CN114902049A - 先兆子痫生物标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了用于确定先兆子痫的风险和发作的生物标志物及其组合、它们的使用方法以及用于诊断、预测风险、管理和治疗妊娠人类女性先兆子痫的方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于确定在怀孕女性人类受试者中发生先兆子痫(preeclampsia)的风险的方法。具体而言,本发明涉及用于确定先兆子痫的风险和发作的生物标志物及生物标志物的组合,提供它们的使用方法和用于诊断、预测妊娠人类女性先兆子痫风险、管理和治疗妊娠人类女性先兆子痫的方法。
发明背景
以下对背景技术的讨论仅旨在促进对本发明的理解。讨论不是承认或认课所提及的任何材料在申请的优先权日是或曾经是公知常识的一部分。
妊娠期高血压疾病是孕产妇和新生儿发病率和死亡率的主要原因。先兆子痫是妊娠期最危险的高血压疾病之一,在妊娠20周后出现,发生在2-8%的妊娠中。先兆子痫是在两次不同情况下出现高血压(≥140/90mm Hg)和终末器官最常见的是肾脏或肝脏受累的证据后确定的。已建立的先兆子痫唯一有效的治疗方法是分娩胎盘,这需要分娩婴儿,通常是早产,这随后又伴发增加新生儿并发症甚至死亡的风险。先兆子痫早在妊娠34周前被认为是“早发”先兆子痫,而在妊娠34周后出现先兆子痫则被认为是“迟发”先兆子痫。
许多风险因素已被确定为与先兆子痫的发展相关,包括孕产妇肥胖、未生育、多次妊娠、孕产妇年龄、妊娠之间的间隔长、既往死产和潜在的孕产妇疾病,例如糖尿病(Burton等人,BMJ.(2019)366:l2381)。
人们对开发先兆子痫的早期生物标志物非常感兴趣,然而,对发病机制知之甚少阻碍了尤其是在妊娠早期的可靠生物标志物的开发。
血管生成相关生物标志物(例如sFlt-1和PlGF,galectin-3,VEGF,参见美国专利号9,518,992;Zeisler等人,N Engl J Med.2016;374(1):13-2;Schlembach等人,2018;18(1);603;Figueira等人,Pregnancy Hypertens 2018;13:30-36)仅指示先兆子痫发作前几周的风险。然而,在可能的情况下,先兆子痫的预测与妊娠结局的改善有关,并且已被证明具有成本效益,甚至在疾病临床发作前很短的时间。
基于母体特征、子宫动脉搏动指数和血管生成因子如PlGF和PAPP-A((Rolnik DL,Wright D,Poon LCY等人ASPRE试验:早产先兆子痫筛查的性能(ASPRE trial:performanceof screening for preterm pre-eclampsia),Ultrasound Obstet Gynecol.2017;50(4):492-495),已在妊娠早期11至13周之间成功使用了其他预测算法。然而,这些主要在预测早发或早产先兆子痫方面有效。因此,缺乏针对迟发性先兆子痫以及在妊娠中期和晚期之间发展的先兆子痫的风险分层策略。这一点尤为重要,因为对有先兆子痫风险的妊娠进行分层与改善妊娠结局有关(Poon LC,McIntyre HD,Hyett JA,da Fonseca EB,Hod M,FIGOPregnancy and NCD Committee,妊娠的前三个月:预测和预防妊娠并发症和未来生活的一个机会窗口(The first-trimester of pregnancy:a window of opportunity forprediction and prevention of pregnancy complications and future life),Diabetes Res Clin Pract.2018;145:20-30)并且看起来具有成本效益,即使在疾病临床发作前几周也是如此(Schlembach D,Hund M,Schroer A,Wolf C.,使用sFlt-1/PlGF比率测试来预测德国先兆子痫的经济评估(Economic assessment of the use of the sFlt-1/PlGF ratio test to predict preeclampsia in Germany),BMC Health ServRes.2018;18(1):603)。
尽管低剂量阿司匹林可有效预防早发性先兆子痫(Rolnik DL,Wright D,Poon LC等人,阿司匹林与安慰剂在早产先兆子痫高风险妊娠中的比较(Aspirin versus placeboin pregnancies at high risk for preterm preeclampsia),N Engl J Med.2017;377(7):613–622),已建立的先兆子痫的唯一治疗方法是分娩胎盘,这需要分娩婴儿,通常在早产时。
FK506结合蛋白样蛋白(FKBPL)是一种肽基脯氨酰顺反异构酶,其属于在血管疾病中具有重要作用的亲免素蛋白组。作为调节血管生成的关键蛋白,FKBPL在发展的和病理性血管生成以及干细胞分化中都发挥着重要作用。消除由FKBPL引起的血管生成取决于与细胞表面受体CD44的结合。
CD44在血管生成中的作用也已得到充分建立。已建议FKBPL作为预测和预报生物标志物的潜力用于乳腺癌、卵巢癌和其他癌症(参见例如,Nelson等人,Oncotarget,2015;6(14):12209-12223;Robson等人,Drug Discovery Today,2012;17(11-12):544-548;Annett等人,British Journal of Cancer 2020;122(3):361-371;McClements等人,BMCCancer 2019;19(1):351,和Valentine等人,Clinical Cancer Res 2011;17(5):1044-1056),神经退行性疾病(Rowan等人的美国专利公开号2014/0315736),和不孕症(Downes等人的美国专利公开号2010/0305082)。本发明人(McClements博士)最近已将FKBPL鉴定为先兆子痫的预报生物标志物(美国专利公开号2019/02043335)。
其他相关出版物包括但不限于Nagalla等人的美国专利公开号2010/0016173和Cooper等人的美国专利公开号2019/079097(先兆子痫的血清生物标志物阵列);Schulze-Forster等人的美国专利公开号2010/0075348(先兆子痫的抗内皮素受体抗体生物标志物);Hansson等人的美国专利公开号2018/0074070(用于先兆子痫的血红素结合蛋白和α-1-微球蛋白生物标志物);Ward等人的美国专利公开号2019/0002981(先兆子痫的DNA生物标志物);Grobe等人的美国专利公开号2017/0315130(先兆子痫的和肽素(copeptin)生物标志物);Simon等人的美国专利公开号2017/0097358(先兆子痫的膜联蛋白(annexin)A2生物标志物)和Grobe等人的美国专利公开号2017/0315130(先兆子痫的miRNA生物标志物)。
其他相关参考文献包括McKeen等人,2011;39(2):663-668;North等人,2011;342:d1875;Kenny等人,2014;64(3):644-652;Rana等人,2014:63(2):198-202和Levine等人,2004;350(7):672-683。
本领域需要在严重症状发作之前准确、早期检测处于先兆子痫风险或已经经历先兆子痫的受试者的方法。本发明的一个目的是克服现有技术预示的一个或多个问题。
发明概述
本发明基于一般应用的原则,即FKBPL-CD44途径在先兆子痫的发病中起重要作用,其可用于诊断和治疗目的。FKBPL和CD44在发展为先兆子痫的女性中,于妊娠早期差异性分泌。当CD44/FKBPL比率与平均动脉血压(MABP)组合时,可以提高测试的预测能力,以确定孕妇先兆子痫的风险。
根据本发明的一个方面,提供了一种确定妊娠女性人类受试者发生先兆子痫风险的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂检测受试者生物样品中CD44的水平,其中样品中高于预定阈值的CD44水平指示受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加。
根据本发明的实施方案,样品是妊娠第20周及以后的样品。
根据本发明的实施方案,该方法进一步包括在来自较晚妊娠周的样品中重复所述检测至少一次,并与较早的CD44水平进行比较,其中在较晚的检测中CD44水平相对于较早CD44水平的增加表明受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加,并且其中较晚妊娠周不晚于妊娠第30周。
根据本发明的一个方面,提供了一种确定妊娠女性人类受试者发生先兆子痫风险的方法,该方法包括:
a.使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的生物样品中CD44的水平和FKBPL的水平,
b.确定样品中CD44/FKBPL的比率,
c.其中样品中高于预定阈值的CD44/FKBPL比率指示受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加。
根据本发明的实施方案,样品是妊娠第15-30周。
根据本发明的实施方案,所述方法还包括:在来自较晚妊娠周的样品中重复检测CD44和FKBPL的水平并确定CD44/FKBPL比率至少一次,并与较早的CD44/FKBPL比率进行比较,其中较晚检测中CD44/FKBPL比率相对于较早CD44/FKBPL比率的增加指示受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加,并且其中所述较晚妊娠周不晚于妊娠第30周。
根据本发明的实施方案,所述方法进一步包括:确定受试者中的MABP,并且其中样品中升高的MABP和高于预定阈值的CD44/FKBPL比率指示受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加。
根据本发明的一个方面,提供了一种用于在妊娠第20-30周管理怀孕的女性人类受试者的妊娠的方法,该方法包括:
a.使用结合CD44的试剂检测受试者生物样品中的CD44水平,
b.其中CD44的水平在样品中高于预定阈值,这指示对受试者进行高风险妊娠管理。
根据本发明的一个方面,提供了一种在妊娠第15-30周管理怀孕女性人类受试者的妊娠的方法,该方法包括:
a.使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,
b.确定样品中CD44/FKBPL的比率,
c.其中CD44/FKBPL的比率在样品中高于预定阈值,这指示对受试者进行高风险妊娠管理。
根据本发明的实施方案,该方法进一步包括:确定受试者的MABP,并且当MABP升高并且CD44/FKBPL的比率高于预定阈值时,这指示对受试者进行高风险妊娠管理。
根据本发明的实施方案,高风险妊娠管理包括监测受试者的血压和蛋白尿。
根据本发明的实施方案,受试者表现出选自血压、蛋白尿和肝功能的至少一种先兆子痫指标的正常值。
根据本发明的一个方面,提供了一种治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括:
a.使用结合CD44的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平,其中所述生物样品是妊娠第20-30周,
b.其中生物样品中的CD44水平高于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和
c.其中所述至少一种先兆子痫的指标是阳性的,则在妊娠第30周或之后治疗所述受试者的先兆子痫。
根据本发明的实施方案,步骤(a)进一步包括确定受试者中的MABP,并且步骤(b)包括测试受试者,其中CD44水平和MABP水平高于预定阈值,并且其中先兆子痫的至少一项指标不是MABP。
根据本发明的一个方面,提供了一种治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括:
a.使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述生物样品是妊娠第15-30周,
b.其中生物样品中CD44/FKBPL水平的比率高于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和
c.其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则在妊娠第30周或之后治疗受试者的先兆子痫。
根据本发明的一个方面,提供了一种治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括:
a.使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的第一生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述第一生物样品是妊娠第15-30周的样品,
b.使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的第二生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述第二生物样品是妊娠周晚于妊娠第30周的样品,
c.其中第一生物样品中CD44/FKBPL水平的比率高于第一预定阈值,并且第二生物样品中CD44/FKBPL水平的比率低于第二预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和
d.其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
根据本发明的实施方案,步骤(a)进一步包括确定受试者中的MABP,步骤(b)包括测试受试者,其中CD44/FKBPL水平的比率和MABP高于预定阈值,并且其中先兆子痫的所述至少一种指标不是MABP。
根据本发明的实施方案,所述至少一种指标选自高血压、蛋白尿、低血小板计数、受损的肝功能、肾脏问题的迹象(除了蛋白尿之外的迹象)、肺水肿和头痛或视觉障碍(视觉障碍)。
根据本发明的实施方案,先兆子痫治疗选自抗高血压治疗、类固醇和癫痫发作(seizure)预防。
根据本发明的一个方面,提供了一种治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括:
a.使用结合CD44的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平,其中所述生物样品是妊娠周晚于第30妊娠周的样品,
b.其中生物样品中的CD44水平低于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和
c.其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
根据本发明的实施方案,先兆子痫的所述至少一种指标是MABP。
根据本发明的一个方面,提供了一种治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括:
a.使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述生物样品是妊娠周晚于第30妊娠周的样品,
b.其中生物样品中CD44/FKBPL水平的比率低于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和
c.其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
根据本发明的实施方案,所述至少一种指标选自高血压、蛋白尿、血小板计数、受损的肝功能、肾脏问题的迹象(除了蛋白尿之外的迹象)、肺水肿和头痛或视觉障碍。
根据本发明的实施方案,先兆子痫的所述至少一种指标不是MABP。
根据本发明的实施方案,先兆子痫治疗选自抗高血压治疗、类固醇和癫痫发作预防。
根据本发明的实施方案,生物样品是全血或分离的血液级分。
根据本发明的实施方案,分离的血液级分是血清或血浆。
根据本发明的实施方案,结合CD44的试剂是特异性结合CD44的抗体。
根据本发明的实施方案,结合FKBPL的试剂是特异性结合FKBPL的抗体。
根据本发明的实施方案,所述抗体是单克隆抗体。
根据本发明的实施方案,预定阈值是正常的、健康的怀孕孕龄匹配的女性的CD44水平或CD44/FKBPL比率。
根据本发明的一个方面,提供了一种物质组合物(composition-of-matter),其包含含有结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂的妊娠女性人类受试者的生物样品。根据本发明的一个方面,提供了一种物质组合物,其包含:
a.含有结合CD44的试剂的妊娠女性人类受试者的生物样品的第一部分,和
b.含有结合FKBPL的试剂妊娠女性人类受试者的生物样品的第二部分。
根据本发明的实施方案,所述生物样品是全血或分离的血液级分。
根据本发明的实施方案,分离的血液级分是血浆或血清。
根据本发明的实施方案,样品是15周和15周以上妊娠周的样品。
根据本发明的实施方案,结合CD44的试剂是特异性结合CD44的抗体。
根据本发明的实施方案,结合FKBPL的试剂是特异性结合FKBPL的抗体。
根据本发明的实施方案,所述抗体是单克隆抗体。
根据本发明的一个方面,提供了一种诊断试剂盒,用于诊断妊娠女性人类受试者的先兆子痫或发生先兆子痫的风险,该试剂盒包含:(a)特异性结合可溶性CD44的第一试剂,其中可检测地标记或偶联所述第一试剂至酶;(b)CD44的正常参考样品,其中CD44的正常参考样品是包含在没有先兆子痫或没有发生先兆子痫风险的妊娠人类女性受试者中;未患有早发性先兆子痫或子痫的妊娠人类女性受试者中发现的CD44水平的样品;(c)结合可溶性FKBPL的第二试剂,其中可检测地标记或偶联所述第二试剂至酶,和(d)FKBPL的正常参考样品,其中FKBPL的正常参考样品是包含在没有先兆子痫或没有发生先兆子痫风险的妊娠人类女性受试者中;未患有早发性先兆子痫的妊娠人类女性受试者中发现的FKBPL水平的样品。
根据本发明的实施方案,CD44的正常参考样品含有浓度范围在20和300ng/ml之间的CD44。
根据本发明的实施方案,FKBPL的正常参考样品包含浓度范围在0.1和5ng/ml之间的FKBPL。
根据本发明的实施方案,结合FKBPL的试剂是抗体或其FKBPL结合片段。
根据本发明的实施方案,结合CD44的试剂是抗体或其CD44结合片段。
根据本发明的实施方案,所述抗体是单克隆抗体。
根据本发明的实施方案,将结合CD44的试剂和/或结合FKBPL的试剂固定在固相中。
根据本发明的一个方面,提供了用于治疗先兆子痫的药剂,其用于表现出如下CD44水平的妊娠人类女性受试者:
a.来自其的生物样品中的CD44水平大于预定阈值,其中该样品来自妊娠20-30周;或者
b.低于第二预定阈值,其中该样品来自妊娠30周或30周以上。
根据本发明的一个方面,提供了一种用于治疗先兆子痫的药剂,用于表现出如下CD44/FKBPL比率的妊娠人类女性受试者:
a.来自其的生物样品中的CD44/FKBPL比率大于预定阈值,其中该样品来自妊娠15-30周,或者
b.低于第二预定阈值,其中该样品来自妊娠30周或30周以上。
根据本发明的实施方案,妊娠人类女性受试者进一步表现出升高的MABP。
根据本发明的实施方案,所述生物样品是全血或分离的血液级分。
根据本发明的实施方案,分离的血液级分是血浆或血清。
本发明的进一步的特征在其几个非限制性实施方案的以下描述中进行了更充分的描述。该描述仅出于举例说明本发明的目的。不应将其理解为对上述本发明的广泛概述、公开或描述的限制。
附图简述
现参考以下附图,仅以示例的方式描述本发明的一些实施方案。
图1A-1D是显示血浆FKBPL和CD44与先兆子痫发病率之间的相关性的图:图1A显示与健康对照组(n=60)相比,在后来发展为先兆子痫的女性于妊娠20周时血浆CD44水平显著升高(n=62,先兆子痫;n=60,对照),但是在妊娠15周时没有显著升高(n=60);双尾非配对T检验,*p=0.02。相比之下,与健康对照组(n=59,15周;n=58,20周)相比,发展为先兆子痫的女性在妊娠15周和20周时血浆FKBPL水平均降低(n=61,15周;n=57,20周);Mann-Whitney检验,*p=0.03(15周);*p=0.01(20周)(图1B)。图1C显示CD44/FKBPL比率在继续发展为先兆子痫的女性中升高。对于每位患者,CD44血浆水平除以FKBPL血浆水平以获得在每个时间点的比率。先兆子痫(n=57,15周;n=54,20周)与相同孕龄的健康对照(n=56,15周;n=55,20周)比较;Mann-Whitney检验,*p=0.02(15周);**p=0.004(20周)。图1D是用于预测先兆子痫的CD44/FKBPL比率的接受者操作特征(ROC曲线);AUC:曲线下面积。图1A-1C:数据表示为平均值±SEM。*<0.05,**<0.01;
图2A-2D是散点图,显示FKBPL水平和CD44水平随先兆子痫发作(onset)的变化:在先兆子痫诊断后的孕妇血浆中测量FKBPL(图2A)和CD44(图2B)(n=18)并与健康的怀孕对照(n=14)进行比较。注意与对照相比,血清FKBPL增加(图2A,PE)和CD44减少(图2B,PE)。与对照相比,在先兆子痫诊断后的孕妇中,CD44/FKBPL比率(图2C,PE)降低。与对照相比,来自诊断为先兆子痫的女性的经培养脂肪间充质干细胞(MSC)中分泌的FKBPL水平较高(图2D,MSC-PE,n=3)。根据双尾非配对t检验进行统计计算。先兆子痫的FKBPL分泌调整为MSC数量;双尾非配对t检验。数据表示为平均值±SEM;*<0.05,***<0.001。
图3A-3C是显示缺氧和MSC对HUVEC的血管生成特性的影响与FKBPL降低和CD44水平升高相关的图:使用小管形成测定法评估HUVEC分化;用钙黄绿素(calcein)染色细胞和胰蛋白酶处理,然后将50000个细胞铺板在Matrigel中并在完全培养基或间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)中将它们暴露于缺氧(1%O2)或常氧(21%O2)中6小时(n=6)。使用Leica DMi8荧光显微镜对细胞进行成像,并使用ImageJ软件对形成的小管长度进行定量(图3A)。从在完全培养基或MSC-CM培养基中暴露于缺氧(1%O2)或常氧(21%O2)24小时的HUVEC中收集蛋白质裂解物,并进行蛋白质印迹以确定FKBPL(42kDa)和GAPDH(37kDa)蛋白质表达(n=3)。使用ImageJ定量FKBPL蛋白表达并调整为GAPDH表达(图3B)。使用在缺氧中暴露于完全培养基或MSC-CM培养基24小时(n=3)的HUVEC对相对于18S管家基因的FKBPL和CD44mRNA水平进行实时qPCR分析。无血清培养基用作阴性对照(图3C)。结果表示为平均值±SEM;使用带有Sidak多重比较检验的双向ANOVA进行统计分析。*<0.05,**<0.01。MSC-CM:间充质干细胞-条件培养基(图3C);
图4A-4D是显示缺氧或MSC处理和缺氧调节的FKBPL和CD44刺激滋养层细胞迁移的图:使用伤口愈合-划痕测定法评估BeWo细胞(图4A)或Jar细胞(图4B)的迁移,在缺氧(1%O2)或常氧(21%O2)中,用完全培养基或MSC-CM处理24小时(n=3)。图4C显示了在缺氧(1%O2)下暴露于MSC-CM 24小时后,相对于BeWo滋养层细胞中18S管家基因而言,对FKBPL和GAPDH mRNA水平(n=3)的实时qPCR分析。图4D显示了在缺氧(1%O2)下暴露于MSC-CM 24小时后,相对于Jar滋养层细胞中18S管家基因而言,FKBPL和CD44 mRNA水平(n=3)的实时qPCR分析。结果表示为平均值±SEM;使用带有Sidak或Tukey多重比较检验的双向ANOVA进行统计分析。*<0.05,**<0.01和***<0.001。MSC-CM:间充质干细胞-条件培养基。
序列表
与本申请的提交同时提交的、2020年12月22日创建的标题为77958_BRH_ST25.txt的ASCII文件通过引用并入本文作为参考。序列表是:
SEQ ID NO:1 | DNA | 人 | 编码人FKBPL多肽的核酸 |
SEQ ID NO:2 | PRT | 人 | FKBPL多肽,GenBank登录号NP_079313 |
SEQ ID NO:3 | DNA | 人 | 编码人CD44多肽的核酸 |
SEQ ID NO:4 | PRT | 人 | CD44多肽,GenBank登录号XP_005253288.1 |
SEQ ID NO:5 | PRT | 人工序列 | 生物素连接酶标签(Biotin lygase tag)氨基酸序列 |
发明实施方案的详述
本发明在其一些实施方案中涉及用于早期确定妊娠女性发生先兆子痫风险的标志物和方法、用于监测处于先兆子痫风险中的妊娠女性的方法、以及用于选择管理和治疗患有先兆子痫或有先兆子痫风险的妊娠女性的方法。
为方便起见,以下部分总体上概述了本文使用的术语的各种定义。在该讨论之后,本说明书呈现了本发明的说明性实施方案,随后是展示本发明的各种实施方案的特性以及如何使用它们的具体实施例。本发明的说明性实施方案在应用方面不限于以下描述中阐述的或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其他实施方案或能够以多种方式实践或实施。
1.一般定义
本领域技术人员将理解,本文描述的本发明易于进行除具体描述的那些之外的变化和改变。本发明包括所有这些变化和改变。本发明还包括本说明书中单独或共同地提及或指出的所有步骤、特征、制剂和序列,以及任何步骤或特征和所有组合或任何两个或更多个步骤或特征。
本文中引用的每篇文献、参考文献、专利申请或专利通过引用明确地整体并入本文作为参考,这意味着读者应将其作为本文的一部分来阅读和考虑。本文中引用的文献、参考文献、专利申请或专利在本文中不重复仅仅是为了简洁。然而,所引用的材料或该材料中包含的信息均不应被理解为公知常识。
制造商的说明书、描述、产品说明书和用于本文提及的任何产品或通过引用并入本文的任何文件中的产品表,通过引用并入本文作为参考,并且可以在本发明的实践中使用。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践或测试,但示例性方法和/或材料在下文描述。如有冲突,以专利说明书(包括定义)为准。此外,这些材料、方法和实例仅是说明性的,并不意味着必然是限制性的。
除了在操作实施例中或在另外指明的情况下,本文使用的所有表示成分的量或反应条件的数字都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。当与百分比一起使用时,术语“约”可以表示±10%。
本文描述的本发明可以包括一个或多个值范围(例如尺寸、浓度等)。值范围将被理解为包括该范围内的所有值,包括定义该范围的值,以及与该范围相邻的值,其导致与紧邻定义范围边界的值相同或基本相同的结果。例如,本领域技术人员将理解,范围的上限或下限的10%的变化可以是完全合适的并且被本发明所涵盖。更具体地,范围的上限或下限的变化将是5%或如本领域中通常公认的那样,以较大者为准。
在本说明书中,单数的使用也包括复数,除非另有明确说明。在本申请中,除非另有说明,否则“或”的使用是指“和/或”。此外,术语“包括的”以及诸如“包括”和“包括了”的其他形式的使用不是限制性的。
在整个本说明书中,除非上下文另有要求,否则词语“包含”或诸如“包含了”、“包含的”、“包括”、“包括的”或“具有”的变形将被理解为暗示包含所述的整数或整数组,但不排除任何其他整数或整数组。即,它们意指“包括但不限于”。术语“由…组成”是指“包括并限于”。
术语“基本上由…组成”是指组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部分,但前提是所述额外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖的特征。
如本文所用,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称,除非上下文另有明确规定。例如,术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物,包括它们的混合物。
在整个本申请中,本发明的各种实施方案可以以范围格式呈现。应当理解,范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁,不应理解为对本发明范围的不灵活限制。因此,范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如,对诸如1到6的范围的描述应该被认为具有具体公开的子范围,例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等,以及该范围内的单个数字,例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何,这都适用。
如本文所用,术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程,包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或从已知方式容易开发的那些方式、手段、技术和过程。
应当理解,为了清楚起见,在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合地提供。相反,为了简洁起见,在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合或适合于本发明的任何其他描述的实施方案来提供。在多个实施方案的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征,除非实施方案在没有这些元件的情况下是无法实施。
本文使用的选定术语的其他定义可以在本发明的详细描述中找到并且自始至终适用。除非另有定义,本文使用的所有其他科学和技术术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
现在将参考以下非限制性描述和实施例来讨论本发明的特征。
2.阐述性实施方案
目前可用的先兆子痫生物标志物对于检测先兆子痫,特别是迟发性先兆子痫表型的价值有限。FK506结合蛋白样蛋白(FKBPL)是一种亲免素蛋白组的肽基脯氨酰顺反异构酶,最近已被确定为先兆子痫的预报生物标志物(McClements的US 2019/0305082)。本发明人惊奇地发现,早在妊娠第20周,CD44(FKBPL的细胞表面受体)水平的变化是先兆子痫风险的可靠指标,并且结合FKBPL和CD44(CD44/FKBPL比率)提供了一种敏感的、妊娠妇女出现先兆子痫风险的早期指标,早在妊娠第15周就有效。本发明人进一步发现,将CD44/FKBPL比率与平均动脉血压(MABP)的评估相组合可以提高早期预测先兆子痫风险的准确性,显著扩大了先兆子痫的比值比(Odds Ratio)范围。
将对她的观察扩展到妊娠后期(例如妊娠最后三个月),发明人发现在第30周后诊断为先兆子痫的妊娠女性中CD44水平和CD44/FKBPL比率的显著逆转趋势,提供一种以前无法用于监测和管理妊娠风险以及确定疾病发作的工具。
因此,在本发明的一个方面,提供了一种确定妊娠女性人类受试者发生先兆子痫风险的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平,其中样品中CD44水平高于预定阈值指示受试者发生先兆子痫的风险增加。在具体实施方案中,增加的风险是在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险。
在本发明的另一个方面,提供了一种用于确定妊娠女性人类受试者发生先兆子痫风险的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,确定样品中CD44/FKBPL的比率,其中样品中CD44/FKBPL比率高于预定阈值指示受试者发生先兆子痫的风险增加。在具体实施方案中,增加的风险是在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险。
除了CD44水平和CD44/FKBPL比率之外,母体血压可以作为一个变量包括在内,用于确定受试者发生先兆子痫的风险。因此,在一些实施方案中,本发明的方法进一步包括测定受试者中的MABP,而升高的MABP和升高的CD44水平和/或升高的CD44/FKBPL高于预定阈值表明受试者发生先兆子痫的风险增加。测量血压的方法以及整个妊娠期间的正常血压值范围是众所周知的。在具体实施方案中,“正常血压”定义为MABP等于或低于85mm Hg,“血压升高”定义为MABP大于85mm Hg。
如本文所用,术语“先兆子痫”或“先兆-子痫”是指妊娠的多系统并发症,其可伴有高血压、蛋白尿、手部和面部/眼睛肿胀(水肿)中的一种或多种、头痛、体重突然增加、肝酶高于正常和血小板减少。先兆子痫通常发生在妊娠晚期(third trimester),但在严重的情况下,该疾病发生在妊娠中期,例如大约在妊娠20周后。如果不加以解决,先兆子痫可导致子痫,即与先前存在的脑部疾病无关的癫痫发作。
提及“确定发生先兆子痫的风险”或“预测”先兆子痫或“提供先兆子痫预报”,通常意指提供先兆子痫预测,例如,对发生先兆子痫的受试者易感性或风险的预测;疾病进展过程和/或疾病结果的预测,例如子痫前期的预期发作,先兆子痫的预期持续时间。
如本文所用,术语“发生(developing)先兆子痫”是指患有足以被正式诊断为先兆子痫的临床指标。下面提供先兆子痫临床指标的详细描述。
在一些实施方案中,受试者生物样品的CD44水平或CD44/FKBPL比率将指示在妊娠中后期发生先兆子痫的风险增加。在具体实施方案中,风险是在妊娠第20-30周之间发生先兆子痫的风险。在其他实施方案中,发生先兆子痫的风险是在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险。在又一些实施方案中,发生先兆子痫的风险是在妊娠第30-35周之间例如妊娠第30、31、32、33、34或35周发生先兆子痫的风险。
如本文所用,“诊断”先兆子痫或“提供先兆子痫诊断”通常指提供先兆子痫确定,例如确定受试者(例如,具有一种或多种先兆子痫临床症状的受试者、无先兆子痫症状但具有与先兆子痫相关的风险因素的受试者、无先兆子痫症状且不具有与先兆子痫相关的风险因素的受试者)是否目前受到先兆子痫的影响;将受试者的先兆子痫分类为疾病或病症的亚型;确定先兆子痫的严重程度等。
CD44的正常血清浓度在妊娠中期约为100-135ng/mL,平均为115ng/mL。在一些实施方案中,妊娠中期CD44水平大于120ng/ml、大于125、130、135、140、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或更大ng/ml表明发生先兆子痫的风险增加。在具体实施方案中,在妊娠中期(例如,胎龄15-20周)120-140ng/ml范围内的CD44水平,例如,大于125ng/ml的CD44水平,指示先兆子痫的风险增加。妊娠中期FKBPL的正常血清浓度约为0.8-1.15ng/mL,在妊娠第15周平均为1.0ng/mL,在妊娠第20周平均为0.89ng/mL。在一些实施方案中,正常妊娠中期血清CD44/FKBPL比率在125-165的范围内,在妊娠第15周时平均为129,在妊娠第20周时平均为143,因此在妊娠中期CD44/FKBPL比率大于140,大于145、150、155、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400或更大表明发生先兆子痫的风险增加。在具体实施方案中,在妊娠中期CD44/FKBPL比率在140-200范围内,例如,大于140(例如,胎龄15周)或大于150(胎龄20周)时,表明先兆子痫的风险增加。
在妊娠后期,观察到的平均正常血清CD44浓度约为105ng/mL,而诊断为先兆子痫的女性的CD44水平始终较低,平均约为85ng/mL。因此,在一些实施方案中,在妊娠中期第30周后CD44水平低于100、低于90、85、80或更小ng/ml是进一步测试至少一个先兆子痫指标的指标,用于确定治疗。在其他实施方案中,妊娠大于30周的平均正常晚期妊娠血清CD44/FKBPL比率为136ng/mL,而诊断为先兆子痫的女性的血清CD44/FKBPL比率约为105。因此,在一些实施方案中,CD44/FKBPL比率在妊娠第30周后低于135、低于130、125、120、110、105、100、90、80、70或更低是进一步测试至少一个先兆子痫指标的指标,用于确定治疗。
应当注意,风险和正常怀孕女性群体中的(CD44、FKBPL、CD44/FKBPL)数值范围可能重叠,代表个体观察值的分布。因此,在一些实施方案中,其中受试者的生物标志物(例如CD44、FKBPL、CD44/FKBPL)水平指示升高的风险,但也落入风险和正常水平之间的重叠范围内,佐证升高的风险,应寻求妊娠管理策略、监测和/或转为治疗,例如,通过检测或转为检测至少一个先兆子痫的指标(例如,血压、肾功能、肝功能、蛋白尿等)。
通常,但非排他性地,受试者的CD44水平和/或CD44/FKBPL比值(和,根据需要包括MABP)与来自正常健康怀孕女性样品的相应值的差异越大,指示发生先兆子痫的风险越强,或者,如果评估较晚胎龄,则实际存在先兆子痫。
此外,如上所述,与在妊娠中期的较早时间点首次测定的CD44水平或CD44/FKBPL比率相比,在妊娠后期降低的CD44水平和/或CD44/FKBPL比率可以是进一步测试先兆子痫指标的强有力指标,并根据需要启动治疗。值得注意的是,妊娠中期CD44水平和/或CD44/FKBPL比率表明发生先兆子痫风险增加,以及随后在妊娠第30周后CD44水平和/或CD44/FKBPL比率降低的受试者应被视为进一步研究的候选对象,测试其活动性先兆子痫和适当的治疗。
在其他实施方案中,确定了CD44浓度和/或CD44/FKBPL比率的阈值,并且增加的CD44和/或CD44/FKBPL比率高于预定阈值表明发生先兆子痫的风险增加。
预定阈值可以是为正常、健康的妊娠人类女性确定的CD44浓度和/或CD44/FKBPL比率范围之外的值或值范围,或者可以是在取自一个或多个匹配受试者的一个或多个样品中测定的CD44浓度和/或CD44/FKBPL比率的值(例如,与以下标准中的至少一项匹配:胎儿的胎龄、母亲的年龄、怀孕前的血压、怀孕期间的血压、母亲的BMI、胎儿的体重、先兆子痫或子痫的既往诊断、以及先兆子痫或子痫家族史、既往妊娠次数、疾病和其他临床参数)没有先兆子痫或先兆子痫高风险的人。用于确定阈值的参考样本也可以是取自(如在监测中的)同一受试者的先前样本。
在一些实施方案中,发生先兆子痫的风险或在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险表示为相对于正常、健康的怀孕女性的先兆子痫风险增加的倍数。因此,根据本发明的方法确定的发生先兆子痫的风险在一些情况下相对于正常健康怀孕女性的风险可能轻微升高(例如,1.2、1.4、1.5、1.6倍),而CD44水平显著升高(妊娠20-30周)或CD44/FKBPL比值升高(妊娠15-30周)可以表明风险增加1.5至5倍,是正常健康的孕妇的1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍。在具有高血压(MABP>85mmHg)这一额外风险因素的受试者中,因素和指标的会聚可以指示风险增加超过正常健康怀孕女性确定的风险的10倍。
根据本发明的一些实施方案,确定受试者发生先兆子痫的风险的方法能够将受试者分类为高风险或低风险妊娠,并转为高风险妊娠管理。一般地,高风险妊娠管理方案将包括安排更多产科医生就诊,特别关注产妇健康,进食营养膳食,定期监测体重增加、蛋白尿和血压,先兆子痫症状如头痛,避免危险物质、食物或药物、维生素和铁补充、或产前保健药物或补充剂。除了定期筛查检查外,可能会建议进行其他检查以进一步评估婴儿的健康和发育。这些可能包括生物物理概况或靶向超声。此外,建议在医院而不是在家中进行高风险妊娠的分娩。根据个体情况,婴儿可以通过阴道分娩或剖宫产(C-section)分娩。在具体实施方案中,高风险管理包括频繁监测受试者的血压和蛋白尿。
由于对先兆子痫管理和治疗的响应可能影响疾病结果,本发明的教导可用于确定需要妊娠管理的对象的预报。在这方面,重要的是要注意,正确管理先兆子痫对于允许高风险妊娠延长超过37周、防止早产至关重要。因此,在一些实施方案中,本发明的方法可用于防止早产。特别地,评估先兆子痫的风险或存在的本方法可用于为怀孕女性提供管理和/或治疗来延迟或消除对胎儿早产的需要。
根据本发明的一些实施方案,该方法进一步包括告知受试者先兆子痫的预测风险和/或受试者的预测预后。
如本文所用,短语“告知受试者”是指基于CD44水平或CD44/FKBPL比率建议受试者:受试者应寻求合适的管理和/或治疗方案。例如,如果受试者预计对抗高血压治疗和抗凝血治疗有反应,并且被诊断或患有需要这种治疗的病理,则进行抗高血压治疗和抗凝血治疗是可取的。
一旦确定了CD44水平或CD44/FKBPL比率,所述结果可以记录在受试者的医疗文件中,这可以帮助选择治疗方案和/或确定受试者的预后。
根据本发明的一些实施方案,该方法进一步包括在受试者的医疗文件中记录受试者的CD44水平或CD44/FKBPL比率,和/或先兆子痫的风险水平。
如上所述,受试者发生先兆子痫的风险的预测可用于选择受试者的治疗方案并由此治疗有需要的受试者。因此,根据本发明的一些方面,提供了治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平,其中当生物样品中的CD44水平高于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和如果先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。在具体实施方案中,生物样品是妊娠第20-30周的样品。
在其他实施方案中,提供了治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中,当生物样品中CD44/FKBPL的比值高于预定阈值时,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和如果先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。在具体实施方案中,生物样品是妊娠第15-30周的样品。
在一些实施方案中,先兆子痫的所述至少一种指标是临床公认的指标中的任一种,例如,如本文详述的。在其他实施方案中,除了CD44水平和CD44/FKBPL比率之外,母体血压可以作为用于确定先兆子痫治疗的变量包括在内。因此,在一些实施方案中,本发明的方法进一步包括确定受试者的平均动脉血压(MABP),并且其中MABP升高,CD44水平和/或CD44/FKBPL升高超过预定阈值并且先兆子痫的不是MABP的至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
通常,先兆子痫在妊娠晚中期(late-middle)至晚期被明确诊断,然而,已报道早在20周时的早发性先兆子痫病例。因此,尽管可以在确定CD44和/或CD44/FKBPL比率并测试至少一种先兆子痫指标后的任何时间在必要时启动治疗,但在一些实施方案中,在妊娠第30周或之后治疗受试者的先兆子痫。在其他实施方案中,在妊娠第20周或之后、在妊娠第21、22、23、24、25、26、27、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40周或之后治疗受试者的先兆子痫。
重复确定CD44水平和FKBPL水平可用于监测妊娠女性受试者发生先兆子痫的风险变化。因此,在一个实施方案中,该方法进一步包括在比第一个样品晚的妊娠周重复检测受试者样品中的CD44和/或FKBPL至少一次,并与较早的CD44水平和/或CD44/FKBPL比率比较CD44水平和/或CD44/FKBPL比率,而相对于较早CD44水平和/或较早CD44/FKBPL比率,在后期检测中CD44水平或CD44/FKBPL比率的增加表明受试者发生先兆子痫的增加的风险。在具体实施方案中,增加的风险是在妊娠第30周或之后发生先兆子痫。在其他实施方案中,来自较晚妊娠周的受试者的样品是来自不晚于第30周的妊娠周的样品。
CD44水平和FKBPL水平的重复测定可以在初始测定之后的任何时间进行。这由受试者的医务人员(例如,产科医生,GP)确定,可以在CD44水平和FKBPL水平的初始评估后定期进行重复确定,或者,备选地或另外,响应于先兆子痫指标的特征、严重程度和/或频率的变化(或缺乏)而变化。在一些实施方案中,CD44水平和/或FKBPL水平的重复测定可以在初始测定后几天进行,例如,在初始测定后1、2、3、4、5、6、7天进行,或在初始测定受试者样品中的CD44和/或CD44/FKBPL比率后1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或更多周后进行。在一个具体实施方案中,在初始测定后一周,对妊娠第15-30周的样品进行CD44和/或CD44/FKBPL的重复测定。在其他实施方案中,对初始测定后2周或3周的妊娠周样品进行CD44和/或CD44/FKBPL的重复测定。
应当理解,CD44水平和/或CD44/FKBPL比率的重复测定以及与来自正常妊娠的值或与CD44水平和/或CD44/FKBPL比率的比较可以不止一次地进行,并且多次对不同时间点的受试者样本评估CD44水平和/或FKBPL水平有助于确定受试者发生先兆子痫的进一步风险,并有助于制定监测患者先兆子痫指标的策略。
如本文所用,术语“监测”先兆子痫一般是指监测、特别是记录受试者状况的变化,例如,以告知先兆子痫诊断,以告知先兆子痫预后,以提供关于先兆子痫治疗的效果或功效的信息等。
本发明人研究了健康孕妇和诊断为先兆子痫的孕妇中妊娠后期的CD44水平和FKBPL水平,令人惊讶地发现,与正常健康妊娠的值相比,先兆子痫发作时生物标志物浓度显著变化,其中CD44浓度相对于正常值下降,FKBPL浓度相对于正常值增加。生物标志物相对浓度趋势的这种先前未被认识且令人惊讶的逆转可用于指示先兆子痫的发作,并在严重症状和妊娠并发症发作之前确定妊娠晚期孕妇的治疗和管理。
因此,根据本发明的另一方面,提供了治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平,其中所述生物样品是晚于第30周妊娠周的样品,其中所述生物样品中的CD44水平低于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,并且其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
根据本发明进一步的方面,提供了治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述生物样品的妊娠周晚于第30周,并且其中所述生物样品中CD44/FKBPL水平的比率低于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,且其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
根据本发明的又一方面,提供了一种治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的第一生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中第一生物样品是妊娠第15-30周的,使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的第二生物样品中CD44的水平和FKBPL水平,其中第二生物样品是妊娠周晚于妊娠第30周,并且其中第一生物样品中CD44/FKBPL水平的比率高于第一预定阈值,并且第二生物样品中CD44/FKBPL水平的比率低于第二预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,并且其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
因此,根据本发明的另一方面,提供了治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂检测受试者的第一生物样品中的CD44水平,其中第一生物样品为妊娠第15-30周的;使用结合CD44的试剂检测受试者的第二生物样品中的CD44水平,其中第二生物样品为晚于妊娠第30周的妊娠周,并且其中所述第一生物样品中的CD44水平高于第一预定阈值并且第二生物样品中的CD44水平低于第二预定阈值;测试受试者的先兆子痫的至少一种指标,并且其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗先兆子痫。
因此,根据本发明的另一方面,提供了一种治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,该方法包括使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的第一生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述第一生物样品是妊娠第15-30周的;使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的第二生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述第二生物样品是妊娠周晚于妊娠第30周,并且其中第一生物样品中CD44/FKBPL水平的比率高于第一预定阈值,并且第二生物样品中CD44/FKBPL水平的比率低于第二预定阈值;测试受试者的先兆子痫的至少一种指标,并且其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。如所提到的,在一些实施方案中,先兆子痫的所述至少一种指标可以包括MABP。在其他具体实施方案中,MABP与CD44和CD44/FKBPL一起评估,并且其中MABP升高、CD44水平和/或CD44/FKBPL升高超过预定阈值,并且先兆子痫的至少一个不是MABP的指标是阳性时,指示治疗先兆子痫。
应当注意,最一般地但不排他地,在生物样品是妊娠周晚于妊娠第30周的方法中,预定阈值是参考对应于妊娠周晚于妊娠第30周的正常健康妊娠的值。同样地,一般地但不排他地,在第一个生物样品是妊娠第15-30周且第二个样品是妊娠周晚于妊娠第30周的方法中,第一个预定阈值参考来自对应于妊娠第15-30周的正常健康妊娠的值且第二预定阈值参考来自对应于妊娠周晚于妊娠第30周的正常健康妊娠的值。在具体实施方案中,阈值(例如,第一和第二预定阈值)是自与受试者的孕龄匹配的正常健康妊娠的值以及任选地如本文详述的其他临床标准确定的。
根据本发明的一个方面,确定妊娠女性受试者发生先兆子痫的风险包括检测受试者生物样品中的CD44水平。
如本文所用,术语“CD44”(HCAM、Hermes抗原、淋巴细胞归巢受体LHR、Pgp 1、ECM-III、HUTCH-1)是指由CD44基因(在人中)编码的细胞表面糖蛋白。在具体实施方案中,CD44是CD44多肽,GenBank登录号XP_005253288.1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在其他实施方案中,CD44多肽包含CD44的氨基酸序列的天然变体、片段和/或与CD44的氨基酸序列同源的多肽。编码人CD44多肽的核酸包括但不限于SEQ ID NO:3。在具体实施方案中,该方法包括检测与SEQ ID NO:22具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更高氨基酸序列同一性的CD44的天然变体、片段和/或同源多肽。在其他具体实施方案中,检测到的CD44多肽、天然变体、片段和/或同源多肽与结合天然CD44多肽的试剂是抗原交叉反应的。在一些实施方案中,检测到的CD44多肽与特异性抗人CD44抗体是交叉反应的,如通过动力学测定法、饱和测定法和/或竞争/调节结合测定法所确定的,与天然人CD44具有相似的亲和常数(K)或解离常数(Kd)结合抗人CD44抗体。
根据本发明的另一方面,确定妊娠女性受试者发生先兆子痫的风险包括检测受试者生物样品中CD44和FK506结合蛋白样蛋白(FKBPL)的水平并确定CD44/FKBPL比率。如本文所用,术语“FKBPL”(DIR1,NG7,WISP39,FKBP脯氨酰异构酶样)是指由FKBPL基因(在人中)编码的免疫亲和素样蛋白。在具体实施方案中,FKBPL是FKBPL的多肽,GenBank登录号NP_079313,其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在其他实施方案中,FKBPL多肽包含FKBPL的氨基酸序列的天然变体、片段和/或与FKBPL的氨基酸序列同源的多肽。编码人FKBPL多肽的核酸包括但不限于SEQ ID NO:1。
在具体实施方案中,该方法包括检测与SEQ ID NO:2具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更高氨基酸序列同一性的FKBPL的天然变体、片段和/或同源多肽。在其他具体实施方案中,检测到的FKBPL多肽、天然变体、片段和/或同源多肽与结合天然FKBPL多肽的试剂是抗原交叉反应的。在一些实施方案中,检测到的FKBPL多肽与特异性抗人FKBPL抗体是交叉反应的,如通过动力学测定法、饱和测定法和/或竞争/调节结合测定法所确定的,与天然人FKBPL具有相似的亲和常数(K)或解离常数(Kd)结合抗人FKBPL抗体。
适用于本发明的结合剂的一个实例是特异性结合CD44的亲和结合分子或特异性结合FKBPL的亲和结合分子。在一些实施方案中,亲和结合分子特异性结合其靶标(即CD44或FKBPL多肽)的至少一个表位。
如本文所用,“亲和结合分子(affinity binding molecule)”是指结合特定抗原的分子。
应当注意,可以使用已知方法定量亲和力,例如表面等离子共振(SPR)(描述于Scarano S,Mascini M,Turner AP,Minunni M.,Surface plasmon resonance imagingfor affinity-based biosensors.Biosens Bioelectron.2010,25:957-66),其使用例如捕获的或固定的单克隆抗体(MAb)形式以最小化亲合力的贡献,并且可以使用例如解离常数Kd来计算,由此较低的Kd反映更高的亲和力。
如本文所用,术语“KD”是指抗原结合结构域与其相应抗原之间的平衡解离常数。
根据一个具体实施方案,亲和结合分子是抗体或抗体片段。
抗CD44抗体是本领域技术人员可商业获得的。适用于本发明的方法和组合物的抗CD44抗体包括但不限于Abcam ab189524,ab51037,ab46793,ab216647,ab16728,ab6124,ab25064(单克隆抗体),Abcam ab157104(多克隆抗体);Origene UM500099(单克隆抗体);R&D Systems,Inc,BBA10;ThemoFisher 14-0441-82,MA5-13890,MA4405(单克隆抗体)和PA5-21419。缀合的(标记的)抗CD44抗体也是广泛可商业获得的。在具体实施方案中,CD44使用ELISA CD44试剂盒(例如,来自Abcam,Cambridge,MA的ab45912)测量。
抗FKBPL抗体是本领域技术人员可商业获得的。适用于本发明的方法和组合物的抗FKBPL抗体包括但不限于Abcam ab233426(多克隆抗体),ab233409(单克隆抗体);Origene TA502051(单克隆抗体);ThemoFisher-Invitrogen MA5-25356,MA5-23325(单克隆抗体)和PA5-60378,PA5-99231,PA5-66308,PA5-39168(多克隆抗体);Proteintech,USA10060-1-AP和Atlas抗体HPA043478(多克隆抗体)。在具体实施方案中,使用ELISA FKBPL试剂盒(例如,来自Cloud-Clone Corp,Katy,TX的SEL523Hu)测量FKBPL。缀合的(标记的)抗FKBPL抗体也是广泛可商业获得的。
本发明中使用的术语“抗体”包括完整分子及其(能够结合抗原表位的)功能片段。
如本文所用,术语“表位”是指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物侧链组成,并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
根据一个具体的实施方案,抗体片段包括但不限于单链、Fab、Fab'和F(ab')2片段、Fd、Fcab、Fv、dsFv、scFvs、双抗体(diabodies)、微型抗体、纳米抗体、Fab表达文库或单结构域分子例如VH和VL,它们能够以HLA限制性方式与抗原的表位结合。
用于实施本发明一些实施方案的合适的抗体片段包括免疫球蛋白轻链(本文中称为“轻链”)的互补决定区(CDR)、免疫球蛋白重链(本文中称为“重链”)、轻链可变区、重链可变区、轻链、重链、Fd片段和包含轻链和重链的基本上全部可变区的抗体片段,例如Fv、单链Fv(scFv)、二硫键稳定的Fv(dsFv)、Fab、Fab'和F(ab’)2,或包含抗体Fc区的抗体片段。
如本文所用,术语“互补决定区”或“CDR”可互换使用,指在重链和轻链多肽的可变区内发现的抗原结合区。通常,抗体在每个VH中包含三个CDR(CDR HI或HI;CDR H2或H2;和CDR H3或H3),在每个VL中包含三个CDR(CDR LI或LI;CDR L2或L2;和CDR L3或L3)。
构成可变区或CDR的特定抗体中氨基酸残基的身份可以使用本领域熟知的方法确定,所述方法包括如Kabat等人定义的序列可变性(参见例如,Kabat等人,1992,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NIH,Washington D.C.),Chothia等人定义的结构环区域的位置(参见例如,Chothia等人,Nature 342:877-883,1989),Kabat和Chothia之间的折中,其使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(现为参见Martin等人,1989,Proc.Natl Acad Sci USA.86:9268;以及万维网网站www(dot)bioinf-org(dot)uk/abs),可获得通过接触定义来定义的复杂晶体结构(参见MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745,1996))和“构象定义”(参见例如,Makabe等人,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166,2008)等。
如本文所用,“可变区”和“CDR”可以指由本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的可变区和CDR。
包含轻链和重链的完全或基本上完全可变区的功能性抗体片段定义如下:
a.Fv,定义为由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成的基因工程片段,表达为两条链;
b.单链Fv(“scFv”),包括轻链可变区和重链可变区的基因工程单链分子,通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子。
c.二硫键稳定的Fv(“dsFv”),是一种基因工程抗体,其包括通过基因工程化的二硫键连接的轻链可变区和重链可变区。
d.Fab,是抗体分子的片段,其含有抗体分子的单价抗原结合部分,可以通过用木瓜蛋白酶处理完整抗体以产生完整的轻链和重链的由其可变结构域和CH1结构域组成的Fd片段;
e.Fab',是抗体分子的片段,其包含抗体分子的单价抗原结合部分,可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体,然后还原获得(每个抗体分子获得两个Fab'片段);
f.F(ab')2,是抗体分子的片段,其包含抗体分子的单价抗原结合部分,可以通过用酶胃蛋白酶处理完整抗体获得(即,通过两个二硫键结合在一起的Fab'片段的二聚体);
g.单结构域抗体或纳米抗体包含对抗原表现出足够亲和力的单个VH或VL结构域;和
h.Fcab,是包含抗体的Fc部分的抗体分子片段,所述Fc部分是通过将抗原结合能力引入抗体的Fc区而发展为抗原结合结构域。
产生多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域众所周知的(参见例如,Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork,1988,通过引用并入本文作为参考)。
用于产生抗体的示例性方法采用诱导体内产生抗体分子,筛选免疫球蛋白文库(Orlandi D.R.等人,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:3833-3837;Winter G.等人,1991.Nature 349:293-299)或通过培养中的连续细胞系产生单克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)-杂交瘤技术(KohlerG.等人,1975.Nature 256:495-497;Kozbor D.等人,1985.J.Immunol.Methods 81:31-42;Cote RJ.等人,1983.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030;Cole SP.等人,1984.Mol.Cell.Biol.62:109-120)。
体内产生抗体时靶抗原太小而不能引发足够的免疫原性反应的情况下,这类抗原(半抗原)可以与抗原中性载体如匙孔血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白偶联[例如,牛血清白蛋白(BSA)]载体(参见例如,美国专利号5,189,178和5,239,078]。然后可以将得到的免疫原性复合物注射入合适的哺乳动物受试者例如小鼠、兔等中。合适的方案涉及根据促进血清中抗体产生的方案在佐剂存在下重复注射免疫原。免疫血清的滴度可以容易地使用本领域公知的免疫测定程序来测量。
可以直接使用获得的抗血清,或者可以如上文所述获得单克隆抗体。
根据本发明的一些实施方案的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养或其他蛋白质表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。
可以通过常规方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得抗体片段。例如,可以通过用胃蛋白酶对抗体进行酶促切割来产生抗体片段以提供表示为F(ab')2的5S片段。该片段可以使用硫醇还原剂和任选地由二硫键断裂产生的巯基的封闭基团进一步切割,以产生3.5S Fab'单价片段。备选地,使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段。例如Goldenberg,美国专利号4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献描述了这些方法,这些专利在此通过引用整体并入作为参考。另见Porter,R.R.[Biochem.J.73:119-126(1959)]。也可以使用其他切割抗体的方法,例如分离重链以形成单价轻重链片段,进一步切割片段,或其他酶的、化学的或遗传技术,只要这些片段与被完整抗体识别的抗原结合即可。
如上所述,Fv片段包含VH和VL链的关联。如Inbar等人[Proc.Nat'l Acad.Sci.USA69:2659-62(19720]所述,这种关联可能是非共价的。备选地,所述可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物质如戊二醛交联。Fv片段可以包含通过肽接头连接的VH链和VL链。例如,[Whitlow和Filpula,Methods 2:97-105(1991);Bird等人,Science 242:423-426(1988);Pack等人,Bio/Technology 11:1271-77(1993);和美国专利号4,946,778描述了产生sFv的方法,所述文献的全部内容通过引用并入本文作为参考。
抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码感兴趣抗体的CDR的基因来获得。例如,通过使用聚合酶链式反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区来制备这些基因。例如,参见Larrick和Fry[Methods,2:106-10(1991)]。
如所提及的,抗体片段可以包含称为“Fcab”的抗体的Fc区。这类抗体片段通常包含抗体的CH2-CH3结构域。Fcab被工程化以在抗体的结构环区,即在重链的CH3区中包含至少一个修饰。参见例如,美国专利号9,045,528和9,133,274的全部内容通过引用并入本文作为参考。
非人(例如鼠类)抗体的人源化形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合亚序列)的嵌合分子,其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白(接受抗体(recipientantibody)),其中来自该接受抗体的互补决定区(CDR)的残基用具有所需的特异性、亲和力和能力来自非人类物种(供体抗体(donor antibody))如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。在一些情况下,人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替换。人源化抗体还可以包含既不在接受抗体中也不在输入的CDR或框架序列中发现的残基。一般而言,人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、且通常是两个可变结构域,其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区,且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还最佳地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,通常是人免疫球蛋白的恒定区[Jones等人,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
用于人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的;参见Winter及其同事[Jones等人,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)],(美国专利号4,816,567)。在实践中,人源化抗体通常是这样的人抗体,其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用啮齿动物抗体中类似位点的残基替换。
人抗体也可以使用本领域已知的各种技术产生,包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);以及Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)],或如在例如美国专利号5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016和以下科学出版物中描述的:Marks等人,Bio/Technology 10,:779-783(1992);Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368 812-13(1994);Fishwild等人,Nature Biotechnology 14,845-51(1996);Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996);以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13,65-93(1995)。
在一些实施方案中,使用包含与功能部分例如可检测或治疗部分免疫的本发明抗体的分子(也称为“免疫缀合物”)确定生物样品中CD44或FKBPL多肽的水平。免疫缀合物分子可以是分离的分子,例如可溶性分子和/或合成的分子。
多种类型的可检测或报道部分可以与本发明的抗体缀合。这些可检测或报道部分包括但不限于放射性同位素(例如[125]碘)、磷光化学品、化学发光化学品、荧光化学品(荧光团)、酶、荧光多肽、亲和标签和可通过正电子发射断层扫描(Positron EmissionTomagraphy,PET)或磁共振成像(MRI)检测的分子(造影剂)。
合适的荧光团的例子包括但不限于藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy-chrome、罗丹明、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、德克萨斯红、PE-Cy5等。有关荧光团选择、将荧光团连接到各种类型分子的方法的其他指导,参见Richard P.Haugland,“Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992–1994”,第5版,Molecular Probes,Inc.(1994);Oncoimmunin Inc.的美国专利号6,037,137;Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Academic Press New York,N.Y.(1995);Kay M.等人,1995.Biochemistry 34:293;Stubbs等人,1996.Biochemistry 35:937;Gakamsky D.等人,“Evaluating Receptor Stoichiometry by Fluorescence ResonanceEnergy Transfer,”在“Receptors:A Practical Approach,”第二版,Stanford C.和Horton R.(编辑),Oxford University Press,UK.(2001);Targesome,Inc.的美国专利号6,350,466]。当抗体与荧光可检测部分缀合时可用于检测抗体的荧光检测方法包括例如荧光激活流式细胞术(FACS)、免疫荧光共聚焦显微术、荧光原位杂交(FISH)和荧光共振能量转移(FRET))。
可以将多种类型的酶连接到抗CD44或抗FKBPL抗体[例如,辣根过氧化物酶(HPR)、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶(AP)],并且可以使用ELISA进行酶缀合抗体的测定法(例如,在溶液中)、酶联免疫组织化学测定法(例如,在固定组织中)、酶联化学发光测定法(例如,在电泳分离的蛋白质混合物中)或本领域已知的其他方法[参见例如,Khatkhatay MI.和Desai M.,1999.J Immunoassay 20:151-83;Wisdom GB.,1994.Methods Mol Biol.32:433-40;Ishikawa E.等人,1983.J Immunoassay 4:209-327;Oellerich M.,1980.J ClinChem Clin Biochem.18:197-208;Schuurs AH.和van Weemen BK.,1980.J Immunoassay1:229-49)。
可采用本领域广泛实施的多种方法将链霉亲和素或生物素分子连接至本发明的抗体。例如,生物素分子可以通过生物素蛋白连接酶(例如,BirA)的识别序列与本发明的抗体连接,如以下的实施例部分和Denkberg,G.等人,2000.Eur.J.Immunol.30:3522-3532中所述。备选地,链霉亲和素分子可以连接至抗体片段,例如单链Fv,基本上如Cloutier SM.等人,2000.Molecular Immunology 37:1067-1077;Dubel S.等人,1995.J ImmunolMethods 178:201;Huston JS.等人,1991.Methods in Enzymology 203:46;KipriyanovSM.等人,1995.Hum Antibodies Hybridomas 6:93;Kipriyanov SM.等人,1996.ProteinEngineering 9:203;Pearce LA.等人,1997.Biochem Molec Biol Intl 42:1179-1188)中所述。
与链霉亲和素缀合的功能部分,例如荧光团,可从免疫荧光流式细胞术试剂的基本上所有主要供应商(例如,Pharmingen或Becton-Dickinson)商购获得。
根据本发明的一些实施方案,生物素缀合的抗体与链霉亲和素分子结合以形成多价组合物(例如,抗体的二聚体或四聚体形式)。
表1:提供可与本发明的抗体缀合的可鉴定部分的非限制性实例。
*SEQ ID NO:5
在本发明的一些方面,该方法包括检测受试者生物样品中的CD44和/或FKBPL。
术语“生物样品”包含从生物体获得的多种样品类型并且可以用于诊断、预后或监测测定。该术语涵盖生物来源的血液和其他液体样品或自其衍生的细胞及其后代。该术语涵盖在其获得后以任何方式操作过的样品,例如通过试剂处理、溶解或某些成分的富集。该术语涵盖临床样品,且还包括细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液和组织样品。用于本发明方法的临床样品可以从多种来源获得,特别是血液样品。
特别感兴趣的样品来源包括血液样品或其制备物,例如全血或血清或血浆,以及尿液。约2μl至约2000μl的血液、血清或尿液样本体积通常足以确定CD44和/或FKBPL的水平。通常,样品体积的范围为约10μl至约1,750μl、约20μl至约1,500μl、约40μl至约1,250μl、约60μl至约1,000μl、约100μl至约900μl、约200μl至约800μl、约400μl至约600μl的范围。在具体实施方案中,人样品的合适初始来源是血液样品。因此,用于主题测定法的样品通常是血液衍生的样品。血液衍生的样品可以衍生自全血或其部分,例如血清、血浆等,其中在一些实施方案中样品衍生自血液,使其凝结,并且分离和收集血清或血浆以用于测定法。在其他实施方案中,样品衍生自收集的没有凝结的血液(例如,连同抗凝血剂如EDTA、柠檬酸盐、肝素),然后收集血清或血浆用于测定法。
在一些实施方案中,样品是血清或血清衍生的样品。可以采用任何用于产生流体血清样品的方便方法。在许多实施方案中,该方法采用通过皮肤穿刺(例如,手指穿刺、静脉穿刺)将静脉血采集入凝血或血清分离管,使血液凝结,并将血清从凝结的血液中离心分离。在一些实施方案中,收集血液而不凝结(例如,收集血液到涂有抗凝剂的分离管中)。
然后收集并储存血清直到实施测定法。一旦获得患者来源的样品,然后可以分析样品以确定CD44和/或FKBPL的水平。
在一些实施方案中,可以以多种方式处理受试者样品以增强对CD44和FKBPL中的一种或多种的检测。例如,当样品是血液时,可以在测定之前从样品中去除红细胞(例如,通过离心)。这种处理可用于降低使用亲和试剂检测CD44或FKBPL水平的非特异性背景水平。也可以通过使用本领域熟知的程序浓缩样品(例如酸沉淀、醇沉淀、盐沉淀、疏水沉淀、过滤(使用能够保留大多肽的过滤器、亲和纯化)来增强CD44和/或FKBPL的检测。在一些实施方案中,将测试和对照样品的pH调节至并保持在接近中性的pH(即pH 6.5-8.0)。这种pH调节将防止复合物的形成,从而提供更准确的样品中标志物水平的定量。在样品为尿液的实施方案中,调节样品的pH,并浓缩样品以增强标志物的检测。
受试者样品通常在妊娠的第二或第三个三个月期间从个体获得。“妊娠”是指哺乳动物的妊娠期间,即从受精到出生的发育时间间隔,再加上两周,即到末次月经的第一天。妊娠中期(second trimester)或晚期(third trimester)是指妊娠的第二或第三部分,每个部分(在人类受试者中)为3个月长。因此,例如,“妊娠早期(first trimester)”是指从末次月经的第一天到妊娠的第13周;“妊娠中期”是指从妊娠的第14周到第27周;“妊娠晚期”是指从第28周到出生,即妊娠38-42周。换句话说,可以在妊娠约第14至42周、妊娠约第18至42周、妊娠约第20至42周、妊娠约第24至42周、妊娠约第30周至42周、妊娠约第34周至42周、妊娠约第38周至42周获得受试者样品。
因此,在一些实施方案中,受试者样品可以在妊娠早期获得,例如在妊娠第14-30周之间,例如在妊娠第14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周,或在第20周或之后时间,或在妊娠第15-30周获得。在其他实施方案中,受试者样品可以在妊娠后期获得,例如,在妊娠第30周或之后,例如在妊娠第31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41周。
发明人已经表明,CD44水平可以是妊娠早期发生先兆子痫风险的有效预测因子。因此,在具体实施方案中,本发明的方法包括检测来自妊娠第20周和之后的样品中的CD44水平。在一些实施方案中,CD44水平在妊娠第20-30周,更具体地在妊娠第20、21、22、23、24、25、26、27、28、29周或第30周检测。将“妊娠周”理解为是指如上文所定义的指定妊娠周期间的任何时间。
发明人还显示,CD44/FKBPL比率也可以是妊娠早期对发生先兆子痫风险的有效预测指标。因此,在具体实施方案中,本发明的方法包括检测CD44和FKBPL水平并确定妊娠第15周及以后的样品中的CD44/FKBPL比率。在一些实施方案中,CD44和FKBPL比率在妊娠第15-30周,更具体地在第15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29周或妊娠第30周测定。
如本文所用,术语“管理妊娠”是指为维持妊娠以及胎儿和/或母亲的健康和福祉开具或提供任何手段、治疗、药物、监测或其他方法。如本文所用,短语“高风险妊娠管理”是指密切监测先兆子痫和/或胎儿窘迫(fetal distress)的临床和其他指标,以及允许维持胎儿健康发育至足月的适当干预。在具体实施方案中,先兆子痫的指标包括但不限于高血压、蛋白尿、低的血小板计数、受损的肝功能、肾脏问题的迹象(除了蛋白尿之外的迹象)、肺水肿和头痛或视觉障碍。
在一些实施方案中,先兆子痫背景下的“高血压”是1期(stage 1)高血压,定义为130-139mm Hg之间的收缩压或80-89mm Hg之间的舒张压。在其他实施方案中,“高血压”是2期高血压,定义为至少140mm Hg的收缩压或至少90mm Hg的舒张压。在具体实施方案中,“正常血压”定义为MABP等于或低于85mm Hg,且“高血压”定义为MABP大于85mm Hg。
在一些实施方案中,“蛋白尿”是指尿液样品中的30或更多mg/dL蛋白(例如,在Uniplus尿液分析条上为+1或更大)。大于100mg/dL(在Uniplus分析条上为+2)可能表明有严重的蛋白尿。在其他实施方案中,蛋白尿是在24小时尿液收集内测量的,其中蛋白尿由至少300mg蛋白质/24小时指示。
在一些实施方案中,“低血小板计数”或血小板减少症是指血小板计数下降,如在血液测试(CBC或全血细胞计数)中测量的。正常血小板计数在1.5亿-4亿/mL之间。认为血小板计数下降至1亿至1.5亿血小板/ml血液是轻度妊娠期血小板减少症,认为血小板计数低于7000万/mL是重度妊娠期血小板减少症。在一些实施方案中,受试者的血小板计数在1亿-1.5亿/mL之间。在其他实施方案中,血小板计数低于1亿/mL。
如本文所用,“肝功能”是指一组指示患者肝脏状态的标志物。肝功能测试(也称为“hepatic panel”)包括但不限于测量总胆红素、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、AST/ALT比率、γ谷氨酰转肽酶(GGT)和在患者的血液或血液级分样本中测量的白蛋白。在一些实施方案中,额外的测试包括确定凝血因子和功能(例如,凝血酶原时间(PT)、国际标准化比值(INR)、PT/INR)、5'核苷酸酶(5NTD)、铜蓝蛋白、甲胎蛋白(AFP)、血清葡萄糖和乳酸脱氢酶(LDH)用于评估妊娠期肝功能损害。
如本文所用,“肾脏功能(或肾功能)(除了蛋白尿之外)”是指一组标志物和功能参数,指示患者的肾和肾生理的状态。在一些实施方案中,肾功能标志物包括血浆尿酸(正常上限为5-5.5mg/dL)、血尿素氮(BUN)(妊娠期正常值约为9mg/dL,以及高于14mg/dL的值表示肾功能不全)和血浆肌酐(妊娠期正常肌酐约为0.5mg/dL,且超过0.8mg/dL的值表示肾功能不全)。值得注意的是,妊娠期的测试(例如肾功能标志物)应与肾功能其他参数的变化相关联来解释,包括但不限于血浆容量、肾小球滤过和肾小管重吸收的变化,这些变化通常随着妊娠进展而发生。
在一些实施方案中,先兆子痫的所述至少一种指标是肺水肿。“肺水肿”的诊断是基于呼吸困难、肺部啰音、低氧血症(PaO2低于80mmHg或SatO2低于90%,室内空气)和/或胸片上的空气空间不透明。
在一些实施方案中,先兆子痫的所述至少一种指标是视觉障碍”。如本文所用,“视觉障碍”是指与先兆子痫相关的视觉症状或现象,例如但不限于视力模糊、复视、一过性黑蒙(暂时丧失视力)、幻觉(photopsia)、暗点和同名偏盲(homonymous hemianopsia)。在其他实施方案中,先兆子痫的所述至少一种指标是“头痛”。术语“头痛”是指头部疼痛,通常表现为搏动性、挤压性、持续性、不停歇地或间歇性头部疼痛。其定位可能位于面部或颅骨的一部分,也可能涉及整个头部。
如本文所用,术语“治疗”先兆子痫是指对雌性哺乳动物的先兆子痫开处方或提供任何治疗,包括:(a)防止先兆子痫发生在可能易患先兆子痫(高风险)但尚未被诊断为患有先兆子痫的受试者中;(b)抑制已认可的先兆子痫,即阻止其发展;或(c)缓解先兆子痫,即,引起先兆子痫消退。
“预防先兆子痫”可以包括但不限于他汀类药物(例如普伐他汀)、贝特类药物(例如非诺贝特)、芪类(例如白藜芦醇)或二甲双胍的处方。
如本文所用,短语“治疗方案”是指指定治疗类型、剂量、时间表和/或提供给有需要的受试者(例如,被诊断有病理学的受试者)的治疗持续时间的治疗计划。所选择的治疗方案可以是预期会产生最佳临床结果(例如,完全治愈病理)的积极治疗方案,或者是可以缓解病理症状但导致病理不完全治愈的更温和的治疗方案。应当理解,在某些情况下,更积极的治疗方案可能与受试者的一些不适或不良副作用(例如,对妊娠受试者和/或胎儿的损伤)有关。治疗的剂量、时间表和持续时间可以根据病理的严重程度和所选择的治疗类型而变化,并且本领域技术人员能够调整治疗类型,其中调整治疗的剂量、时间表和持续时间。适用于本发明的本领域已知的先兆子痫治疗可包括卧床休息、多喝水、低盐饮食、抗高血压治疗(例如,拉贝洛尔、硝苯地平、甲基多巴等)、皮质类固醇,在严重的情况下,癫痫发作预防(例如硫酸镁)、引导妊娠(inducing pregnancy)等。在一些实施方案中,先兆子痫的治疗包括施用FKBPL激动剂。在具体实施方案中,FKBPL激动剂用于在妊娠第30周之前具有先兆子痫高风险和/或血液FKBPL降低或CD44/FKBPL比率升高的受试者。
如上所述,本发明的方法可用于确定有发生先兆子痫风险或患有一种或多种先兆子痫症状的妊娠女性的治疗策略和方案。因此,在一些实施方案中,提供了用于治疗先兆子痫的药剂,用于在来自其的生物样品中CD44水平表现出高于预定阈值的妊娠人类女性受试者,其中该样品来自妊娠第20-30周;或低于第二预定阈值,其中该样品来自妊娠30周或30周以上。
还提供了用于治疗先兆子痫的药剂,用于在来自妊娠人类女性受试者的生物样品中表现出CD44/FKBPL比率大于预定阈值的该受试者,其中该样品来自妊娠第15-30周,或表现出CD44/FKBPL比率低于第二预定阈值,其中该样品来自来自妊娠30周或30周以上。如上所述,在一些实施方案中,妊娠人类女性还表现出升高的MABP。
在一些实施方案中,用于治疗先兆子痫的药剂包含选自抗高血压药、皮质类固醇和抗惊厥药的药物。
还提供了用于实施一个或多个上述方法的试剂、系统和其试剂盒。主题试剂、系统和其试剂盒可以有很大的不同。感兴趣的试剂包括专门设计用于产生代表来自样品的上述先兆子痫标志物的标志物水平的试剂,例如,一种或多种检测元件,例如用于检测CD44和/或FKBPL蛋白的抗体或肽、用于检测核酸的寡核苷酸等。在一些情况下,试剂盒包含特异性结合可溶性CD44的第一试剂、特异性结合可溶性FKBPL的第二试剂以及CD44和FKBPL的正常参考样品。在具体实施方案中,CD44的正常参考样品和FKBPL的参考样品是分别含有一定水平的CD44或FKBPL的样品,在没有先兆子痫或没有发生先兆子痫、早发性先兆子痫或子痫风险的妊娠人类女性受试者中发现。在其他实施方案中,第一和/或第二试剂可以可检测地标记或偶联至酶,例如,如上文详述的荧光标记的、放射性标记的或免疫缀合的抗体。结合CD44和/或FKBPL的试剂可以是抗体或其CD44或FKBPL结合片段。在一些实施方案中,抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中,如上文详述的,结合CD44的试剂和/或结合FKBPL的试剂固定在固体表面上,例如与珠(微球)、ELISA板等结合。
在一些实施方案中,所述系统或试剂盒包含也称为dipstick的测试条(例如,侧向流动测试条),优选地,但不是必须的,封装在一个外壳里,被设计为由受试者或医学专业人员读取,并且在一些实施方案中,用该测试条进行的测定是夹心免疫测定。通过在与样品接触后将这类装置浸渍有特异性指示给定分子(例如CD44和/或FKBPL)存在的试剂而改变颜色或其他指示(通常是视觉的)。受试者样品的类型已在本文中定义。在一些实施方案中,抗体通过与物理可检测标记缀合而被标记,并且在与含有CD44和/或FKBPL的样品接触后形成复合物。然后将抗体-CD44和/或FKBPL复合物与识别复合物并固定在装置内的固体支持物上的第二抗体接触。第二抗体捕获抗体-CD44复合物或抗体-FKBPL复合物以形成抗体-CD44和/或FKBPL-抗体夹心复合物,并且固定在固体支持物上的所得复合物可通过标记进行检测。然后可以将测试条插入读取仪中,在读取仪中测量来自复合物中标记的信号。备选地,可以在添加样品之前将测试条插入读取仪。备选地,CD44和/或FKBPL的存在被对象可视化为装置的至少一部分的颜色变化。Dipstick通常由纸或纸板制成。通常,额外的分子作为阳性或阴性对照存在于装置中。典型的阳性对照可以是识别待测样品中已知存在的分子的抗体。典型的阴性对照可以是识别待测样品中已知不存在的分子的抗体。
在一些实施方案中,CD44的正常参考样品含有浓度范围为20-300ng/ml、25-275ng/ml、35-250、50-225、75-200、100-180、110-160、100-200ng/ml,且FKBPL的正常参考样品含有的FKBPL浓度范围为0.1-5ng/ml之间、0.15-4.75ng/ml、0.2-4.50、0.5-4.2、0.75-4.0、1.0-3.80、1.5-3.5、1.0-5.0ng/ml之间。
另一类这样的试剂是探针阵列、引物集合或抗体集合,其包括对CD44和FKBPL特异的探针、引物或抗体(也称为试剂)。这样的阵列可以包括对上文未列出的其他基因/蛋白质/辅因子具有特异性的试剂,例如对本领域已知其表达模式与先兆子痫相关的基因/蛋白质/辅因子具有特异性的探针、引物或抗体,例如,和sFlt-1(VEGF-RI)和PIGF。
在一些实施方案中,提供了一种物质组合物(composition of matter),其包含妊娠女性人类受试者的生物样品、结合CD44的试剂和结合FKBPL的第二试剂。结合CD44的试剂和结合FKBPL的第二试剂可以是上文详细描述的试剂中的任何一种试剂,例如。分别针对CD44和针对FKBPL的特异性抗体,且妊娠女性的生物样品可以是上述样品中的任一种。在具体实施方案中,样品是例如来自处于妊娠中期(第15-30周)的妊娠女性自15周之后的血液级分(血浆或血清、全血)。在其他实施方案中,样品是来自妊娠晚期的妊娠女性的血液级分,例如,在妊娠30周之后。在进一步的实例中,物质组合物包含(a)妊娠女性人类受试者的生物样品的第一部分,其包含结合CD44的试剂,和(b)妊娠女性人类受试者的生物样品的第二部分,其包含结合FKBPL的试剂。
在一些情况下,可以提供一种系统。如本文所用,术语“系统”是指试剂的集合,但是经过了汇编,例如,对通过从相同或不同来源购买的试剂集合来汇编。在一些情况下,可以提供试剂盒。如本文所用,术语“试剂盒”是指一起提供的例如出售的试剂的集合。例如,基于抗体的样品蛋白质检测可以分别与电化学生物传感器平台相偶联,该平台将允许多重测定CD44和FKBPL用于个性化的先兆子痫护理。本发明的系统和试剂盒可以包括上述阵列、基因特异性引物集合或蛋白质特异性抗体集合,以及在多种方法中使用的一种或多种额外的试剂,它们可以是预混的或分开的。主题系统和试剂盒还可以包括一种或多种先兆子痫表型测定元件,例如参考或对照样品或标志物表示,例如可以通过合适的实验或计算手段使用,以基于“输入”标志物水平概况作出先兆子痫预报。
除了上述组分之外,主题试剂盒将进一步包括用于实施主题方法的说明。这些说明可以多种形式存在于主题试剂盒中,一种或多种形式的说明可以存在于试剂盒中。这些说明可能存在的一种形式是作为印刷信息在合适的介质或基材上,例如,在其上印刷信息的一张或多张纸、在试剂盒的包装中、在包装插页中等。另一种方式是记录信息的计算机可读介质,例如磁盘、CD等。可能存在的另一种方式是网站地址,该地址可用于通过互联网访问所取出站点上的信息。试剂盒中可存在任何方便的方法。
实施例
现在参考以下实施例,其与以上描述一起以非限制性方式阐述本发明。通常,本文使用的命名法和本发明使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中详尽讲解。参见例如,"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等人(1989);"Current Protocols in Molecular Biology",Volumes I-IIIAusubel,R.M.编辑(1994);Ausubel等人,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"A Practical Guide toMolecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988);Watson等人,"RecombinantDNA",Scientific American Books,New York;Birren等人(编辑)"Genome Analysis:ALaboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork(1998);美国专利号4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中所述的方法;"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.编辑(1994);"Current Protocols in Immunology",卷I-III Coligan J.E.编辑(1994);Stites等人(编辑),"Basic and Clinical Immunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(编辑),"Selected Methods in CellularImmunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980);可用的免疫测定法在专利和科学文献中广泛描述,参见例如,美国专利号3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771和5,281,521;"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.编辑(1984);“Nucleic Acid Hybridization",Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1985);"Transcription and Translation"Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1984);"Animal Cell Culture",Freshney,R.I.编辑(1986);"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986);"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984);以及"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press;"PCR Protocols:A Guide ToMethods and Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak等人,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual"CSHL Press(1996);所有这些都通过并入本文作为参考,如同在本文中完全示出一样。在本文中提供了其他一般参考。相信其中的程序在本领域中是众所周知的并且是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息通过引用并入本文作为参考。
材料和方法
孕妇血浆样品的酶联免疫吸附测定法(ELISA)
在诊断先兆子痫之前,在妊娠的第15周和第20周获得来自单胎妊娠的未生育妇女队列的血浆样品。在妊娠20周后出现先兆子痫的女性在妊娠第15周和第20周时测量血浆FKBPL水平(Cloud-Clone Corp.,中国)和CD44水平(Abcam,英国),并将这些水平与年龄和BMI匹配的健康对照比较。
FKBPL的平均测定内和测定间CV分别为5.5%和17.1%。每个ELISA板包括在妊娠的每个时间点随机选择的先兆子痫样品和对照样品。操作人员也是盲的(blinded)。对于CD44 ELISA,平均测定间CV为6.9%,平均测定内CV%为3.9%。对CV(%)超过15%的任何样品进行重新分析,并且仅在CV%小于15%时才包括样品。根据数据分布进行双尾t检验或Mann-Whitney统计分析。
也在来自诊断为先兆子痫后(n=18)和匹配的血压正常的妊娠对照(n=14)的分别队列妊娠妇女的样品中测量了血浆FKBPL和CD44。
将从全血获得的EDTA血浆样品在4℃以2000rpm离心15分钟。分离后,将血浆储存在-80℃直至进一步使用。使用试剂盒提供的标准稀释剂将血浆稀释2倍用于FKBPL(Cloud-Clone Corp.,中国)或稀释40倍用于CD44(Abcam,UK)。
细胞培养
在随后的研究中使用了总共四种细胞系(BeWo、Jar、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、骨髓来源的间充质干细胞(MSC))。所有细胞系均通过供应商实施的短串联重复(STR)分析进行验证,并定期检测支原体。
a.人胎盘绒毛膜癌(BeWo)维持在补充有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中。
b.人胎盘绒毛膜癌(Jar)维持在补充有10%FBS的RPMI-1640培养基中。
c.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)维持在内皮细胞生长培养基MV2中,并在明胶包被的组织培养瓶上补充低血清生长补充剂(LSGS)。
d.MSC维持在补充有16.5%热灭活胎牛血清(FBS)、50μg/ml青霉素-链霉素(PS)和4mM L-谷氨酰胺的αMEM中,并且不晚于第7代使用。
除非另有说明,否则所有细胞培养耗材均购自Thermo Fisher Scientific(UK)。在37℃、5%CO2和95%空气的气氛中,所有细胞最初在通风的75cm2组织培养瓶(Nunc;Thermoscientific,Denmark)中单层生长。
MSC条件培养基处理
将MSC以每5个HUVEC、BeWo或Jar 1个MSC的比例接种在HUVEC、BeWo和Jar所需的细胞培养基中的6个孔板中。在21%O2条件下,允许细胞在细胞培养基中粘附和调节24小时。在实验当天之前,将条件培养基吸出、收集并以1200rpm的速度离心5分钟以去除细胞碎片。然后将条件培养基预平衡至21%(常氧)或1%(缺氧)O2,然后再用于其他下游实验。
小管(Tubule)形成测定法
为了评估HUVEC形成管状结构(tube-like structure)的能力,将7x105个HUVEC重悬在500μl MSC-CM或对照培养基中,并用钙黄绿素染色(2μg/ml;Thermo FisherScientific,UK),然后接种在不含酚红的减少生长因子Matrigel上于21%和1%O2下培养6小时。通过使用DMI8倒置荧光显微镜在每孔中随机捕获6个图像来对小管形成进行成像。使用Image J软件(NIH,USA)对总的管长度(tube length)进行定量。
创伤划痕(Wound scratch)测定法
在37℃5%CO2中允许BeWo、Jar和HUVEC达到汇合。使用无菌P200尖端从每个孔的顶部到底部进行单个垂直“划痕”创伤,穿过水平线。用PBS洗涤细胞两次以去除细胞碎片,并将500μl无血清细胞生长培养基添加到每个孔中。使用DMI8倒置光学显微镜对水平线正上方和正下方的每个孔的创伤区域进行成像,并使用AxioVision Rel.4.8软件提供的平铺扫描坐标。
在基线测量后,用500μl MSC条件培养基和规定的培养基或无血清培养基(在21%或1%O2中预平衡的)替换无血清培养基。在对创伤区域重新成像之前,将板于37℃在21%或1%O2中孵育24小时。使用ImageJ v1.48测量基线和24小时的创伤部位的面积。获得的值用于计算24小时期间创伤闭合的百分数。
实时聚合酶链反应
使用TRIzolTM试剂(Thermo Fisher Scientific,英国)提取RNA,并如前所述进行实时qPCR。22提取RNA后,使用定制的主混合液(master mix)(Thermo Fisher Scientific,UK)进行逆转录。使用Roche Lightcycler Probes 480Master试剂盒(Roche,USA)和用于人FKBPL、CD44和18S的Roche Realtime Ready TaqMan基因表达单水解探针(Roche,USA)为实时qPCR制备cDNA。使用Roche LightCycler 480软件计算得到的交叉点(crossing points,Cp),并使用标准曲线效率进行定量。将样品Cp值校正到18S水平。使用ΔΔCT法进行数据分析。
蛋白质印迹法
在迁移和侵袭测定法之后,使用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Roche,UK)的RIPA缓冲液(SantaCruz Biotechnology,USA)收获BeWo、Jar和HUVEC细胞裂解物并进行蛋白质印迹。在4x和10x Bolt LDS样品缓冲液(Thermo Fisher Scientific,英国)中还原细胞裂解物并进行蛋白质印迹。用特异性第一抗体和合适的HRP连接第二抗体IgG(Cellsignalling,UK)以1:10000检测印迹。在使用West Dura或Femto化学发光(Thermo FisherScientific,UK)孵育后,用G:Box(SynGene,India)对膜进行成像。除非另有说明,抗体CD44H(R&D Systems,目录号:BBA10);FKBPL(Proteintech,美国目录号:10060-1-AP);抗GAPDH(Cell signalling,英国,目录号:G9545);所有抗体均以1:1000使用。
统计分析
使用双尾t检验或Mann-Whitney,或单向或双向ANOVA分析数据,然后根据需要进行Sidak或Tukey多重比较检验,并报告调整后的p值。结果表示为平均值±平均值的标准误(SEM),并且如果p<0.05,则认为值具有统计学意义。使用Prism 5软件(GraphPadSoftware,La Jolla,CA,USA)进行分析。
使用SPSS 20.0(IBM,美国纽约)对与FKBPL、CD44和患者队列的临床特征相关的结果进行统计分析。在初始测试正常性(Shapiro-Wilks测试)后,根据需要,使用独立样品t检验或Mann-Whitney对组间(先兆子痫vs.对照组)差异进行测试。先兆子痫和对照样品的年龄和BMI匹配。接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)分析用于获得在妊娠第20周时测量的主要变量(CD44/FKBPL比率和平均动脉血压(MABP))的截止值。将参与者分为所讨论参数的低水平组(低于截止值(cut-off))或高水平组(高于截止值)。使用二元和多项逻辑回归评估CD44/FKBPL比率对先兆子痫发展风险的贡献,其中包括年龄、身体质量指数(body mass index,BMI)、体重变化和MABP作为可能的混杂因素。多项逻辑回归用于测试CD44/FKBPL比率和MABP对发生先兆子痫风险的组合影响。显著性设定为p<0.05。
结果
实施例I:CD44/FKBPL比率是早期确定先兆子痫风险的有效参数
发明人使用来自在整个妊娠期前瞻性跟踪的妊娠15周和20周单胎妊娠的未生育妇女的血浆样品,分别研究了FKBPL和CD44的早期生物标志物潜力,并结合了重要的临床参数。
患者特征在表2中呈现。
表2:妊娠15周和20周孕妇的临床特征
所有值均表示为平均值±SD或四分位距(interquartile range;IQR)的中位数
双尾非配对t检验(归一化分布)或Man-Whitney(非归一化分布)
BMI:身体质量指数;SBP:收缩压;DBP:舒张压;MAP:平均动脉血压
病例=先兆子痫
CD44是自妊娠第20周对先兆子痫的预测生物标志物:
当在正常孕妇的血浆中测量CD44时,然后在妊娠20周后发生先兆子痫的女性中测量CD44时,在妊娠第15周时未观察到后来发展为先兆子痫的女性(121.7±3.7SEM,n=60)和维持正常妊娠的健康对照组(115.9ng/ml±3.2SEM,n=60;图1A,p=0.23)之间CD44血浆水平的差异。
在妊娠第20周时,与维持正常妊娠的对照组相比,后来发展为先兆子痫的组中的CD44血浆水平更高(127.5ng/ml±3.8SEM,n=62vs.115.3ng/ml±3.4SEM,n=60;p=0.02)(图1A)。
FKBPL是自妊娠第15周对先兆子痫的预测生物标志物:
妊娠第15周时,与维持正常妊娠的健康对照组(1.02ng/ml±0.06SEM,n=59)相比,后来发展为先兆子痫的女性的FKBPL血浆水平(0.84ng/ml±0.06SEM,n=61)显著降低(图1B,p=0.03)。
在妊娠第20周时,分别与维持正常妊娠的对照组相比,后来发展为先兆子痫的组中FKBPL血浆水平较低(0.76ng/ml±0.05SEM,n=57vs.0.92ng/ml±0.05SEM,n=58;,p=0.01)(图1B)。
CD44/FKBPL比率是先兆子痫风险的有效早期指标
当CD44和FKBPL组合为CD44/FKBPL比率时,后来发展为先兆子痫的组和对照组之间的差异表明血浆CD44/FKBPL水平几乎增加了1.5倍[第15周:199.5±16.5SEM,n=57vs.138.7±8.3SEM,n=56(p=0.02);第20周:208.5±13.9,n=54vs.149.6ng/ml±8.7,n=55(p=0.004),图1C]。CD44/FKBPL比率作为先兆子痫的预测性生物标志物本身在妊娠第15周提供接受者工作特征(ROC)曲线上的AUC 0.629(95%CI0.527-0.732;p=0.02)和在妊娠第15周提供接受者工作特征(ROC)曲线上的AUC 0.659(95%CI 0.55–0.76;p=0.004)(图1D)。
基于ROC分析,确定妊娠第20周时CD44/FKBPL比率在100-300范围内表示妊娠后期发生先兆子痫的风险增加1.5至5.0倍是可能的。也可以从数据外推出具体的截止点:CD44/FKBPL比率的合适截止点为143.6(敏感性=0.7,特异性=0.5)和155.1(敏感性=0.6和特异性0.6),用于预测妊娠第20周时先兆子痫的风险。使用这些截止点,单变量逻辑回归模型表明,在妊娠第20周时CD44/FKBPL比率高于143.6的女性在妊娠后期发生先兆子痫的风险增加2.5倍(OR=2.5 95%CI 1.12-5.41,p=0.02);以及155.1的截止点使妊娠后期发生先兆子痫的风险增加2.4倍(OR=2.4 95%CI 1.09-5.08,p=0.03)。
使用BMI、年龄、体重变化和平均动脉血压(MABP)作为混杂因素的多变量逻辑回归模型表明,CD44/FKBPL比率与先兆子痫独立相关(143.6截止值:OR=2.3 95%CI 1.03-5.2,p=0.04;155.1截止值:OR=2.3 95%CI 1.05–5.2,p=0.04;下表2)。使用多项逻辑回归模型研究了CD44/FKBPL和MABP对发生先兆子痫风险的组合影响。参与者分为四组:(第1组)低风险(参照)组-CD44/FKBPL比率(<143.6或155.1)和MABP(<82.5mmHg)水平低的女性;(第2组)中风险1组包括具有高CD44/FKBPL(>143.6或155.1)和低MABP(<82.5mmHg)的妊娠;(第3组)中风险2组包括具有CD44/FKBPL比率低和MABP高的妊娠,以及(第2组)高风险组(CD44/FKBPL>143.6或155.1和MABP>82.5mmHg)(表2)。
综合数据的分析表明,将CD44/FKBPL比率和MABP组合提供了在妊娠第20周时预测先兆子痫风险的增加的准确性,有效地将OR的范围从没有MABP的1.5-5.0扩展到高达3-12倍且MABP>82.5。统计学显著性仅限于高风险模型,其显示为3.9倍(截止点143.5:95%CI1.3-11.8,p=0.02,表3a)和4.1倍(截止点155.1:95%CI 1.4-12.4,p=0.01,表3b)增加发生先兆子痫的风险。
表3a和3b:基于低风险参照值的妊娠第20周时低或高水平MABP和低或高水平CD44/FKBPL比率的组合,发生先兆子痫的比值比(OR)
表3a
表3b
a基于ROC分析确定CD44/FKBPL比率(143.5(表3a)或155.1(表3b))和MABP(82.5mmHg)的截止值
b低风险:低CD44/FKBPL和低MABP-参照类别
c中风险1:高CD44/FKBPL和低MABP
d中风险2:低CD44/FKBPL和高MABP
e高风险:高CD44/FKBPL和高MABPOR,比值比(odds ratio);CI,置信区间
总之,这些结果表明,在妊娠第20周或之后测量,可溶性CD44是妊娠第30周或之后发生先兆子痫风险的有效生物标志物。令人惊讶的是,结果还表明,虽然CD44在妊娠第15周时没有升高,但血浆CD44/FKBPL比率是妊娠第30周或之后发生先兆子痫倾向和/或风险的更有效指标,直至妊娠第20周其敏感性和特异性增加。
MABP参数的添加进一步提高了血浆CD44/FKBPL比率对早期检测孕妇先兆子痫的存在或风险的预测价值,从而在妊娠20周后筛查和应用对先兆子痫的治疗具有更高的准确性.
总之,高CD44/FKBPL比率是与BMI、年龄、体重变化和MABP无关的对先兆子痫的风险因素。结合MABP、高CD44/FKBPL比率和高MABP与先兆子痫风险增加约4倍相关。
实施例II:先兆子痫中FKBPL和CD44的变化
血浆FKBPL和CD44水平以及来自MSC的FKBPL在诊断患有先兆子痫的女性中显示出相反的趋势。
使用分别的患者队列,血浆FKBPL和CD44水平(n=18,先兆子痫;n=14,对照)以及从分离自患有先兆子痫的孕妇(n=3)和血压正常对照(n=3)的MSC分泌的FKBPL进行了分析。与诊断前的测量相比,在妊娠第15周和20周时,与对照组相比,诊断为先兆子痫的女性血浆FKBPL水平升高(图2A;0.81ng/ml±0.018SEM vs 0.76ng/ml±0.011SEM,p<0.05),而血浆CD44水平在相同样品中降低(图2B;85.1ng/ml±4.2SEM vs 104.7ng/ml±4.9SEM,p<0.01)。与对照组相比,先兆子痫病例的CD44/FKBPL比率也显著降低(图2C;105.3ng/ml±5.5SEM vs 136.3ng/ml±5.2,p<0.001)。
与健康的妊娠对照相比,从进行剖腹产的孕妇的脂肪组织培养的MSC分泌的FKBPL在来自先兆子痫诊断后的妇女培养的细胞中更高(图2D)。
表4显示了先兆子痫发作(onset)期间CD44和FKBPL的趋势:
总之,这些数据表明血清FKBPL和CD44可以是有效的生物标志物,不仅用于确定风险,而且用于监测有先兆子痫风险的妇女,以及用于确定诊断后妊娠管理的选项。
实施例III:暴露于缺氧或用MSC治疗后,内皮细胞和滋养层细胞的血管生成功能改善,与FKBPL水平降低和CD44水平升高有关
研究了缺氧和MSC条件培养基(MSC-CM)对内皮细胞小管形成和滋养层迁移的影响,以及滋养层对FKBPL信号传导的影响。在小管形成测定法中,在完全/正常培养基中,在常氧和缺氧之间观察到HUVEC的小管网络的长度增加(p=0.014,n=6)。在常氧条件下(p=0.002,n=6)和缺氧条件下(p=0.02,n=6;图3A),在Matrigel中播种细胞后6小时,与完全培养基相比,MSC-CM处理还导致HUVEC的小管网络长度增加。总体而言,由于缺氧或MSC-CM而改善的血管生成特性与在完全培养基条件下暴露于缺氧后FKBPL蛋白水平降低有关(p<0.01,n=6),以及在完全培养基条件和MSC-CM条件之间常氧中有区别(p<0.01,n=6;图3B)。在缺氧中,由于MSC-CM处理HUVEC,FKBPL在mRNA水平上降低(p=0.021,n=3),且CD44同时增加(p=0.005,n=3)(图3C)。
当滋养层细胞BeWo和Jar暴露于缺氧和/或MSC-CM时,由于缺氧,在完全培养基和MSC-CM中也观察到细胞迁移增加[BeWo:p=0.03(完全培养基;n=3),p=0.01(MSC-CM,n=3);Jar:p=0.002(完全培养基,n=3),p<0.001(MSC-CM,n=3);图4A和图4B],以及MSC在常氧(BeWo:p=0.02,n=3;Jar:p=0.04,n=3;图4A和图4B)或在缺氧(BeWo:p=0.008,n=3;Jar:p=0.001,n=3;图4A和图4B)。在BeWo细胞和Jar细胞中观察到与HUVEC细胞相似的表明FKBPL mRNA表达下调和CD44 mRNA表达上调的趋势(图4C和图4D)。
总之,这些数据表明FKBPL和CD44参与介导缺氧或MSC-CM对内皮细胞和滋养层细胞的促血管生成作用。
Claims (51)
1.确定妊娠女性人类受试者发生先兆子痫风险的方法,所述方法包括使用结合CD44的试剂检测受试者生物样品中CD44的水平,其中样品中CD44的水平高于预定阈值指示受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品是妊娠第20周及之后的样品。
3.根据权利要求1所述的方法,还包括在来自较晚妊娠周的样品中重复所述检测至少一次,并与较早的CD44水平比较,其中在较晚的检测中CD44水平相对于较早的CD44水平的增加指示受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加,并且其中较晚的妊娠周不晚于妊娠第30周。
4.确定妊娠女性人类受试者发生先兆子痫风险的方法,所述方法包括:
a)使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,
b)确定样品中CD44/FKBPL的比率,
c)其中样品中CD44/FKBPL比率高于预定阈值指示受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述样品是妊娠第15-30周的样品。
6.根据权利要求4所述的方法,还包括在来自较晚妊娠周的样品中重复检测CD44和FKBPL的水平,并确定CD44/FKBPL比率至少一次,以及与较早的CD44/FKBPL比率比较,其中较晚检测中的CD44/FKBPL比率相对于较早CD44/FKBPL比率的增加指示受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加,并且其中较晚妊娠周不晚于妊娠第30周。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法,其还包括确定所述受试者的平均动脉血压,且其中所述样品中升高的MABP和高于预定阈值的CD44/FKBPL比率指示所述受试者在妊娠第30周或之后发生先兆子痫的风险增加。
8.用于在妊娠第20-30周管理妊娠女性人类受试者的妊娠的方法,所述方法包括:
a)使用结合CD44的试剂检测受试者生物样品中的CD44水平,
b)其中样品中CD44的水平高于预定阈值指示对受试者进行高风险妊娠管理。
9.在妊娠第15-30周管理妊娠女性人类受试者的妊娠的方法,所述方法包括:
a)使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,
b)确定样品中的CD44/FKBPL比率,
c)其中样本中的CD44/FKBPL比率高于预定阈值指示对受试者进行高风险妊娠管理。
10.根据权利要求9所述的方法,还包括确定所述受试者的平均动脉血压,并且当平均动脉血压升高并且CD44/FKBPL比率高于预定阈值时,对所述受试者进行高风险妊娠管理。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法,其中所述高风险妊娠管理包括监测受试者的血压和蛋白尿。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述受试者表现出选自血压、蛋白尿和肝功能的至少一种先兆子痫指标的正常值。
13.治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,所述方法包括:
a)使用结合CD44的试剂检测受试者生物样品中的CD44水平,其中所述生物样品是妊娠第20-30周的,
b)其中生物样品中的CD44水平高于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和
c)其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则在妊娠第30周或之后治疗受试者的先兆子痫。
14.根据权利要求13所述的方法,其中步骤(a)进一步包括确定受试者的平均动脉血压,且步骤(b)包括测试受试者,其中CD44和平均动脉血压的水平高于预定阈值,并且其中先兆子痫的所述至少一种指标不是平均动脉血压。
15.治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,所述方法包括:
a)使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述生物样品是妊娠第15-30周的,
b)其中生物样品中CD44/FKBPL水平的比率高于预定阈值,则测试受试者的先兆子痫的至少一种指标,和
c)其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则在妊娠第30周或之后治疗受试者的先兆子痫。
16.治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,所述方法包括:
a)使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的第一生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述第一生物样品是妊娠第15-30周的,
b)使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的第二生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述第二生物样品是妊娠周晚于妊娠第30周的,
c)其中所述第一生物样品中CD44/FKBPL水平的比率高于第一预定阈值并且所述第二生物样品中CD44/FKBPL水平的比率低于第二预定阈值,则测试受试者先兆子痫的至少一种指标,和
d)其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
17.根据权利要求16所述的方法,其中步骤(a)进一步包括确定受试者的平均动脉血压,并且步骤(b)包括测试受试者,其中CD44/FKBPL水平的比率和平均动脉血压高于预定阈值,并且其中先兆子痫的所述至少一种指标不是平均动脉血压。
18.根据权利要求16或17所述的方法,其中所述至少一种指标选自高血压、蛋白尿、低血小板计数、受损的肝功能、肾脏问题的迹象(除了蛋白尿之外的迹象)、肺水肿和头痛或视觉障碍。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的方法,其中所述先兆子痫治疗选自抗高血压治疗、类固醇和癫痫发作预防。
20.治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,所述方法包括:
a)使用结合CD44的试剂检测受试者生物样品中的CD44水平,其中所述生物样品是妊娠周晚于妊娠第30周的,
b)其中所述生物样品中的CD44水平低于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和
c)其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
21.根据权利要求20所述的方法,其中先兆子痫的所述至少一种指标是平均动脉血压。
22.治疗妊娠女性人类受试者的先兆子痫的方法,所述方法包括:
a)使用结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂检测受试者的生物样品中的CD44水平和FKBPL水平,其中所述生物样品是妊娠周晚于妊娠第30周的,
b)其中所述生物样品中CD44/FKBPL水平的比率低于预定阈值,则对受试者测试先兆子痫的至少一种指标,和
c)其中先兆子痫的所述至少一种指标是阳性的,则治疗受试者的先兆子痫。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述至少一种指标选自高血压、蛋白尿、血小板计数、受损的肝功能、肾脏问题的迹象(除了蛋白尿之外的迹象)、肺水肿和头痛或视觉障碍。
24.根据权利要求22所述的方法,其中先兆子痫的所述至少一种指标不是MABP。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法,其中所述先兆子痫治疗选自抗高血压治疗、类固醇和癫痫发作预防。
26.根据权利要求1-24中任一项所述的方法,其中所述生物样品是全血或分离的血液级分。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述分离的血液级分是血清或血浆。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述结合CD44的试剂是特异性结合CD44的抗体。
29.根据权利要求4-7、9-11和14-27中任一项所述的方法,其中所述结合FKBPL的试剂是特异性结合FKBPL的抗体。
30.根据权利要求28或29所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法,其中所述预定阈值是正常、健康的怀孕孕龄匹配女性中的CD44水平或CD44/FKBPL的比率。
32.包含妊娠女性人类受试者的生物样品的物质组合物,其包含结合CD44的试剂和结合FKBPL的试剂。
33.一种物质组合物,其包含:a)妊娠女性人类受试者的生物样品的第一部分,其包含结合CD44的试剂,和b)妊娠女性人类受试者的生物样品的第二部分,其包含结合FKBPL的试剂。
34.根据权利要求32或33所述的物质组合物,其中所述生物样品是全血或分离的血液级分。
35.根据权利要求34所述的物质组合物,其中所述分离的血液级分是血浆或血清。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的物质组合物,其中所述样品是15周和15周以上妊娠周的样品。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的物质组合物,其中所述结合CD44的试剂是特异性结合CD44的抗体。
38.根据权利要求32-36中任一项所述的物质组合物,其中所述结合FKBPL的试剂是特异性结合FKBPL的抗体。
39.根据权利要求37或38所述的物质组合物,其中所述抗体是单克隆抗体。
40.用于诊断妊娠女性人类受试者的先兆子痫或发生先兆子痫的风险的诊断试剂盒,所述试剂盒包含:(a)特异性结合可溶性CD44的第一试剂,其中所述第一试剂可检测地标记或偶联至酶;(b)CD44的正常参考样品,其中CD44的正常参考样品是包含在没有先兆子痫或没有发生先兆子痫风险的妊娠人类女性受试者中;未患有早发性先兆子痫或子痫的妊娠人类女性受试者中发现的CD44水平的样品;(c)结合可溶性FK506结合蛋白样蛋白(FKBPL)的第二试剂,其中所述第二试剂可检测地标记或偶联至酶,和(d)FKBPL的正常参考样品,其中FKBPL的正常参考样品是包含在没有先兆子痫或没有发生先兆子痫风险的妊娠人类女性受试者中;未患有早发性先兆子痫的妊娠人类女性受试者中发现的FKBPL水平的样品。
41.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述CD44的正常参考样品含有浓度范围在20和300ng/ml之间的CD44。
42.根据权利要求40和41所述的试剂盒,其中所述FKBPL的正常参考样品包含浓度范围在0.1和5ng/ml之间的FKBPL。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的试剂盒,其中所述结合FKBPL的试剂是抗体或其FKBPL结合片段。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的试剂盒,其中所述结合CD44的试剂是抗体或其CD44结合片段。
45.根据权利要求43或44所述的试剂盒,其中所述抗体是单克隆抗体。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的试剂盒,其中将结合CD44的试剂和/或结合FKBPL的试剂固定在固相中。
47.一种用于治疗先兆子痫的药剂,其用于表现出如下CD44水平的妊娠人类女性受试者:
a)来自其的生物样品中的CD44水平大于预定阈值,其中该样品来自妊娠20-30周;或者
b)低于第二预定阈值,其中该样品来自妊娠30周或30周以上。
48.一种用于治疗先兆子痫的药剂,用于表现出如下CD44/FKBPL比率的妊娠人类女性受试者:
a)来自其的生物样品中的CD44/FKBPL比率大于预定阈值,其中该样品来自妊娠15-30周,或者
b)低于第二预定阈值,其中该样品来自妊娠30周或30周以上。
49.根据权利要求48所述的用于治疗的药剂,其中所述妊娠人类女性受试者进一步表现出升高的MABP。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的用于治疗的药剂,其中所述生物样品是全血或分离的血液级分。
51.根据权利要求50所述的用于治疗的药剂,其中所述分离的血液级分是血浆或血清。
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