CN114901258A - 分离的具有较小尺寸的线粒体和包裹分离的线粒体的基于脂质膜的囊泡 - Google Patents

Abstract

根据本发明，提供了一种包含具有较小尺寸的线粒体的群体和将线粒体包裹在封闭空间中的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物，以及生产所述组合物的方法。

Description

分离的具有较小尺寸的线粒体和包裹分离的线粒体的基于脂 质膜的囊泡

与相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月27日提交的日本申请号2019-239479的优先权利益，其全部内容通过参考并入本文。

技术领域

本发明涉及分离的具有较小尺寸的线粒体和包裹分离的线粒体的基于脂质膜的囊泡。

背景技术

线粒体功能障碍例如呼吸链复合体功能障碍，是造成线粒体疾病和衰老的主要原因。线粒体功能的降低影响许多器官中主要与线粒体疾病和年龄相关疾病有关的细胞。为了克服这个问题，已尝试将线粒体引入到细胞中(US9,603,872B)。在专利文献1中，将线粒体与lipofectamine 2000试剂混合以获得线粒体与lipofectamine的脂质复合体(即lipofectamine粒子与游离形式的线粒体粒子的缔合)。在US9,603,872B中，证实了所得到的脂质复合体被引入到细胞中。然而，在US9,603,872B中，引入的脂质复合体的生理作用尚未得以证实。

已开发了一种被称为微流道装置的技术，用于通过使用宽度为100至200μm的通道形成脂质体(Kimura N.等，ACS Omega,3:5044-5051,2018)。根据Kimura N.等，2018，可以获得基于脂质膜且粒度为约10nm至100nm的囊泡。

发明内容

本发明提供了包裹分离的线粒体的基于脂质膜的囊泡以及生产所述囊泡的方法。

本发明人获得了一种包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物。可以设想所述囊泡各自具有由脂质膜形成的用于包含线粒体的袋状膜结构(封闭空间)。

例如，本文中提供了下述发明。

(1)一种组合物，其包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体。

(2)根据条目(1)所述的组合物，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有当通过动态光散射测定时在小于1μm处具有峰的粒度分布。

(3)根据条目(2)所述的组合物，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布。

(4)根据条目(1)至(3)中的任一条所述的组合物，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有小于0.5的PDI。

(5)根据条目(1)至(4)中的任一条所述的组合物，其中被包裹的线粒体可以被并入到与其接触的细胞的细胞质中，并且所述线粒体可以与所述细胞质中的内源线粒体融合。

(6)根据条目(1)至(6)中的任一条所述的组合物，其用于将线粒体递送到细胞内。

(7)根据条目(6)所述的组合物，其用于提高细胞中线粒体的呼吸活性。

(8)一种用于生产根据条目(1)所述组合物的方法，所述方法包括：

使包含分离的线粒体的水性溶液和包含可以形成脂质膜的脂质的乙醇溶液在微流道装置内的汇合通道中彼此接触，以混合所述溶液。

(9)根据条目(8)所述的方法，其中所述微流道装置包含用于促进在所述汇合通道中彼此接触的溶液的混合的流动通道，所述流动通道具有挡板结构。

此外，还提供了下述发明。

[1]一种组合物，其包含线粒体群体，其中所述群体具有当通过动态光散射测定时在小于1μm处具有峰的粒度分布。

[2]根据条目[1]所述的组合物，其中所述群体具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布。

[3]根据条目[1]或[2]所述的组合物，其中所述群体具有小于0.5的PDI。

[4]一种组合物，其包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有当通过动态光散射测定时在小于1μm处具有峰的粒度分布。

[4A]根据条目[1]所述的组合物，其中50％或更多的所述线粒体被各自包裹在基于脂质膜的囊泡中。

[5]根据条目[4]或[4A]所述的组合物，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布。

[6]根据条目[4]至[5](即条目[4]、[4A]和[5])中的任一条所述的组合物，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有小于0.5的PDI。

[7]根据条目[4]至[6]中的任一条所述的组合物，其中被包裹的线粒体可以被并入到与其接触的细胞的细胞质中，并且所述线粒体可以与所述细胞质中的内源线粒体融合。

[8]根据条目[4]至[7]中的任一条所述的组合物，其用于将线粒体递送到细胞内。

[9]根据条目[8]所述的组合物，其用于提高细胞中线粒体的呼吸活性。

[10]一种用于生产根据条目[4]或[4A]所述的组合物的方法，所述方法包括：

使包含分离的线粒体的水性溶液和包含可以形成脂质膜的脂质的乙醇溶液在微流道装置内的汇合通道中彼此接触，以混合所述溶液。

[11]根据条目[10]所述的方法，其中所述微流道装置包含用于促进在所述汇合通道中彼此接触的溶液的混合的流动通道，所述流动通道具有挡板结构。

在本发明中，线粒体可以被包裹在适用于药物制剂的囊泡中。含有具有单分散粒度分布(即PDI≤0.5)和/或在尺寸分布中在小于1μm处具有峰的线粒体的基于脂质膜的纳米囊泡的群体，也适用于药物制剂。

[12]一种测量分离的线粒体或被包裹的线粒体中的线粒体DNA水平的方法，所述方法包括在包含所述分离的线粒体或被包裹的线粒体的样品中扩增所述线粒体DNA的至少一部分以获得所扩增的DNA的扩增子，并对所述扩增子进行计数以获得所述线粒体DNA水平。

[13]根据条目[12]所述的方法，其还包括将所述测量到的线粒体DNA水平与标准值进行比较。

附图说明

图1示出了通过动态光散射(DLS)和ζ电位(ζ)所测定的从细胞分离的线粒体的悬液的粒度分布和PDI。a)示出了在冷冻之前分离的线粒体(在使用时制备的产物)的数据，b)示出了在冻融过程后分离的线粒体(冷冻产物)的数据。

图2示出了使用荧光染料(TMRE)检测的在使用时制备的产物和冷冻产物中线粒体的极化的结果。从每个在使用时制备的产物和冷冻产物观察荧光。

图3的子图a)示出了使用微流道装置和后续的透析来制备纳米囊泡的方案。图3的子图b)示出了通过使含脂质有机相和水性缓冲液(水性相)在微流道装置内的汇合通道中彼此接触以混合它们来制备纳米粒子的方案；所述有机相和水性相的组成及其流速，通过DLS测定的所得到的纳米粒子的粒度分布及其PDI和ζ电位(ζ)。

图4示出了通过使含脂质有机相和含有分离的线粒体的水性缓冲液(水性相)在微流道装置内的汇合通道中彼此接触以混合它们来制备包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的方案；所述有机相和水性相的组成及其流速，通过DLS测定的所得到的囊泡的粒度分布和PDI及其ζ电位(ζ)。

图5-1的子图a)示出了在所述有机相是不含脂质的有机相(50％乙醇溶液)并且所述水性相是含有分离的线粒体的水性缓冲液的情况下，通过DLS测定的所得到的粒子的粒度分布和PDI及其ζ电位(ζ)；并且子图b)示出了在所述有机相是含有硬脂基化八聚精氨酸(STR-R8)的有机相并且所述水性相是含有分离的线粒体的水性缓冲液的情况下，通过DLS测定的所得到的粒子的粒度分布和PDI及其ζ电位(ζ)。

图5-2的子图c)示出了在使用水性缓冲液代替所述有机相并且所述水性相是含有分离的线粒体的水性缓冲液的情况下，通过DLS测定的所得到的粒子的粒度分布和PDI及其ζ电位(ζ)。

图6示出了根据图4的方案通过微流道装置制备的纳米粒子的荧光显微镜图像(在这里，脂质用DOPE-N-(7-硝基-2-1,3-苯并

二唑-4-基)(NBD-DOPE)荧光染色；而线粒体用MitoTracker(商标)深红染色)。子图a)示出了来自于分离的线粒体的荧光信号；子图b)示出了来自于脂质的荧光信号，并且子图c)示出了它们的合并信号，表明它们几乎完全共定位。

图7示出了通过化学固定法固定的分离的线粒体的电子显微镜图像。

图8示出了按照图3的子图b)的方案制备并通过负染法染色的纳米胶囊的电子显微镜图像。图8显示所得到的纳米胶囊的内部出乎意料地被脂质(脂质层)填满。

图9示出了按照图4的方案制备并通过负染法染色的纳米粒子的电子显微镜图像。在所述负染法中，线粒体不产生对比，结果线粒体本身无法被检测。

图10示出了按照图5-1的子图b)的方案获得的用STR-R8处理并通过化学固定法固定的分离的线粒体的电子显微镜图像。

图11示出了按照除了脂质类型被改变之外与图4中相同的方案获得的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的通过DLS测定的粒度分布和PDI及其ζ电位(ζ)。子图a)和b)示出了使用不含线粒体的水性溶液的阴性对照的数据。子图c)和d)示出了在除了所述水性溶液是含有分离的线粒体的水性缓冲液之外分别与子图a)和b)中相同的条件下获得的结果。

图12示出了被引入到微流道装置中的溶液的流速，得到的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的通过DLS测定的粒度分布和PDI，以及ζ电位(ζ)。

图13示出了通过将所得到的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡与培养的人类细胞接触并将它们温育3小时而获得的细胞的共焦激光扫描显微镜图像。在图13中，将存在于人类细胞内的线粒体用MitoTracker(商标)绿染色，并将所述包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡中的线粒体用MitoTracker(商标)深红染色。在所述温育的细胞中，由从这些线粒体分别发射的荧光形成的图像在位置上几乎完全匹配(参见HeLa mito绿、分离的mito红和合并)。

图14示出了通过将未包装在囊泡中的分离的线粒体与培养的人类细胞接触并将它们温育3小时而获得的细胞的共焦激光扫描显微镜图像。在图14中，将存在于人类细胞内的线粒体用MitoTracker(商标)绿染色，并将所述分离的线粒体用MitoTracker(商标)深红染色。图14显示在所述细胞内事实上未观察到源自于分离的线粒体的信号。

图15示出了通过将未包装在囊泡中并用STR-R8处理的分离的线粒体与培养的人类细胞接触并将它们温育3小时而获得的细胞的共焦激光扫描显微镜图像。在图15中，将存在于人类细胞内的线粒体用MitoTracker(商标)绿染色，并将所述分离的线粒体用MitoTracker(商标)深红染色。图15显示在所述细胞内事实上未观察到源自于分离的线粒体的信号。在图15中，左下方子图显示了温育的人类培养细胞的光学显微镜图像，表明诱导了细胞死亡。

图16示出了通过将未包装在囊泡中的分离的线粒体与培养的人类细胞(人心脏前体细胞)接触并将它们温育3小时而获得的细胞的共焦激光扫描显微镜图像。在图16中，将存在于人类细胞内的线粒体用MitoTracker(商标)绿染色，并将所述分离的线粒体用MitoTracker(商标)深红染色。图16显示在所述细胞内事实上未观察到源自于分离的线粒体的信号。

图17示出了通过将未包装在囊泡中并用STR-R8处理的分离的线粒体与培养的人类细胞(人心脏前体细胞)接触并将它们温育3小时而获得的细胞的共焦激光扫描显微镜图像。在图17中，将存在于人类细胞内的线粒体用MitoTracker(商标)绿染色，而将所述分离的线粒体用MitoTracker(商标)深红染色。图17显示在所述细胞内事实上未观察到源自于分离的线粒体的信号。

图18示出了通过从心肌获得人心肌干细胞(hCDC)并从hCDC分离线粒体来获得包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡的方案。

图19示出了通过将包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡与从MELAS患者获得的皮肤成纤维细胞接触并将它们温育3小时或24小时而获得的细胞的线粒体呼吸活性的测量结果。

图20示出了通过将包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡与从LHON患者获得的皮肤成纤维细胞接触并将它们温育3小时或24小时而获得的细胞的线粒体呼吸活性的测量结果。

图21示出了通过将包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡或lipofectamine和线粒体的脂质复合物(LFN iso Mt)与正常成纤维细胞接触并将它们温育24小时而获得的细胞的线粒体呼吸活性的测量结果。LFN iso Mt降低所述细胞的线粒体呼吸活性。由此看出，LFN iso Mt进入所述细胞并对线粒体造成毒性。

图22示出了通过将包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡或lipofectamine和线粒体的脂质复合物(LFN iso Mt)与从Leigh脑病患者获得的皮肤成纤维细胞接触并将它们温育24小时而获得的细胞的线粒体呼吸活性的测量结果。

图23示出了通过将包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡或lipofectamine和线粒体的脂质复合物(LFN iso Mt)与从LHON患者获得的皮肤成纤维细胞接触并将它们温育24小时而获得的细胞的线粒体呼吸活性的测量结果。

图24示出了包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡和LFN iso Mt被并入到细胞中的能力。

图25示出了LFN iso Mt的通过DLS测定的粒度分布和PDI以及ζ电位(ζ)。在LFNiso Mt中，ζ电位值接近于0。由此看出，得到了其中带负电荷的线粒体和带正电荷的LFN被电中和的复合体。

图26示出了被负染色的lipofectamine 2000(LFN)和LFN与分离的线粒体的混合物(LFN+Mt)的电子显微镜图像(分别在子图B和A中)。

图27示出了通过化学固定染色的分离的线粒体(子图A)和lipofectamine 2000(LFN)与分离的线粒体的混合物(LFN+Mt)(在子图B中)的电子显微镜图像。图27的子图C示出了分别用MITO-Q和LFN+Mt处理的细胞的存活比。

图28示出了基于所得到的结果的lipofectamine与分离的线粒体的复合体的示意图(子图a)和包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的示意图(子图b)。

图29A示出了通过图中指明的各种不同方法分离的线粒体的膜电位测定的结果。使用MitoTracker深红作为线粒体膜电位指示剂。

图29B示出了通过图中指明的各种不同方法分离的线粒体的膜电位测定的结果。使用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)作为线粒体膜电位指示剂。

图30A示出了在用所述被包裹的线粒体或LFN处理的线粒体处理的细胞中用于线粒体呼吸活性的测定法的概述。

图30B示出了所述线粒体呼吸活性的测定结果。

图30C以条状图格式示出了所述线粒体呼吸活性的测定结果。

图31A示出了为通过定量PCR确定的DNA浓度和通过BradFord法测量的蛋白质浓度拟合的校准曲线。

图31B示出了为通过PCR方法获得的扩增子的拷贝数和模板浓度拟合的校准曲线。

图31C示出了通过图中指明的方法分离的线粒体中mtDNA的拷贝数。使用总线粒体蛋白量将所述拷贝数标准化。

图31D示出了通过图中指明的方法分离的被包裹的线粒体中mtDNA的拷贝数。使用总线粒体蛋白量将所述拷贝数标准化。

图31E示出了用通过图中指明的方法分离的被包裹的线粒体处理的细胞的基线呼吸活性。

图31F示出了用通过图中指明的方法分离的被包裹的线粒体处理的细胞的最大呼吸活性。

图31G示出了通过图中指明的方法分离的线粒体中TFAM的量。使用总线粒体蛋白量将所述量标准化。

图31H示出了在通过图中指明的各种不同方法分离的线粒体中包含的总蛋白的浓度。D-Mt通过常规去污剂方法分离，Q(pH 7.4)使用pH 7.4的缓冲液通过iMIT分离，Q(pH8.9)使用pH 8.9的缓冲液通过iMIT分离。

图32A示出了通过包裹使用iMIT方法从人心脏祖细胞(hCPC)分离的线粒体而制备的hCPC-MITO-Q的粒度分布。

图32B示出了在使用或未使用hCPC-MITO-Q处理的细胞内线粒体的TMRM染色的结果。

图33示出了在用图中指明的样品处理的细胞中线粒体呼吸活性的结果。项目“Res-hCPC-MITO-Q”表示从用包封白藜芦醇的MITO-Porter处理的hCPC制备的MITO-Q。

图34A示出了测定方案的时间过程。

图34B示出了用MITO-Q处理的细胞在图中指明的温育时间后的最大呼吸活性。

图35示出了用MITO-Q处理的细胞在4℃下储存图中指明的各种不同时间长度后的最大呼吸活性。

图36示出了显示微流道装置的结构的参考图。在所述图中，大箭头指示通道的液体流动方向。

具体实施方式

在本说明书中，“线粒体”是存在于真核细胞的细胞质中的一种细胞内细胞器。可以想到的是，线粒体通过电子传递系统在细胞内生产ATP(通过氧化磷酸化)中发挥作用。线粒体具有独立于细胞核的DNA的自身DNA(线粒体DNA)，其编码线粒体组分因子(例如电子传递系统中呼吸链复合体的蛋白质)。线粒体DNA的突变有时损害线粒体功能。线粒体的功能失常可以导致被称为线粒体疾病的疾病。为了克服这个问题，已尝试了供应外源线粒体作为疗法。

在本说明书中，“囊泡”是指一种采取粒子形式的物体，在内部具有被膜包围的封闭空间。封闭空间是指物质的物理、化学和/或生理迁移受到限制的空间。

在本说明书中，“基于脂质膜的囊泡”是指由包含脂质作为主要组成成分的膜形成的囊泡，例如脂质体。置于水性溶液中的两亲性脂质或阳离子或阴离子脂质可以形成囊泡，其由脂质双层(特别是单一脂质双层)构成，在其中具有包含水性溶液的封闭空间。

在本说明书中，“包裹”是指预定物质被包裹在物质的迁入/迁出受到限制的封闭空间内的状态。因此，被包裹的线粒体将被分隔在由膜结构形成的中空囊或囊泡中的封闭空间内。具有脂质双层膜的基于脂质膜的囊泡通常被称为脂质体。脂质膜结构通常对水、血液或其他水性溶液没有渗透性或渗透性很低。因此，在线粒体向细胞的递送期间，被包裹的线粒体可以在体液中受到完全包装整个线粒体的膜结构的保护。当膜的组成与细胞膜的组成相似时或者当膜结构的表面具有正电荷时，所述膜结构可以促进所述被包裹的线粒体进入细胞。线粒体是否被包裹在基于脂质膜的囊泡中，可以例如通过下述方法来确认：将线粒体和脂质分别染色，形成其中包裹有所述线粒体的囊泡，并在通过光学显微镜(例如如果使用荧光染料的话通过荧光显微镜)观察时寻找所述线粒体和脂质的相应颜料的共同存在，并在通过电子显微镜观察形态时通过负染色寻找中空脂质膜(或其横截面)的存在。线粒体是否被包裹在基于脂质膜的囊泡中，可以例如通过将所述囊泡与细胞接触并观察所述线粒体是否可以被引入到细胞质中来确认，或者在囊泡的脂质膜带正电荷的情况下可以通过检查是否获得例如10mV或更高的正ζ电位来确认。在本说明书中，“游离形式的”线粒体是指分离的线粒体，并且特别用于清楚地描述未包裹在囊泡中的线粒体。在本说明书中，除非另有说明，否则“分离的线粒体”或“线粒体”是指游离形式的线粒体。

在本说明书中，“群体”是指一组多个相同或不同的物质。在本说明书中，“包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体”是一组至少多个相同或不同的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡。所述群体可能不总是均质的，并且可能具有物理、化学和/或生理学分布。所述物理分布包括例如粒度和多分散指数。所述化学分布包括例如ζ电位分布和脂质组成分布。所述生理学分布包括例如生理功能(例如呼吸活性)的差异。

在本说明书中，“动态光散射”(DLS)是指用于在纳米量级上确定溶液中的细小粒子的尺寸的技术。用于测量粒度和多分散性的方法被定义在例如ISO22412:2017中。在动态光散射中，可以获得粒子的尺寸分布。具体来说，平均粒度可以根据累积量分析法(ISO22412)，从散射光强度的自相关函数获得。在本说明书中，“峰”是指在示出了测量到的粒度分布的直方图中指示最高频率的部分。如果线粒体被完整地分离，则可以想象所述分离的线粒体显示出通常在约1μm处附近具有峰的粒度分布。

在本说明书中，“多分散指数”(PDI)(或者被称为多分散性)是评估通过DLS获得的粒度分布的宽度的指数。PDI可以根据累积量分析法(ISO22412)，从散射光强度的自相关函数获得。PDI＝0表示溶液中的一组粒子完全由尺寸相同的粒子组成，PDI最大为1。如果PDI为0.5或更大，则认为一组粒子具有多分散性。线粒体(细胞内细胞器)的粒度分布具有多分散性，并且分离的线粒体被认为通常具有0.5或更大的PDI。

在本说明书中，“ζ电位”是指可以根据Helmholtz-Smoluchowski方程通过电泳光散射计算的电位。ζ电位定义如下。当粒子相对于溶液运动时，具有一定厚度的溶液层与所述粒子一起运动。所述层的表面(滑动面)与溶液的位于距所述表面足够远的主体部分之间的电位差被定义为ζ电位。ζ电位可以通过电泳光散射法测量，并在溶液的介电常数、溶液的黏度、粒子的迁移速度和电场的基础上根据Helmholtz-Smoluchowski方程得到。线粒体在呼吸过程中将质子从内膜释放到外部。因此，线粒体被负极化并具有负ζ电位。当线粒体被包裹在基于脂质膜的囊泡中时，ζ电位在所述脂质膜基质的组成的基础上确定。因此，线粒体对ζ电位没有影响或影响有限。

在本说明书中，“呼吸”是指线粒体在电子传递系统中利用线粒体从内部释放的质子的浓度梯度消耗氧来产生ATP的活性。线粒体的呼吸活性是指线粒体的呼吸能力，其可以例如通过线粒体的耗氧率(OCR)来确定。所述耗氧率可以例如通过细胞外通量分析仪来确定。更具体来说，将呼吸链复合体的底物例如苹果酸添加到线粒体，然后测量所述线粒体溶液的OCR(被称为“OCR1”)。然后，向线粒体添加ATP合成酶抑制剂(例如寡霉素)，然后可以测量所述线粒体溶液的OCR(被称为“OCR2”)。随后，向线粒体添加解偶联剂(例如FCCP)，然后可以测量所述线粒体溶液的OCR(被称为“OCR3”)。随后，添加呼吸链复合体抑制剂(例如复合体I的抑制剂例如鱼藤酮和复合体III的抑制剂例如抗霉素A)，然后可以测量所述线粒体溶液的OCR(被称为“OCR4”)。线粒体的基线呼吸率、ATP生产呼吸率和最大呼吸率可以根据下述方程获得。

线粒体的基线呼吸率＝OCR1-OCR4；

线粒体的ATP生产呼吸率＝OCR1-OCR2；

线粒体的最大呼吸率＝OCR3-OCR4。

在一个实施方式中，待测定的线粒体的呼吸活性可以是线粒体的最大呼吸活性。

在本说明书中，“微流道装置”或“微流体装置”可互换使用，并且是指包含直径或宽度和长度在μm量级上的通道的装置。在所述微流道装置的通道中，从两个不同入口引入的两种不同组合物可以在汇合通道中交汇。所述汇合通道是分别连接到两个不同入口的两个流路交汇的部分。除了所述汇合通道之外，所述微流道装置还可以具有用于混合交汇的溶液的通道(混合通道)。所述混合通道可以具有促进混合和搅拌的结构(例如弯曲)。所述混合通道也可以在内表面中具有或不具有凹面和凸面。

在本说明书中，“乙醇溶液”是指包含乙醇的水性溶液。在本说明书中，“有机相”是指包含有机溶剂的相，并且可以是包含能够溶解可以形成脂质膜的脂质的有机溶剂的相。所述有机相中的有机溶剂可以是例如可溶于水的有机溶剂。水溶性有机溶剂是有利的，因为它在囊泡形成后易于通过诸如透析的方法去除。作为水溶性有机溶剂的实例，可以提到的是乙醇。在所述实施方式中，有机相可以是例如乙醇水溶液。

本发明人发现，包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡和所述囊泡的群体可以通过将包含分离的线粒体的水性溶液和包含可以形成脂质膜的脂质的有机相(例如乙醇溶液)在微流道装置的汇合通道中彼此接触以混合它们来获得。根据本发明，提供了一种生产包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡或其群体或包含所述囊泡的组合物的方法，所述方法包括将包含分离的线粒体的水性溶液和包含可以形成脂质膜的脂质的有机相(例如乙醇溶液)在微流道装置内的汇合通道中彼此接触以混合它们。

当在本文中使用时，术语“线粒体活化剂”意味着能够活化线粒体呼吸链复合体(电子传递系统)的物质，特别是能够根据膜电位使线粒体进入极化状态的物质，特别是优选地使用能够使线粒体进入超极化状态的物质。所述线粒体活化剂的实例可以包括抗氧化剂例如白藜芦醇(3,5,4'-三羟基-反式-二苯乙烯)、辅酶Q10、维生素C、维生素E、N-乙酰半胱氨酸、2,2,6,6,-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽，特别地白藜芦醇是优选的(参见WO2018/092839)。优选地在本发明中使用的白藜芦醇可以是通过已知方法从植物提取的白藜芦醇或通过已知方法例如Andrus等人的方法(TetrahedronLett.2003,44,第4819-4822页)化学合成的白藜芦醇。线粒体活化剂的其他实例包括线粒体DNA和线粒体RNA例如12SrRNA和16S rRNA(参见整体通过参考并入本文的WO2020/230601)和线粒体的任何其他组分。

所述微流道装置包含从至少两个入口延伸的流动通道交汇处的汇合通道。所述微流道装置还可以包含用于促进在汇合通道处交汇的溶液的混合的混合通道。所述混合通道可以是线性延伸的通路，或者可以具有至少一个弯曲以便进一步促进混合(例如挡板结构或连续排列的多个弯曲)。所述混合通道在内表面中可以具有或不具有凹面和凸面。

所述微流道装置的通道可以具有μm量级的厚度。如果通道具有圆形横截面，则所述通道的厚度用其直径表示。如果所述横截面是椭圆，则所述厚度可以用长轴和短轴中的任一者或它们两者来表示。如果所述横截面是矩形，则可以使用宽度和高度中的任一者或它们两者。所述通道的宽度和高度可以各自独立地是例如100μm至400μm。参考图36，将描述可以适合地用于本发明的微流道装置。如图36中所示，所述微流道装置的通道(10)具有两个液体样品入口(11a和12a)、在所述液体样品入口(11a和12a)和汇合通道(13)之间各自连接的通道(11和12)和混合通道(14)。汇合通道13是分别从两个液体样品入口延伸的通道(11和12)交汇的位点。混合通道14是用于混合交汇的液体样品的通道。混合通道14可以是线性通道或具有弯曲的通道。如图36中所示，在混合通道14中，溶液沿着大箭头所示的流动方向移动，并通过弯曲被导向出口14c。混合通道14可以具有单组或多组用14a和14b表示的弯曲(例如10至30组、15至25组、20组)。在图36中，14a表示通道宽度变窄的区域，14b表示变窄的通道加宽的区域。

可以形成基于脂质膜的囊泡中的脂质膜的脂质的实例包括磷脂、糖脂、甾醇和饱和或不饱和脂肪酸。所述脂质可以包括多种脂质。

磷脂是指在结构中具有磷酸酯的脂质。磷脂可以是能够构造细胞膜的磷脂类型。磷脂的实例包括磷脂酰胆碱(例如二油酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、磷脂酰甘油(例如二油酰基磷脂酰甘油、二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油)、磷脂酰乙醇胺(例如二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸甘油、神经酰胺磷酸甘油磷酸、1,2-二肉豆蔻酰基-1,2-脱氧磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰胆碱、缩醛磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、它们的加氢产物,3β-[N-(N'-,N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆甾醇(DC-Chol)、1,2-二油酰基-3-三甲基丙烷铵(DOTAP)和1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基丙烷铵(DOTMA)。

糖脂是指结合到糖的脂质。在糖脂中，糖可以结合到脂质的末端。糖脂的实例包括甘油糖脂(例如磺氧基核糖基甘油酯、二糖基甘油二酯、二半乳糖基甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、糖基甘油二酯)和鞘糖脂(例如半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂、神经节苷脂)。甾醇的实例包括动物来源的甾醇(例如胆甾醇、胆甾醇琥珀酸酯、胆甾烷醇、羊毛甾醇、二氢羊毛甾醇、链甾醇、二氢胆甾醇)、植物来源的甾醇(植物甾醇)(例如豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、芸苔甾醇)和微生物来源的甾醇(例如酵母甾醇和麦角甾醇)。

甾醇是指存在于动物和植物界中的甾醇。甾醇的实例包括来源的甾醇(例如胆甾醇、胆甾醇琥珀酸酯、胆甾烷醇、羊毛甾醇、二氢羊毛甾醇、链甾醇、二氢胆甾醇)和植物来源的甾醇(例如豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、芸苔甾醇)。微生物来源的甾醇例如酵母甾醇和麦角甾醇也包括在甾醇中。

在一个实施方式中，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、鞘磷脂(SM)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇的混合物可用于制备基于脂质膜的囊泡。在一个实施方式中，烷基化聚精氨酸或S2肽例如硬脂基化八聚精氨酸(STR-R8)或S2肽可以被进一步包含在所述囊泡中。

所述乙醇溶液可以具有例如10V/V％至50V/V％或10V/V％至20V/V％的乙醇浓度，只要所述溶液可以溶解所述脂质组成成分即可。

作为线粒体，可以使用分离的线粒体。分离是指从细胞中取出某物。作为线粒体，可以使用纯化的线粒体。纯化是指在分离后将组分与至少一种其他组分完全或部分分开。纯化的线粒体由于已被分离，因此可以是分离的线粒体。在本说明书中，被分离的线粒体被称为分离的线粒体，并且被纯化的线粒体有时被称为纯化的线粒体。

线粒体可以通过水的剪切应力例如通过匀浆从细胞分离。线粒体也可以通过用重复的冻融过程破坏细胞膜而从细胞分离。线粒体也可以通过用表面活性剂(临界胶束浓度或更高的浓度)破坏细胞膜而从细胞分离。线粒体也可以通过使它们与表面活性剂(低于临界胶束浓度的浓度)接触，然后将处理过的细胞在冰上温育，任选地随后对所述处理过的细胞施加水的剪切应力，而从细胞分离到细胞外。所述剪切应力可以被提供给所述处理过的细胞，优选地不发泡，例如通过吸打含有所述处理过的细胞的溶液。浓度低于临界胶束浓度的表面活性剂可以被有利地用于分离，因为可以将使用表面活性剂取出的线粒体的损伤降至最低。

所述分离的线粒体可以通过离心来收集。线粒体可以通过例如以500×g进行几分钟(例如4分钟)的离心过程与细胞组分(例如高密度细胞组分)例如细胞核分开。因此，可以在所述离心过程后通过回收上清液来收集线粒体。此外，可以将线粒体进一步离心以沉淀。通过这种方式，可以将线粒体与未沉淀的其他细胞组分(例如低密度细胞组分)分开。

含有线粒体的水性溶液可以被维持在缓冲液(例如线粒体保存缓冲液)中。所述维持可以在4℃下进行。可以使用的缓冲液的实例包括生理盐水、Tris缓冲液、Hepes缓冲液和磷酸盐缓冲液。所述缓冲液可以包含张度剂。所述张度剂的实例可以包括糖例如蔗糖。所述缓冲液可以包含二价离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇醚二胺四乙酸)。所述缓冲液可以包含生理上可接受的盐(例如氯化钠、氯化镁)。

包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡可以通过将包含线粒体的水性溶液和包含可以形成脂质膜的脂质的有机相(例如乙醇溶液)在微流道装置的汇合通道中彼此接触以混合它们来获得。此时，本发明人发现，当向所述微流道装置提供粒度为约1μm的分离的线粒体时，可以获得粒度实质性小于1μm的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡；并且如果将所述囊泡中含有的线粒体引入到细胞中，则可以提高所述细胞的线粒体活性。所得到的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡具有比所述分离的线粒体更小的PDI，并且其作为细胞器的单分散性相对高。因此，根据本发明，提供了一种生产包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物(或制剂)的方法。根据本发明，提供了一种包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂。包含一组未包裹在囊泡中的线粒体的组合物可以通过在接触步骤中将不含脂质的有机相与含有线粒体的水性溶液接触来获得。这种包含未被包裹的线粒体的组合物可以进一步进行包裹程序，以形成包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡。

包含线粒体的水性溶液和包含可以形成脂质膜的脂质的有机相(例如乙醇溶液)被引入到微流道装置的汇合通道中的流速及其流速比，可以由本领域技术人员适合地确定。

在一个实施方式中，线粒体群体未被包裹在囊泡中。在一个实施方式中，本发明提供了一种包含未包裹在囊泡中的线粒体群体的组合物或药物组合物。在优选实施方式中，线粒体群体具有当通过动态光散射测定时在小于1μm、900nm或更小、800nm或更小、700nm或更小、600nm或更小、500nm或更小、400nm或更小或300nm或更小处具有峰的粒度分布。所述线粒体群体的PDI可以是0.5或更小、0.4或更小或0.3或更小。所述群体可以是单分散的。这种群体可以通过使用微流体装置通过iMIT将分离的线粒体分裂成更小的线粒体来获得。据认为，小线粒体在制备包裹分裂的分离的线粒体的基于脂质膜的囊泡中以及在通过肠胃外途径给药以避免血管中的任何堵塞中是有用的。因此，所述药物组合物可以被配制成用于肠胃外给药(例如静脉内、肌肉内、室内和脑室内)，例如通过将所述分裂的分离的线粒体包裹在基于脂质膜的囊泡中。在一个实施方式中，分裂的Q可以具有在数目和/或密度方面与未分裂的Q可比的嵴。

在优选实施方式中，包裹在基于脂质膜的囊泡中的线粒体可以是可以在被包裹在脂质膜结构(即囊泡或囊)时分裂的分裂的线粒体。线粒体的分裂可以在存在或不存在脂质的情况下使用微流体装置来实现。因此，所述基于脂质膜的囊泡可以包裹分裂的线粒体，所述分裂的线粒体在群体的粒度分布中可以具有小于1000nm、900nm或更小、800nm或更小、700nm或更小、600nm或更小、500nm或更小、400nm或更小或300nm或更小的峰。在一个实施方式中，所述分裂的线粒体具有在线粒体内部的嵴和基质。在特定实施方式中，所述分裂的线粒体在内膜的内部充满嵴。根据本发明，这种分裂的线粒体不一定具有膜电位，但是可以通过将所述囊泡引入到细胞中来改善细胞内的线粒体呼吸。在一个实施方式中，所述囊泡内的分裂的分离的线粒体可能不具有可检测的膜电位。所述线粒体的膜电位可以使用线粒体膜电位指示剂来检测。

在一个实施方式中，被包裹的线粒体群体的50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多由分裂的分离的线粒体组成。

在一个实施方式中，所述群体中的线粒体可以被包裹在基于脂质膜的囊泡中。在一个实施方式中，所述群体中50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多的线粒体被各自包裹在基于脂质膜的囊泡中。所述被包裹的线粒体可以被配制成药物组合物。

在本发明的一个实施方式中，本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在小于1μm、900nm或更小、800nm或更小、700nm或更小、600nm或更小、500nm或更小、400nm或更小或300nm或更小处具有峰的粒度分布。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在例如200nm或更大且小于500nm处具有峰的粒度分布。

在本发明的一个实施方式中，本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在50nm至200nm、50nm至150nm、100nm至500nm、200nm至400nm、300nm至500nm、500nm至1500nm、600nm至1400nm、700nm至1300nm、800nm至1200nm或约1000nm(或约1μm)处具有峰的粒度分布。

在另一个实施方式中，被包裹在基于脂质膜的囊泡中的线粒体或分裂的线粒体本身可能不具有显著的膜电位或在囊泡中没有保持显著的呼吸能力。即使被包裹的线粒体或分裂的线粒体没有显著的膜电位或在囊泡中没有显著的呼吸能力，但被包裹的线粒体或分裂的线粒体很可能可以将它们的组成成分例如线粒体DNA、辅酶Q10和其他成分递送到细胞线粒体，因此可以有益于已接受所述成分的细胞。在较高pH条件例如pH 8至10或8至9下，线粒体的膜电位或呼吸能力可能降低。这种被包裹的线粒体或分裂的线粒体在重新引入到细胞中之后可以任选地显示出或恢复其生理功能例如膜电位或呼吸。

已从线粒体泄漏的线粒体DNA会对细胞功能造成一些负面影响。此外，分离的线粒体中的线粒体DNA会改善线粒体功能，特别是在线粒体功能有缺陷的细胞中。因此，在优选实施方式中，所述分裂的线粒体可以将线粒体DNA维持在线粒体内。分离的线粒体中的非核酸组分会改善细胞内线粒体功能。因此在优选实施方式中，所述分裂的线粒体可以维持线粒体内或上的非核酸组分。

本发明的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的粒度分布或其峰的上限可能随着充当来源的细胞和从细胞分离线粒体的方法而变。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时0.5或更小、0.4或更小或0.3或更小的多分散指数(PDI)。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有0.2至0.4的PDI。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有正、零或负ζ电位。为了提高囊泡在溶液中的分散能力(以防止在溶液中聚集)，所述ζ电位可以为正或负。所述囊泡可能具有正ζ电位。由于所述囊泡具有的正ζ电位，可以提高被细胞的摄入。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有例如-10mV或更低、-11mV或更低、-12mV或更低、-13mV或更低、-14mV或更低、-15mV或更低、-16mV或更低、-17mV或更低、-18mV或更低、-19mV或更低或-20mV或更低的ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有例如10mV或更高、11mV或更高、12mV或更高、13mV或更高、14mV或更高、15mV或更高、16mV或更高、17mV或更高、18mV或更高、19mV或更高或20mV或更高的ζ电位。为了使囊泡群体具有正ζ电位，脂质膜可以由能够提供正ζ电位的材料形成(例如由阳离子脂质和包含具有阳离子部分的脂质(例如，具有阳离子部分的脂质例如硬脂基化八聚精氨酸和S2肽)的电中性脂质形成的脂质膜)。为了使囊泡群体具有负ζ电位，脂质膜可以由具有负ζ电位的材料形成(例如由阴离子脂质形成的脂质膜)。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在小于1μm处具有峰的粒度分布，0.5或更小的PDI，并具有正ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布，0.5或更小的PDI，并具有正ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布，0.5或更小的PDI，并具有10mV或更高的ζ电位。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在小于1μm处具有峰的粒度分布，具有0.5或更小的PDI，并具有负ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布，0.5或更小的PDI，并具有负ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布，0.5或更小的PDI，并具有-10mV或更低的ζ电位。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在500nm至1500nm(或约1μm)处具有峰的粒度分布，并具有正ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在500nm至1500nm(或约1μm)处具有峰的粒度分布，0.5或更小的PDI，并具有正ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在500nm至1500nm(或约1μm)处具有峰的粒度分布，具有0.5或更小的PDI，并具有10mV或更高的ζ电位。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在500nm至1500nm(或约1μm)处具有峰的粒度分布，并具有负ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在500nm至1500nm(或约1μm)处具有峰的粒度分布，具有0.5或更小的PDI，并具有负ζ电位。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以具有当通过动态光散射测定时在500nm至1500nm(或约1μm)处具有峰的粒度分布，具有0.5或更小的PDI，并具有-10mV或更低的ζ电位。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂当被引入到细胞中时，将线粒体释放到细胞质内并提高细胞内的线粒体功能(例如呼吸活性)。细胞内线粒体功能的提高可以例如通过测量线粒体的耗氧率来确定。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂当被引入到细胞中时，将线粒体释放到细胞质内并允许释放的线粒体与内源线粒体融合。更具体来说，本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂将线粒体包裹在基于脂质膜的囊泡中。当所述组合物或制剂被并入到细胞内时，它在内体中分离。线粒体即使在内体环境中也受到脂质膜保护，并随后可以从所述内体中释放出；更具体来说，内体与所述囊泡的脂质膜融合并将线粒体释放到脂质膜外。通过这种方式，可以将与完整或部分脂质膜分开的线粒体释放到细胞质中。所述与完整或部分脂质膜分开的线粒体可以与其他线粒体(例如内源线粒体)接触并与它们融合。细胞中线粒体的融合可以通过用不同的荧光染料(可以通过波长分辨)分别标记细胞内的线粒体和包裹在囊泡中的线粒体并检查它们是否共存于细胞中来确认。

在本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂中，所述囊泡的内部和外部环境被脂质膜物理、化学和/或生理学分隔。更具体来说，囊泡具有由脂质膜形成的封闭空间，所述脂质膜充当屏障以抑制物质在内部与外部区域之间的自由运输。线粒体在基于脂质膜的囊泡中的包裹可以通过用负染法和电子显微镜观察基于脂质膜的囊泡内的中空空间的图像，和用不同的荧光染料(可以通过波长分辨)分别标记线粒体和脂质膜并在通过显微镜观察时检查它们是否共存来确认。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂包裹线粒体。所述线粒体在细胞内或在呼吸链复合体的底物存在下可能具有呼吸活性。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可用于在细胞中改善降低的线粒体功能。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以被给药到例如具有降低的线粒体功能的组织。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以被给药到例如被心肌梗塞损伤的组织。本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以被给药到例如具有线粒体功能障碍的对象。线粒体功能障碍的实例包括神经退行性障碍和神经精神障碍。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以包含有效量的所述囊泡。有效量是指当囊泡被引入到细胞中时足以改善所述细胞的线粒体功能的量。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以以冷冻状态提供。处于冷冻状态下的本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂还可以包含冷冻保护剂(例如甘油)。

本发明的包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂可以在4℃下储存1天或更长时间、2天或更长时间、3天或更长时间、4天或更长时间、5天或更长时间、6天或更长时间、一周或更长时间。储存的组合物可用于改善与所述组合物接触的细胞中的细胞内线粒体。

根据本发明，提供了一种用于生产包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体的组合物或包含所述群体的线粒体制剂的方法，所述方法包括：

将包含分离的线粒体的水性缓冲液和包含可以形成脂质膜的脂质的有机相在微流道装置的汇合通道中彼此接触以混合它们。

对所述有机相没有特别限制，只要它可以通过在晚些时候进行的透析来去除即可，例如可以提到的是乙醇溶液。

在本发明的所述方法中，微流道装置可以具有促进汇合通道中彼此接触的溶液的混合并具有至少一个弯曲的通道。在本发明的所述方法中，所述微流道装置包含促进汇合通道中彼此接触的溶液的混合的流动通道，所述流动通道具有挡板结构。

本发明的所述方法还可以包括从得到的混合物(包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的溶液)中去除乙醇。去除乙醇可以通过使用保存线粒体的缓冲液作为外部溶液对所得到的混合物进行透析来进行。

本发明的所述方法还可以包括向包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的溶液(缓冲溶液)添加可药用赋形剂(例如缓冲剂、张度剂、稳定剂、分散剂、盐和冷冻保护剂)。

在本发明的所述方法中，可以将分离的线粒体用电位依赖性染料(例如线粒体膜电位指示剂)染色。可以在本发明中使用的线粒体膜电位指示剂的实例包括四甲基罗丹明甲酯(TMRM)、四甲基罗丹明乙酯(TMRE)、3,3'-二己基氧杂羰花青碘化物(DiOC₆)、6-氨基-9-(2-甲氧基羰基苯基)呫吨-3-亚基)氯化氮鎓(罗丹明123)和5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(JC-1)。JC-1以膜电位依赖性方式在线粒体中积累，在高浓度下形成缔合并从绿色变成红色。TMRM和TMRE各自以膜电位依赖性方式在线粒体中积累，并在高浓度下显示出高荧光强度。在本发明中，可以使用例如TMRE。因此，如果使用线粒体膜电位指示剂，则其荧光强度反映出线粒体膜电位的幅度。荧光强度与膜电位之间的关系可以在先前制备的校准曲线的基础上确定。通过这种方式，可以容易地评估包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡是否包裹有功能的线粒体。

在一个实施方式中，本公开提供了通过一种新方法分离的线粒体，所述新方法在本文中被称为“无去污剂和匀浆(DHF)”方法或“iMIT”方法。正如本文中描述的，通过iMIT方法分离的线粒体不被损伤(例如保留内膜和外膜完整性)并维持功能性能力(例如膜电位)。通过iMIT方法获得的线粒体在本文中被称为“Q”线粒体。这些线粒体适用于例如通过线粒体移植来治疗各种不同疾病和障碍，包括本文中描述的疾病和障碍。线粒体移植是一种预期在各种不同的疾病和障碍中有用的治疗方法。将外源线粒体(例如Q线粒体)内化到线粒体具有严重功能障碍的细胞和/或高度功能性线粒体的内流对其有益的细胞中，以恢复和/或增强线粒体功能。

在实施方式中，本公开提供了通过下述步骤从细胞回收或分离线粒体的方法：将细胞在含有浓度低于临界胶束浓度(CMC)的表面活性剂的溶液中处理，从含有处理过的细胞的溶液中去除表面活性剂，然后将表面活性剂处理过的细胞温育以将线粒体回收到溶液中，从而从细胞回收线粒体。所述方法被称为“iMIT”。因此，本文中提供了iMIT这种从细胞获得线粒体的方法，所述方法包括：

(A)将细胞在第一溶液中用浓度低于临界胶束浓度(CMC)的表面活性剂处理，

(B)从所述第一溶液去除所述表面活性剂，以形成第二溶液，和

(C)将表面活性剂处理过的细胞在所述第二溶液中温育，以将线粒体回收在所述第二溶液中。上述(A)至(C)和本发明方法的附加配置在下文中描述。

根据本公开的所述方法，将在细胞质中具有线粒体的细胞在溶液中用浓度低于临界胶束浓度的表面活性剂处理。因此，在实施方式中，细胞膜在结构强度方面被减弱，但是由于表面活性剂的浓度低而未被通透化，此时线粒体膜被暴露于很少或不暴露于表面活性剂并保持完整。在实施方式中，细胞膜可以被部分通透化，但由于表面活性剂的浓度低，线粒体膜被暴露于很少或不暴露于表面活性剂并保持完整。

在实施方式中，(A)的溶液可以包含缓冲液。用于本文中提供的方法中的示例性缓冲液包括例如Tris缓冲液、HEPES缓冲液和磷酸盐缓冲液。缓冲液可以具有例如pH 6.7-7.6(例如pH 6.8-7.4、pH 7.0-7.4，例如pH 7.2-7.4，例如pH 7.4)。在实施方式中，所述缓冲液可以包括张度剂和渗透压调节剂。示例性的张度剂和渗透压调节剂包括单糖(例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等)、二糖(例如乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等)、三糖(例如棉子糖、melesinose等)、多糖(例如环糊精等)、糖醇(例如赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等)、甘油、双甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇等。缓冲液还可以含有螯合剂，特别是用于二价金属的螯合剂，例如用于钙离子的螯合剂。螯合剂包括例如乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。

在实施方式中，缓冲液可以是包含蔗糖和螯合剂的Tris缓冲液，其中pH为6.7-7.6(例如pH 6.8-7.4、pH 7.0-7.4，例如pH 7.2-7.4，例如pH 7.4)。在实施方式中，所述Tris缓冲液可以包含毛地黄皂苷或皂苷或本文中提供的另一种表面活性剂。在实施方式中，所述毛地黄皂苷或皂苷或其他表面活性剂可以具有临界胶束浓度的20％或更低、15％或更低、14％或更低、13％或更低、12％或更低、11％或更低或10％或更低的浓度。在实施方式中，毛地黄皂苷可以以400μM或更低、350μM或更低、200μM或更低、150μM或更低、100μM或更低、90μM或更低、80μM或更低、70μM或更低、60μM或更低、50μM或更低、40μM或更低或30μM或更低的浓度(例如30μM的浓度)使用。在实施方式中，皂苷可以以400μM或更低、400μM或更低、350μM或更低、200μM或更低、150μM或更低、100μM或更低、90μM或更低、80μM或更低、70μM或更低、60μM或更低、50μM或更低、40μM或更低或30μM或更低的浓度(例如30μM的浓度)使用。

在实施方式中，在本文提供的方法中使用的表面活性剂可以是离子型或非离子型表面活性剂。在本发明中使用的非离子型表面活性剂可以包括例如酯、醚和烷基糖苷形式。非离子型表面活性剂包括例如烷基聚乙二醇、聚氧乙烯烷基苯基醚和烷基糖苷。非离子型表面活性剂可以包括Triton-X 100、Triton-X 114、Nonidet P-40、正十二烷基-D-麦芽糖苷、Tween-20、Tween-80、皂苷和/或毛地黄皂苷。在处理步骤(A)中，使用选自Triton-X100、皂苷和毛地黄皂苷的至少一种表面活性剂。在实施方式中，所述表面活性剂是皂苷或毛地黄皂苷。

在实施方式中，处理步骤(A)包括用浓度低于临界胶束浓度的表面活性剂处理所述细胞。步骤(A)中的细胞处理时间可以是例如1-30分钟、例如1-10分钟或例如1-5分钟、例如2-4分钟、例如3分钟。(A)中的细胞处理可以在冰上、4℃或室温或其间的温度下进行。

在实施方式中，处理步骤(A)中的表面活性剂浓度可以是低于临界胶束浓度的浓度，例如临界胶束浓度的90％或更低、80％或更低、70％或更低、60％或更低、50％或更低、40％或更低、30％或更低、20％或更低、15％或更低、14％或更低、13％或更低、12％或更低、11％或更低、10％或更低，例如5-15％，例如8-12％，例如10％。

在实施方式中，处理步骤(A)是所述细胞的预处理。不希望受到理论限制，据信用低于临界胶束浓度的表面活性剂处理细胞可以降低细胞膜的强度，和/或部分或完全消除去污剂对细胞内线粒体的影响。

因此，为了最小化表面活性剂对线粒体的影响，至少在从细胞回收线粒体期间和之后的任何步骤(例如步骤(B)至(E)中的每一者)中，与线粒体发生接触的溶液中的表面活性剂浓度可以低于临界胶束浓度，例如临界胶束浓度的低于10％、低于5％、低于4％、低于3％、低于2％或低于1％或更低，或低于检测极限。为了最小化表面活性剂对线粒体的影响，优选地在从细胞回收线粒体期间和之后，不应该向与线粒体发生接触的溶液添加表面活性剂。

在实施方式中，所述细胞可以采取存在于组织中的细胞的形式，或者它们可以从组织(例如单细胞)或其群体分离。所述从组织分离的细胞可以是培养细胞，或通过使用用于使组织或培养细胞成为单细胞的酶例如胶原酶处理所述组织或培养细胞而获得的单细胞或其群体。如果需要，可以在酶例如胶原酶处理之前将组织切碎。

在实施方式中，在从(A)中的表面活性剂处理过的细胞回收线粒体之前可以从所述溶液中去除表面活性剂，以便降低与线粒体接触的表面活性剂的浓度或充分减少与线粒体接触的表面活性剂。

在去除步骤(B)中，可以例如通过用含有较低或降低浓度的表面活性剂的溶液(优选为无表面活性剂溶液)(例如缓冲液)替换所述缓冲液或向所述缓冲液添加所述溶液，来进行表面活性剂的去除。如果所述表面活性剂处理过的细胞是贴壁细胞，则可以通过吸出所述溶液，如果需要的话将细胞在含有较低或降低浓度的表面活性剂的溶液(优选为无表面活性剂溶液)(例如缓冲液)中漂洗，并添加含有较低或降低浓度的表面活性剂的溶液(优选为无表面活性剂溶液)(例如缓冲液)，来去除所述含有表面活性剂的缓冲液。如果所述表面活性剂处理过的细胞是漂浮细胞，则可以通过将细胞离心，去除上清液，如果需要的话将所述细胞在含有较低或降低浓度的表面活性剂的溶液(优选为无表面活性剂溶液)(例如缓冲液)中漂洗，并添加含有较低或降低浓度的表面活性剂的溶液(优选为无表面活性剂溶液)(例如缓冲液)，来去除所述表面活性剂。

去除意味着至少降低与线粒体发生接触的溶液中的表面活性剂浓度，包括例如所述表面活性剂浓度的低于10％、低于5％、低于4％、低于3％、低于2％或低于1％或更低，或在与线粒体发生接触的溶液中低于检测极限。为了确保从所述溶液去除表面活性剂，(B)可以包括用含有较低或降低浓度的表面活性剂的溶液(优选为无表面活性剂溶液)(例如缓冲液)清洗所述细胞。

在(B)中，为了从所述溶液中去除表面活性剂，添加到所述溶液或与所述溶液交换的溶液优选地可以是缓冲液，并且可以如上文(A)中所描述的缓冲液(但为含有较低浓度的表面活性剂的溶液，优选为不含表面活性剂或含有不可检测水平的表面活性剂的溶液)。

在(A)中处理的细胞具有降低的质膜强度，并且允许仅通过将它们在溶液中温育即可将线粒体从细胞内部释放到细胞外区域。然而在(C)之前的步骤中，与线粒体接触的表面活性剂的量少，表面活性剂对线粒体的影响有限，因此线粒体膜强度的降低也有限，和/或线粒体膜保持完整。

在实施方式中，所述方法包括简单地通过允许所述细胞在第二溶液中静置来获得释放到所述第二溶液中的线粒体。

因此，在本发明中，可以将所述表面活性剂处理过的细胞在溶液中温育，以将线粒体从细胞内部释放到细胞外区域。(C)中的术语“释放”意味着线粒体离开细胞的内部到达被质膜包围的区域的外部(例如在溶液侧或细胞外侧上)。

所述在(C)中用于温育的溶液(“第二溶液”)可以是含有较低浓度的表面活性剂的溶液。在优选实施方式中，所述第二溶液是无表面活性剂溶液或具有可忽略和/或不可检测的量的表面活性剂的溶液。在(C)中用于温育的溶液可以是例如在上文(A)中描述的缓冲液，并且可以是具有比上文(A)中描述的缓冲液更低的表面活性剂浓度的缓冲液(优选为无表面活性剂溶液)。所述在(C)中使用的溶液可以是包含例如缓冲液、渗透压调节剂和二价金属螯合剂并且基本上不含表面活性剂的溶液。当在本文中使用时，“基本上不含”在不排除存在不可被去除或不可被检测的量的“基本上不含的成分”的污染的意义上使用。

在(C)中，所述温育可以是例如1-30分钟、例如5-25分钟或例如5-20分钟、例如5-15分钟、例如10分钟。所述(C)中的细胞处理可以在冰上或室温或其间的温度下进行。

在(C)中，可以添加使线粒体的脂质双层不发生机械破坏的物理刺激，以便增强线粒体从细胞的回收。因此，在(C)中，温育可以例如在振摇或不振摇条件下进行。在(C)中，温育可以例如在搅拌或不搅拌的条件下进行。在(C)中，表面活性剂处理使得细胞更容易从附着表面脱离，因此如上所述用温和的水流将细胞从附着表面脱离似乎对极化比没有负面影响。可选地，在(C)中，温育可以进行到细胞不变得脱离的程度。

在(C)中，在溶液中回收的线粒体可以作为分离的线粒体群体用于各种不同的应用。在实施方式中，本公开提供了通过本文中提供的方法生产的线粒体群体，所述线粒体在本文中被称为“Q”线粒体。在实施方式中，本公开提供了通过本文中提供的方法生产的单个线粒体(即单个Q)。

在实施方式中，本文中提供的方法还包括(D)纯化在溶液中回收的线粒体。可以通过离心将线粒体与一种或多种其他细胞组分分开。例如，可以通过将(C)中回收的线粒体群体以1500g或更低、1000g或更低或500g或更低的速度离心以沉淀所述线粒体群体中包含的污染物例如脱离的细胞，将线粒体作为上清液纯化。优选地可以通过以500g离心，将线粒体作为例如上清液纯化。也可以通过对得到的上清液进行进一步离心(例如8000g至12000g)以便富集等，来收集作为沉淀物的线粒体。本文中使用的术语“纯化的”意味着通过操作将所述线粒体与溶液中的至少一种其他组分分开。

在上述(C)和/或(D)中获得的线粒体可以作为分离的线粒体群体用于各种不同应用中。

本发明的方法还可以包括(E)冷冻线粒体。冷冻可以通过将线粒体轻柔地悬浮在冷冻用缓冲液中来进行。所述冷冻用缓冲液可以是(A)中所描述的缓冲液，但不包含表面活性剂，并且可以进一步包含冷冻保护剂。示例性的冷冻保护剂在本领域中是已知的，包括例如甘油、蔗糖、海藻糖、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、丙二醇、二乙二醇、三乙二醇、甘油-3-磷酸、脯氨酸、山梨糖醇、甲酰胺和聚合物。因此，本文提供的线粒体可以通过冷冻来储存。在本公开的方法中，如果低温保存不是必需的，则线粒体可以不被冷冻，例如线粒体可以在新鲜分离时使用。在其他实施方式中，线粒体可以在4℃±3℃下或在冰上储存。在实施方式中，通过本文中提供的方法生产的本文中提供的线粒体可以储存在液氮中，在约-80℃±3℃或更低温度、约-20℃±3℃或更低温度或约4℃±3℃下。在实施方式中，所述线粒体可以储存数天、数周或数月或更长时间，并在融化后保留起作用的能力。

在实施方式中，本文中提供的方法还包括融化本文中所提供的已被分离并随后冷冻的线粒体的方法。融化本文中提供的线粒体的方法包括将线粒体在约20℃±3℃或更低温度下融化，和将线粒体迅速融化，例如在约5、约4、约3、约2或约1分钟内。在实施方式中，线粒体的迅速融化产生保留了本文中描述的功能性能力的线粒体。

在实施方式中，本文提供的方法在从细胞收集线粒体的整个过程中不包括以使线粒体膜被破坏的方式破坏细胞膜的方法。例如，在本文提供的方法中，在从细胞收集线粒体的过程中不通过匀浆破坏细胞。也就是说，在实施方式中，本文提供的方法不包括匀浆；在实施方式中，所述方法包括匀浆，但所述匀浆仅进行到不引起任何气泡或不引起溶液相对于细胞或组织的气泡的程度。在实施方式中，所述方法也不包括细胞的冻融。尽管细胞的反复冻融适合于破坏质膜并回收其内含物，并且可用于从细胞回收线粒体，但据信冻融也破坏线粒体脂质双层，因为得到的线粒体的膜电位未能维持(与其中线粒体膜电位得以维持的本公开的方法相反)。

在实施方式中，本公开的方法在从细胞收集线粒体的整个过程中不包括破坏细胞膜的其他方法(例如超声、用强烈水流处理到溶液产生气泡的程度或溶液发泡的程度)。在实施方式中，本公开的方法在不进行可能实质性地对线粒体造成物理、化学或生理学损伤的任何过程的情况下进行，尽管可以向用于储存的线粒体应用冻融循环。因此，本发明的方法能够获得损伤极小的线粒体。

本发明的方法在从细胞纯化线粒体中不需一个或多个过滤步骤。

在实施方式中，本文提供的方法在不损伤线粒体的情况下将线粒体与微管系统轻柔地分开，同时线粒体仍在细胞中。在所述温育期间，由于微管从线粒体表面脱离而变成非丝状的线粒体，能够通过表面活性剂处理过的细胞膜离开细胞。因此，通过本公开的方法从细胞获得的线粒体在不撕破或撕裂线粒体膜或以其他方式破坏线粒体结构的情况下获得。因此，本文提供的分离的线粒体及其群体能够在分离后维持功能，并远远比任何以前描述的分离的线粒体更适合用于治疗疾病病症。

因此，本文提供的方法以重要的方式有别于用于分离线粒体的常规方法，并且提供的分离或得到的线粒体相对于通过常规方法或任何其他以前公开的方法分离的线粒体具有令人吃惊且有利的特点。

在优选实施方式中，线粒体可以从心脏细胞、肌肉细胞、心肌细胞、心脏祖细胞、心脏干细胞、细胞系例如HUVEC细胞和HeLa细胞分离。

本公开提供了分离或得到或处理的线粒体群体，其中所述群体中的线粒体表现出卓越的功能性能力。例如在一种情况下，本公开提供了分离的线粒体群体，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体具有完整的内膜和外膜；和/或所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体当通过荧光指示剂测量时是极化的。在实施方式中，所述荧光指示剂选自带正电荷的染料例如JC-1、四甲基罗丹明甲酯(TMRM)和四甲基罗丹明乙酯(TMRE)。

在实施方式中，本公开提供了分离的线粒体群体，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在细胞外环境中维持功能性能力(例如是极化的)。在实施方式中，所述细胞外环境中的功能性能力通过膜电位的荧光指示剂来测量。在实施方式中，所述荧光指示剂选自带正电荷的染料例如JC-1、TMRM和TMRE。在实施方式中，所述细胞外环境可以包括约4mg/dL至约12mg/dL或约1mmol/L(1000μM)至约3mmol/L(3000μM)的总钙浓度。例如在实施方式中，所述细胞外环境包括约8mg/dL至约12mg/dL或约2mmol/L(2000μM)至约3mmol/L(3000μM)的总钙浓度。在实施方式中，所述细胞外环境包括约4mg/dL至约6mg/dL或约1mmol/L(1000μM)至约1.5mmol/L(1500μM)的游离或活性钙浓度。在实施方式中，所述线粒体群体在与细胞内的钙环境相比具有更高钙浓度的环境中维持功能性能力。

在实施方式中，本文提供了分离的线粒体群体，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体没有正在进行发动蛋白相关蛋白1(drp1)依赖性分裂。在实施方式中，本文提供了具有内膜和外膜的分离的线粒体群体，其中所述线粒体的内膜包含致密折叠的嵴。

在实施方式中，本文提供了分离的线粒体群体，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体具有基本上非丝状、不分支的结构或形状。例如在实施方式中，本文提供的线粒体当在显微镜下观察时呈圆形、点状、球形、不规则形状和/或略微拉长，或它们的任何混合物。在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体具有不超过4:1、不超过3.5:1或不超过3:1的长径与短径比率。在实施方式中，本文提供的线粒体群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的分离的线粒体具有比所述线粒体的流体力学直径的两倍或三倍更短的长度。通过这种方式，本文提供的分离的线粒体当与细胞内的大多数线粒体的形状(丝状)相比时具有明显不同的形状(非丝状)。因此，在实施方式中，本文提供的线粒体群体具有与存在于细胞中且尚未被分离的线粒体不同的形状，因为所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体的形状是非丝状。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体表现出与线粒体相关膜(MAM)的结合降低。在实施方式中，与MAM的结合通过葡萄糖调节蛋白75(GRP75)的表达来测量。在实施方式中，当与细胞内的线粒体和/或通过常规分离方法例如本文中进一步描述的涉及匀浆和/或高水平去污剂的方法获得的线粒体相比时，本文提供的分离的线粒体群体表现出与MAM的约60％、至少约65％、至少约70％、约60％、约50％、约40％、约30％或更少的结合。在实施方式中，相对于细胞中的线粒体或通过常规分离方法分离的线粒体与MAM的结合，本文提供的分离的线粒体群体表现出与MAM的结合降低，其中所述降低为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或更多。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体的尺寸在约500nm至约3500nm之间。在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的线粒体的尺寸在约500nm至约3500nm之间。在实施方式中，所述群体中的线粒体的平均尺寸为约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、约1000nm、约1100nm、约1200nm、约1300nm、约1400nm、约1500nm、约1600nm、约1700nm、约1800nm、约1900nm、约2000nm、约2100nm、约2200nm、约2300nm、约2400nm、约2500nm、约2600nm、约2700nm、约2800nm、约2900nm、约3000nm、约3100nm、约3200nm、约3300nm、约3400nm或约3500nm。在实施方式中，所述分离的线粒体群体的多分散指数(PDI)为约0.2至约0.8。在实施方式中，所述分离的线粒体群体的PDI为约0.2至约0.5。在实施方式中，所述分离的线粒体群体的PDI为约0.25至约0.35。在实施方式中，所述线粒体群体的ζ电位为约-15mV至约-40mV。在实施方式中，所述线粒体群体的ζ电位为约-20mV、约-25mV、约-30mV、约-35mV或约-40mV。

在实施方式中，当将分离的线粒体群体与细胞群体接触时，本文提供的分离的线粒体群体能够被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位。例如在实施方式中，本公开提供了从细胞获得线粒体，并且随后将细胞(例如离体或体内细胞)群体与所述分离的线粒体群体接触的方法。在此类实施方式中，本文提供的通过本文描述的iMIT方法分离的线粒体能够与细胞内存在的内源线粒体共定位。在实施方式中，本文提供的线粒体进一步能够与细胞中存在的与它们接触的线粒体融合。在实施方式中，所述分离的线粒体群体的显著部分能够与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。例如在实施方式中，所述群体中至少约30％,至少约40％,至少约50％,至少约60％,至少约70％,至少约80％,至少约90％或至少约95％的线粒体能够与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。因此，本文提供的线粒体与通过常规方法分离的线粒体的显著差异在于它们能够与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在约4℃储存后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在约4℃储存后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在约-20℃或更低温度储存后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在约-20℃储存后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在约-80℃或更低温度储存后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在约-80℃储存后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在液氮中储存后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在液氮中储存后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。

在实施方式中，所述储存持续至少约2小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月或更长时间。因此，在实施方式中，本文提供的分离的线粒体与通过常规方法分离的线粒体的显著差异至少在于它们在新鲜分离时以及甚至在储存后维持功能性能力。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在所述线粒体群体已被冷冻储存然后融化后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，在被冷冻然后融化后，相对于冷冻前所述线粒体的膜电位，膜电位的维持率为约90％。例如，在实施方式中，已被冷冻和融化的线粒体群体的极化比为该群体在冷冻前的极化比的约90％。在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在被冷冻储存然后融化后，例如在被冷冻储存然后融化1、2、3次或更多次后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。因此，在实施方式中，本文提供的分离的线粒体与通过常规方法分离的线粒体的显著差异至少在于它们甚至在被冷冻储存然后融化后维持功能性能力。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体在将所述线粒体在本文中提供的任何温度(例如4℃±3℃、-20℃±3℃、-80℃±3℃或在液氮中)储存后，能够被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在所述线粒体已被储存和/或经历一个或多个冻融循环后，能够被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。在实施方式中，储存和融化本文提供的分离的线粒体群体的方法包括将所述群体储存在约-20℃±3℃、约-80℃±3℃或更低温度下(例如在液氮中)，然后将所述线粒体在约20℃±3℃或更低温度下融化，其中所述线粒体在约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟或约1分钟内融化。在特定实施方式中，所述线粒体群体在约1分钟内融化。因此，在实施方式中，本文提供的线粒体与通过常规方法分离的线粒体的显著差异至少在于它们能够被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合，而通过常规方法分离的线粒体不能被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合，或表现出大大降低的此类能力。在实施方式中，所述共定位的分离的线粒体可以形成丝状结构、网络结构和/或网状结构。

在实施方式中，本公开提供了包含本文提供的分离的线粒体的组合物。在实施方式中，所述组合物还包含一种或多种可药用载体。

在实施方式中，本公开提供了从细胞分离线粒体的方法，所述方法与常规已知方法不同，并产生具有卓越功能和本文中提供的其他特征的线粒体。在实施方式中，所述从细胞分离线粒体的方法包括将细胞在表面活性剂浓度低于所述表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)的第一溶液中处理，去除所述表面活性剂以形成第二溶液，将所述细胞在所述第二溶液中温育，并从所述第二溶液回收线粒体。在实施方式中，所述第一溶液中的表面活性剂浓度为所述表面活性剂的CMC的约50％或更低。例如在实施方式中，所述第一溶液中的表面活性剂浓度为所述表面活性剂的CMC的约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低或约10％或更低。

在实施方式中，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。在实施方式中，所述表面活性剂选自Triton-X 100、Triton-X 114、Nonidet P-40、正十二烷基-D-麦芽糖苷、Tween-20、Tween-80、皂苷和毛地黄皂苷。在实施方式中，所述表面活性剂是皂苷或毛地黄皂苷。在实施方式中，所述表面活性剂的浓度低于约400μM。例如，在实施方式中，所述第一溶液中的表面活性剂浓度低于约300μM、低于约200μM、低于约100μM或低于约50μM。在实施方式中，所述第一溶液中的表面活性剂浓度为约100μM、约75μM、约60μM、约50μM、约40μM、约30μM或约20μM。在实施方式中，所述第一溶液中表面活性剂的浓度为约20μM至约50μM或约30μM至约40μM。

在实施方式中，所述第一溶液还包含缓冲液，其包含一种或多种张度剂、渗透压调节剂或螯合剂。在实施方式中，所述第一溶液包含tris缓冲液、蔗糖和螯合剂。

在实施方式中，所述在包含低浓度表面活性剂(例如低于表面活性剂的CMC)的第一溶液中处理细胞的步骤包括将所述细胞在所述第一溶液中在室温下温育约2分钟至约30分钟。例如，在实施方式中，所述在第一溶液中处理细胞的步骤包括将所述细胞在所述第一溶液中温育约2、约5、约10、约15、约20、约25或约30分钟。所述温育可以在约4℃至约37℃的温度下进行。

在实施方式中，所述去除表面活性剂的步骤包括将所述溶液中的表面活性剂减少到低于所述第一溶液中表面活性剂浓度的10％，或减少到低于所述第一溶液中表面活性剂浓度的1％。在实施方式中，所述去除表面活性剂的步骤包括用缓冲液清洗所述细胞。

在实施方式中，所述温育第二溶液的步骤包括将所述细胞在所述第二溶液中温育约5分钟至约30分钟。例如，在实施方式中，所述将细胞在第二溶液中温育的步骤包括将所述细胞在所述第二溶液中温育约5、约10、约15、约20、约25或约30分钟。在实施方式中，所述将细胞在第二溶液中温育的步骤在约4℃±3℃的温度下或在冰上进行。

在实施方式中，所述从第二溶液回收线粒体的步骤包括收集上清液以回收所述分离的线粒体。在实施方式中，所述从第二溶液回收线粒体的步骤包括将所述第二溶液离心并在离心后收集上清液，以回收所述分离的线粒体。

在实施方式中，所述iMIT可以在附着到培养表面的细胞上进行。在实施方式中，所述iMIT可以在附着到培养表面的细胞上，在不从所述表面脱离所述细胞的情况下进行。在实施方式中，所述从第二溶液回收线粒体的步骤包括收集上清液以回收所述分离的线粒体，随后可以任选地用所述第二溶液或另外的第二溶液清洗所述培养表面上的剩余细胞，以将其与所述上清液合并。

在实施方式中，本文提供的方法还包括冷冻所述分离的线粒体。在实施方式中，所述方法包括将所述线粒体在包含冷冻保护剂(例如甘油)的缓冲液中冷冻。在实施方式中，所述方法包括将所述缓冲液中的线粒体在液氮中冷冻。在实施方式中，所述方法还包括在冷冻后融化所述线粒体。在实施方式中，所述用于融化线粒体的方法包括迅速融化所述线粒体，例如在约5分钟内或约1分钟内。在实施方式中，将所述线粒体在温度为约20℃±3℃至约37℃±3℃的温浴中融化。在实施方式中，将所述线粒体在约20℃±3℃或更低温度下融化。

在实施方式中，本公开提供了通过本文提供的方法获得的分离的线粒体群体。在实施方式中，本文提供的方法是“iMIT”方法，并且通过这种方法获得的线粒体在本文中被称为“Q”线粒体。在实施方式中，本公开提供了包含通过本文提供的方法获得的分离的线粒体群体的组合物和/或制剂。

在实施方式中，本公开提供了用于治疗或预防与线粒体功能障碍相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括将对象的细胞与本文提供的分离的线粒体例如Q线粒体群体接触。在实施方式中，所述疾病或障碍是缺血相关的疾病或障碍。例如，在实施方式中，所述缺血相关的疾病或障碍选自脑缺血再灌注、缺氧缺血性脑病、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、肝缺血再灌注损伤、缺血损伤间室综合征、血管阻塞、伤口愈合、脊髓损伤、镰状细胞病和移植器官的再灌注损伤。在实施方式中，所述疾病或障碍是遗传障碍。在实施方式中，所述疾病或障碍是癌症、心血管疾病、眼部障碍、耳部障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或纤维化障碍。在实施方式中，所述疾病是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在实施方式中，所述疾病或障碍是衰老疾病或障碍或与衰老相关的病症。在实施方式中，所述疾病或障碍是先兆子痫或宫内生长受限(IUGR)。

在实施方式中，本公开提供了用于治疗或预防本文中提供的疾病或障碍的方法，其中所述方法包括向有需要的对象给药所述分离的线粒体群体或组合物。在实施方式中，所述分离的线粒体的给药途径是通过静脉内、动脉内、气管内、皮下、肌肉内、吸入或肺内给药途径。在实施方式中，所述对象是哺乳动物，例如人类。

在实施方式中，本公开提供了具有完整的内膜和外膜的分离的线粒体，其中所述内膜包含折叠的嵴，其中所述线粒体已从细胞分离，其中所述线粒体当通过荧光指示剂(例如JC-1、TMRM或TMRE)测量时是极化的，并且其中所述线粒体能够在细胞外环境中维持极化。在实施方式中，所述折叠的嵴是密集折叠的嵴。在实施方式中，所述线粒体具有基本上非丝状形状。在实施方式中，所述线粒体在其表面上包含与微管蛋白结合的电压依赖性阴离子通道(VDAC)。例如，在实施方式中，所述分离的线粒体在表面上包含与VDAC结合的二聚体微管蛋白。在实施方式中，所述微管蛋白至少包括α-微管蛋白。在实施方式中，所述微管蛋白是包含α-微管蛋白和β-微管蛋白的异二聚体。在实施方式中，所述微管蛋白是同二聚体。在实施方式中，所述分离的线粒体当通过GRP75表达测量时表现出与MAM的减少的结合。例如，在实施方式中，当与细胞中存在的(即尚未被分离的)线粒体和/或通过常规分离方法例如本文中进一步描述的涉及匀浆和/或高水平去污剂的方法获得的线粒体相比时，分离的线粒体表现出约70％、约60％、约50％、约40％、约30％或更少的与MAM的结合。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体表现出与MAM的结合降低，其中所述降低是相对于细胞中存在的(即尚未被分离的)线粒体和/或通过常规分离方法分离的线粒体与MAM的结合至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或更多。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体具有约-30mV至约-220mV之间的膜电位。在实施方式中，所述分离的线粒体的形状是非丝状。在实施方式中，所述分离的线粒体没有正在进行drp1依赖性分裂。在实施方式中，所述分离的线粒体的尺寸在约500nm至3500nm之间。例如，在实施方式中，所述分离的线粒体的尺寸为约500、约600、约700、约800nm、约900nm、约1000nm、约1100nm、约1200nm、约1500nm、约2000nm、约2500nm、约3000nm或约3500nm。

在实施方式中，本公开提供了通过本文提供的方法获得的分离的线粒体。在实施方式中，本公开提供了包含本文提供的分离的线粒体的组合物和制剂。

在优选实施方式中，线粒体可以从MITO细胞分离。MITO细胞是一种通过将细胞与MITO-Porter接触而被活化的细胞(参见WO2018/092839，其整体通过参考并入本文)。MITO-Porter包含在脂质体内部的线粒体活化剂，所述脂质体任选地呈递线粒体靶向信号分子例如烷基化的生理上可接受的聚阳离子例如聚精氨酸或S2肽或偶联到聚阳离子例如聚精氨酸或S2肽的脂质(参见WO2017/090763和WO2018/092839，它们整体通过参考并入本文)。线粒体活化剂的实例包括但不限于抗氧化剂例如白藜芦醇(3,5,4'-三羟基-反式-二苯乙烯)、辅酶Q10、维生素C、维生素E、N-乙酰半胱氨酸、2,2,6,6,-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽，并且具体来说白藜芦醇是优选的(参见WO2018/092839)。已报道白藜芦醇可以活化Sirtuin家族的SIRT1，所述家族是具有NAD⁺依赖性组蛋白脱乙酰酶活性的酶的家族。白藜芦醇可以形成Sirtuin-AMPK-PPAR-PGC-1α复合体，以加速FOXO1的转录和引起线粒体生物发生。MITO细胞这种用含有线粒体活化剂的MITO-Porter处理的细胞由于所述线粒体活化剂例如抗氧化剂而具有活化的呼吸活性和呼吸复合体活性。还以报道，Sirtuin-AMPK-PPAR-PGC-1α轴信号诱导的线粒体生物发生进一步激活嵴融合和分裂，以便接受由于e^-从NAD⁺流入而造成的氧化磷酸化反应的增加。嵴融合会导致嵴的致密化，导致线粒体内的线粒体指示剂的荧光急剧增加。因此理论上，从已被MITO-Porter活化的MITO细胞分离的Q(也被称为“Super Q”)与来自于未处理细胞的Q相比可能具有密度更高的嵴，更多的包含在MITO-Porter中的抗氧化剂例如白藜芦醇，更多的类核，更多的活化的SIRT3-AMPK-PPAR-PGC-1α复合体或活化的SIRT1-AMPK-PPAR-PGC-1α，以及由于所述复合体的活化而比来自于未处理细胞的Q更多的转录本。因此，据认为在细胞内线粒体活化后，包裹的Super Q可能显示出比包裹的Q更强的效应。

在一个实施方式中，本发明提供了Super Q或从已用MITO-Porter处理的细胞分离的线粒体。在一个实施方式中，Super Q可以通过iMIT方法分离。在一个实施方式中，SuperQ和包裹的Super Q可能含有通过使用MITO-Porter而被并入的线粒体活化剂例如白藜芦醇。在一个实施方式中，Super Q和包裹的Super Q可能含有比在从未处理细胞分离的Q和包裹的Q中更多的线粒体活化剂。

一方面，本公开提供了使用本文提供的方法从细胞分离并因此具有高度功能性的线粒体群体。如上所述，本文提供的新的分离方法被可互换地称为“DHF”方法或“iMIT”方法；通过所述DHF或iMIT方法获得的线粒体在本文中被称为“Q”线粒体。Q线粒体避免了当通过常规方法分离线粒体时发生的破裂和膜破坏，因此在结构和功能上优于通过常规方法分离的线粒体。

在实施方式中，本公开提供了分离或得到的线粒体群体，其中所述群体含有高比例的极化线粒体(即所述群体具有高极化比)。因此，本文提供的线粒体群体包含高比例的具有膜电位的线粒体。在实施方式中，本公开提供了线粒体群体，其中所述群体中高比例的线粒体具有完整的内膜和外膜。在实施方式中，完整的内膜和外膜的存在可以通过线粒体的功能活性例如膜电位和极化来确定。

因此，本文提供的线粒体群体优于使用常规方法例如上文所描述的涉及匀浆和/或细胞冻融和/或高浓度去污剂或表面活性剂的方法从细胞获得的线粒体群体。例如，通过常规方法从细胞分离的线粒体必然被分离过程损伤并失去功能性能力。因此，本公开提供了分离的线粒体群体，其与通过常规方法获得的线粒体群体相比具有更高的极化比和/或更高的极化百分率和/或更高百分率的具有完整的内膜和外膜的线粒体。

在实施方式中，所述分离或得到的线粒体群体的极化比可以是例如40％或更大、45％或更大、50％或更大、55％或更大、60％或更大、65％或更大、70％或更大、75％或更大、80％或更大或85％或更大。

在实施方式中，所述分离或得到的线粒体群体的至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多当通过荧光指示剂测量时是极化的。在实施方式中，所述荧光指示剂可以是本领域普通技术人员已知适用于测量线粒体膜电位的任何荧光指示剂。在实施方式中，所述荧光指示剂选自JC-1、TMRM和TMRE。

在实施方式中，所述分离或得到的线粒体群体的至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多具有完整的内膜和外膜。在实施方式中，所述分离或得到的线粒体群体的至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多在内膜中具有密集折叠的嵴。例如，在实施方式中，Q线粒体的嵴结构类似于细胞中的、即尚未从细胞分离的线粒体的嵴结构。当在本文中使用时，术语“密集折叠的嵴”意味着所述线粒体包含以高密度存在的嵴，也就是说高度折叠的嵴。嵴的密度可以使用显微术(例如透射电子或光学显微术，包括共聚焦显微术)来评估。在实施方式中，线粒体中的嵴密度可以通过每平方微米的嵴折叠的数目来度量，其可以通过对折叠的数目进行计数来人工确定和/或通过自动化软件程序来确定。在实施方式中，“高密度的嵴”、“密集折叠的嵴”等意味着每平方微米至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8个或更多个嵴(即嵴折叠)。可选地或此外，线粒体中的嵴密度可以通过每单位线粒体体积的嵴表面积来度量。因此，在实施方式中，“高密度的嵴”、“密集折叠的嵴”等意味着每单位线粒体体积的嵴表面积(μm²μm^–3)为至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40或更大。用于确定嵴密度的方法在本领域中是已知的(参见例如Segawa等，“嵴结构的定量揭示出单个线粒体的时间依赖性特征”(Quantification of cristae architecture reveals time dependentcharacteristics of individualmitochondria)，Life Science Alliance第3卷第7期、2020年6月；和Nielsen等，The Journal of Physiology 595.9(2017)第2839-47页)。在实施方式中，本文提供的线粒体群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多的线粒体具有每平方微米至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8个或更多个嵴；和/或具有至少约20的每单位线粒体体积的嵴表面积(μm²μm^–3)、至少约25μm²μm^–3、至少约30μm²μm^–3、至少约35μm²μm^–3、至少约40μm²μm^–3或更大。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体的平均或代表性嵴密度等同于和/或不显著小于获得所述分离的线粒体的细胞类型中线粒体的嵴密度。在实施方式中，本文提供的线粒体群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多的线粒体表现出的嵴密度等同于和/或不显著小于获得所述分离的线粒体的细胞类型中线粒体的平均或代表性嵴密度。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体具有即使在暴露于高钙(Ca²⁺)环境时也维持功能性能力的令人吃惊的特点。在实施方式中，由于本文提供的分离方法，本文提供的分离的线粒体群体在细胞外环境中维持功能性能力。在实施方式中，所述分离或得到的线粒体群体的至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多在细胞外环境中维持功能性能力。在实施方式中，所述细胞外环境包含约6mg/dL至约14mg/dL或约8mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度。在实施方式中，所述细胞外环境包含约3mg/dL至约8mg/dL或约4mg/dL至约6mg/dL的游离/活性钙浓度。因此，在实施方式中，本文提供的Q线粒体具有引人注目的特征，即以极小或可忽略的损伤从细胞内环境分离，并且即使在暴露于细胞外环境、例如原本预计会对线粒体造成损伤和/或显著抑制它们的功能性能力的富钙环境时仍保留起作用的能力。

不希望受到理论限制，在某些实施方式中，本文提供的分离或得到的线粒体在细胞外环境中维持功能性能力的能力部分或完全是由于微管蛋白与线粒体表面上的电压依赖性阴离子通道(VDAC)的结合。例如，在实施方式中，在本文提供的iMIT分离过程中，微管蛋白可以与线粒体表面上的所有或显著数量的VDAC结合，使得线粒体即使在富钙环境(例如包含约3mg/dL至约14mg/dL或更多钙的细胞外环境)中也能维持功能。在实施方式中，微管蛋白与所述分离的线粒体表面上的VDAC的结合可以通过检测线粒体表面处微管蛋白的存在，例如通过染色来确定。

不希望受到理论限制，在某些实施方式中，本文提供的分离的Q线粒体能够在细胞外环境中维持功能性能力，这完全或部分是由于在iMIT分离期间Q线粒体外膜中的胆甾醇、麦角甾醇和/或相关分子的消除。也就是说，由于在分离程序期间少量表面活性剂与线粒体膜的接触，胆甾醇(其使VDAC结构稳定)可能消除到一定程度，导致分离的线粒体在表面上具有已失去部分或所有功能的VDAC，使得线粒体变得对细胞外钙浓度(例如包含约3mg/dL至约14mg/dL或更多钙的细胞外环境)有抗性。因此，在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在线粒体膜中包含非常低水平的甾醇浓度。

在实施方式中，相对于细胞中的线粒体和/或使用常规方法例如涉及细胞匀浆和/或细胞冻融的方法分离或得到的线粒体，所述分离或得到的线粒体群体还表现出与线粒体相关膜(MAM)的结合降低。在实施方式中，所述降低的MAM结合通过线粒体表面处葡萄糖调节蛋白GRP75的表达来测量。

在实施方式中，所述分离的线粒体的形状是基本上非丝状的。“非丝状”可以与“非网络状”等互换使用，并且意味着所述线粒体不表现出细胞内存在的线粒体的分支和网状网络。在实施方式中，本文提供的线粒体当在显微镜下观察时，不具有丝状、网络状或分支结构，而是呈现圆形、球形、不规则形状和/或略微拉长或它们的任何混合。在较低放大倍数下，所述分离的线粒体呈现点状结构。相反，在较低放大倍数下，细胞中的线粒体可见高度拉长、网络或分支结构。在实施方式中，所述分离或得到的线粒体群体的至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多具有不超过4:1、不超过3.5:1或不超过3:1的长径与短径比。不希望受到理论限制，通过本文提供的方法分离的线粒体的形状是由于在分离之前通过运动蛋白到微管的连接被温和地去除，而此时线粒体仍在细胞中。也就是说，一旦线粒体不再被束缚到细胞的微管，它们就会失去它们在细胞内具有的高度拉长且分支/网络状的形状，代之以形成本文中描述的非丝状形状。

在实施方式中，本文提供的线粒体群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的分离的线粒体具有比所述线粒体的流体力学直径的两倍更短的长度。在实施方式中，所述流体力学直径为约1μm，并且本文提供的线粒体群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的分离的线粒体在长轴长度上具有2μm或更小、1.9μm或更小、1.8μm或更小、1.7μm或更小、1.6μm或更小、1.5μm或更小、1.4μm或更小或1.3μm或更小的长度。在实施方式中，流体力学直径通过动态光散射方法(DLS)来测量。在实施方式中，流体力学直径是中值直径D₅₀。

通常，在细胞中，线粒体的形状被高度拉长或采取如上所述的丝状分支结构的形式。非丝状和不拉长的线粒体通常仅在发生drp1依赖性分裂或drp1依赖性裂殖时才存在于细胞中。对于这个线粒体裂殖过程来说，与内质网的相互作用引起线粒体的初始缢缩。Drp1蛋白被招募到线粒体并在其表面上组装，以引起进一步缢缩。DYN2被招募进行膜分裂的最后阶段。得到的线粒体的形状通常可以是球形的。在细胞中，此类球形线粒体在变得拉长或形成更典型的分支状结构之前可以保持球形形状一段有限的时间。相比之下，使用iMIT方法分离的线粒体的形状在没有正在进行Drp1介导的裂殖的情况下是非丝状的。此外，通过常规方法例如涉及细胞匀浆的方法分离的线粒体产生的线粒体是非丝状的并且在很大程度上呈圆形或球形，因为它们已被损坏，并从细胞中原本导致它们保持拉长形状的微管撕裂。与以这种方式分离的线粒体相反，通过本文提供的iMIT方法分离的线粒体没有经历从微管的损坏性去除，并且没有正在进行drp1介导的裂殖。因此，本公开的线粒体不同于细胞中的天然线粒体和通过更常规的方法分离的线粒体两者。例如，在实施方式中，本文提供的通过iMIT方法获得的线粒体的形状基本上是非丝状的，并在同时表现出高度功能性状态(例如极化)、包含密集折叠的嵴的完整内膜和外膜结构，同时没有正在进行drp1裂殖。

在实施方式中，本文提供的Q线粒体在与细胞或细胞群体接触时，表现出与所述一个或多个细胞中的内源线粒体共定位的令人吃惊的特点。与通过常规方法分离的线粒体相比，所述Q线粒体以高得多的程度与内源线粒体共定位。在实施方式中，本文提供的Q线粒体在与细胞或细胞群体接触时，与所述一个或多个细胞中的内源线粒体融合。所述分离的Q线粒体的融合明显不同于且优于通过常规方法分离的线粒体。在实施方式中，所述线粒体即使在储存后也保留这种能力。因此，在实施方式中，本文提供的Q线粒体优于常规分离的线粒体，至少在于它们在与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合方面更加高效，并因此在用于治疗例如本文中描述的任何疾病或障碍时表现出优越的临床效果。这可能表明本文提供的Q线粒体与常规分离的线粒体相比具有更鲁棒且接近完整的外膜。

在实施方式中，本公开提供了通过本文提供的方法分离或得到的线粒体群体。例如，本公开提供了通过包含上文中所描述的iMIT方法的步骤(A)至(C)的方法分离或得到的线粒体群体。在实施方式中，本公开提供了通过包含上文中所描述的步骤(A)至(E)的方法分离或得到的线粒体群体。

根据本公开，提供了一种包含本发明的分离的线粒体群体的组合物。根据本公开，提供了一种包含本发明的分离的线粒体群体的线粒体制剂。包含本发明的分离的线粒体群体的组合物可以进一步包含缓冲液。包含本发明的分离的线粒体群体的线粒体制剂是可药用的，并且可以进一步包含可药用的其他组分例如赋形剂。本公开的分离的线粒体群体或含有它的组合物或线粒体制剂可以在分离过程中获得，而不使用通过流式细胞仪的细胞分拣例如荧光激活细胞分拣(FACS)。因此，本发明的分离的线粒体群体或含有它的组合物或线粒体制剂不含荧光染料和荧光探针(以及非荧光线粒体染色剂和探针)。在实施方式中，所述组合物是药物组合物。Q的所有这些特点都可以在Super Q制剂中执行。

在实施方式中，去污剂处理可以在低于10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃或4℃下，优选地在约0℃至约4℃的温度下或在冰上进行(只要样品不冻结即可)。在实施方式中，所有分离程序均可以在约0℃至室温之间，优选地低于10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃或4℃，优选地在约4℃的温度下或在冰上进行。

本公开提供了通过本文提供的方法从线粒体已被活化的细胞分离或得到的线粒体群体。线粒体的活化可以通过各种不同方法来实现，例如通过将线粒体与线粒体活化剂接触。这种线粒体活化可以通过各种不同方法来实现，包括MITO-Porter技术。MITO-Porter技术可以使用线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体。在线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体中，可以任选地通过连接物将线粒体靶向载体共价或非共价地连接到线粒体活化剂。在所述复合体中，线粒体靶向载体例如MTS肽、聚阳离子、八聚精氨酸和S2肽可以被共价连接到通过疏水相互作用呈递在基于脂质膜的囊泡例如脂质体的表面上的脂质或疏水性组成部分(例如烃)。在一个实施方式中，采取囊泡形式的线粒体靶向载体可以包裹或包含线粒体活化剂。在实施方式中，活化的线粒体与未处理的线粒体或线粒体活化处理之前的线粒体相比，具有改善的膜电位和/或改善的呼吸活性，所述呼吸活性可以通过耗氧率(OCR)来评估。

本公开还提供了通过本文提供的方法从已用包裹了线粒体活化剂例如白藜芦醇的MITO-Porter处理的细胞分离或得到的线粒体群体。在实施方式中，本公开提供了通过本文提供的方法从细胞分离或得到的线粒体群体，其中所述线粒体群体包含线粒体活化剂例如白藜芦醇。本发明包括将线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体引入到细胞例如CPC或非CPC细胞中的步骤。在实施方式中，所述细胞可以不是心脏细胞。

本发明包括将线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体引入到细胞例如CPC或非CPC细胞中的步骤。在优选实施方式中，线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体是包裹或包含线粒体活化剂的基于脂质膜的囊泡(即线粒体靶向脂质体)。

所述线粒体靶向载体是在被引入到细胞中时具有选择性到达作为细胞内细胞器之一的线粒体的功能的载体。线粒体靶向载体的实例可以包括脂溶性阳离子物质例如亲脂性三苯基鏻阳离子(TPP)和罗丹明123，多肽例如线粒体靶向序列(MTS)肽(Kong,BW.等，Biochimica et Biophysica Acta 2003,1625,第98-108页)和S2肽(Szeto,H.H.等，Pharm.Res.2011,28,第2669-2679页)，以及线粒体靶向脂质体例如DQAsome(Weissig,V.等，J.Control.Release 2001,75,第401-408页)、MITO-Porter(Yamada,Y.等，BiochimBiophys Acta.2008,1778,第423-432页)、DF-MITO-Porter(Yamada,Y.等，Mol.Ther.2011,19,第1449-1456页)和用S2肽修饰的修饰DF-MITO-Porter(Kawamura,E.等，Mitochondrion2013,13,第610-614页)。所述关于本发明中的载体的生产和用途的文献通过参考并入本文。

本发明中的优选线粒体靶向载体是线粒体靶向脂质体，具体来说MITO-Porter、DF-MITO-Porter或修饰的DF-MITO-Porter是优选的。

所述线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体是一种具有其中线粒体靶向载体和线粒体活化剂以一体方式行动的配置的物质，不论形成所述复合体使用的是化学键合、物理包裹还是其他方法。例如，当所述脂溶性阳离子脂质或多肽是线粒体靶向载体时，可以按照例如Murphy等人关于脂溶性阳离子物质的方法(G.F.Kelso等，J.Biol.Chem.,2001,276,第4588-4596页)或JP2007-503461A中所述关于Szeto肽的方法，通过使用化学方法例如共价键合或离子键合将线粒体靶向载体键合到线粒体活化剂，来形成线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体。

此外，当所述线粒体靶向载体是脂质体时，可以通过将线粒体活化剂化学键合到脂质体的脂质膜表面，或将线粒体活化剂物理包裹在脂质体即被脂质膜阻挡的内部空间中，来形成线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体。

所述复合体可以通过已知用于线粒体靶向载体的将复合体引入到细胞中的方法引入到细胞例如CPC或非CPC细胞中。所述复合体可以通过例如下述方法引入到细胞中：将细胞例如CPC或非CPC细胞在含有所述复合体的适合的培养基中培养，或将所述复合体与细胞例如CPC或非CPC细胞在能够加速物质在细胞中的摄入的已知物质例如lipofectamine或聚乙二醇的存在下温育。

在本发明的第一种情况下，将线粒体靶向载体和线粒体活化剂的复合体引入到细胞例如CPC或非CPC细胞中的步骤的优选实例，是通过将细胞例如CPC或非CPC细胞与作为包裹线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体的复合体、特别是作为表面用MTS肽或S2肽修饰并包裹线粒体活化剂的MITO-Porter或DF-MITO-Porter的复合体温育，将复合体引入到细胞例如CPC或非CPC细胞中的步骤。

所述线粒体活化剂是能够活化线粒体呼吸链复合体(电子传递系统)的物质，特别是能够在膜电位方面使线粒体进入极化状态的物质，并且具体来说，优选地使用能够使线粒体进入超极化状态的物质。线粒体活化剂的实例可以包括抗氧化剂例如白藜芦醇(3,5,4'-三羟基-反式-二苯乙烯)、辅酶Q10(参见WO2020/203961A，其整体通过参考并入本文)、维生素C、维生素E、N-乙酰半胱氨酸、TEMPO、SOD和谷胱甘肽，并且具体来说，白藜芦醇是优选的。

在本发明中优选使用的白藜芦醇可以是通过已知方法从植物提取的白藜芦醇，或通过已知方法例如Andrus等人的方法(Tetrahedron Lett.2003,44,第4819-4822页)化学合成的白藜芦醇。

通过本发明的方法产生的细胞例如CPC或非CPC细胞是本发明的其他方面之一，并且正如下文实施例中所示可以显著提高接受多柔比星的小鼠的生存能力。

临床上已知，多柔比星这类基于蒽环的药剂的给药会引起严重的心肌损伤，并且将接受多柔比星的小鼠用作心力衰竭小鼠模型。因此，通过本发明的方法产生的细胞例如CPC或非CPC细胞可用于治疗和/或预防心肌损伤、特别是严重心肌损伤，恢复、保护或抑制心脏功能的恶化，治疗和/或预防心力衰竭等。

本发明的另一方面涉及一种包括心肌干细胞的细胞群体，其中当将所述细胞群体用荧光染料JC-1染色时，JC-1二聚体的荧光强度与JC-1单体的荧光强度之比(JC-1二聚体的荧光强度/JC-1单体的荧光强度)的平均值为1至4。

在线粒体中存在的呼吸链复合体的作用下，线粒体在膜的内侧和外侧产生质子浓度梯度，并进入其中存在膜电位的极化状态。当接受凋亡、代谢胁迫等时，极化的线粒体转变成其中膜电位降低的去极化状态。因此，线粒体的极化状态是指示线粒体代谢活性的参数，并且具有大量极化线粒体的细胞被认为是具有活化的线粒体的细胞。

已知作为线粒体膜电位探针的荧光染料JC-1(5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物)在去极化线粒体中是发射绿色荧光的单体，但在极化的线粒体中形成发射红色荧光的二聚体。因此，JC-1单体与JC-1二聚体之间荧光强度的比率是指示线粒体极化状态的指数。所述荧光强度比率可以通过例如使用可以从Thermo FisherScientific,Cosmo Bio Co.,Ltd商购的JC-1等，按照制造商的方案检测荧光比率来测量。

根据这一方面的细胞群体是包括具有活化的线粒体的细胞例如CPC或非CPC细胞的细胞群体，并且所述群体中包括的细胞例如CPC或非CPC细胞的线粒体活化程度可以用当将所述细胞群体用JC-1染色时，JC-1二聚体的荧光强度与JC-1单体的荧光强度之比(JC-1二聚体的荧光强度/JC-1单体的荧光强度)的平均值来表示。

所述荧光强度比率的平均值可以如下确定：测量包括在所述细胞群体中的任何数量的细胞例如CPC或非CPC细胞，优选为大于10并小于100个细胞例如CPC或非CPC细胞中的每一个细胞的JC-1二聚体的荧光强度与JC-1单体的荧光强度之比(JC-1二聚体的荧光强度/JC-1单体的荧光强度)，并计算所述测量到的比率的平均值。在包括具有活化的线粒体的CPC的细胞群体中，所述JC-1二聚体的荧光强度与JC-1单体的荧光强度之比的平均值大于1，优选为1至4。

根据这一方面的细胞群体是主要由诸如CPC或非CPC细胞的细胞组成的细胞群体。所述细胞群体通常可以通过上述本发明的第一方面的方法来产生。

从所述细胞分离的线粒体已用所述线粒体活化剂处理。因此，线粒体优选地从已用包裹或包含线粒体活化剂的MITO-Porter(或基于脂质膜的囊泡或脂质体)处理的细胞分离。

在一个实施方式中，所述分离的线粒体或分裂的线粒体中的线粒体DNA浓度为10⁵至10⁷个拷贝/μg蛋白质。线粒体DNA的拷贝数可以使用包含具有SEQ ID NO：1的序列的正向引物和具有SEQ ID NO：2的序列的反向引物的引物集，通过定量PCR来计算。在一个实施方式中，线粒体转录因子A(TFAM)可以以约50ng/mg总蛋白至约300ng/mg总蛋白(例如约100ng/mg总蛋白至250ng/mg总蛋白)之间的浓度包含在所述分离的线粒体或分裂的线粒体中，所述浓度可以使用抗TFAM抗体通过ELISA来计算。所述计算可以通过比较TFAM标准值或样品来进行。

一方面，本发明提供了一种测量被包裹的线粒体中的线粒体DNA水平的方法，所述方法包括提供分离的线粒体，并测量所述分离的线粒体中的线粒体DNA水平。在一个实施方式中，所述方法还可以包括测量所述分离的线粒体中蛋白质的量。在一个实施方式中，所述方法还可以包括测量所述分离的线粒体中蛋白质的量，并计算线粒体DNA水平与所述蛋白质的量的比率。在一个实施方式中，线粒体DNA水平可以被表示成线粒体DNA的拷贝数或浓度。在优选实施方式中，可以将所述分离的线粒体包裹在囊泡例如基于脂质膜的囊泡中。在一个实施方式中，所述蛋白质的量可以通过Bradford方法测量。在一个实施方式中，所述DNA量可以通过定量PCR方法测量。在优选实施方式中，测量线粒体DNA水平的步骤可以包括通过使用包含具有SEQ ID NO：1中阐述的核苷酸序列的第一引物和具有SEQ ID NO：2中阐述的核苷酸序列的第二引物的引物集扩增所述线粒体DNA。所述方法还可以包括将测量到的线粒体DNA水平与标准值进行比较。所述标准值可以是通过iMIT方法获得的有功能的分离的线粒体的值。所述分离的线粒体或被包裹的线粒体中的线粒体DNA水平可以指示分离过程或储存期间对所述线粒体的损伤。在一个实施方式中，如果所述水平是等于所述标准值的20％或更大、30％或更大、40％或更大、50％或更大、60％或更大、70％或更大、80％或更大或90％或更大的预定值，则所述方法还可以包括将具有等于或大于所述预定值的水平的样品预测为药物组合物的药物有效成分。换句话说，所述水平可以指示所述样品作为药物有效成分的有效性、功能性或可用性。在一个实施方式中，所述方法还可以包括选择具有等于或大于所述预定值的水平的样品，和/或舍弃具有低于预定值的水平的样品。所述方法可以是测试包含分离的线粒体或被包裹的线粒体的样品的线粒体功能的方法。因此，根据本发明的方法在预测样品例如分离的线粒体样品、储存的线粒体样品、被包裹的线粒体样品、可药用线粒体制剂或可药用线粒体制备物中线粒体的损伤方面有用。所述预测步骤可以包括将DNA水平或上述比率与预定值进行比较。所述预定值在2×10⁵个拷贝/μg蛋白质至5×10⁶个拷贝/μg蛋白质之间的范围内。所述预定值的下限为2×10⁵个拷贝/μg蛋白质、3×10⁵个拷贝/μg蛋白质、4×10⁵个拷贝/μg蛋白质、5×10⁵个拷贝/μg蛋白质、6×10⁵个拷贝/μg蛋白质、7×10⁵个拷贝/μg蛋白质、8×10⁵个拷贝/μg蛋白质、9×10⁵个拷贝/μg蛋白质、1×10⁶个拷贝/μg蛋白质、2×10⁶个拷贝/μg蛋白质、3×10⁶个拷贝/μg蛋白质、4×10⁶个拷贝/μg蛋白质或5×10⁶个拷贝/μg蛋白质。所述预定值的上限可以是5×10⁶个拷贝/μg蛋白质、4×10⁶个拷贝/μg蛋白质、3×10⁶个拷贝/μg蛋白质、2×10⁶个拷贝/μg蛋白质或1×10⁶个拷贝/μg蛋白质。

本公开还提供了已被人工活化的分离或得到或加工的线粒体群体，其中所述群体中的线粒体表现出卓越的功能性能力。例如，在一种情况下，本公开提供了分离的线粒体群体，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体具有完整的内膜和外膜，和/或所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体当通过荧光指示剂测量时是极化的。在实施方式中，所述荧光指示剂选自带正电荷的染料例如JC-1、四甲基罗丹明甲酯(TMRM)和四甲基罗丹明乙酯(TMRE)。

在实施方式中，本公开提供了分离的线粒体群体，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在细胞外环境中维持功能性能力(例如是极化的)。在实施方式中，所述在细胞外环境中的功能性能力通过膜电位的荧光指示剂来测量。在实施方式中，所述荧光指示剂选自带正电荷的染料例如JC-1、TMRM和TMRE。在实施方式中，所述细胞外环境可以包括约4mg/dL至约12mg/dL或约1mmol/L(1000μM)至约3mmol/L(3000μM)的总钙浓度。例如，在实施方式中，所述细胞外环境包括约8mg/dL至约12mg/dL或约2mmol/L(2000μM)至约3mmol/L(3000μM)的总钙浓度。在实施方式中，所述细胞外环境包括约4mg/dL至约6mg/dL或约1mmol/L(1000μM)至约1.5mmol/L(1500μM)的游离或活性钙浓度。在实施方式中，所述线粒体群体在具有比细胞中的钙环境更高的钙浓度的环境中维持功能性能力。

在实施方式中，本文提供了分离的线粒体群体，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体没有正在进行发动蛋白相关蛋白1(drp1)依赖性分裂。在实施方式中，本文提供了具有内膜和外膜的分离的线粒体群体，其中所述线粒体的内膜包含密集折叠的嵴。

在实施方式中，本文提供了分离的线粒体群体，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体具有基本上非丝状、无分支的结构或形状。例如，在实施方式中，本文提供的线粒体当在显微镜下观察时呈圆形、点状、球形、不规则形状和/或略微拉长，或它们的混合。在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体具有不超过4:1、不超过3.5:1或不超过3:1的长径与短径比率。在实施方式中，本文提供的线粒体群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的分离的线粒体具有比所述线粒体的流体力学直径的两倍或三倍更短的长度。通过这种方式，当与细胞内的大多数线粒体的形状(丝状)相比时，本文提供的分离的线粒体具有显著不同的形状(非丝状)。因此，在实施方式中，本文提供的线粒体群体具有与细胞中存在并且尚未分离的线粒体不同的形状，其中所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体的形状是非丝状的。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体表现出与线粒体相关膜(MAM)的结合降低。在实施方式中，与MAM的结合通过葡萄糖调节蛋白75(GRP75)的表达来测量。在实施方式中，当与细胞中的线粒体和/或通过常规分离方法例如本文中进一步描述的涉及匀浆和/或高水平去污剂的方法获得的线粒体相比时，本文提供的分离的线粒体群体表现出约60％、至少约65％、至少约70％、约60％、约50％、约40％、约30％或更低的与MAM的结合。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体表现出与MAM的结合降低，其中所述降低是相对于细胞中的线粒体或通过常规分离方法分离的线粒体与MAM的结合至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或更多。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体的尺寸在约500nm至约3500nm之间。在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的线粒体的尺寸在约500nm至约3500nm之间。在实施方式中，所述群体中的线粒体的平均尺寸为约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、约1000nm、约1100nm、约1200nm、约1300nm、约1400nm、约1500nm、约1600nm、约1700nm、约1800nm、约1900nm、约2000nm、约2100nm、约2200nm、约2300nm、约2400nm、约2500nm、约2600nm、约2700nm、约2800nm、约2900nm、约3000nm、约3100nm、约3200nm、约3300nm、约3400nm或约3500nm。在实施方式中，所述分离的线粒体群体的多分散指数(PDI)为约0.2至约0.8。在实施方式中，所述分离的线粒体群体的PDI为约0.2至约0.5。在实施方式中，所述分离的线粒体群体的PDI为约0.25至约0.35。在实施方式中，所述PDI为约0至0.8，优选为约0至0.5，更优选为约0至0.35。在实施方式中，所述线粒体群体的ζ电位为约-15mV至约-40mV。在实施方式中，所述线粒体群体的ζ电位为约-20mV、约-25mV、约-30mV、约-35mV或约-40mV。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体在将所述分离的线粒体群体与细胞群体接触时，能够被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位。例如，在实施方式中，本公开提供了用于从细胞获得线粒体，然后将细胞(例如离体或体内细胞)群体与所述分离的线粒体群体接触的方法。在此类实施方式中，本文提供的通过本文描述的iMIT方法分离的线粒体能够与细胞中存在的内源线粒体共定位。在实施方式中，本文提供的线粒体还能够与它们接触的细胞中存在的线粒体融合。在实施方式中，所述分离的线粒体群体的显著部分能够与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。例如，在实施方式中，所述群体中至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的线粒体能够与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。因此，本文提供的线粒体与通过常规方法分离的线粒体的显著差异在于它们能够与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在约4℃储存后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在约4℃储存后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在约-20℃或更低温度储存后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在约-20℃储存后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在约-80℃或更低温度储存后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在约-80℃储存后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在液氮中储存后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在液氮中储存后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，所述储存持续至少约2小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月或更长时间。因此，在实施方式中，本文提供的分离的线粒体与通过常规方法分离的线粒体的显著差异至少在于它们在新鲜分离时和甚至在储存后维持功能性能力。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体在所述线粒体群体已被冷冻储存然后融化后，在暴露于细胞外环境后(例如暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。在实施方式中，在被冷冻然后融化后，相对于冷冻前所述线粒体的膜电位，膜电位的维持率为约90％。例如，在实施方式中，已被冷冻和融化的线粒体群体的极化比为该群体在冷冻前的极化比的约90％。在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在被冷冻储存然后融化后，例如在被冷冻储存然后融化1、2、3次或更多次后，在暴露于细胞外环境后(例如在暴露于约4mg/dL至约12mg/dL的总钙浓度后)是稳定和/或极化的，和/或维持膜电位和/或维持完整的内膜和外膜和/或维持起作用的能力。因此，在实施方式中，本文提供的分离的线粒体与通过常规方法分离的线粒体的显著差异至少在于它们甚至在被冷冻储存然后融化后维持功能性能力。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体群体在将所述线粒体在本文中提供的任何温度(例如4℃±3℃、-20℃±3℃、-80℃±3℃或在液氮中)储存后，能够被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。例如，在实施方式中，所述群体中至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的线粒体在所述线粒体已被储存和/或经历一个或多个冻融循环后，能够被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合。在实施方式中，储存和融化本文提供的分离的线粒体群体的方法包括将所述群体储存在约-20℃±3℃、约-80℃±3℃或更低温度下(例如在液氮中)，然后将所述线粒体在约20℃±3℃或更低温度下融化，其中所述线粒体在约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟或约1分钟内融化。在特定实施方式中，所述线粒体群体在约1分钟内融化。因此，在实施方式中，本文提供的线粒体与通过常规方法分离的线粒体的显著差异至少在于它们能够被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合，而通过常规方法分离的线粒体不能被并入到细胞中和/或与细胞中的内源线粒体共定位和/或融合，或表现出大大降低的此类能力。在实施方式中，所述共定位的分离的线粒体可以形成丝状结构、网络结构和/或网状结构。

在实施方式中，本公开提供了包含本文提供的分离的线粒体的组合物。在实施方式中，所述组合物还包含一种或多种可药用载体。

在实施方式中，本公开提供了从细胞分离线粒体的方法，所述方法与常规已知方法不同，并产生具有卓越功能和本文中提供的其他特征的线粒体。在实施方式中，所述从细胞分离线粒体的方法包括将细胞在表面活性剂浓度低于所述表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)的第一溶液中处理，去除所述表面活性剂以形成第二溶液，将所述细胞在所述第二溶液中温育，并从所述第二溶液回收线粒体。在实施方式中，所述第一溶液中的表面活性剂浓度为所述表面活性剂的CMC的约50％或更低。例如在实施方式中，所述第一溶液中的表面活性剂浓度为所述表面活性剂的CMC的约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低或约10％或更低。

在实施方式中，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。在实施方式中，所述表面活性剂选自Triton-X 100、Triton-X 114、Nonidet P-40、正十二烷基-D-麦芽糖苷、Tween-20、Tween-80、皂苷和毛地黄皂苷。

在实施方式中，所述表面活性剂是皂苷或毛地黄皂苷。在实施方式中，所述表面活性剂的浓度低于约400μM。例如，在实施方式中，所述第一溶液中的表面活性剂浓度低于约300μM、低于约200μM、低于约100μM或低于约50μM。在实施方式中，所述第一溶液中的表面活性剂浓度为约100μM、约75μM、约60μM、约50μM、约40μM、约30μM或约20μM。在实施方式中，所述第一溶液中表面活性剂的浓度为约20μM至约50μM或约30μM至约40μM。

在实施方式中，所述第一溶液还包含缓冲液，其包含一种或多种张度剂、渗透压调节剂或螯合剂。在实施方式中，所述第一溶液包含tris缓冲液、蔗糖和螯合剂。

在实施方式中，所述在包含低浓度表面活性剂(例如低于表面活性剂的CMC)的第一溶液中处理细胞的步骤包括将所述细胞在所述第一溶液中在室温下温育约2分钟至约30分钟。例如，在实施方式中，所述在第一溶液中处理细胞的步骤包括将所述细胞在所述第一溶液中温育约2、约5、约10、约15、约20、约25或约30分钟。所述温育可以在约4℃至约37℃的温度下进行。

在实施方式中，所述去除表面活性剂的步骤包括将所述溶液中的表面活性剂减少到低于所述第一溶液中表面活性剂浓度的10％，或减少到低于所述第一溶液中表面活性剂浓度的1％。在实施方式中，所述去除表面活性剂的步骤包括用缓冲液清洗所述细胞。

在实施方式中，所述温育第二溶液的步骤包括将所述细胞在所述第二溶液中温育约5分钟至约30分钟。例如，在实施方式中，所述将细胞在第二溶液中温育的步骤包括将所述细胞在所述第二溶液中温育约5、约10、约15、约20、约25或约30分钟。在实施方式中，所述将细胞在第二溶液中温育的步骤在约4℃±3℃的温度下或在冰上进行。

在实施方式中，所述从第二溶液回收线粒体的步骤包括收集上清液以回收所述分离的线粒体。在实施方式中，所述从第二溶液回收线粒体的步骤包括将所述第二溶液离心并在离心后收集上清液，以回收所述分离的线粒体。

在实施方式中，所述iMIT可以在附着到培养表面的细胞上进行。在实施方式中，所述iMIT可以在附着到培养表面的细胞上，在不从所述表面脱离所述细胞的情况下进行。在实施方式中，所述从第二溶液回收线粒体的步骤包括收集上清液以回收所述分离的线粒体，随后可以任选地用所述第二溶液或另外的第二溶液清洗所述培养表面上的剩余细胞，以将其与所述上清液合并。

在实施方式中，本文提供的方法还包括冷冻所述分离的线粒体。在实施方式中，所述方法包括将所述线粒体在包含冷冻保护剂(例如甘油)的缓冲液中冷冻。在实施方式中，所述方法包括将所述缓冲液中的线粒体在液氮中冷冻。在实施方式中，所述方法还包括在冷冻后融化所述线粒体。在实施方式中，所述用于融化线粒体的方法包括迅速融化所述线粒体，例如在约5分钟内或约1分钟内。在实施方式中，将所述线粒体在温度为约20℃±3℃至约37℃±3℃的温浴中融化。在实施方式中，将所述线粒体在约20℃±3℃或更低温度下融化。

在实施方式中，本公开提供了通过本文提供的方法获得的分离的线粒体群体。在实施方式中，本文提供的方法是“iMIT”方法，并且通过这种方法获得的线粒体在本文中被称为“Q”线粒体。在实施方式中，本公开提供了包含通过本文提供的方法获得的分离的线粒体群体的组合物和/或制剂。

在实施方式中，本公开提供了用于治疗或预防与线粒体功能障碍相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括将对象的细胞与本文提供的分离的线粒体例如Q线粒体群体接触。在实施方式中，所述疾病或障碍是缺血相关的疾病或障碍。例如，在实施方式中，所述缺血相关的疾病或障碍选自脑缺血再灌注、缺氧缺血性脑病、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、肝缺血再灌注损伤、缺血损伤间室综合征、血管阻塞、伤口愈合、脊髓损伤、镰状细胞病和移植器官的再灌注损伤。在实施方式中，所述疾病或障碍是遗传障碍。在实施方式中，所述疾病或障碍是癌症、心血管疾病、眼部障碍、耳部障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或纤维化障碍。在实施方式中，所述疾病是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在实施方式中，所述疾病或障碍是衰老疾病或障碍或与衰老相关的病症。在实施方式中，所述疾病或障碍是先兆子痫或宫内生长受限(IUGR)。

在实施方式中，本公开提供了用于治疗或预防本文中提供的疾病或障碍的方法，其中所述方法包括向有需要的对象给药所述分离的线粒体群体或组合物。在实施方式中，所述分离的线粒体的给药途径是通过静脉内、动脉内、气管内、皮下、肌肉内、吸入或肺内给药途径。在实施方式中，所述对象是哺乳动物，例如人类。

在实施方式中，本公开提供了具有完整的内膜和外膜的分离的线粒体，其中所述内膜包含折叠的嵴，其中所述线粒体已从细胞分离，其中所述线粒体当通过荧光指示剂(例如JC-1、TMRM或TMRE)测量时是极化的，并且其中所述线粒体能够在细胞外环境中维持极化。在实施方式中，所述折叠的嵴是密集折叠的嵴。在实施方式中，所述线粒体具有基本上非丝状形状。在实施方式中，所述线粒体在其表面上包含与微管蛋白结合的电压依赖性阴离子通道(VDAC)。例如，在实施方式中，所述分离的线粒体在表面上包含与VDAC结合的二聚体微管蛋白。在实施方式中，所述微管蛋白至少包括α-微管蛋白。

在实施方式中，所述微管蛋白是包含α-微管蛋白和β-微管蛋白的异二聚体。在实施方式中，所述微管蛋白是同二聚体。在实施方式中，所述分离的线粒体当通过GRP75表达测量时表现出与MAM的减少的结合。例如，在实施方式中，当与细胞中存在的(即尚未被分离的)线粒体和/或通过常规分离方法例如本文中进一步描述的涉及匀浆和/或高水平去污剂的方法获得的线粒体相比时，分离的线粒体表现出约70％、约60％、约50％、约40％、约30％或更少的与MAM的结合。在实施方式中，本文提供的分离的线粒体表现出与MAM的结合降低，其中所述降低是相对于细胞中存在的(即尚未被分离的)线粒体和/或通过常规分离方法分离的线粒体与MAM的结合至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或更多。

在实施方式中，本文提供的分离的线粒体具有约-30mV至约-220mV之间的膜电位。在实施方式中，所述分离的线粒体的形状是非丝状。在实施方式中，所述分离的线粒体没有正在进行drp1依赖性分裂。在实施方式中，所述分离的线粒体的尺寸在约500nm至3500nm之间。例如，在实施方式中，所述分离的线粒体的尺寸为约500、约600、约700、约800nm、约900nm、约1000nm、约1100nm、约1200nm、约1500nm、约2000nm、约2500nm、约3000nm或约3500nm。

在实施方式中，本公开提供了通过本文提供的方法获得的分离的线粒体。在实施方式中，本公开提供了包含本文提供的分离的线粒体的组合物和制剂。

本公开还可以提供如下所述的发明。

条目1.一种分离的线粒体群体，其中：

(i)所述群体中至少80％的线粒体具有完整的内膜和外膜，

(ii)所述群体中至少80％的线粒体当通过荧光指示剂测量时是极化的。

和/或

(iii)所述群体中至少80％的线粒体在细胞外环境中维持功能性能力。在优选实施方式中，所述线粒体已被活化。在更优选实施方式中，所述线粒体已用线粒体活化剂例如白藜芦醇活化。在更优选实施方式中，此类线粒体可以从已用线粒体活化剂例如含有或包裹了线粒体活化剂例如白藜芦醇的基于脂质膜的囊泡(例如脂质体)处理的细胞获得。

条目2.条目1所述的分离的线粒体群体，其中(iii)的在细胞外环境中的功能性能力通过膜电位的荧光指示剂来测量。

条目3.条目1所述的分离的线粒体群体，其中(iii)的细胞外环境包括约8至约12mg/dL的总钙浓度。

条目4.条目1所述的分离的线粒体群体，其中(iii)的细胞外环境包括约4至约6mg/dL的游离/活性钙浓度。

条目5.条目1所述的分离的线粒体群体，其中所述群体中至少80％的线粒体没有正在进行发动蛋白相关蛋白1(drp1)依赖性分裂。

条目6.条目1所述的分离的线粒体群体，其中所述线粒体的内膜包含密集折叠的嵴。

条目7.条目1-6中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中所述群体中至少80％的线粒体具有非丝状形状。

条目8.条目7所述的分离的线粒体群体，其中至少85％的所述线粒体具有非丝状形状。

条目9.条目8所述的分离的线粒体群体，其中至少90％的所述线粒体具有非丝状形状。

条目10.条目1-9中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中所述线粒体当通过葡萄糖调节蛋白75(GRP75)表达测量时表现出与线粒体相关膜(MAM)的结合降低。

条目11.条目10所述的分离的线粒体群体，其中所述结合降低是相对于细胞中的线粒体或通过包括细胞匀浆的方法获得的分离的线粒体与MAM的结合降低至少约30％。

条目12.条目11所述的分离的线粒体群体，其中所述结合降低是降低至少约50％。

条目13.条目1-12中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中

(i)所述群体中至少85％的线粒体具有完整的内膜和外膜，

(ii)所述群体中至少85％的线粒体当通过荧光指示剂测量时是极化的，

和/或

(iii)所述群体中至少85％的线粒体在细胞外环境中维持功能性能力。

条目14.条目1-12中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中

(i)所述群体中至少90％的线粒体具有完整的内膜和外膜，

(ii)所述群体中至少90％的线粒体当通过荧光指示剂测量时是极化的，

和/或

(iii)所述群体中至少90％的线粒体在细胞外环境中维持功能性能力。

条目15.条目1-14中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中所述荧光指示剂选自JC-1、四甲基罗丹明甲酯(TMRM)和四甲基罗丹明乙酯(TMRE)。

条目16.条目1-15中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中所述群体中至少80％的线粒体的尺寸在约500nm至约3500nm之间。

条目17.条目1-16中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中所述群体的多分散指数(PDI)为约0.2至约0.8。

条目18.条目1-16中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中所述群体的多分散指数(PDI)为约0.2至约0.3。

条目19.条目1-18中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中所述线粒体群体的ζ电位在约-15mV至约-40mV之间。

条目20.条目1-19中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中在将所述分离的线粒体群体与细胞群体接触后，所述分离的线粒体能够与所述细胞中的内源线粒体共定位。

条目21.条目1-19中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中在将所述分离的线粒体群体与细胞群体接触后，所述线粒体能够与所述细胞中的内源线粒体融合。

条目22.条目20所述的分离的线粒体群体，其中所述线粒体在4℃储存至少12小时后能够与所述内源线粒体共定位。

条目23.条目21所述的分离的线粒体群体，其中所述线粒体在4℃储存至少12小时后能够与所述内源线粒体融合。

条目24.条目1-23中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中在所述群体经历一个或多个冻融循环后，所述群体中至少70％的分离的线粒体当通过荧光指示剂测量时是极化的。

条目25.条目1-24中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中在所述群体经历一个或多个冻融循环后，所述线粒体能够与内源线粒体共定位。

条目26.条目24或25所述的分离的线粒体群体，其中将所述群体在-80℃或更低温度下冷冻至少两周，然后在20℃或更低温度下在约5分钟内融化。

条目27.条目26所述的分离的线粒体群体，其中所述群体在约1分钟内融化。

条目28.条目26或27所述的分离的线粒体群体，其中将所述群体在液氮中冷冻至少两周。

条目29.条目28所述的分离的线粒体群体，其中将所述群体在液氮中冷冻至少两个月。

条目30.条目24至29中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中在将融化的线粒体群体与细胞群体接触后，所述群体中的分离的线粒体能够与所述细胞中的内源线粒体融合。

条目31.一种组合物，其包含条目1-30中的任一项所述的分离的线粒体群体。

条目32.一种制剂，其包含条目31所述的组合物和可药用载体。

条目33.一种从细胞分离线粒体的方法，所述方法包括：

(i)将细胞在表面活性剂浓度低于所述表面活性剂的临界胶束浓度的第一溶液中处理，

(ii)去除所述表面活性剂以形成第二溶液，

(iii)将所述细胞在所述第二溶液中温育，和

(iv)从所述第二溶液回收线粒体，

其中所述细胞具有例如通过将所述细胞与含有或包裹有线粒体活化剂的基于脂质膜的囊泡接触而被活化的线粒体。

条目34.条目33所述的方法，其中所述第一溶液中的表面活性剂浓度为所述表面活性剂的临界胶束浓度的约50％或更低。

条目35.条目33或34所述的方法，其中所述第一溶液中的表面活性剂浓度为所述表面活性剂的临界胶束浓度的约10％或更低。

条目36.条目33-35中的任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。

条目37.条目33-36中的任一项所述的方法，其中所述表面活性剂选自Triton-X100、Triton-X 114、Nonidet P-40、正十二烷基-D-麦芽糖苷、Tween-20、Tween-80、皂苷和毛地黄皂苷。

条目38.条目37所述的方法，其中所述表面活性剂是皂苷或毛地黄皂苷，并且其中所述第一溶液中的表面活性剂浓度小于约400μM。

条目39.条目37所述的方法，其中所述表面活性剂是皂苷或毛地黄皂苷，并且其中所述第一溶液中的表面活性剂浓度小于约50μM。

条目40.条目37所述的方法，其中所述表面活性剂是皂苷或毛地黄皂苷，并且其中所述第一溶液中的皂苷或毛地黄皂苷浓度为约30μM至约40μM。

条目41.条目33-40中的任一项所述的方法，其中所述第一溶液还包含缓冲液，其含有一种或多种张度剂、渗透压调节剂或螯合剂。

条目42.条目41所述的方法，其中所述第一溶液包含tris缓冲液、蔗糖和螯合剂。

条目43.条目33-42中的任一项所述的方法，其中将所述细胞在所述第一溶液中处理包括将所述细胞在所述第一溶液中在室温下温育约2分钟至约30分钟。

条目44.条目33-43中的任一项所述的方法，其中去除所述表面活性剂包括将所述溶液中的表面活性剂减少到小于所述第一溶液中的表面活性剂浓度的10％。

条目45.条目33-44中的任一项所述的方法，其中去除所述表面活性剂包括将所述溶液中的表面活性剂减少到小于所述第一溶液中的表面活性剂浓度的1％。

条目46.条目33-45中的任一项所述的方法，其中去除所述表面活性剂包括将所述细胞用缓冲液清洗。

条目47.条目33-46中的任一项所述的方法，其中温育所述第二溶液包括将所述细胞在所述第二溶液中在约4℃温育约5分钟至约30分钟。

条目48.条目33-47中的任一项所述的方法，其中从所述第二溶液回收所述线粒体包括收集上清液以回收所述分离的线粒体。

条目49.条目33-48中的任一项所述的方法，其中从所述第二溶液回收所述线粒体包括将所述第二溶液离心并在离心后收集上清液以回收所述分离的线粒体。

条目50.条目33-49中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括冷冻所述分离的线粒体。

条目51.条目50所述的方法，其中所述方法包括将所述分离的线粒体在包含冷冻保护剂的缓冲液中冷冻。

条目52.一种分离的线粒体群体，其通过根据条目33-51中的任一项所述的方法来获得。

条目53.一种治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括将需要治疗的对象的细胞与根据条目1-30中的任一项所述的分离的线粒体群体或条目31所述的组合物或条目32所述的制剂接触，其中所述疾病或障碍选自糖尿病(I型和II型)、代谢疾病、与线粒体功能障碍有关的眼部疾病、听力丧失、与治疗剂有关的线粒体毒性、与化疗或其他治疗剂有关的心脏毒性、线粒体功能障碍和偏头痛。

条目54.一种治疗与线粒体功能障碍有关的疾病或障碍的方法，所述方法包括将需要治疗的对象的细胞与根据条目1-30中的任一项所述的分离的线粒体群体或条目31所述的组合物或条目32所述的制剂接触。

条目55.条目54所述的方法，其中所述疾病或障碍选自线粒体肌病、糖尿病和耳聋(DAD)综合征、Barth综合征、Leber遗传性视神经病(LHON)、Leigh综合征、NARP(神经病、共济失调、视网膜色素变性和上睑下垂综合征)、肌神经源性胃肠脑病(MNGIE)、MELAS(线粒体脑病、乳酸酸中毒和中风样发作)综合征、肌阵挛性癫痫伴不规则红纤维(MERRF)综合征、Kearns-Sayre综合征和线粒体DNA耗竭综合征。

条目56.条目54所述的方法，其中所述疾病或障碍是缺血相关疾病或障碍。

条目57.条目56所述的方法，其中所述缺血相关疾病或障碍选自脑缺血再灌注、缺氧缺血性脑病、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、肝缺血再灌注损伤、缺血损伤间室综合征、血管阻塞、伤口愈合、脊髓损伤、镰状细胞病和移植器官的再灌注损伤。

条目58.条目54所述的方法，其中所述疾病或障碍是遗传障碍。

条目59.条目54所述的方法，其中所述疾病或障碍是衰老疾病或障碍。

条目60.条目54所述的方法，其中所述疾病或障碍是神经变性病症或心血管病症。

条目61.条目60所述的方法，其中所述神经变性病症选自痴呆症、弗里德里希共济失调、肌萎缩侧索硬化症、线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒、中风(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴不规则红纤维(MERFF)、癫痫、帕金森氏病、阿兹海默氏病或亨廷顿病。示例性的神经精神障碍包括躁郁症、精神分裂症、抑郁症、成瘾症、焦虑症、注意力缺陷障碍、人格障碍、自闭症和阿斯伯格病。

条目62.条目60所述的方法，其中所述心血管病症选自冠心病、心肌梗塞、动脉粥样硬化、高血压、心脏骤停、脑血管疾病、外周动脉疾病、风湿性心脏病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心律失常、中风、深静脉血栓和肺栓塞。

条目63.条目54所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病或纤维化障碍。

条目64.条目54所述的方法，其中所述疾病是进行呼吸窘迫综合征(ARDS)。

条目65.条目54所述的方法，其中所述疾病或障碍是先兆子痫或宫内生长受限(IUGR)。

条目66.条目54-65中的任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述分离的线粒体群体或组合物通过静脉内、动脉内、气管内、皮下、肌肉内、吸入或肺内给药途径给药到所述对象。

条目67.一种具有完整的内膜和外膜的分离的线粒体，其中所述内膜包含折叠的嵴，其中所述线粒体已从细胞分离，其中所述线粒体当通过荧光指示剂测量时是极化的，并且其中所述线粒体能够在细胞外环境中维持极化。

条目68.条目67所述的分离的线粒体，其中所述线粒体具有非丝状形状。

条目69.条目67或68所述的分离的线粒体，其中所述线粒体表面上的电压依赖性阴离子通道(VDAC)在表面处与微管蛋白结合。

条目70.条目67所述的分离的线粒体，其中所述微管蛋白是二聚体微管蛋白。

条目71.条目70所述的分离的线粒体，其中所述微管蛋白是包含α-微管蛋白和β-微管蛋白的异二聚体。

条目72.条目67-71中的任一项所述的分离的线粒体，其中所述荧光指示剂选自JC-1、四甲基罗丹明甲酯(TMRM)和四甲基罗丹明乙酯(TMRE)。

条目73.条目67-72中的任一项所述的分离的线粒体，其中所述分离的线粒体当通过葡萄糖调节蛋白75(GRP75)表达测量时表现出与线粒体相关膜(MAM)的结合降低。

条目74.条目73所述的分离的线粒体，其中所述结合降低是相对于细胞中的线粒体或通过包括细胞匀浆的方法获得的分离的线粒体与MAM的结合降低至少约30％。

条目75.条目74所述的分离的线粒体，其中所述结合降低是降低至少约50％。

条目76.条目67-75中的任一项所述的分离的线粒体，其中所述分离的线粒体的膜电位在约-30mV至约-220mV之间。

条目77.条目67-76中的任一项所述的分离的线粒体，其中所述分离的线粒体没有正在进行drp1依赖性分裂。

条目78.条目67-77中的任一项所述的分离的线粒体，其中所述分离的线粒体的尺寸在约500nm至约3500nm之间。

条目79.一种组合物，其包含条目67-78中的任一项所述的分离的线粒体。

条目80.条目1-30中的任一项所述的分离的线粒体群体，其中所述分离的线粒体从其中的线粒体已用线粒体活化剂处理的细胞衍生或分离。

条目81.条目33-52中的任一项所述的方法，其中在(i)至(iv)之前将细胞中的线粒体用线粒体活化剂处理。

条目82.条目30或79所述的组合物或条目31所述的制剂，其中所述分离的线粒体从其中的线粒体已用线粒体活化剂处理的细胞衍生或分离。

条目83.一种分离的线粒体，其中所述分离的线粒体从其中的线粒体已用线粒体活化剂处理的细胞衍生或分离。

条目84.条目67-78中的任一项所述的分离的线粒体，其中所述分离的线粒体从其中的线粒体已用线粒体活化剂处理的细胞衍生或分离。

条目85.条目53-66中的任一项所述的方法，其中待给药的分离的线粒体群体是条目80所述的分离的线粒体群体、条目82所述的组合物或条目82所述的制剂。

条目86.条目80所述的分离的线粒体群体、条目82所述的组合物或制剂或条目83或84所述的分离的线粒体，其还包含所述线粒体活化剂。

条目87.条目80所述的分离的线粒体群体、条目82所述的组合物或制剂或条目83或84所述的分离的线粒体，其中所述线粒体活化剂是白藜芦醇。

条目88.条目86所述的群体、组合物、制剂或分离的线粒体，其中所述线粒体活化剂是白藜芦醇。

条目89.一种分离的线粒体，其中所述分离的线粒体从已用包裹或含有线粒体活化剂的基于脂质膜的囊泡处理的细胞衍生或分离。

条目90.条目89所述的分离的线粒体，其中所述线粒体活化剂是白藜芦醇。

条目91.条目89或90所述的分离的线粒体，其还包含所述线粒体活化剂。

条目92.条目88至90中的任一项所述的分离的线粒体的群体。

条目93.一种组合物，其包含条目88至90中的任一项所述的分离的线粒体的群体。

条目94.一种药物组合物，其包含条目88至90中的任一项所述的分离的线粒体的群体。

条目95.条目33至66中的任一项所述的方法，其中所述细胞已用包裹或含有线粒体活化剂的基于脂质膜的囊泡处理。

条目96.条目95所述的方法，其中所述线粒体活化剂是白藜芦醇。

在一个实施方式中，所述被包裹的线粒体可以从如上所解释的分离的线粒体制备。

实施例

实施例1

线粒体的分离

如下所述从HeLa细胞分离线粒体。将购自Riken细胞库的人类来源的HeLa细胞(RCB3680)进行培养。在所述培养中使用的培养基是MEM+10％FBS，并每周进行一次或两次传代培养。

1)将细胞在直径为100mm的培养皿中培养，并确认80％合生。

2)舍弃培养基，并将培养皿用3mL分离缓冲液(10mM Tris-HCl，250mM蔗糖，0.5mMEGTA，pH 7.4)清洗两次。

3)向培养皿添加3mL含有30μM毛地黄皂苷的分离缓冲液，并将培养皿在室温静置3分钟。30μM约为毛地黄皂苷的临界胶束浓度(cmc)的1/10。

4)将培养皿的内部用3mL分离缓冲液清洗两次。

5)向培养皿添加3mL分离缓冲液，并将培养皿在4℃静置10分钟。

6)使用微量移液器通过轻柔吸打使细胞脱离。

7)然后将包含线粒体和脱离的细胞的悬液转移到15mL离心管并在500×g和4℃下离心10分钟。收集上清液(2mL)以获得分离的线粒体群体(在后文中也被称为“在使用时制备的产物”)。

8)在冷冻时，不是向分离缓冲液而是向冷冻缓冲液(10mM Tris-HCl，225mM甘露糖醇，75mM蔗糖，0.5mM EGTA，pH 7.4)添加甘油以获得10％的浓度并悬浮。将悬液在液氮中冷冻以获得冷冻的分离的线粒体(在后文中也被称为“冷冻产物”)。

将所述在使用时制备的产物在苹果酸和谷氨酰胺(各5mM)存在下用250nM四甲基罗丹明甲酯(TMRM)染色，并评估分离的线粒体的活性。结果确认了线粒体的极化。将分离的线粒体用100nM MitoTracker深红染色并检查其纯度。结果，从包含分离的线粒体的几乎整个溶液发射出明显的绿色荧光。由此证实分离的线粒体存在于几乎整个溶液中。换句话说，分离的线粒体以98％或更高的比率存在于线粒体溶液中，并且90％的线粒体显示出极化。

通过暴露到流水将冷冻的线粒体融化并在500×g和4℃下离心10分钟。收集上清液然后离心，以沉淀线粒体。舍弃上清液并代之以添加Tris缓冲液，以获得样品。通过Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments,Ltd.,Worcestershire,UK)测量这些样品中包含的线粒体的粒度(通过动态光散射)和ζ电位(通过电泳光散射)。更具体来说，根据累积分析(ISO22412)从散射光强度的自相关函数获得线粒体的平均粒度(平均流体力学粒度)和多分散指数(PDI)。然后，在所述粒度的基础上制备直方图。结果示出在图1中。在图1中，在冷冻之前在上述步骤7)中获得的在使用时制备的产物的结果示出在子图a)中；而通过融化上述步骤8)中获得的冷冻产物得到的样品的结果示出在子图b)中。如图1中所示，所述分离的线粒体群体中线粒体的粒度分布在约1,000nm周围(参见图1的子图a))。在冻融的分离的线粒体群体中获得了相同的分布结果(参见图1的子图b))。此外，在冻融过程后，ζ电位维持在负值(参见图1的ζ电位)。

随后，为了评估分离的线粒体群体中包含的线粒体的表面电位，通过共聚焦激光显微镜进行了观察。更具体来说，为了评估膜电位，使用了线粒体电位依赖性试剂四甲基罗丹明乙基醚(TMRE)(激发波长：549nm，荧光波长：574nm)(Thermo Fisher,Waltham,MA)。如果线粒体膜电位得以维持，TMRE发射红色荧光。将分离的线粒体溶液(300μL)添加到3.5cm玻璃培养皿(AGC TECHNO GLASS Co.,LTD.(IWAKI),Shizuoka,Japan)中，并在10×g和4℃下离心10分钟。舍弃上清液。添加染色溶液以获得10nM TMRE、0.33mg/mL牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、5mM苹果酸(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,Osaka,Japan)和5mM谷氨酸(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,Osaka,Japan)的终浓度。温育在室温进行10分钟。使用FV10i-LVI(Olympus Corporation,Tokyo,Japan)进行观察。结果示出在图2中。在图2中，在上述步骤7)中获得的分离的线粒体群体(即冻融过程之前的分离的线粒体群体，在后文中也被称为“在使用时制备的产物”)的结果示出在子图a)中；而通过融化上述步骤8)中获得的冷冻材料而得到的样品(即冻融过程之后的分离的线粒体群体，在后文中也被称为“冷冻产物”)的结果示出在子图b)中。如图2中所示，在所述冷冻产物中也令人满意地检测到红色荧光。证实了即使在冻融过程后膜电位也得以维持。

实施例2

得到的粒子的脂质膜包被和特征分析

所述分离的线粒体群体中包含的线粒体各自被具有层结构的脂质膜包被(以获得包裹在脂质膜中的线粒体)，所述脂质膜充当在拓扑学上分隔内部和外部的边界。在脂质膜包被中，检查了是否可以使用微流道装置。所述过程具体如下。作为微流道装置，使用了具挡板结构有的iLiNP^TM(Lilac pharma Inc.)。如图36中所示，iLiNP装置具有两个溶液入口(11a和12a)和分别将溶液入口连接到汇合通道(13)和混合通道(14)的通道(11和12)。汇合通道13是从所述两个溶液入口延伸的通道(11和12)交汇的位点。混合通道14是对交汇的溶液进行混合的通道。如图36中所示，在混合通道14中，溶液沿着由大箭头指示的流动方向移动，并通过弯曲导向出口14c。混合通道14具有一组或多组(20组)由14a和14b表示的弯曲。在图36中，14a表示通道的宽度变窄的区域(宽度为50μm)，14b(宽度为200μm)表示变窄的区域的宽度恢复到原始宽度的区域。通道的高度为100μm。根据微流道装置，有机溶剂和水溶性溶剂可以以高速搅拌(参见图3的子图a))。在所述实施例中，使用的有机相是溶解在乙醇中的7.7mM脂质溶液(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)/鞘磷脂(SM)/1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG 2000)/硬脂基化八聚精氨酸(STR-R8)＝9/2/0.33/1.1(摩尔比))；使用的水性相是分离的线粒体的溶液。将这两种溶液分别施加到微流道装置的两个入口并在微流道装置的汇合通道中混合(参见图4)。混合条件如下：总流速：500μL/分钟(有机相：100μL/分钟，水性相：400μL/分钟)。在这里使用的注射泵是PUMP11ELITE(Harvard Apparatus,Holliston,MA)。作为对照，评估了在水性相中不含分离的线粒体的样品(参见图3的子图b))、在有机相中仅使用乙醇的样品(参见图5的子图a))和在有机相中使用仅包含STR-R8的乙醇的样品(参见图5的子图b))。此外，还评估了使用水溶性溶剂和代替有机相的分离的线粒体溶液的混合物的样品(参见图5的子图c))。测量了各个样品的粒度和ζ电位。结果如图4中所示，从微流道装置获得的粒子显示出单分散粒度分布，峰在100nm附近。由于有活性的线粒体是极化的，因此它们具有负ζ电位。相比之下，通过微流道装置获得的粒子显示出正ζ电位(参见图4)。这一事实表明线粒体被表面上暴露出阳离子型STR-R8的脂质膜包裹，并且由于所述R8的存在ζ电位变成正值。

此外，显示了所述线粒体已被分裂成更小的线粒体(尺寸：262nm；PDI：0.301；ζ电位：-19.7mV)，并且在用微流道装置分裂后使用线粒体膜电位指示剂没有可检测的负膜极化。

实施例3

通过荧光显微镜观察包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡

接下来，为了确定线粒体是否被脂质膜成功包被，将线粒体染成红色(MitoTracker(商标)深红(激发波长：644nm，荧光波长：665nm)(Thermo Fisher,Waltham,MA))，而脂质被染成绿色(DOPE-N-(7-硝基-2-1,3-苯并

二唑-4-基)(NBD-DOPE)(激发波长：465nm，荧光波长：535nm)(Avanti Polar lipids,Alabaster,AL)，然后使用如上所述的微流道装置对分离的线粒体进行包被过程，并通过荧光成像进行观察。如果线粒体被包被，红色和绿色重叠，并且应该产生黄色荧光。将通过微流道装置得到的粒子添加到玻璃载片并通过Nikon A1(Nikon Corporation,Tokyo,Japan)观察。结果如图6中所示。如图6中所示，显示线粒体存在的红色荧光(参见图6的子图a))和显示脂质存在的绿色荧光(参见图6子图b))完全共存(参见图6的子图c))。所述结果支持得到的粒子是采取被脂质膜包裹的线粒体的形式的粒子。

实施例4

通过电子显微镜观察包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡

通过电子显微镜观察通过上述微流道装置获得的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的结构(参见图4)。使用分离的线粒体(在使用时制备的产物)和带有STR-R8修饰的分离的线粒体(图5的子图b)中示出的线粒体)作为对照。更具体来说，按照常规用于观察生物样品的化学固定法将分离的线粒体和带有STR-R8修饰的分离的线粒体染色。按照适合于纳米粒子观察的负染法将简单的基于脂质膜的囊泡(参见图3的子图b))和包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡(参见图4)染色。化学固定法如下进行。首先，将样品用相同量的含有4％聚甲醛和2％戊二醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH 7.4)固定，冷却，然后用含有2％戊二醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH 7.4)在4℃继续固定过夜。将固定的样品用二甲胂酸盐缓冲液清洗，然后用含有2％四氧化锇的0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH 7.4)进一步固定。将所述样品在包含乙醇的溶液中逐步浸泡，以去除水。将样品用环氧丙烷处理两次，并在包含比例为70:30的环氧丙烷和树脂(Quetol-812；Nisshin EM Co.,Tokyo,Japan)的混合物中温育1小时。随后去除管盖，允许样品静置过夜以蒸发掉环氧丙烷。然后，将样品包埋在100％树脂中，并在60℃进行48小时的聚合反应。将样品切成厚度为70nm的切片。通过电子显微镜观察所述切片。通过负染法观察到纳米粒子。这是因为脂质膜被化学固定法分解，并且得到的样品不适合用于观察膜结构。这里使用的电子显微镜是JEM-1400Plus(JEOL Ltd.,Tokyo,Japan)。观察分析被外包给Tokai Electron Microscopy,Inc。结果如图7至10中所示。在图7中所示的化学固定法中，观察到分离的线粒体具有线粒体中特有的嵴结构。如图8中所示，观察到未包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡具有粒子形式，然而所述粒子的内部被脂质膜填充。与此相反，观察到包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡(参见图4)具有中空的脂质膜结构，如图9中所示。脂质膜如果在内部未包裹材料，则粒子的内部被脂质膜填充，如图8中所示。在图9中示出的粒子中，由于脂质膜不能进入内部，因此推测包裹了线粒体。需要注意的是，负染法不是用于观察如图7中所示的线粒体结构的适合方法。因此，在图9中未示出线粒体。然而，在STR-R8修饰和分离的线粒体中，观察到线粒体结构被破坏，如图10中所示。发现在线粒体被脂质膜包裹后，线粒体优选地被STR-R8修饰。

实施例5

使用各种不同类型的脂质的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡

代替图4中制备的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的脂质膜组合物(纳米胶囊材料：DOPE/SM/STR-R8)，使用各种不同的脂质膜组合物来检查是否可以从这些组合物制备包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡。这里使用的脂质膜材料组合物是中性脂质膜组合物：氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)/胆固醇(Chol)/1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG 2000)＝3/2/0.25(摩尔比)，其是与临床使用的纳米胶囊Doxil的组成相同的组分；和DOPE/胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)＝9/2(摩尔比)，其是具有负电位的脂质膜组合物的组分。如上所述通过微流道装置制备包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡。作为阴性对照，使用从不含线粒体的溶液和包含脂质的有机溶剂制备的粒子。结果如图11中所示。如图11中所示，观察到任一粒子组显示出没有聚集的粒度分布。发现包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡(图中的“线粒体包装”)的粒度倾向于比其中未包裹线粒体的粒子(图中的“纳米粒子”)更大。还发现不仅在带正电荷和图4中示出的组合物中，而且在中性脂质(参见图11的子图c))和带负电荷的脂质(参见图11的子图d))两者中，也可以获得包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡。基于粒度之间的比较，提出了粒度分布随着脂质膜组成而变的可能性(参见图11)。

实施例6

在各种不同流速下包装的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡

使用与上文中相同的微流道装置制备包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡(参见图4)，区别只在于改变了有机相的流速和乙醇浓度。总流速被改变到50μL/分钟、100μL/分钟、250μL/分钟或500μL/分钟。有机相的乙醇浓度被改变到10％、20％或40％。以与上述相同的方式测量得到的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的粒度和ζ电位。结果如图12中所描述。正如在图12中所述，在任何条件下，粒度均为约100至150nm。

实施例7

得到的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡在细胞中的并入

观察了图4中得到的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡在细胞中的并入及其在并入后在细胞中的细胞内动力学。将所述包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡中的线粒体在分离的线粒体包装之前用MitoTracker(商标)深红染成红色(出于对线粒体染色的目的，通过将它们在100nM的浓度下在4℃温育15分钟)。制备HeLa细胞并将HeLa细胞中的线粒体用MitoTracker(商标)绿染成绿色(通过将它们在100nM的浓度下并在37.0℃、5％CO₂条件下温育15分钟)。然后向得到的HeLa细胞添加所述包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡。将混合物温育3小时。在温育后，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，使用的机器是OlympusFV10i-LIV，物镜是UPlanSApo 60x/NA＝1.2水，LD激光473nm，635nm)观察细胞。结果如图13中所示。如图13中所示，在HeLa细胞中，观察到源自于包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的线粒体的红色信号和源自于HeLa细胞的线粒体的绿色信号。几乎所有的线粒体均显示出共定位。由此发现，源自于包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的线粒体被并入到细胞中，并且所述并入到细胞中的线粒体与细胞中的线粒体融合，并且融合均匀地进行。

相比之下，在向HeLa细胞添加包装之前的分离的线粒体(相同的量)的情况下，事实上在细胞中未观察到红色信号(参见图14)。观察到在添加STR-R8修饰和分离的线粒体(未用脂质包被)的HeLa细胞中许多细胞死亡(参见图15)。

从人心肌干细胞(hCDC)分离线粒体并将其以与上述相同的方法与HeLa细胞接触。30分钟后，观察到所述分离的线粒体在细胞中的并入。没有观察到未用脂质包装的分离的线粒体在细胞中的并入(参见图16和17)。

实施例8

线粒体疾病模型细胞的挽救实验

在所述实验中，从人心肌干细胞(hCDC)分离线粒体，将其包装在脂质中并移植到具有线粒体突变的细胞中。通过这种方式来挽救线粒体突变。以与上述相同的方式从hCDC收集分离的线粒体群体，区别在于细胞变成hCDC(参见图18)。如图4中所示将收集的分离的线粒体群体包装在脂质膜中，以获得包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡。然后，将得到的包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡添加到通过从MELAS患者分离培养而得到的皮肤成纤维细胞(MELA细胞)和通过从LHON患者分离培养而得到的皮肤成纤维细胞(LHON细胞)。在3小时和24小时后，通过细胞外通量分析仪评估线粒体呼吸活性(使用的机器：细胞外通量分析仪XFp，Agilent Technologies,California,USA)。向测定板的孔以15,000个细胞/孔的比率接种细胞。在测定前3小时和24小时，添加包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡。向用于呼吸活性测量的基本培养基添加葡萄糖(5.5mM)、丙酮酸(1.25mM)和谷氨酰胺(4.0mM)。在通过细胞外通量分析仪测量基础呼吸后，依次顺序添加寡霉素(终浓度1μM)、羰基氰对三氟甲氧基苯腙(FCCP)(终浓度1.5μM)和鱼藤酮和抗霉素A(终浓度各为0.5μM)，以测量线粒体耗氧率。

结果如图19和20中所示。如图19和20中所示，通过添加包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡，添加FCCP后的线粒体呼吸活性被极大提高。甚至在3小时后也观察到呼吸活性的提高，并且在24小时后观察到更大的提高。正如所述，发现通过将包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡移植到细胞中，处理过的细胞中的线粒体功能得以改善。所述改善在仅仅3小时内就被观察到，表明所述改善不一定需要线粒体基因组DNA，相反，被包裹的线粒体中的某些其他组分可能有助于支持细胞内线粒体功能。

实施例9

通过包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡将线粒体递送到细胞与通过脂转染将线粒体递送到细胞的比较

作为包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡，使用了如上所述制备的包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡。对于脂转染来说，使用了如上所述制备的在使用时制备的产物和脂质复合物(lipoplex，在后文中也被称为“LFN iso Mt”)，后者通过将lipofectamine (

2000，Invitrogen,California,USA)的溶液(1μL)与0.32μg(根据蛋白质)的线粒体掺混来制备。作为细胞，使用了正常皮肤成纤维细胞(正常成纤维细胞)、通过从Leigh脑病患者分离培养而得到的皮肤成纤维细胞(Leigh脑病细胞)和通过从LHON患者分离培养而获得的皮肤成纤维细胞(LHON细胞)。向测定板的孔以15,000个细胞/孔的比率接种细胞。在测定前24小时添加包裹hCDC来源的线粒体的基于脂质膜的囊泡和LFN iso Mt(引入的线粒体的量相同)。向用于呼吸活性测量的基本培养基添加葡萄糖(5.5mM)、丙酮酸(1.25mM)和谷氨酰胺(4.0mM)。在通过细胞外通量分析仪测量基础呼吸后，依次顺序添加寡霉素(终浓度1μM)、FCCP(终浓度1.5μM)和鱼藤酮和抗霉素A(终浓度各为0.5μM)，以测量线粒体耗氧率。

结果如图21至23中所示。如图21至23中所示，所述包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡提高包括正常细胞、Leigh脑病成纤维细胞和LHON成纤维细胞在内的任一种细胞的线粒体呼吸活性。与此相比，在使用lipofectamine(LFN iso Mt)的组中，线粒体呼吸活性的提高未被观察到或者有限。如图21中所示，使用lipofectamine(LFN iso Mt)的组对正常细胞的线粒体呼吸活性具有负面影响。由此表明，使用lipofectamine(LFN iso Mt)的组可能具有细胞毒性。

随后，将包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡并入到细胞中的能力与LFN iso Mt的能力进行比较。测试样品各自以与上述相同的方式制备，区别在于线粒体以与在使用时制备的产物中相同的方式从正常皮肤成纤维细胞获取。通过流式细胞仪(CytoFlex,BeckmanCoulter,Inc.,Tokyo,Japan)评估所述测试样品并入到细胞中的能力。将HeLa细胞以2.0×10⁵个细胞/孔的比率接种到6孔板中。在接种后8小时，添加LFN iso Mt溶液、分离的线粒体溶液和包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡，以便提供相同量的线粒体。24小时后，收集Hela细胞，并通过流式细胞仪(激光638nm，通道APC)测量细胞中从MITO MitoTracker(商标)深红发射的荧光的强度。

结果如图24中所示。如图24中所示，证实了使用lipofectamine(LFN iso Mt)的组进入细胞中的能力低于分离的线粒体。确认了与在图13的观察图像中所示的相似，包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡被高效并入到细胞中。

实施例10

包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡与lipofectamine-线粒体复合体之间的比较

制备了分离的线粒体(在使用时制备的产物)和在使用时制备的产物与lipofectamine 2000的混合物，后者即通过将1μL lipofectamine溶液(Opti MEM)与线粒体(根据蛋白质0.32μg)(LFN iso Mt)掺混而制备的混合物。通过Zetasizer测量它们的粒度分布和ζ电位。结果如图25中所示。如图25中所示，lipofectamine具有约2670nm的粒度，并且lipofectamine-线粒体复合体具有约3500nm的粒度。所述lipofectamine-线粒体复合体具有小的负ζ电位。这意味着所述复合体是电中和的；换句话说，线粒体未被lipofectamine(正电荷)完全包裹，并表明lipofectamine和游离形式的线粒体可能形成复合体以便中和电荷。

对于在使用时制备的产物和lipofectamine 2000的混合物来说，通过电子显微镜观察了在所述混合物中形成的lipofectamine-线粒体缔合。将所述在使用时制备的产物和lipofectamine 2000的混合物按照常规方式分别用化学固定法和负染法染色，然后观察缔合。负染色的结果如图26中所示，化学固定法的结果如图28中所示。如图26中所示，lipofectamine 2000(单独的LFN)在溶液中形成粒子的缔合。相比之下，在lipofectamine2000和线粒体的混合物(LFN+Mt)的情况下，观察到LFN粒子与碎片样线粒体(被白色虚线包围)之间的缔合。如图27中所示，与在使用时制备的产物(子图A)相比，在lipofectamine2000-线粒体混合物(LFN+Mt；子图B)中观察到lipofectamine粒子的聚集体与一部分线粒体的侧面缔合。因此，LFN和线粒体的复合体明显不是包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡。

此外，测量了MITO-Q的细胞毒性并与LFN+Mt的细胞毒性进行比较。将HeLa细胞以1.0×10⁴细胞/孔的密度铺板并培养24小时。然后将所述Hela细胞与不同浓度的MITO-Q或用LFN处理的Q接触。在温育1小时后，去除培养基，并向每个孔添加500μL新鲜培养基(FBS(-))以进一步温育细胞。在线粒体处理24小时后，将细胞用500μL PBS清洗。然后对所述温育的细胞进行WST-1测定(预混WST-1细胞增殖测定系统，Takara Bio,Japan)，以测量处理过的细胞的存活率(％)。结果示出在图27的子图C中。如图27的子图C中所示，通过用LFN+Mt处理，HeLa细胞以剂量依赖性方式显示出细胞毒性，而通过用MITO-Q处理，Hela细胞基本上不显示出细胞毒性。这表明被完全包裹的线粒体可以降低包裹线粒体的粒子的细胞毒性。这还表明较小的线粒体可能可用于制备不表现出显著细胞毒性的基于脂质膜的纳米囊泡。

结果总结在图28中。如图28中所示，在lipofectamine与分离的线粒体的混合物中形成了粒子；然而，线粒体未被包裹在所述粒子内。据认为，线粒体(粒子)和lipofectamine粒子形成复合体。相比之下，在本发明中获得将线粒体包裹在封闭空间中的基于脂质膜的囊泡。所述包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡具有线粒体活性。将所述囊泡引入到细胞中可以增强所述细胞的线粒体活性。此外，由于将微流道装置用于混合分离的线粒体和脂质溶液，因此所述分离的线粒体在保持活性的同时被分割成小群体，并以分割的小群体的状态包裹在基于脂质膜的囊泡中。根据本发明，不仅提供了包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡，而且可以将所述包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡小型化。也可以提供小型化的包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡。

实施例11

膜电位的丧失对改善细胞内线粒体功能的影响

如实施例1中所示制备分离的线粒体，区别在于在整个分离过程中使用具有pH7.4至8.9的溶液，正如在图29A和29B中所指明的。然后，将所述在具有不同pH的溶液中分离的线粒体在苹果酸和谷氨酰胺(各为5mM)存在下用100nM MitoTracher深红或250nM四甲基罗丹明甲酯(TMRM)染色，并评估分离的线粒体的活性。结果示出在图29A和29B中。如图29A和29B中所示，在具有pH 8.0至8.9的溶液中分离的线粒体的膜电位降低，正如由这些样品中荧光强度的降低所证实的。

为了评估具有降低的膜电位的线粒体的转移对改善细胞内线粒体功能的影响，按照实施例9中描述的程序将在pH 8.9的溶液中分离的具有降低的膜电位的线粒体包裹在基于脂质膜的囊泡中，然后引入到HeLa细胞中。将在pH 7.4溶液中分离的被包裹的线粒体用作阳性对照，并将tris缓冲液用作阴性对照。实验如图30A中所示进行。简单来说，在实验前24小时将HeLa细胞铺板。24小时后，将细胞传代，然后向培养物添加所制备的被包裹的线粒体。在温育1小时后，以20％的终浓度向培养物添加FBS。24小时后，如实施例9中所述测量细胞的呼吸功能。

如图30B和30C中所示，在用在pH 8.9缓冲液中制备的被包裹的线粒体处理的组中，处理过的细胞中的线粒体呼吸得以改善。这种呼吸功能的改善与用在pH 7.4缓冲液中制备的被包裹的线粒体处理的组相当，并且与阴性对照组相比是明显大的改善。从这些结果认为，线粒体的膜电位对改善转移有线粒体的细胞内的线粒体功能来说不是必然需要的。

实施例12

MITO-Q中mtDNA的丰度及其对MITO-Q活性的影响

从在pH7.4缓冲液中分离的Q、在pH8.9缓冲液中分离的Q和通过使用浓度高于临界胶束浓度的去污剂的常规方法(在后文中也被称为“D方法”)分离的线粒体制备MITO-Q。

通过定量PCR方法测量线粒体DNA(也被称为“mt DNA”)。在测量之前，对引物集进行选择以便在宽动态范围内以线性方式检测mtDNA。在选择大量引物对后，鉴定到具有SEQID NO：1中阐述的核酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO：2中阐述的核酸序列的反向引物可以通过PCR实现mtDNA的线性扩增。在图31A中，将分离的线粒体用Tris缓冲液稀释以获得稀释系列。通过常规的Bradford方法测量蛋白质浓度，并使用上述引物对通过PCR扩增来计算mtDNA浓度。蛋白质浓度与mtDNA浓度之间的关系示出在图31A中。如图31A中所示，所述浓度以高线性方式彼此相关。此外，通过将tRNA^Leu(3230-3304)插入到pUC57-Amp质粒载体的EcoRI和EcoRV限制性酶位点中，制备了pT7-tRNA^Leu。将该质粒用Tris缓冲液稀释以获得稀释系列。然后，对具有不同浓度的质粒进行扩增以测量扩增子的拷贝数。图31B显示了测量到的拷贝数(或扩增子的浓度)(ng/μL)与质粒的浓度高度相关，表明所选的引物对可以线性扩增mtDNA，并且可用于样品中包含的模板mtDNA的定量。

如果所述分离的线粒体的膜破裂，mtDNA会从线粒体漏出，导致得到的线粒体中mtDNA的量减少。计算了通过各种不同方法分离的线粒体中mtDNA的数目。如图31C中所示，在pH7.4溶液中通过iMIT分离的线粒体具有9.3×10⁶个拷贝的mtDNA/μg蛋白质，在pH8.9溶液中通过iMIT分离的线粒体具有5.6×10⁶个拷贝的mtDNA/μg蛋白质，并且在高于CMC的浓度下通过D方法分离的线粒体具有8.7×10⁵个拷贝的mtDNA/μg蛋白质，假设1ng mtDNA含有1.0×10⁶个拷贝的mt DNA。因此认为，通过iMIT分离的线粒体将它们的mtDNA保持在线粒体内部，而通过D方法分离的线粒体在分离过程中从线粒体失去了大多数它们的mtDNA。

此外，将这些分离的线粒体包装以获得被包裹的线粒体，然后以相似的方式计算被包裹的线粒体中mtDNA的拷贝数。结果示出在表1和图31D中。

表1：通过不同方法获得的被包裹的线粒体中的mtDNA拷贝数

将所得到的被包裹的线粒体与细胞接触以将所述线粒体引入到细胞中。测量基线线粒体呼吸和最大线粒体呼吸。结果示出在图31E和31F中。如图31E和31F中所示，在pH 7.4中分离的MITO-Q和在pH8.9中得到的MITO-Q显示出呼吸活性的急剧提高，而通过D方法获得的线粒体显示出呼吸活性的轻度提高。从这些结果看出，线粒体可能在分离过程中失去一些线粒体组分，而通过iMIT分离的Q保留了它们。

使用用于线粒体转录因子A(TFAM)(物种：智人)的酶联免疫吸附测定试剂盒(#MBS2706301)，按照制造商的手册测量包括在每种被包裹的线粒体中的线粒体转录因子A(TFAM)的量。将通过使用pH 7.4缓冲液或pH 8.9缓冲液的iMIT方法或通过D方法分离的线粒体用作分离的线粒体。按照上文示出的实施例将这些线粒体包裹在基于脂质膜的纳米囊泡中。来自于WST-1测定的结果示出在图31G中。如图31G中所示，包括在通过各种不同方法分离的线粒体中的TFAM的水平彼此相当。对于通过这些方法分离的线粒体中的总蛋白的量来说，也是彼此相当的(图31H)。

分裂的线粒体或分裂的Q失去其呼吸活性，并且因此在通过常规方法的分离过程中减少的某些线粒体组分可能在活化线粒体功能中发挥重要作用。还已显示，囊泡中的mtDNA浓度会是MITO-Q功能的重要指示物。

实施例13

包含来自于人心脏祖细胞的线粒体的基于脂质膜的囊泡的制备

按照实施例1从人心脏祖细胞(hCPC)分离线粒体，然后按照实施例2将其包裹在基于脂质膜的囊泡中。分离的hCPC线粒体和被包裹的线粒体的粒度分布示出在下面的图32A和表2中。

表2：分离的hCPC线粒体和被包裹的线粒体的平均尺寸、PDI和ζ电位

如表2和图32A中所示，分离的hCPC线粒体(即分离的hCPC Mt)在粒度分布中在接近800nm处具有峰，PDI为0.7，大于0.5，并具有负ζ电位。在包裹在呈递阳离子肽的基于脂质膜的囊泡中后，所述囊泡(即hCPC-MITO-Q)在粒度分布中在85nm处具有峰，PDI小于0.5，并具有正ζ电位。这些结果表明hCPC线粒体被成功包裹在呈递阳离子肽的囊泡中。

然后将所制备的被包裹的线粒体(hCPC-MITO-Q)与hCPC接触，通过使用TMRM将线粒体染色来测量得到的hCPC的膜极化程度。如图32B中所示，与未处理的对照细胞相比，hCPC-MITO-Q在处理过的细胞中诱导更强的荧光。

实施例14

来自于线粒体功能被MITO-Porter活化的细胞的分离的线粒体的转移的影响

在本实施例中，在与WO2018/092839的实施例1中所示相同的方法中，使用线粒体药物递送系统MITO-Porter将hCPC用线粒体活化剂白藜芦醇处理。然后，按照实施例12中描述的方法，从白藜芦醇处理的hCPC分离线粒体，并将其包裹在通过使用硬脂基化S2肽代替硬脂基化八聚精氨酸而呈递S2肽的基于脂质膜的囊泡中(Szeto,H.H.等，Pharm.Res.,2011,28,第2669-2679页)。得到的囊泡被称为Res-hCPC-MITO-Q。

图33中示出了用Tris缓冲液处理的hCPC、在实施例12中制备的hCPC-MITO-Q和在实施例13中制备的Res-hCPC-MITO-Q的基线呼吸和最大呼吸。如图33中所示，与hCPC-MITO-Q相比，Res-hCPC-MITO-Q诱导处理过的细胞的呼吸能力的更大提高。这些结果表明活化的线粒体可以进一步提高处理过的细胞的呼吸能力。

实施例15

将如实施例1至2中所示制备的MITO-Q与正常成纤维细胞接触，然后如图34A中所示将处理过的细胞温育不同时间。测量每个样品中的最大呼吸活性。结果示出在图34B中。如图34B中所示，与未处理组(NT)相比，所有处理过的细胞均显示出提高的最大呼吸活性。据认为，MITO-Q含有线粒体DNA和线粒体的其他组分，鉴于线粒体的周转期(约2至3天)，在温育较短时间(例如3小时至48小时)的样品中观察到的提高由包括蛋白质、代谢物等在内的一些非DNA组分引起，而在温育较长时间(例如72小时)的样品中观察到的提高由转移到细胞的线粒体DNA引起。

实施例16

包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的储存

按照实施例12中描述的方法，从hCPC分离线粒体并将其包裹在呈递S2肽/适体的基于脂质膜的囊泡中。将得到的hCPC-MITO-Q在4℃储存一周。然后，将储存过的hCPC-MITO-Q与hCPC接触，以测量最大呼吸能力。使用储存前的hCPC-MITO-Q作为阳性对照。如图35中所示，用储存过的hCPC-MITO-Q处理的细胞的最大呼吸大于未处理的细胞(NT)和用储存前的hCPC-MITO-Q处理的细胞。因此，这些结果表明含有基于脂质膜的囊泡的制剂可以稳定地储存至少一周。

图36的参考符号列表

11：通道1

11a：通道1的液体样品入口

12：通道2

12a：通道2的液体样品入口

13：通道1和通道2的汇合通道

14：用于混合在汇合通道中交汇的液体样品的混合通道

14a：通道的变窄区域

14b：变窄区域的加宽区域

14c：用于排出液体样品混合物的出口。

序列表

<110>

卢卡科学株式会社（LUCA Science Inc.）

<120> 分离的具有较小尺寸的线粒体和包裹分离的线粒体的基于脂质膜的囊泡

<130> PL15-9011WO

<150> JP 2019-239479

<151> 2019-12-27

<160> 2

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物 (A3243+)

<400> 1

ccaagaacag ggtttgttaa g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物 (A3243G-)

<400> 2

tgttaagaag aggaattgaa cc 22

Claims (13)

1.一种组合物，其包含线粒体群体，其中所述群体具有当通过动态光散射测定时在小于1μm处具有峰的粒度分布。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述群体具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述群体具有小于0.5的PDI。

4.一种组合物，其包含包裹线粒体的基于脂质膜的囊泡的群体，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有当通过动态光散射测定时在小于1μm处具有峰的粒度分布。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有当通过动态光散射测定时在小于500nm处具有峰的粒度分布。

6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述基于脂质膜的囊泡的群体具有小于0.5的PDI。

7.根据权利要求4至6中的任一项所述的组合物，其中被包裹的线粒体被并入到与其接触的细胞的细胞质中，并且所述线粒体与所述细胞质中的内源线粒体融合。

8.根据权利要求4至7中的任一项所述的组合物，其用于将线粒体递送到细胞内。

9.根据权利要求8所述的组合物，其用于提高细胞中线粒体的呼吸活性。

10.一种用于生产根据权利要求4所述的组合物的方法，所述方法包括：

使包含分离的线粒体的水性溶液和包含形成脂质膜的脂质的乙醇溶液在微流道装置内的汇合通道中彼此接触，以混合所述溶液。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述微流道装置包含用于促进在所述汇合通道中彼此接触的溶液的混合的流动通道，所述流动通道具有挡板结构。

12.一种测量分离的线粒体或被包裹的线粒体中的线粒体DNA水平的方法，所述方法包括在包含所述分离的线粒体或被包裹的线粒体的样品中扩增所述线粒体DNA的至少一部分以获得所扩增的DNA的扩增子，并对所述扩增子进行计数以获得所述线粒体DNA水平。

13.根据权利要求12所述的方法，其还包括将测量到的线粒体DNA水平与标准值进行比较。

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