CN114917217A - 磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用 - Google Patents

磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型磷酸二酯酶4抑制剂ZL‑n‑91在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。利用在体外细胞学实验和体内动物学实验表明本发明所述磷酸二酯酶4抑制剂ZL‑n‑91可以显著抑制三阴性乳腺癌的增殖，揭示该磷酸二酯酶4抑制剂ZL‑n‑91有望治疗三阴性乳腺癌，具有良好的开发应用前景。

Description

磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备治疗三阴性乳腺癌的药物 中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤生物学领域，涉及一种磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是全球女性高发的恶性肿瘤之一。2020年，乳腺癌成为全球新发病例最多的癌症，约有226万例，其中中国新增乳腺癌患者约42万，占全球新增乳腺癌病例的18.5％。在乳腺癌病例中，又以三阴性乳腺癌(TNBC)发病最为恶劣。TNBC具有独特的生物学及临床特征,较其他亚型的乳腺癌有更强的侵袭性,而且无病生存期较短,软组织及内脏转移率高,5年内死亡率较非TNBC患者高。目前治疗乳腺癌主要以ER，PR，HER2为靶点，但TNBC患者因为缺少靶点，不能从内分泌治疗及靶向治疗中获益，导致其预后差、复发转移率及死亡率高，因此优化目前临床使用的治疗手段、寻找新的有效治疗TNBC方法具有重要意义。
磷酸二酯酶(简称PDEs)具有水解细胞内第二信使cAMP或cGMP的功能，从而影响这些第二信使所介导的信号通路，调节细胞功能。PDEs共分为11个亚型，其中磷酸二酯酶4(PDE4)特异性水解cAMP。PDE4主要分布于各种炎性细胞内，包括肥大细胞、巨噬细胞淋巴细胞、上皮细胞等，参与了促进单核细胞与巨噬细胞活化、中性粒细胞浸润、血管平滑肌的增殖、血管扩张以及心肌收缩等相关生理病理过程，对中枢神经系统功能、心血管功能、炎症/免疫系统、细胞黏附等都有影响。研究显示，PDE4抑制剂(PDE4i)具有抗炎、抗过敏、抗血小板活化作用。其作用机制主要涉及：1)抑制多种炎症介质/细胞因子的释放，能够抑制IL-4、IL-5基因的表达；2)抑制白细胞的激活(如呼吸爆发)，抑制白细胞游走；3)抑制细胞粘附因子的表达或上调；4)诱导产生具有抑制活性的细胞因子，如IL-6；5)诱导细胞凋亡；6)刺激内源性激素和儿茶酚胺类物质的释放。已经开发或正在开发的PDE4抑制剂针对的疾病主要针对慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、炎症性肠疾病、关节炎等。
现有的PDE4抑制剂主要有咯利普兰(Rolipram)、西洛司特(Cilomilast)、罗氟司特(Roflumilast)等。由于Rolipram和Cilomilast引发头晕、头痛和恶心、呕吐等胃肠道不良反应，影响了药物在临床中推广应用。导致胃肠道不良反应的可能原因之一是PDE4抑制剂特异性差，从而中度选择性地抑制了整个PDE家族。如Cilomilast对PDE4的Ki＝92nM，仅是PDE1、2、3、5的Ki的500到1000倍。因此使用较高剂量Cilomilast会与其他PDE家族成员发生作用从而产生副作用。事实上，大多数PDE4抑制剂，在高剂量时产生呕吐的副作用是普遍现象。Roflumilast虽然已经通过美国FDA批准上市用于治疗COPD，降低肺部的炎症、抵抗氧化应激、有效的缓解肺部的纤维化、增强粘膜的清除能力以及气道的重塑等等。但是也有不良反应，主要表现为腹泻、体重下降、恶心、心房纤颤及精神方面疾病的加重(如失眠、焦虑、抑郁)等。
新型磷酸二酯酶抑制剂ZL-n-91是在第二代PDE4抑制剂的基础上设计的，对PDE4D2和PDE4B2的IC50分别为12nM和20nM，是其他PDE家族成员的5000倍以上，针对性强。相比其他PDE4抑制剂，具有神经保护活性和副作用小等特点，能有效减轻甚至避免呕吐等不良反应。与其他PDE4抑制剂一样，ZL-n-91最初研究主要集中在免疫，神经及炎症等方面。研究发现ZL-n-91抑制人类记忆性Th17细胞产生IL-17，并对细胞活力无明显影响。Ya-juanWang等人发现ZL-n-91可抑制COPD样大鼠模型的炎症反应。我们首次利用新型的磷酸二酯酶抑制剂ZL-n-91治疗三阴性乳腺癌，研究发现ZL-n-91可以特异性的升高cAMP水平，抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖，但是相同剂量的ZL-n-91对正常细胞的增殖没有影响。我们还发现ZL-n-91对三阴性乳腺癌的抑制作用显著高于传统PDE4抑制剂rolipram且显著促进DNA损伤，抑制DNA的损伤修复，产生了意想不到的效果，为PDE4抑制剂ZL-n-91与DNA损伤修复抑制剂如PARP抑制剂联合使用提供思路，具有良好的开发应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
为解决上述技术问题，采用的技术方案如下：
本发明利用体外肿瘤细胞培养和体内肿瘤皮下瘤模型，通过细胞增殖实验，细胞周期实验，细胞凋亡实验和动物皮下瘤实验，研究ZL-n-91的病理生理学作用。实验证实：该抑制剂能够显著抑制人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖；能显著阻滞三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞周期；能显著诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡；能显著促进三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231DNA损伤，抑制DNA修复与复制能力；能显著抑制三阴性乳腺癌皮下瘤的增长，而且对小鼠副作用较小。为制备抗三阴性乳腺癌增殖药物的研究奠定了基础。
以上应用的给药方式优选为口服、注射或吸雾给药。
本发明所述的磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91可直接购买或者自行合成，例如可以参考文献[Ruihong Ma,Bin-yan Yang,Chang-you Wu.A selective phosphodiesterase 4(PDE4)inhibitor Zl-n-91suppresses IL-17production by human memory Th17cells.International Immunopharmacology,2008,8(10):1408-1417.]自行合成制备。
有益效果：本发明所述的选择性PDE4抑制剂ZL-n-91，可以特异性的升高cAMPs水平，抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖，但是相同剂量的ZL-n-91对正常细胞的增殖没有影响。我们还发现ZL-n-91对三阴性乳腺癌的抑制作用显著高于传统PDE4抑制剂rolipram且显著促进DNA损伤，抑制DNA的损伤修复，产生了意想不到的效果，为PDE4抑制剂ZL-n-91与DNA损伤修复抑制剂如PARP抑制剂联合使用提供思路。ZL-n-91对PDE4B和PDE4D的抑制剂强度是其他PDE家族成员的5000倍以上。相比其他PDE4抑制剂，该化合物对PDE4B和PDE4D具有更高的选择性，特异性强，产生的副作用小，能有效减弱甚至避免呕吐等不良反应，进一步提高了PDE4抑制剂治疗三阴性乳腺癌的应用前景。
附图说明
图1ZL-n-91对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用；(a)不同浓度的ZL-n-91处理MDA-MB-231细胞48h后，细胞OD450值；(b)不同浓度的ZL-n-91处理后，对MDA-MB-231细胞增殖的影响；(c)不同浓度的ZL-n-91所对应的MDA-MB-231细胞的增殖抑制率；(d)相同浓度的ZL-n-91与Rolipram对MDA-MB-231细胞增殖的影响；(e)ZL-n-91对HaCaT细胞增殖的影响；所有数据均用平均值±标准误差表示。(n＝3)，*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001，均与溶剂对照组相比。
图2是ZL-n-91对MDA-MB-231细胞周期的影响；(a)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞的细胞周期流式检测图；(b)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞周期分布的统计直方图；(c)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞相关周期蛋白的表达情况；(d)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞相关周期蛋白表达量灰度值的统计图；所有数据均用平均值±标准误差表示。(n＝3)，*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001，均与溶剂对照组相比。
图3是ZL-n-91对MDA-MB-231细胞凋亡的影响；(a)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞凋亡流式检测图；(b)MDA-MB-231细胞总凋亡率的统计直方图；(c)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞相关凋亡蛋白的表达情况；(d)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞相关凋亡蛋白表达量灰度值的统计图；所有数据均用平均值±标准误差表示；(n＝3)，*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001，均与溶剂对照组相比。
图4是ZL-n-91对MDA-MB-231细胞的DNA损伤修复与复制能力的影响。(a)不同浓度的ZL-n-91处理后，DNA修复途径的GSEA分析；(b)不同浓度的ZL-n-91处理后，治疗组(100μM、200μM)和对照组DNA修复通路差异表达基因热图分析；(c)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞中FANCA、FANCC、LIG1、UNG1、FEN1、RPA1、BCA1、RAD51的qRT-PCR分析，β-肌动蛋白mRNA水平作为标准化内参；(d)不同浓度的ZL-n-91处理后，MDA-MB-231细胞内DNA损伤标志物γ-H2AX和DNA修复复制蛋白PCNA的变化情况。所有数据均用平均值±标准误差表示；(n＝3)，*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001，均与溶剂对照组相比。
图5是Zl-n-91抑制裸鼠三阴性乳腺癌皮下瘤的生长情况；(a)给药治疗后裸鼠肿瘤体积变化图；(b)给药治疗后裸鼠体重变化图；(c)肿瘤重量图；(d)肿瘤大小图。(e)肿瘤组织内Ki67和γ-H2AX免疫组化结果，(f)肿瘤组织内Ki67和γ-H2AX阳性率统计图；所有数据均用平均值±标准误差表示；(n＝6)，*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001,均与溶剂对照组相比。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
CCK8法检测ZL-n-91对MDA-MB-231和HaCaT细胞增殖的影响
1)取对数生长期的细胞MDA-MB-231或者HaCaT，制备单细胞悬液。按每孔100μl细胞悬液(含1×104个细胞)接种于96孔板中，共分为8组:Con，10μM，20μM，40μM，80μM，100μM，160μM，320μM，每组3个副孔；
2)待细胞完全贴壁后，各组分别加入不同浓度的ZL-n-91，将细胞继续培养48h；
3)向每孔加入10ul CCK-8溶液，避免产生气泡；
4)将细胞继续孵育1-2h，将培养板取出，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。并计算细胞增殖率和细胞抑制率，采用Graphpad软件计算IC50结果。细胞增殖率(％)＝(OD450实验组-OD450本底)/(OD450溶剂对照组-OD450本底)×100％；细胞抑制率(％)＝1－细胞增殖率(％)
结果如图1所示：随着ZL-n-91浓度的升高，三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖能力显著性降低，相比传统PDE4抑制剂Rolipram，ZL-n-91在同等浓度下更能抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，并且对人正常皮肤永生化角质形成细胞HaCaT的细胞活力无显著影响。
流式细胞术和Western blot检测ZL-n-91对MDA-MB-231细胞周期的影响(1)流式细胞术检测ZL-n-91对MDA-MB-231细胞周期的影响
1)取对数生长期的MDA-MB-231细胞，用无血清的基础培养基重悬，以2×105个/ml接种于6孔培养板，每孔2ml，放在培养箱培养，饥饿处理24h；
2)24h后，弃废弃培养基，并分别加入完全培养基和ZL-n-91给药浓度(100μM，150μM)，同时设溶剂对照组，将细胞继续培养48h；
3)48h后收集细胞，冷PBS洗涤2次，用PBS制备成1×106个/mL的细胞悬液,加入1ml70％的无水乙醇，置于4℃或者-20℃固定24h以上；
4)离心，冷PBS洗涤2次，按试剂盒说明书加入200μl PI染色，轻柔的涡旋细胞，室温避光孵育15min,ModFit LT 5.0软件进行细胞周期分析。
结果如图2a和2b所示：药物处理后，MDA-MB-231细胞周期阻滞在G0/G1时期，且药物浓度越高阻滞越显著，处于S时期分裂的细胞有不同程度的下降。
(2)Western blot检测ZL-n-91对MDA-MB-231细胞周期蛋白的影响
实验共设计3组(Con组，100、200μM ZL-n-91处理组)，药物处理48h后，胰酶消化收集细胞，RIPA裂解细胞，超声破碎后12000r/min离心20min。取上清，采用BCA法进行测定蛋白浓度。定量后用12％SDS-PAGE凝胶对蛋白进行电泳分离，湿法转印至PVDF膜，5％牛奶封闭1h，加入稀释后的一抗于4℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)，摇床室温孵育1h，TBST洗膜3次后，ECL化学发光显色，并应用Image J软件分析目标蛋白和内参蛋白灰度值，相对表达量＝目的蛋白灰度值/内参灰度值。
结果如图2c和2d所示：药物处理后，MDA-MB-231细胞内正向调控G0/G1期的周期蛋白CDK2，CDK4，CyclinD1，p-Rb和Rb显著下调。表明ZL-n-91可通过CDK2-CDK4-CyclinD1-Rb途径调控MDA-MB-231细胞周期的阻滞。
流式细胞术和Western blot检测ZL-n-91对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
(1)流式细胞术检测ZL-n-91对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
1)取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以2×105个/ml接种于6孔培养板，每孔2ml；
2)铺板后24h待细胞完全贴壁后，分别加入实验浓度ZL-n-91(100μM，200μM)，同时设溶剂对照组，将细胞继续培养48h；
3)48h后收获细胞，冷PBS洗涤2次，用1×Binding Buffer制备成1×106个/mL的细胞悬液,取100μl于流式管中，按试剂盒说明书加入5μl 7AA-D和5μl PE染色，轻柔的涡旋细胞，室温避光孵育15min,再加200μl 1×Binding Buffer于管中，1h内进行流式细胞检测,FlowJo V10分析软件分析结果。
结果如图3a和3b所示：ZL-n-91显著诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡。
(2)Western blot检测ZL-n-91对MDA-MB-231细胞凋亡蛋白的影响
实验共设计3组(Con组，100、200μM ZL-n-91处理组)，药物处理48h后，胰酶消化收集细胞，RIPA裂解细胞，超声破碎后12000r/min离心20min。取上清，采用BCA法进行测定蛋白浓度。定量后用12％SDS-PAGE凝胶对蛋白进行电泳分离，湿法转印至PVDF膜，5％牛奶封闭1h，加入稀释后的一抗于4℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)，摇床室温孵育1h，TBST洗膜3次后，ECL化学发光显色，并应用Image J软件分析目标蛋白和内参蛋白灰度值，相对表达量＝目的蛋白灰度值/内参灰度值。
结果如图3c和3d所示：药物处理后，MDA-MB-231抑凋亡蛋白Bcl-2显著下调，促凋亡蛋白BAX显著上调，表明，ZL-n-91可通过Bcl-2/BAX途径促进MDA-MB-231细胞凋亡。
ZL-n-91对MDA-MB-231细胞的DNA损伤修复与复制能力的影响
为了进一步探究ZL-n-91对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231治疗作用的机制，我们开展了转录组测序，qRT-PCR和Western blot实验。
(1)转录组测序
将0，100μM，200μM浓度的ZL-n-91与MDA-MB-231细胞共孵育培养48h，离心收集细胞，使用TRIzol试剂试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)从MDA-MB-231细胞中提取总RNA。随后，用dT珠富集mRNA。将富集的mRNA用片段缓冲液分段，并用随机引物反转录成cDNA。用DNA聚合酶I、RNase H、dNTP和缓冲液合成第二条cDNA链。用QiaQuick PCR提取试剂盒(Qiagen 28104)纯化cDNA片段，修复末端，添加poly(a)并连接到Illumina测序适配器。结合产物经琼脂糖凝胶电泳筛选，PCR扩增，利用Illumina NovaSeq 6000(广州基迪奥公司)平台开展测序分析。使用edgeR软件包(http://www.r-project.org/)分析组间的差异表达基因，我们把差异倍数大于2倍，FDR<0.05，FPKM>＝2，作为筛选显著差异基因的条件，用作后续GSEA和热图分析。
结果如图4a和4b所示，200μM浓度的ZL-n-91处理显著降低了与DNA修复相关的基因富集程度，并呈剂量依赖性下调通路关键基因的表达。
(2)qRT-PCR
实验共设计3组(Con组，100、200μM ZL-n-91处理组)，药物处理后，胰酶消化收集细胞，Trizol裂解细胞，并提取细胞总RNA，测定RNA浓度后，根据Vazyme试剂盒说明书进行cDNA合成。然后，以cDNA为模板，以目的基因和β-actin(內参)为引物，按试剂盒说明配制PCR反应液，配置试剂后，振荡离心，混合均匀后，使用qPCR仪进行扩增，并收集数据。以Folds＝2-△△Ct表示实验组和对照组基因表达的倍比关系，△△Ct＝[目的基因平均Ct值(样本组)－管家基因平均Ct値(样本组)]－[目的基因平均Ct值(对照组)－管家基因平均Ct值(对照组)]。
结果如图4c所示，ZL-n-91显著抑制FANCA、FANCC、LIG1、UNG1、FEN1、RPA1、BRCA1、RAD51等正向调控DNA修复能力的基因表达。
(3)Western blot
实验共设计3组(Con组，100、200μM ZL-n-91处理组)，药物处理48h后，胰酶消化收集细胞，RIPA裂解细胞，超声破碎后12000r/min离心20min。取上清，采用BCA法进行测定蛋白浓度。定量后用12％SDS-PAGE凝胶对蛋白进行电泳分离，湿法转印至PVDF膜，5％牛奶封闭1h，加入稀释后的一抗于4℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)，摇床室温孵育1h，TBST洗膜3次后，ECL化学发光显色，并应用Image J软件分析目标蛋白和内参蛋白灰度值，相对表达量＝目的蛋白灰度值/内参灰度值。
结果如图4d所示，ZL-n-91显著促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞内DNA损伤标志物γ-H2AX的表达并下调复制DNA修复修复蛋白PCNA的表达。
ZL-n-91抑制裸鼠三阴性乳腺癌皮下瘤的生长情况
为了在体内研究Zl-n-91对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖抑制作用，我们将MDA-MB-231细胞种植于6周龄裸鼠皮下。将荷瘤小鼠随机分为两组：溶剂对照组和给药组(5mg/kg)，细胞种植第三天开始，每天灌胃给药治疗，每两天称量小鼠体重、测量肿瘤体积，并对解剖后小鼠肿瘤组织内的Ki67蛋白和DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白进行免疫组化染色分析。
结果如图5所示：给药组和对照组相比,小鼠体重没有明显差异，给药16天开始，给药组小鼠肿瘤体积显著小于对照组。剥离肿瘤，称重，给药组肿瘤重量(0.696g±0.254)显著小于对照组肿瘤重量(1.385g±0.380)。这些结果表明，Zl-n-91不但能显著抑制三阴性乳腺癌的增长，而且对小鼠副作用较小。此外，免疫组化结果显示，Zl-n-91可下调Ki67蛋白表达和促进DNA损伤标志物γ-H2AX的表达。
以上研究结果表明，本发明所采用的磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91能抑制三阴性乳腺癌增殖，具有良好的抗肿瘤效果。

Claims (10)

1.磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物的剂型为口服制剂、注射制剂或雾化制剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物抑制三阴性乳腺癌增殖和/或诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，ZL-n-91还与DNA损伤修复抑制剂联合使用，DNA损伤修复抑制剂优选为PARP抑制剂。
5.一种含有磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91的药物。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，药物的剂型为口服制剂、注射制剂或雾化制剂。
7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，药物还包括DNA损伤修复抑制剂。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，DNA损伤修复抑制剂为PARP抑制剂。
9.磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备抑制三阴性乳腺癌增殖和/或诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品为细胞培养基或口服制剂或注射制剂或雾化制剂。
CN202210551070.0A 2022-05-20 2022-05-20 磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用 Active CN114917217B (zh)

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