CN114895042A - S100a11基因或蛋白作为生物标记物在制备诊断、预防或治疗肝纤维化的产品的应用 - Google Patents

S100a11基因或蛋白作为生物标记物在制备诊断、预防或治疗肝纤维化的产品的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及S100A11基因或蛋白作为生物标记物在制备诊断、预防或治疗肝纤维化的产品中的应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了检测肝纤维化生物标记物表达量的试剂在制备肝纤维化诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肝纤维化生物标记物是S100A11基因或蛋白，并提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。本发明提供了一种新的肝纤维化生物标记物及治疗靶点，为肝纤维化疾病提供了更多的诊断依据和治疗靶点，以建立肝纤维化检测试剂盒和筛选或制备肝纤维化治疗药物提供了新的思路和参考依据。

Description

S100A11基因或蛋白作为生物标记物在制备诊断、预防或治疗 肝纤维化的产品的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及S100A11基因或蛋白作为生物标记物在制备诊断、预防或治疗肝纤维化的产品中的应用。
背景技术
肝纤维化(liver fibrosis)是发生在多种慢性肝脏疾病中的一种病理生理过程，其主要病理变化是以胶原蛋白为主的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝脏异常沉积。多种因素可以导致肝纤维化的发生发展，其病因大致可分为化学毒物性(如氨甲喋呤，对乙酰氨基酚，酒精等)，感染性(寄生虫感染，病毒性肝炎等)，自身免疫反应(原发性胆汁性肝硬化，自身免疫性肝炎等)，先天性代谢缺陷，肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病导致的代谢综合征。当肝脏受到损伤因子的刺激时，肝脏修复愈合的过程中发生肝纤维化，如果损伤因素长期不能去除，肝脏血液循环中肝及肝小叶结构被重塑，导致肝脏在形态结构上发生改变进而影响肝脏功能，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化、甚至肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝功能衰竭、肝移植或死亡。
鉴于肝纤维化，肝硬化疾病给人类健康带来巨大威胁和经济负担，且目前没有有效的药物来治疗该类疾病，越来越多的病人急需有效药物和肝移植的救治，因此对于肝纤维化以及肝硬化的治疗，是我国乃至全世界都急切需要解决的问题，但是目前在临床上还并没有太多有效的诊断生物标志物和治疗靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供S100A11基因或蛋白作为生物标记物在制备诊断、预防或治疗肝纤维化的产品中的应用。本发明的S100A11是一种新的肝纤维化生物标记物及治疗靶点，为肝纤维化疾病提供了更多的诊断依据和治疗靶点，以建立肝纤维化检测试剂盒和筛选或制备肝纤维化治疗药物提供了新的思路和参考依据。
本发明提供了检测肝纤维化生物标记物表达量的试剂在制备肝纤维化诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肝纤维化生物标记物是S100A11基因或蛋白。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗四氯化碳诱导的肝纤维化的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗MCD诱导的肝纤维化的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备降低四氯化碳或MCD诱导的肝纤维化中ALT、AST表达量、胶原蛋白积累量或肝纤维化相关基因表达量的药物中的应用，所述肝纤维化相关基因包括α-SMA、Col1α2和VIM。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗TGF-β1诱导的肝纤维化的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备抑制TGF-β1诱导的肝纤维化的星状细胞激活的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备抑制TGF-β1诱导的肝纤维化的TGF-β信号通路激活的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备降低TGF-β1诱导的肝纤维化的TGF-β信号通路的P-Smad2和P-Smad3表达水平的药物中的应用。
优选的是，所述S100A11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了检测肝纤维化生物标记物表达量的试剂在制备肝纤维化诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肝纤维化生物标记物是S100A11基因或蛋白。本发明发现S100A11基因和蛋白的表达量及临床血清含量与肝纤维化存在相关性，并发现S100A11基因和蛋白的过表达能够显著导致胶原蛋白等细胞外基质的积累并引肝纤维化，降低S100A11基因或者蛋白的表达量则能缓解肝纤维化的发生发展。本发明提出S100A11是一种新的肝纤维化生物标记物及S100A11在促进肝纤维化疾病过程中具有重要作用，本发明为肝纤维化疾病提供了更多的诊断依据和治疗靶点，以建立肝纤维化检测试剂盒和筛选肝纤维化治疗药物。
附图说明
图1为本发明提供的S100A11在肝纤维化疾病中高表达的多组学肝纤维化关键基因筛选策略的建立；其中，A直方图显示四氯化碳(CCl4)、蛋氨酸和胆碱缺乏饲料/高脂肪饲料(MCD+HFD)、3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢可力定(DDC)、硫代乙酰胺(TAA)诱导肝纤维化组与对照组GEO数据库RNA-Seq基因变化；B表示4个来源的GEO数据库差异基因韦恩图分析，分析结果展示共有16基因在这4个RNA-Seq组学中均显著变化；C为16个在肝纤维化中显著变化的基因名字列表；D为GEO数据库联合分析本发明前期的树鼩蛋白质组学数据韦恩图；
图2为本发明提供的S100A11在CCl4诱导肝纤维化模型中高表达；其中，A实时荧光定量RT-PCR检测S100A11基因mRNA表达水平，Corn Oil处理组作为对照；B Westernblot检测S100A11蛋白水平的结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图3为本发明提供的S100A11在MCD诱导肝纤维化模型中高表达；其中，A表示S100A11基因mRNA水平在MCD诱导肝纤维化中高表达，MCD饲料作为对照；B是S100A11蛋白水平在MCD诱导的肝纤维化中表达结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图4为本发明提供的高脂食物诱导树鼩肝纤维化模型S100A11蛋白表达；
图5为本发明提供的高脂食物诱导大鼠肝纤维化模型S100A11蛋白表达；
图6为本发明提供的TGF-β1诱导肝星状细胞激活S100A11高表达；其中，A为S100A11基因mRNA检测结果，B是S100A11蛋白表达水平结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图7为本发明提供的S100A11在人临床患者中高表达；其中，A为S100A11基因mRNA检测结果，B是S100A11蛋白表达水平结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图8本发明提供的为S100A11在人临床患者血清中含量升高达；其中，A为血清S100A11含量ELISA检测结果；B是S100A11血清含量与ALT相关性分析；C是血清S100A11与AST相关性分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图9为本发明提供的小鼠模型中过表达S100A11加重肝纤维化表型；其中，A CCl4诱导的S100A11基因过表达肝纤维化实验设计的示意图和S100A11蛋白表达检测；B小鼠血清中的ALT含量；C为AST含量；D天狼星红染色胶原蛋白沉积；E促肝纤维化关键基因mRNA表达；F促肝纤维化关键基因蛋白表达；G MCD诱导的S100A11基因过表达肝纤维化实验设计的示意图和S100A11蛋白表达检测；H小鼠血清中的ALT含量；I为AST含量；J天狼星红染色胶原蛋白沉积；K促肝纤维化关键基因mRNA表达；L促肝纤维化关键基因蛋白表达；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图10为本发明提供的小鼠模型中敲低S100A11缓解肝纤维化表型；其中，ACCl4诱导的S100A11基因敲低肝纤维化实验设计的示意图和S100A11蛋白表达检测；B小鼠血清中的ALT含量；C为AST含量；D天狼星红染色胶原蛋白沉积；E促肝纤维化关键基因mRNA表达；F促肝纤维化关键基因蛋白表达；G MCD诱导的S100A11基因敲低肝纤维化实验设计的示意图和S100A11蛋白表达检测；H小鼠血清中的ALT含量；I为AST含量；J天狼星红染色胶原蛋白沉积；K促肝纤维化关键基因mRNA表达；L促肝纤维化关键基因蛋白表达；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图11为本发明提供的S100A11促进肝星状细胞的激活；其中，A表示过表达S100A11引起肝纤维化相关基因mRNA表达检测结果；B表示过表达S100A11引起肝纤维化相关基因蛋白表达水平检测；C表示敲低S100A11引起肝纤维化相关基因mRNA表达检测结果；D表示敲低S100A11引起肝纤维化相关基因蛋白表达水平检测；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图12为本发明提供的S100A11通过调节激活关键信号通路Smad2/3-TGF-β参与肝纤维过程；其中，A为S100A11过表达TGF-β信号通路下游响应蛋白检测；B是敲低S100A11后，对TGF-β诱导肝星状细胞激活相关基因mRNA表达水平检测；C是蛋白水平检测结果；D是原代小鼠肝星状细胞中敲低S100A11后，肝纤维化相关基因和蛋白表达；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
本发明提供了检测肝纤维化生物标记物表达量的试剂在制备肝纤维化诊断试剂或试剂盒中的应用，所述肝纤维化生物标记物是S100A11基因或蛋白。在本发明中，所述S100A11基因(人源)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGGCAAAAATCTCCAGCCCTACAGAGACTGAGCGGTGCATCGAGTCCCTGATTGCTGTCTTCCAGAAGTATGCTGGAAAGGATGGTTATAACTACACTCTCTCCAAGACAGAGTTCCTAAGCTTCATGAATACAGAACTAGCTGCCTTCACAAAGAACCAGAAGGACCCTGGTGTCCTTGACCGCATGATGAAGAAACTGGACACCAACAGTGATGGTCAGCTAGATTTCTCAGAATTTCTTAATCTGATTGGTGGCCTAGCTATGGCTTGCCATGACTCCTTCCTCAAGGCTGTCCCTTCCCAGAAGCGGACCTGA。在本发明中，所述S100A11蛋白(人源)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MAKISSPTETERCIESLIAVFQKYAGKDGYNYTLSKTEFLSFMNTELAAFTKNQKDPGVLDRMMKKLDTNSDGQLDFSEFLNLIGGLAMACHDSFLKAVPSQKRT。在临床方面，临床患者血清中S100A11含量显著上升，且与临床血清样品中的转氨酶AST和ALT水平呈正相关。同时，在各种动物模型和人类临床样品的肝纤维化中，S100A11的表达呈病程依赖性。在本发明中，鼠源S100A11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：atgcctacagagactgagagatgcattgagtccctgattgctgttttccaaaagtacagcgggaaggatggaaacaacactcaactctccaaaactgaattcctttccttcatgaacacagagctggctgccttcacaaagaaccagaaggatcctggtgtccttgaccgcatgatgaagaagctggacctcaactgtgacgggcagctagatttccaagagtttctcaacctcattggtggcttagctatagcgtgccatgattctttcatccaaacttcccagaagcgaatctaa。在本发明中，鼠源S100A11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：MPTETERCIESLIAVFQKYSGKDGNNTQLSKTEFLSFMNTELAAFTKNQKDPGVLDRMMKKLDLNCDGQLDFQEFLNLIGGLAIACHDSFIQTSQKRI。此外，HCC患者中S100A11高表达与患者生存不良有关。本发明S100A11能够作为肝纤维化的生物标志物，用于制备肝纤维化诊断试剂或试剂盒。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。在本发明中，所述试剂优选包括干扰序列、干扰载体、抗体或药物抑制剂。在本发明中，所述干扰序列优选包括人肝细胞中敲低S100A11的序列：GAAAGGATGGTTATAACTA(SEQ ID NO.5)。在本发明中，所述干扰序列优选包括小鼠肝细胞中敲低S100A11的序列：CAACACTCAACTCTCCAAA(SEQ ID NO.6)所示。S100A11基因和蛋白的表达量与肝纤维化疾病存在相关性：S100A11基因和蛋白的过表达能够显著导致胶原蛋白异常积累并引起肝纤维化；而抑制S100A11基因或蛋白表达可有效减少胶原蛋白积累，改善肝纤维化。因此，抑制S100A11基因或蛋白过表达的载体、抗体或药物抑制剂在治疗肝纤维化方面具有重要的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗四氯化碳诱导的肝纤维化的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗MCD诱导的肝纤维化的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备降低四氯化碳或MCD诱导的肝纤维化中ALT、AST表达量、胶原蛋白积累量或肝纤维化相关基因表达量的药物中的应用，所述肝纤维化相关基因包括α-SMA、Col1α2和VIM。
本发明发现在肝脏疾病临床患者血液中S100A11的含量显著增加，且血清S100A11含量与临床患者血清样品中的转氨酶AST和ALT水平呈正相关。同时，在体外细胞以及在HFD、HFHC、CCL4和MCD诱导的小鼠、大鼠、树鼩、到人类的肝纤维化模型中，肝脏中S100A11的表达均是升高的，且这种表达随着肝脏疾病病程而增加。此外，HCC患者肿瘤样品中S100A11高表达与患者生存不良有关。增加S100A11基因和蛋白在肝脏中的表达，在体内和体外都能增加肝脏胶原蛋白的积累，对肝纤维化、肝损伤起到促进作用。敲低S100A11基因和蛋白在肝脏中的表达，在体内体外均能减少胶原蛋白等胞外基质积累，对肝纤维化、肝损伤起到改善作用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗TGF-β1诱导的肝纤维化的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备抑制TGF-β1诱导的肝纤维化的星状细胞激活的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备抑制TGF-β1诱导的肝纤维化的TGF-β信号通路激活的药物中的应用。
本发明还提供了抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备降低TGF-β1诱导的肝纤维化的TGF-β信号通路的P-Smad2和P-Smad3表达水平的药物中的应用。
在体内模型和体外模型中，S100A11通过调节激活关键信号通路Smad2/3-TGF-β1进而调节肝纤维化肝硬化过程中基因α-SMA、VIM和COL1α2的上调而促进胶原蛋白等胞外基质异常积累；抑制S100A11的表达则可以下调α-SMA、VIM和COL1α2基因的表达，改善CCl4、MCD及TGF-β1诱导的胶原蛋白等胞外基质的积累，抑制TGF-β信号通路以及TGF-β1诱导的肝纤维化的星状细胞的激活，从而实现TGF-β1诱导的肝纤维化的预防或治疗。
下面结合具体实施例对本发明所述的S100A11基因或蛋白作为生物标记物在制备诊断、预防或治疗肝纤维化的产品的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
S100A11在肝纤维化疾病中高表达的多组学肝纤维化关键基因筛选策略的建立
图1为S100A11在肝纤维化疾病中高表达的多组学肝纤维化关键基因筛选策略的建立；其中，A直方图显示四氯化碳(CCl4)、蛋氨酸和胆碱缺乏饲料/高脂肪饲料(MCD+HFD)、3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢可力定(DDC)、硫代乙酰胺(TAA)诱导肝纤维化组与对照组GEO数据库RNA-Seq基因变化；B表示4个来源的GEO数据库差异基因韦恩图分析，分析结果展示共有16基因在这4个RNA-Seq组学中均显著变化；C：16个在肝纤维化中显著变化的基因名字列表；D为GEO数据库联合分析本发明前期的树鼩蛋白质组学数据韦恩图。通过对已公开发表的四氯化碳(CCl4)、蛋氨酸和胆碱缺乏饲料/高脂肪饲料(MCD+HFD)、3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢可力定(DDC)、硫代乙酰胺(TAA)诱导C57BL6/J小鼠模型肝纤维化(表1)转录组学数据进行了全面的比较分析。对每个GSE转录组数据库进行基因差异分析，筛选出数据库中上调和下调的差异表达基因(图1中的A)。采用韦恩图交叉分析发现，Cyp2b13、Lgals1、Mmp2、Ccdc120、Mfge8、Lpl、Egfr、Anxa2、Ppic、Emp1、Spp1、Gpnmb、S100A11、Cyp2b9、Fom3和Ly6d这16个基因在四个GSE数据中表现出一致的变化趋势(图1中的B、图1中的C)。其中，Lpl被报道与多种人类疾病有关，这些试验结果表明，肝纤维化发病机制的重要基因组改变，本次筛选是具有可靠性的。
表1肝纤维化转录组数据信息
Figure BDA0003674323090000081
Figure BDA0003674323090000091
通过进一步建立不同的肝纤维化疾病模型对S100A11在肝纤维化疾病中表达进行验证。本发明使用四氯化碳腹腔注射4周(每周两次)和蛋氨酸胆碱缺乏饲料持续饲喂4周建立小鼠肝纤维化模型，其中玉米油处理组和蛋氨酸胆碱-缺乏对照饲料处理组作为实验对照组，与GSE数据的结果一致的是，在四氯化碳和蛋氨酸胆碱-缺乏饲料诱导的肝纤维化小鼠模型中，肝脏中S100A11基因和蛋白水平表达均升高(见图2中的A、图2中的B；图3中的A、图3中的B；图2为S100A11在四氯化碳诱导肝纤维化模型中高表达；其中，A实时荧光定量RT-PCR检测S100A11基因转录水平相对表达量，玉米油处理组作为对照；B蛋白免疫印迹检测S100A11蛋白水平的结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图3为S100A11在蛋氨酸胆碱-缺乏饲料诱导肝纤维化模型中高表达；其中，A表示S100A11基因转录水平在蛋氨酸胆碱-缺乏饲料诱导肝纤维化中高表达，蛋氨酸胆碱-缺乏对照饲料作为对照；B是S100A11蛋白水平在蛋氨酸胆碱缺乏饲料诱导的肝纤维化中表达结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。进一步证明，在高脂肪高胆固醇诱导的树鼩和高脂饲料诱导的大鼠肝纤维化模型中，S100A11表达均显著上调(见图4；图5，图4为高脂高胆固醇诱导树鼩肝纤维化模型S100A11蛋白表达；图5为高脂饲料诱导大鼠肝纤维化模型S100A11蛋白表达)。这些数据提示S100A11与肝纤维化疾病具有强烈相关性。
为了进一步检测S100A11在肝纤维化肝脏疾病中的重要性及本次数据筛选的可靠性，使用转化生长因子(TGF-β1)对人肝星状细胞(LX-2)细胞进行诱导处理，建立肝星状细胞激活细胞纤维化模型，在TGF-β1诱导后S100A11的表达量显著高于对照组(见图6中的A；图6中的B，图6为TGF-β1诱导肝星状细胞激活S100A11高表达；其中，A为S100A11基因转录水平检测结果，B是S100A11蛋白表达水平结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；通过对S100A11在人临床肝病患者中进行检测，结果发现S100A11在人类临床肝脏样本中无论是基因水平还是蛋白水平均显著上升(见图7中的A、图7中的B，图7为S100A11在人临床患者中高表达；其中，A为S100A11基因转录水平检测结果，B是S100A11蛋白表达水平结果；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；同时，在临床患者血清中S100A11含量也显著上升(图8中的A，图8为S100A11在人临床患者血清中含量升高达；其中，A为血清S100A11含量酶联免疫吸附实验(ELISA)检测结果；B是S100A11血清含量与丙氨酸转氨酶(ALT)相关性分析；C是血清S100A11与天门冬氨酸转氨酶(AST)相关性分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。综上所述，这些数据表明S100A11在肝纤维化中显著升高，提示S100A11在肝纤维化的发病机制中具有重要作用。
实施例2
过表达S100A11促进肝纤维化的发生发展
图9为小鼠模型中过表达S100A11加重肝纤维化表型；其中，A四氯化碳诱导的S100A11基因过表达肝纤维化实验设计的示意图和S100A11蛋白表达检测；B小鼠血清中的丙氨酸转氨酶含量；C为天门冬氨酸转氨酶含量；D天狼星红染色胶原蛋白沉积；E促肝纤维化关键基因转录水平表达；F促肝纤维化关键基因蛋白表达；G蛋氨酸胆碱缺乏饲料诱导的S100A11基因过表达肝纤维化实验设计的示意图和S100A11蛋白表达检测；H小鼠血清中的丙氨酸转氨酶含量；I为天门冬氨酸转氨酶含量；J天狼星红染色胶原蛋白沉积；K促肝纤维化关键基因转录水平表达；L促肝纤维化关键基因蛋白表达；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
为了进一步探究S100A11与肝纤维化疾病关系，本发明中所用到的S100A11过表达小鼠委托北京百奥赛图基因生物技术有限公司使用CRISPR/Cas9系统获得(C57BL/6J背景)。经过验证，本发明成功构建S100A11过表达小鼠(图9中的A)。经过四氯化碳四周诱导后，与对照组相比，四氯化碳诱导4周S100A11过表达小鼠的血清丙氨酸转氨酶(ALT)(图9中的B)和天门冬氨酸转氨酶(AST)(图9中的C)水平都显著升高；同时天狼星红染色病理切片结果显示，S100A11过表达小鼠中的胶原蛋白积累显著增加(图9中的D)；同时，实时荧光定量RT-PCR和蛋白免疫印迹结果也提示肝脏组织中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Ⅰ型胶原(COL1)和波形蛋白(VIM)等肝纤维化蛋白的表达水平在S100A11过表达小鼠中经过四氯化碳诱导后显著升高(图9中的E、图9中的F)，这些数据提示过表达S100A11加重四氯化碳诱导的肝纤维化。
肝纤维化的发生发展是一个复杂的病理过程，化学性药物、代谢性疾病、病毒和酒精滥用等多种致病因素均能促进肝纤维化的发生发展。为了验证S100A11在肝脏损伤纤维化中的广谱作用，并更好地模拟人肝脏疾病，本发明同时也使用蛋氨酸胆碱-缺乏饲料诱导肝纤维化模型对S100A11在肝纤维化的发生发展进行功能探究(图9中的G)。如图9中的H和图9中的I所示，相比于对照组小鼠，血清中丙氨酸转氨酶含量和天门冬氨酸转氨酶水平在蛋氨酸胆碱-缺乏饲料诱导的S100A11过表达小鼠中也显著增加。同时，天狼星红染色结果也显示，与蛋氨酸胆碱-缺乏饲料处理的对照组小鼠相比，S100A11过表达小鼠的肝脏中有更多的胶原蛋白沉积(图9中的J)，这些结果提示S100A11过表达能显著促进蛋氨酸胆碱-缺乏饲料诱导的肝纤维化损伤。在另一个方面，本发明也检测到与肝纤维相关基因和蛋白的表达量也S100A11过表达小鼠中也是显著增加的(图9中的K、图9中的L)。这些结果表明，在蛋氨酸胆碱-缺乏饲料饮食条件下，S100A11过表达加速了肝纤维化的发展。
综上，S100A11过表达能够促进胶原的沉积，进而促进肝纤维化的发生发展。
实施例3
敲低S100A11的表达改善肝纤维化的发生发展
图10为小鼠模型中敲低S100A11缓解肝纤维化表型；其中，A四氯化碳诱导的S100A11基因敲低肝纤维化实验设计的示意图和S100A11蛋白表达检测；B小鼠血清中的丙氨酸转氨酶含量；C为天门冬氨酸转氨酶含量；D天狼星红染色胶原蛋白沉积；E促肝纤维化关键基因转录水平表达；F促肝纤维化关键基因蛋白表达；G蛋氨酸胆碱-缺乏饲料诱导的S100A11基因敲低肝纤维化实验设计的示意图和S100A11蛋白表达检测；H小鼠血清中的丙氨酸转氨酶含量；I为天门冬氨酸转氨酶含量；J天狼星红染色胶原蛋白沉积；K促肝纤维化关键基因转录水平表达；L促肝纤维化关键基因蛋白表达；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
本发明采用在小鼠尾静脉注射腺相关病毒(AAV8)下调S100A11的表达，腺相关病毒(AAV8)委托上海汉恒生物有限公司合成，小鼠注射四氯化碳每周两次4周(图10中的A)。研究结果发现，丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶含量相比于对照组P小鼠明显降低(图10中的B、图10中的C)；与这些结果一致，肝脏组织切片天狼星红染色显示四氯化碳诱导4周后，敲低S100A11表达后胶原蛋白沉积显著减少(图10中的D)。同时本发明也通过实时荧光定量RT-PCR和蛋白免疫印迹检测参与调控胞外基质沉积的基因和蛋白的表达，肝脏组织敲低S100A11小鼠肝脏组织中这些基因的表达降低，且具有统计学差异(图10中的E、10中的F)。这些数据表明，敲低肝脏S100A11表达可缓解四氯化碳诱导的肝纤维化。
同时，本发明采用腺相关病毒减少S100A11在小鼠肝脏体内表达(图10中的G)。尾静脉注射两周后，给予蛋氨酸胆碱缺乏饲料处理4周收取血液样本和肝脏样本组织进行研究分析，敲低S100A11实验组小鼠表血浆丙氨酸转氨酶(图10中的H)和天门冬氨酸转氨酶(图10中的I)水平相对于对照而言也显著降低。此外，在蛋氨酸胆碱缺乏饲料诱导处理4周后，与对照组小鼠相比，天狼星红染色S100A11敲低小鼠在蛋氨酸胆碱-缺乏饲料诱导小鼠肝脏胶原蛋白积累显著减少(图10中的J)。与预期的一样，与对照组相比，S100A11敲低小鼠肝脏中纤维相关基因和蛋白的表达也显著降低(图10中的K、图10中的L)。这些研究数据提减少肝脏组织S100A11明显减轻蛋氨酸胆碱缺乏饲料处理的小鼠的肝损伤和肝纤维化。
以上结果表明，S100A11是一种控制肝纤维化发生的新型促纤维化关键因子，在肝损伤和肝纤维化中可能具有广谱作用。
实施例4
S100A11在肝纤维化过程中促进肝星状细胞的激活
图11为S100A11促进肝星状细胞的激活；其中，A表示过表达S100A11引起肝纤维化相关基因转录水平表达检测结果；B表示过表达S100A11引起肝纤维化相关基因蛋白表达水平检测；C表示敲低S100A11引起肝纤维化相关基因转录水平表达检测结果；D表示敲低S100A11引起肝纤维化相关基因蛋白表达水平检测；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
人肝星状细胞LX-2细胞作为进行作用机理探究的细胞系。首先建立S100A11过表达细胞系，用于探究是否在人肝星状细胞LX-2过表达S100A11能够促进肝星状细胞的激活；同时本发明也在人肝星状细胞LX-2中采用Si-RNA干扰实验来敲低S100A11在LX-2细胞中的表达。研究结果发现和对照组相比，S100A11过表达的细胞中这些肝纤维化相关基因表达在转录和翻译水平都显著上升(图11中的A、图11中的B)。同时，本发明也采用Si-RNA干扰实验来减少S100A11在LX-2细胞中的表达，通过对LX-2敲低细胞进行分析发现，减少LX-2细胞中S100A11的表达后，参与肝纤维化的这些标记基因都表达下调(图11中的C、图11中的D)。这一部分研究结果提示，S100A11能够促进肝星状细胞的激活进而促进肝纤维化的发生发展。
实施例5
S100A11作为TGF信号通路关键因子参与肝星状细胞激活
图12为S100A11通过调节激活关键信号通路Smad2/3-TGF-β参与肝纤维过程；其中，A为敲低肝星状细胞S100A11表达后，检测TGF-β刺激诱导肝纤维化标志物基因的转录表达水平检测；B是敲低S100A11后，对TGF-β诱导肝星状细胞激活相关蛋白水平检测结果；C是原代小鼠肝星状细胞中敲低S100A11后，肝纤维化、TGF-β信号通路下游靶基因P-Smad2和P-Smad3相关蛋白表达；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
S100A11能够激活肝星状细胞，通过实时荧光定量RT-PCR实验检测纤维化相关标志物转录水平，(图12中的A)，发现在S100A11敲低人星状细胞中，TGF-β刺激诱导的星状细胞激活被抑制。
进一步的研究发现，在TGF-β1处理24小时后，LX-2细胞被诱导激活，LX-2细胞中S100A11，α-SMA，Col1α2和VIM的转录水平明显高于对照组；在另一个处理组中，敲低LX-2细胞S100A11的表达，然后再加入TGF-β1处理LX-2细胞，发现相比TGF-β1处理组，减少S100A11表达的情况下，TGF-β1下游信号通路及LX-2激活均被显著抑制(图12中的B)。另一方面，和对照组小鼠肝脏原代星状细胞相比，在S100A11敲低小鼠肝星状原代细胞中，TGF-β1诱导处理后TGF-β信号通路及肝星状细胞的激活被抑制(图12中的C)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南大学
<120> S100A11基因或蛋白作为生物标记物在制备诊断、预防或治疗肝纤维化的产品的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcaaaaa tctccagccc tacagagact gagcggtgca tcgagtccct gattgctgtc 60
ttccagaagt atgctggaaa ggatggttat aactacactc tctccaagac agagttccta 120
agcttcatga atacagaact agctgccttc acaaagaacc agaaggaccc tggtgtcctt 180
gaccgcatga tgaagaaact ggacaccaac agtgatggtc agctagattt ctcagaattt 240
cttaatctga ttggtggcct agctatggct tgccatgact ccttcctcaa ggctgtccct 300
tcccagaagc ggacctga 318
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Lys Ile Ser Ser Pro Thr Glu Thr Glu Arg Cys Ile Glu Ser
1 5 10 15
Leu Ile Ala Val Phe Gln Lys Tyr Ala Gly Lys Asp Gly Tyr Asn Tyr
20 25 30
Thr Leu Ser Lys Thr Glu Phe Leu Ser Phe Met Asn Thr Glu Leu Ala
35 40 45
Ala Phe Thr Lys Asn Gln Lys Asp Pro Gly Val Leu Asp Arg Met Met
50 55 60
Lys Lys Leu Asp Thr Asn Ser Asp Gly Gln Leu Asp Phe Ser Glu Phe
65 70 75 80
Leu Asn Leu Ile Gly Gly Leu Ala Met Ala Cys His Asp Ser Phe Leu
85 90 95
Lys Ala Val Pro Ser Gln Lys Arg Thr
100 105
<210> 3
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcctacag agactgagag atgcattgag tccctgattg ctgttttcca aaagtacagc 60
gggaaggatg gaaacaacac tcaactctcc aaaactgaat tcctttcctt catgaacaca 120
gagctggctg ccttcacaaa gaaccagaag gatcctggtg tccttgaccg catgatgaag 180
aagctggacc tcaactgtga cgggcagcta gatttccaag agtttctcaa cctcattggt 240
ggcttagcta tagcgtgcca tgattctttc atccaaactt cccagaagcg aatctaa 297
<210> 4
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Pro Thr Glu Thr Glu Arg Cys Ile Glu Ser Leu Ile Ala Val Phe
1 5 10 15
Gln Lys Tyr Ser Gly Lys Asp Gly Asn Asn Thr Gln Leu Ser Lys Thr
20 25 30
Glu Phe Leu Ser Phe Met Asn Thr Glu Leu Ala Ala Phe Thr Lys Asn
35 40 45
Gln Lys Asp Pro Gly Val Leu Asp Arg Met Met Lys Lys Leu Asp Leu
50 55 60
Asn Cys Asp Gly Gln Leu Asp Phe Gln Glu Phe Leu Asn Leu Ile Gly
65 70 75 80
Gly Leu Ala Ile Ala Cys His Asp Ser Phe Ile Gln Thr Ser Gln Lys
85 90 95
Arg Ile
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaaggatgg ttataacta 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caacactcaa ctctccaaa 19

Claims (10)

1.检测肝纤维化生物标记物表达量的试剂在制备肝纤维化诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述肝纤维化生物标记物是S100A11基因或蛋白。
2.抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。
3.抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗四氯化碳诱导的肝纤维化的药物中的应用。
4.抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗MCD诱导的肝纤维化的药物中的应用。
5.抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备降低四氯化碳或MCD诱导的肝纤维化中ALT、AST表达量、胶原蛋白积累量或肝纤维化相关基因表达量的药物中的应用，所述肝纤维化相关基因包括α-SMA、Col1α2和VIM。
6.抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备预防或治疗TGF-β1诱导的肝纤维化的药物中的应用。
7.抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备抑制TGF-β1诱导的肝纤维化的星状细胞激活的药物中的应用。
8.抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备抑制TGF-β1诱导的肝纤维化的TGF-β信号通路激活的药物中的应用。
9.抑制S100A11基因或蛋白表达的试剂在制备降低TGF-β1诱导的肝纤维化的TGF-β信号通路的P-Smad2和P-Smad3表达水平的药物中的应用。
10.根据权利要求2～9任一项所述的应用，其特征在于，所述S100A11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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