌在体外和体内抵抗噬菌体增殖的功效。

抗噬菌体的细菌基于噬菌体的细菌宿主的鉴定和相应的噬菌体序列信息进行工程化。在一些实施方案中，将与一种或多种鉴定的噬菌体匹配的一个或多个序列引入非致病性共生细菌菌株的CRISPR(例如，CRISPR-Cas)基因座中。调节细胞中针靶核酸的抗性的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号10,066,233。阅读本公开的本领域技术人员将因此理解此类方法和本领域已知的其他方法(包括例如，CRISPR-Cas技术)可用于工程化非致病性和共生细菌的治疗性组合物，所述细菌对一种或多种噬菌体具有抗性(例如，如本文所述)。在一些实施方案中，可通过在目标非致病性和共生细菌菌株中存在的CRISPR阵列(例如，内源性CRISPR阵列或外源性/异源性CRISPR阵列)内插入一个或多个靶噬菌体序列作为CRISPR间隔区来对抗噬菌体的非致病性和共生细菌进行工程化。例如，在一些实施方案中，可使用实施例1和2中描述的技术来鉴定感染给定目标非致病性和共生细菌菌株的噬菌体。在一些实施方案中，可通过对细菌菌株的基因组的相关部分(包括例如，在一些实施方案中整个基因组)进行测序来鉴定非致病性和共生细菌菌株中的CRISPR-Cas基因座序列。在一些此类实施方案中，表征了被鉴定的CRISPR-Cas系统识别的原型间隔区相邻基序(PAM)序列。参见例如，Mendoza和Trinh，Biotechnol J.(2018)13:e1700595；和Gleditzsch等人，RNA Biol.(2019)16:504-517。合适的间隔区序列通常选自噬菌体的基因组，所述噬菌体被鉴定为感染给定目标非致病性和共生细菌菌株。在一些实施方案中，合适的间隔区序列是或包含保守序列。在一些实施方案中，这样的保守序列可存在于噬菌体基因中(例如，存在于噬菌体的不同属、种和/或菌株中的噬菌体基因)。在一些实施方案中，合适的间隔区序列可以是或包含在PAM序列上游至多8个核苷酸的序列。然后将包含侧接两个重复元件(例如，CRISPR重复序列)的合适间隔区序列或由其组成的CRISPR单元引入目标非致病性和共生细菌菌株中。在一些实施方案中，可将间隔区序列引入非致病性和共生细菌的内源性CRISPR-Cas阵列中。在一些实施方案中，间隔区序列可反式引入与内源性Cas机制相容的合成阵列上(例如基因组上的其他地方，或质粒上)。在一些实施方案中，间隔区序列可在与外源性cas基因共同递送的合成阵列中反式引入。

在一些实施方案中，可使用多个间隔区序列来靶向每个不同的噬菌体群体。因此，在一些实施方案中，将靶向单个噬菌体群体的至少一个或多个(包括例如，至少两个或更多个)间隔区序列引入非致病性共生细菌的CRISPR基因座中。间隔区多样性可增强针对噬菌体感染的保护。因此，在一些此类实施方案中，至少两个或更多个间隔区序列是相同的，而在一些此类实施方案中，至少两个或更多个间隔区序列是不同的。

在一些实施方案中，可将靶向不同噬菌体群体或家族的多个(例如，至少两个、至少三个或更多个)间隔区序列引入单一非致病性和共生细菌中。这种工程化的非致病性和共生细菌可用于提供针对多个不同噬菌体群体或家族的抗性。

在一些实施方案中，引入非致病性共生细菌的CRISPR基因座中的间隔区序列为20-50bp长。在一些实施方案中，引入非致病性共生细菌的CRISPR基因座(例如，CRISPR-Cas基因座)中的间隔区序列选自被鉴定为与给定细菌宿主中鉴定的CRISPR间隔区序列匹配的序列，和/或也可选自噬菌体序列。在一些实施方案中，选择在各个噬菌体群体中(或跨群体)保守的序列。

在一些实施方案中，本文所述的非致病性共生细菌可在维持健康中发挥关键作用和/或可用作治疗多种慢性疾患的疗法。

用于遗传工程化的工具在本领域是众所周知的；因此，本领域技术人员将理解，此类工具可用于将非致病性共生细菌工程化为如本文所述产生噬菌体抗性。如本领域技术人员将理解的，在一些实施方案中，具有高效无标记基因编辑优势的基于CRISPR/Cas9的基因组编辑工具可用于工程化抗噬菌体的非致病性共生细菌。关于与使用CRISPR-Cas系统进行CRISPR-Cas鉴定和/或间隔区的表征、选择和/或工程化和/或基因组编辑的方法有关的信息，参见例如，Barrangou等人Science(2007)315:1709-1712；Deveau等人Journal ofBacteriology(2008)190:1390-1400；Barrangou和Marraffini，Mol Cell(2014)54:234-244；Crawley等人CRISPR J.(2018)1:171-181；Crawley等人Scientific Reports(2018)8:11544；以及Hidalgo-Cantabrana等人PNAS(2019)116:15774-15783出于本文所述的目的，本文引用的每篇参考文献的内容以引用的方式整体并入本文。

可使用本领域已知的方法在体外评估工程化抗噬菌体的非致病性共生细菌。例如，在一些实施方案中，可通过测量这种工程化细菌在感染性噬菌体存在下的存活率来在体外评估工程化的抗噬菌体的非致病性共生细菌。感染性噬菌体可从被鉴定存在感染性噬菌体的患者粪便样品的病毒级分中收集。然后对收集的病毒级分进行过滤灭菌。将来自过滤的病毒级分的噬菌体添加至(i)一种或多种工程化抗噬菌体的非致病性共生细菌菌株或(ii)作为对照的野生型(WT)菌株的培养物(例如，单一培养物)中。评估在噬菌体存在下细菌菌株的生长，例如，使用噬斑测定。

单一培养物中的生长可能不同于细菌的混合细菌培养物(例如来自肠道的微生物群系)中的生长。因此，在一些实施方案中，可在感染性噬菌体存在下在混合细菌培养物中评估工程化抗噬菌体的非致病性共生细菌的存活。

实施例4.体内工程化示例性抗噬菌体的共生细菌

为了评估工程化抗噬菌体的细菌对抗噬菌体捕食和促进体内定殖的能力，使用了人微生物群相关(HMA)小鼠模型。用抗生素预处理的小鼠被粪便样品定殖，其中感染性噬菌体被鉴定为针对靶非致病性共生细菌宿主，从而使小鼠稳定定殖人微生物群。然后将工程化抗噬菌体的非致病性共生细菌(例如，在体外测定中表现出稳健功效的非致病性共生细菌，例如，如上文实施例3中所述)或WT菌株添加至HMA小鼠。可以每周时间间隔分别通过16srRNA测序和qPCR监测整个微生物群和工程抗噬菌体的非致病性共生菌株的组成持续特定时间段(例如，持续28天的时间段)。

在一些实施方案中，工程化抗噬菌体的细菌在无特定病原体(SPF)小鼠模型中进行评估。例如，将(i)靶向目标非致病性和共生细菌的噬菌体和(ii)包含抗噬菌体的非致病性和共生细菌(例如，如本文所述)或由其组成的治疗性组合物引入SPF小鼠的肠道中。例如，使用与工程化细菌菌株互补的引物通过qPCR评估噬菌体和抗噬菌体的细菌菌株的水平。

还分离了来自小鼠粪便样品的噬菌体，并对此类样品进行测序，以评估在抗噬菌体的非致病性共生细菌菌株存在下靶噬菌体的复制是否减少。

实施例5.使用示例性抗噬菌体的梭菌属来治疗炎症性肠病(IBD)。

如上文所论述，本发明人发现攻击梭状芽孢杆菌中的细菌的噬菌体在患有IBD的患者中显著更普遍。此类梭状芽孢杆菌细菌主要包括许多被证明具有抗炎益处的菌种。例如，据先前报告，许多此类梭菌属菌种促进小鼠中结肠调控性T(Treg)细胞的诱导，并且口服接种17种梭菌属菌株的混合物减轻了结肠炎小鼠模型中的疾病。目前的发现表明，噬菌体驱动的抗炎梭菌属菌种的减少可促进或促成易感个体中炎症和IBD疾病的发展。

为了评估抗噬菌体的细菌在IBD小鼠模型中治疗生态失调和疾病的能力，将来自健康个体或IBD患者的粪便样品的细菌和病毒级分分离。然后用来自健康个体的细菌级分定殖用抗生素预处理的小鼠，例如通过经口管饲。然后将小鼠用从健康个体或患有IBD的个体分离的噬菌体和一种或多种抗噬菌体或WT非致病性共生细菌菌株口服接种。随时间推移跟踪抗噬菌体细菌和WT细菌的水平，例如使用qPCR，并且可通过体重、潜血测量和/或炎症标志物来监测疾病状态。

还可使用直接用一个或多个患有IBD的患者的粪便样品定殖的小鼠来评估抗噬菌体的非致病性共生细菌的功效。施用WT和抗噬菌体的非致病性共生细菌，并随时间推移跟踪此类细菌的水平，然后可通过体重、潜血测量和/或炎症标志物监测疾病状态。

实施例6.工程化抗噬菌体的长双歧杆菌

在一些实施方案中，存在于人肠道中的长双歧杆菌可含有I-C型CRISPR系统。在一些实施方案中，与肠道中存在的消耗这些细菌的靶噬菌体匹配的间隔区序列可被引入这些CRISPR阵列中以赋予抗性。在体外和体内存在靶噬菌体的情况下，可评估抗噬菌体的细菌的改进的生长。

实施例7.工程化抗噬菌体的乳杆菌属

乳杆菌属的几种共生菌种已被证明对人类健康重要，包括但不限于加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌。在一些实施方案中，可使用实施例3中描述的方法对乳杆菌属的抗噬菌体的菌株进行工程化以抵抗存在于人肠道微生物群系中的噬菌体。包含此类工程化抗噬菌体的菌株的治疗性组合物可用于施用于受影响的个体以治疗微生物群系功能障碍相关疾病。

等效物和范围

在权利要求中，除非指明相反情况或另外从上下文明显看出，否则冠词诸如“一个/种(a/an)”和“所述(the)”可意指一个/种或多于一个/种。除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产物或方法，那么认为包括在组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或描述得到了满足。本发明包括其中所述组中只有一个成员存在于、被用于给定产品或方法中或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或所有的组成员存在于、被用于或以其他方式与给定的产品或方法相关的实施方案。

此外，本发明包括所有的变化、组合和排列，其中一个或多个限制、要素、条款以及描述性术语从所列出的权利要求中的一项或多项被引入到另一项权利要求。例如，任何从属于另一项权利要求的权利要求可被修改以包括在任一其他从属于同一基本权利要求的权利要求中所见的一个或多个限制。在要素被呈现为列表例如以Markush组格式时，所述要素的每个子组也被公开，并且任何一个或多个要素可从所述组移除。应理解，一般来说，在本发明或本发明的方面被称作包含特定要素和/或特征的情况下，本发明或本发明方面的某些实施方案由此类要素和/或特征组成或者基本上由此类要素和/或特征组成。为简单起见，那些实施方案在本文中并非都具体陈述。还应注意，术语“包含”和“含有”旨在为开放的并且容许包括另外的要素或步骤。在给出范围时，端点被包括在内。此外，除非另外指示或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则在本发明的不同实施方案中，表述为范围的值可假定为任何特定值或所述范围内的子范围，到所述范围的下限的单位的十分之一，除非在上下文中另有明确规定。

本领域技术人员将会认识到或利用常规实验即可确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。应当了解的是，除非另外指明或除非对于本领域的普通技术人员来说显然将会出现矛盾或不一致，否则本发明涵盖了所有变化、组合以及置换，其中来自所列权利要求中的一项或多项的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等被引入从属于同一基础权利要求(或相关的任何其他权利要求)的另一权利要求中。此外，还应当了解的是，本发明的任何实施方案或方面可以明确地被排除在权利要求之外，无论在说明书中是否叙述了特定的排除。本发明的范围并非旨在限于以上描述，而是如以下权利要求所阐述。

Claims (22)

1.一种方法，所述方法包括以下步骤：

使患有或易患微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患的受试者暴露于治疗性细菌群体，所述治疗性细菌(i)是非致病性的并且在所述受试者中共生和(ii)对一种或多种靶噬菌体具有抗性。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗性细菌各自包含靶向所述一种或多种靶噬菌体的至少一个成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)间隔区。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述治疗性细菌各自包含用于靶噬菌体-受体结合蛋白的所述治疗性细菌的一种或多种受体中的突变。

4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述微生物群系是肠道微生物群系。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患是炎症性肠病(IBD)或肠易激综合征。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患是克罗恩氏病。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患是溃疡性结肠炎。

8.如权利要求4所述的方法，其中所述肠道微生物群系功能障碍相关疾病、病症或疾患是免疫疗法相关结肠炎。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶噬菌体与所述微生物群系功能障碍相关疾病相关。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述一种或多种噬菌体是温和或非裂解性噬菌体。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述一种或多种噬菌体是或包括尾噬菌体目。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述治疗性细菌是或包括拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属或它们的组合。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述受试者已施用了益生菌疗法、粪便微生物群移植(FMT)和/或免疫疗法(例如，结肠炎相关免疫疗法)。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述暴露步骤包括向所述受试者施用包含所述治疗性细菌群体的组合物。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述暴露步骤包括向所述受试者施用包含编码所述CRISPR间隔区的核酸序列的组合物，其中所述组合物被递送至所述受试者的宿主共生细菌以产生所述治疗性微生物。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述核酸由重组噬菌体递送。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述核酸通过载体递送。

18.一种治疗性组合物，所述治疗性组合物包含工程化的治疗性细菌群体，所述治疗性细菌(i)是非致病性的并且在待施用的受试者中共生和(ii)对一种或多种靶噬菌体具有抗性。

19.如权利要求18所述的治疗性组合物，其中所述治疗性细菌各自包含靶向所述一种或多种靶噬菌体的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)间隔区。

20.如权利要求18所述的治疗性组合物，其中所述治疗性细菌被遗传工程化为表达靶向所述一种或多种靶噬菌体的CRISPR间隔区。

21.如权利要求18-20中任一项所述的治疗性组合物，其中所述治疗性细菌是或包括拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、艾克曼菌属或它们的组合。

22.如权利要求18-21中任一项所述的治疗性组合物，其中用于靶噬菌体-受体结合蛋白的所述治疗性细菌的一种或多种受体被突变，以使得所述治疗性细菌对所述靶噬菌体具有抗性。

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