CN114891794A - 调控番茄外果皮表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和遗传学技术领域，具体涉及一种调控番茄外果皮表达的启动子及其应用，本发明启动子的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或包含与SEQ ID NO:1所述核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列；或包含来源于SEQ ID NO:1所述核苷酸序列上的100个及100以上连续的核苷酸片段。本发明首次发现番茄外果皮特异性启动子pSlPR10，可用于外源基因在番茄外果皮中的特异性表达，从而避免该外源基因在番茄的其他组织中持续表达所带来的不利影响，对番茄品种的改良具有重要意义，另外，在植物基因工程中利用本发明启动子能够使得外源目的基因在特定组织中高效表达，以便实现对外源基因表达进行定时、定点、定量的三维精确调控。

Description

调控番茄外果皮表达的启动子及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和遗传学技术领域，具体涉及一种调控番茄外果皮表达的启动子及其应用。

背景技术

番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，年产量高达1.823亿吨(FAOSTAT，2019年)。除了经济价值高，番茄还富含对人体有益的化合物，如维生素、类胡萝卜素和酚类化合物等。这些生物活性化合物具有广泛的生理特性，包括抗炎抗过敏、抗菌、血管扩张、抗血栓、心脏保护和抗氧化作用(Raiola等，2014)。同时，番茄还是模式植物，具有成熟的转基因体系，是研究肉质果实发育、成熟以及果实重要农艺性状(包括座果率、大小、质地、颜色、风味、香气和营养品质等)分子机制的主要模型作物(Shinozaki et al.2018)。

科研人员已将多种基因改造技术用于提高番茄果实的品质，如提高营养价值或延长贮藏寿命(Mehta等人2002；Rosati等人2000；Liu等人2004；Gupta等人2013)。通常使用两类启动子表达外源基因：组成型启动子(如CaMV35S)或组织特异性启动子。但是，外源基因的组成型高水平表达在许多情况下往往会导致植物生长发育的异常(Chen and Chen2002；Hsieh et al.2002；Kasuga et al.2004)。因此，不管是对于基础科学研究还是作物遗传改良，组织特异性启动子的鉴定和使用显得尤为重要。

常见用于番茄果实改造的组织特异性启动子有E8启动子，其是一种乙烯诱导型启动子，能使目的基因在成熟期果实中表达(Butelli et al.2008；He et al.2008；Luo etal.2008；Zhang et al.2013；Zhang et al.2014)。

花青素是一类重要的类黄酮代谢物，具有着色、吸引传粉者、抗强光、抗氧化、抵御各种生物和生物胁迫等功能。已有多个课题组的研究人员利用果实特异性启动子在番茄果实中制造花青素，使番茄果实的营养价值提高、货架期延长以及提升抵御生物胁迫的能力(Butelli et al.2008；He et al.2008；Luo et al.2008；Zhang et al.2013；Zhang etal.2014)。

目前，尚缺乏番茄外果皮特异性启动子的报道。一些改良番茄果实性状的基因不适合全果实表达，可能会影响果实风味或果肉品质，但如果能够将其限制在外果皮中表达则可以克服这个问题。另外，花青素等具有氧化作用的次生代谢物在叶片中积累会影响植物生长发育，从而导致减产等不良后果。若能限制其仅表达于在特定位置如番茄外果皮，则可克服前述问题。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明旨在提供一种调控番茄外果皮表达的启动子，使得目的基因基于本发明提供的启动子而仅于番茄的外果皮中表达，避免目的基因全果实表达对番茄生长代谢产生的负面影响。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种调控番茄外果皮表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

或包含与SEQ ID NO:1所述核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列；

或包含来源于SEQ ID NO:1所述核苷酸序列上的100个及100以上连续的核苷酸片段。

本发明利用启动子pSlPR10在番茄绿色期和成熟期的外果皮中都具有极高的表达能力，而在其他部位几乎不表达，可有效控制目的基因的表达位置。

本发明启动子为pSlPR10启动子，所述启动子具有在番茄外果皮中特异表达的功能，通过将本发明所述启动子与报告基因GUS相连，转化番茄，检测分析转基因植株中的GUS表达活性和表达模式，通过在转基因植株的果实进行GUS染色分析，结果发现pSlPR10启动子驱动GUS基因主要在番茄外果皮中表达，进而证明本发明所提供的启动子是一个番茄外果皮特异性表达的启动子。

本发明所提供的番茄外果皮特异表达启动子，含有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:1中所列核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列，或包含来源于SEQ ID NO:1序列上的100个及100以上连续的核苷酸片段，并且可以驱动与该启动子操作性连接的核苷酸序列在植物外果皮中的表达。含有上述序列的表达载体、转基因细胞系以及宿主菌等均属于本发明的保护范围。

本发明所述启动子还可用于从番茄以外的其它植物中分离相应序列，尤其是从其他茄科植物中进行同源克隆。根据这些相应序列与本文所列启动子序列间的序列同源性，或与本启动子基因的同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本发明所述SEQ ID NO:1启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。

本发明所述的“启动子”是指一种DNA调控区域，其通常包含能指导RNA聚合酶II在特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子还可包含其它识别序列，这些识别序列通常位于TATA盒的上游或5"端，通常被称为上游启动子元件，发挥调控转录效率的作用。本领域技术人员应该知晓，虽然已经鉴定了针对本发明公开的启动子区域的核苷酸序列，但是分离和鉴定处于本发明鉴定的特定启动子区域的TATA盒上游区域的其它调控元件也在本发明的范围内。

因此，本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包含上游调控元件，例如用于调控编码序列的时空表达功能的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织(例如外果皮)中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证外果皮优先的表达。核心启动子指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，是编码蛋白质基因的启动子通常都具有的元件。因此，可选地，pSlPR10启动子可与其自身的或其它来源的核心启动子关联使用。

核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子、泛素启动子等。

所述基因启动子的功能可以通过以下方法进行分析：将启动子序列与报告基因可操作性连接，形成可转化的构建体，再将该构建体转入植株中；在获得转基因后代中，通过观察报告基因在植物各个组织器官中的表达情况来确认其表达特性；或者将上述构建体亚克隆进用于瞬时表达实验的表达载体，通过瞬时表达实验来检测启动子或其调控区的功能。

启动子的活性和强度可以根据其驱动的报告基因的mRNA或蛋白质的表达量来测定。报告基因(Reporter gene)是指编码容易被被检测的蛋白质或酶的基因。科研人员通常将其蛋白编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列的调节下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有β-葡萄糖苷酸酶基因GUS，和绿色荧光蛋白基因GFP。

本发明通过GUS报告基因来检测启动子的活性和表达特性，采用组织化学法检测GUS基因的表达。以5-溴-4-氯-3-吲哚-B-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞转入了GUS基因，并表达出了GUS酶蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使各组织细胞中有GUS表达活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性的强弱。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

第二方面，本发明提供一种构建体，所述构建体包括上述启动子和调控于番茄外果皮表达的目的基因。

优选地，目的基因包括GUS基因、Del/Ros1基因、ANT1/ANT1-like基因、AN2/MYB75/AN2-like基因、MYB31基因、ABCG42基因中的至少一种。

本发明的启动子可与非SlPR10基因的核苷酸序列相连，以表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段或变体可与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒中，用于在目的植株中表达。所述表达盒有合适的限制性酶切位点，用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的相应表型。

本发明所公开的pSlPR10启动子，可用于驱动下列异源核苷酸序列的表达，以使转化的植株获得相应的表型。所述异源核苷酸序列可编码花青素合成基因ANT1。在某些实施方式中，本发明中所提到的可操作地连接在本发明启动子下游的核酸，其中所述的“核酸”可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。

本发明还包括含有pSlPR10启动子的构建体，所述构建体包括通常所说的载体或表达盒。上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是本发明所提供基因的终止子，也可以是来自外源的终止子。更具体地，上述终止子可以是胭脂碱合酶基因(NOS)的终止区域或SlPR10基因的终止区域。

在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将DNA片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

优选地，构建体还包括选择标记基因，所述标记基因包括氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因或草丁嶙抗性基因。

本发明所提供的构建体中还包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于：氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘膦抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光蛋白基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1等基因。

本发明所提供的构建体如表达盒或载体可被插入质粒或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。本发明的表达盒或载体一般被插入植物细胞核的染色体DNA中。

第三方面，本发明提供上述启动子或构建体在调控花青素相关基因于番茄外果皮中表达的应用。

优选地，花青素相关基因包括Del/Ros1基因、ANT1/ANT1-like基因、AN2/MYB75/AN2-like基因、MYB31基因、ABCG42基因。

第四方面，本发明提供上述启动子或构建体在延缓果实衰老、或提高果实产量、或提高果实抗病性、或延长果实货架期中表达的应用。

本发明还包括所公开的pSlPR10启动子的应用，在某些应用的实施方式中，可以应用本发明所提供的pSlPR10启动子来实现在番茄外果皮产生花青素，所述花青素相关基因包括但不限于Del/Ros1基因、ANT1/ANT1-like基因、AN2/MYB75/AN2-like基因、MYB31基因、ABCG42基因。优选地，利用本发明提供的pSlPR10启动子可对番茄进行遗传改良，所述遗传改良包括但不限于提高果皮花青素含量、延缓果实衰老、提高果实产量、提高果实抗病性、延长果实货架期、改变果实颜色、制造代谢产物。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术(可参见Horsch RB等(1985)Science225：1229；White FF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等.Techniquesfor Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press，1993，pp.128-143，等)。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但也适合单子叶植物。本发明提供的pSlPR10启动子的核苷酸序列可被插入任何植物细胞中，尤其适用于如番茄等的茄科植物。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明首次发现番茄外果皮特异性启动子pSlPR10，填补了番茄外果皮特异性启动子的空白，本发明外果皮特异表达启动子可用于外源基因在番茄外果皮中的特异性表达，从而避免外源基因在番茄的其他组织中持续表达所带来的不利影响，如在叶片中持续表达导致植株生长抑制，或在果肉中表达对果实或人类的毒害作用。该启动子的提出和应用，对番茄品种的改良具有重要意义。

(2)本发明利用启动子pSlPR10在番茄绿色期和成熟期的外果皮中都具有极高的表达能力，而在其他部位几乎不表达，从而可有效控制目的基因的表达位置，在植物基因工程中利用本发明启动子能够使得外源目的基因在特定组织中高效表达，以便实现对外源基因表达进行定时、定点、定量的三维精确调控。

(3)本发明启动子能够调控与花青素合成相关基因于番茄外果皮中表达累积花青素，而非外果皮部分依然保持野生型性状，避免了花青素在叶片积累导致抑制番茄生长的问题，对未来番茄遗传改良提供了重要的技术支撑。

(4)本发明的启动子是番茄植物自有的序列，避免了外源序列可能引起的植物内基因表达水平的紊乱；基于本发明启动子开发的转基因品系不存在由启动子序列导致的生物安全性的问题。

(5)含有本发明构建体的表达载体不受转基因技术种类的影响，适用于包括农杆菌侵染愈伤组织，茎尖法在内的多种转基因技术，推广应用性强。

附图说明

图1是SlPR10基因在番茄中的qRT-PCR表达分析；

图2是表达载体pCAMBIA-pPR10-GUS的T-DNA区图谱；

图3是表达载体pCAMBIA-pPR10-ANT1的T-DNA区图谱；

图4是pCAMBIA-pPR10-GUS转基因番茄和野生型番茄果实切片的GUS组织染色图；

图5是pSlPR10驱动花青素合成基因ANT1的转基因番茄果实；

图6是外果皮相对于Trolox的总抗氧化能力。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由广州生工生物工程有限公司合成，测序由广州生工生物工程有限公司完成；KODFX DNA聚合酶购自TAKARA公司，载体构建过程中的核酸内切酶购自NEB公司，qRT-PCR试剂盒和重组酶试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit购自诺唯赞公司。实验中所用的载体pCAMBIA3101于本实验室保存。总抗氧化能力(FRAP法)试剂盒购自格锐思公司。所有方法均参照试剂盒提供商推荐的方法进行。

实施例1 SlPR10基因在番茄中的Real-time PCR表达分析

本案发明人在转录组数据中发现，番茄SIPR10基因在番茄外果皮具有很高的表达量，而在中果皮和叶片中几乎不表达。取番茄的根、叶、绿色期外果皮(绿外果皮)、绿色期中果皮(绿中果皮)、红色期外果皮(红外果皮)、红色期中果皮(红中果皮)，提取RNA，反转录为cDNA作为模板，以番茄ACTIN作为内参对照，对SlPR10基因进行了RT-qPCR表达分析。

RT-PCR的检测引物是如下

引物1：5'-atgaactttgttgaaggtggac-3'(SEQ ID NO:4)；

引物2：5'-ggcaattgattccaatttgtcacc-3'(SEQ ID NO:5)；

引物3：5'-TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3'(SEQ ID NO:6)；

引物4：5'-GGACAATGGATGGACCAGAC-3'(SEQ ID NO:7)；

其中，引物1和引物2分别是SlPR10基因检测的上游引物和下游引物；引物3和引物4是分别是番茄内参基因ACTIN的检测分析的上游引物和下游引物。PCR检测体系按说明书要求添加。PCR反应条件：95℃，预变性5分钟；94℃，变性30秒；55℃，退火30秒；72℃，延伸30秒；40个循环。在qRT-PCR仪上进行反应，反应结束后，分析软件输出的数据，得到的检测结果如图1所示，SlPR10基因的表达集中在红果和绿果的外果皮区域，而在根、叶及中果皮区域几乎不表达。

这表明，本发明的SlPR10基因是花器官特异性表达基因，主要表达于番茄果实部位的外果皮区域。

实施例2启动子pSlPR10、ANT1基因、GUS基因的分离

设计如下所需引物：

引物5：5'-CACTGACGGCTTTATGCCggctttagtcaagatttcatcaactccatga-3'(SEQ IDNO:8)；

引物6：5'-ACGTAACATcataatgtttgattaagtatttatattttgaaagaaaaaaagatatga-3'(SEQ ID NO:9)；

引物7：5'-aacattatgATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC-3'(SEQ ID NO:10)；

引物8：5'-CCAAATGTTTGAACGATCTTATTGTTTGCCTCCCT-3'(SEQ ID NO:11)；

引物9：5'-aacattatgatgaacagtacatctatgtcttcattggg-3'(SEQ ID NO:12)；

引物10：5'-CATCTTTATAATCTCCatcaagtagattccataagtcaatttcagcag-3'(SEQ IDNO:13)；

2.1启动子pSlPR10的分离

利用正向引物(引物5)和反向引物(引物6)，其中带下划线部分的序列为启动子序列，以番茄品种Alisa Craig(AC)的DNA作为模板，KODFX DNA聚合酶进行扩增，反应条件是：95℃预变性3分钟；94℃变性15秒；55℃退火15秒；72℃延伸2分钟30秒；33个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收，电泳条带大小符合预期，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.2 GUS基因的分离

利用正向引物(引物7)和反向引物(引物8)，其中带下划线部分的序列为GUS基因序列，以实验室提供的含GUS序列质粒作为模板，KODFX DNA聚合酶进行扩增，反应条件同2.1所述。反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收，电泳条带大小符合预期。

2.3 ANT1基因的分离

利用正向引物(引物9)和反向引物(引物10)，其中带下划线部分的序列为ANT1基因序列，以番茄品种Alisa Craig(AC)的DNA作为模板，KODFX DNA聚合酶进行扩增，反应条件是：95℃预变性3分钟；94℃变性15秒；55℃退火15秒；72℃延伸1分钟30秒；33个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收，电泳条带大小符合预期。

实施例3遗传转化载体的构建和鉴定

3.1 pCAMBIA-pPR10-GUS载体的构建

首先将实验室保存的pCAMBIA载体用内切酶PstI进行酶切，载体的酶切产物作琼脂糖凝胶电泳，割胶回收。用酶标仪鉴定实施例2中回收的pSlPR10启动子、GUS基因以及酶切后pCAMBIA载体的浓度，使用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit对三者进行同源重组。

取100μL冷冻感受态细胞，加入10μL重组产物，样品轻轻混匀，冰上放置30分钟。42℃下热激90秒，迅速放于冰上冷却2分钟。向EP管中加入400μL LB培养基，37℃振荡培养1小时。取培养液100μL涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃恒温培养。挑取10个克隆并编号。用菌落PCR验证克隆是否为阳性。PCR扩增引物同实施例2中GUS引物。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，有目的的条带编号的克隆可以初步确定为阳性克隆。挑取菌落PCR阳性克隆，液体LB(LB粉末来自海博生物技术有限公司)+Kan(来自广州华奇盛生物有限公司)于37℃培养过夜，提取质粒。送广州生工生物工程股份有限公司用通用引物测序。序列确认无误，pCAMBIA-pPR10-GUS载体构建成功，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其T-DNA区域如图2所示，LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；HPT表示潮霉素抗性基因；pPR10表示本发明中的启动子pSlPR10；Tnos表示nos基因的终止子；T35s表示35s基因的终止子；GUS表示gus蛋白(β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase))基因。

3.2 pCAMBIA-pPR10-ANT1载体的构建

首先将实验室保存的pCAMBIA载体用内切酶PstI进行酶切，载体的酶切产物作琼脂糖凝胶电泳，割胶回收。用酶标仪鉴定实施例2中回收的pSlPR10启动子、ANT1基因以及酶切后pCAMBIA载体的浓度，使用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit对三者进行同源重组。

取100μL冷冻感受态细胞，加入10μL重组产物，样品轻轻混匀，冰上放置30分钟。42℃下热激90秒，迅速放于冰上冷却2分钟。向EP管中加入400μLLB培养基，37℃振荡培养1小时。取培养液100μL涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃恒温培养。挑取10个克隆并编号。用菌落PCR验证克隆是否为阳性。PCR扩增引物同实施例2中ANT1引物。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，有目的的条带编号的克隆可以初步确定为阳性克隆。挑取菌落PCR阳性克隆，液体LB+Kan于37℃培养过夜，提取质粒。送广州生工生物工程股份有限公司用通用引物测序。序列确认无误，pCAMBIA-pPR10-ANT1载体构建成功，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。其T-DNA区域如图3所示，LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；HPT表示潮霉素抗性基因；pPR10表示本发明中的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；T35s表示35s基因的终止子；ANT1表示番茄ANT1基因。

实施例4番茄遗传转化和pSlPR10功能鉴定

利用热激法将质粒pCAMBIA-pPR10-GUS和pCAMBIA-pPR10-ANT1分别转入不同农杆菌GV3101菌株，利用农杆菌介导法对番茄进行转化。从转基因植株中分离各组织器官，进行GUS活性检测，将各组织器官置于含有GUS染色缓冲液的离心管中，放于37℃温箱温育过夜，然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。

4.1转基因番茄苗的组织器官染色

将转化pCAMBIA-pPR10-GUS的转基因番茄和野生型番茄的果实切片分别进行GUS染色。结果如图4所示，GUS基因只在转基因番茄的外果皮中有很强的表达，显现出肉眼可明显观测到的很强的蓝色。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株的外果皮中指导其下游的GUS蛋白表达，而且这种表达具有外果皮组织表达特异性。

4.2转基因番茄外果皮抗氧化能力检测

野生型番茄(WT)和pSlPR10-ANT1转基因番茄果实(pSlPR10-ANT1)的果皮颜色分别如图5所示，肉眼可见，pSlPR10-ANT1转基因番茄果实表皮的颜色相对较深。将野生型番茄(WT)和pSlPR10-ANT1转基因番茄果实(pSlPR10-ANT1)的外果皮切下，用含0.3％盐酸的甲醇溶液在4℃提取24小时，然后5000g离心20分钟，取上清液。按照总抗氧化能力(FRAP法)试剂盒说明书测定其相对于Trolox的抗氧化能力，如图6所示，结果表明pSlPR10-ANT1转基因番茄果实的外果皮具有极强的抗氧化能力。

该实施例证明，使用本发明提出的pSlPR10启动子可对番茄进行遗传改良，如将pSlPR10启动子与ANT1基因融合，使转基因番茄的外果皮富含具有抗氧化功能的花青素。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 调控番茄外果皮表达的启动子及其应用

<130> H220805606

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2087

<212> DNA

<213> pSlPR10启动子

<400> 1

ggctttagtc aagatttcat caactccatg atttttacta taagacaatg tttggcttag 60

tcaattagat gtagacattg aaaagatttt tctatagaga agaaactata tggtatacac 120

tacatatcat tatcctcaca cccacccacc caattatcaa agaccaacta gcctctcaaa 180

aagataagta ttaaaaaaaa aattattcgt attcgatatt tatacaacta tataagatat 240

agagagaagt atttaaaata catttgaatt taacgtaaat tattaatttc atctttaata 300

tcaaatatat tcatttgttt ggctagctga acttaaaaat atccttaatt ttataagatg 360

agtgaaatac atctttatag tttcaccaga tttaggagtg ttttcaaccc ttctctcgat 420

tttttatgaa aagtttcatt tttctacaag aatttgaaac cacttgtata tcagatttag 480

ttagataagt aaaaaaattc ttataaagct attaataatt taaaaataaa actaataatt 540

tatatcaaat taaaaaataa ttccattact tctctacgag atatttaatt aaacaataca 600

ttaagctata ctacattaat atttgacaaa aatattttac aaattaatta cctaaatata 660

aactgacaaa tggttacttt caaaatgatt tttttgaaaa gtttttcttt ttccaagcaa 720

tcagagttaa agtttgatta aataaagtat tataacataa tataaacagt aataaatata 780

aaaatatatt tttatttata atacataaaa acacctatca aaatatcatt aaattcaaac 840

tcatgacacc gtaattttca ttactcattt tcttattata taatttaatg agtgaaacta 900

gataattttg aattcaaaaa attaatattg atggataata atattagcaa acgaacgttc 960

ttctaagctt ccaaatataa tgaacactat tattattaag gatcgtagtt gaaatgataa 1020

tacttataat ttattcttaa cgagaggtct tagaaaatat aataaactct attatacgag 1080

atctttcagt gtaaatttat atttaatcga atttcaacac gaataatatc gatgagaaaa 1140

aacatgatga gcactaccaa gttggtaggt tcctaaagtc caatcaaact taatatcgtg 1200

tcagcaagcc ttatttttat agaccatatt atataaaatt ctcccaatgt cacaactaac 1260

aaaattaatt atcaaagata gtgacacaac atgtagaaaa aaataaaaat aaaaaatgga 1320

caaaattgtc aacaatgcac tgctttgaat gttgaaatta atactaaagt taagattgtt 1380

catgactaga attctaaaat ttcaccaaac ttttccaaca acttatacac cttccagatc 1440

gcgatctaac aatttatttt aattataact tttgcaacaa tttatacatc ttttagatcg 1500

cgttaacgat ttattttaat tataactttt ataattatta gataatattt tgtttgatat 1560

cttcgtcttt ttcgatcatg attgataaga taaattcaaa agattttaat agctttcact 1620

ctacttgtac tgaatacgag taattgttca ccatttgtcc aaaggtttat attttttctg 1680

tctaataata tttgttcagt attgacggtg gacacttttt taaaaattat aaataaaagg 1740

ataattttac tatatcactc attgaatatg attataaata taacgtttta aaaaatgtaa 1800

taaaaatgac tataactaat aatatatcgt ggataagtat tattggacat tttataataa 1860

tatagtactg aacaactatt gtcgaacatg atcgagtttt atatgacttt tcaaggtagg 1920

gacaaaactt acataataat caaccaaaat ctcacttcat tttttgtcct ataaatacca 1980

tctaaaactt tcaatatatc acacacactt caaagcatta tattcatctt atcctttctc 2040

tttcatatct ttttttcttt caaaatataa atacttaatc aaacatt 2087

<210> 2

<211> 4155

<212> DNA

<213> pCAMBIA-pPR10-GUS

<400> 2

ggctttagtc aagatttcat caactccatg atttttacta taagacaatg tttggcttag 60

tcaattagat gtagacattg aaaagatttt tctatagaga agaaactata tggtatacac 120

tacatatcat tatcctcaca cccacccacc caattatcaa agaccaacta gcctctcaaa 180

aagataagta ttaaaaaaaa aattattcgt attcgatatt tatacaacta tataagatat 240

agagagaagt atttaaaata catttgaatt taacgtaaat tattaatttc atctttaata 300

tcaaatatat tcatttgttt ggctagctga acttaaaaat atccttaatt ttataagatg 360

agtgaaatac atctttatag tttcaccaga tttaggagtg ttttcaaccc ttctctcgat 420

tttttatgaa aagtttcatt tttctacaag aatttgaaac cacttgtata tcagatttag 480

ttagataagt aaaaaaattc ttataaagct attaataatt taaaaataaa actaataatt 540

tatatcaaat taaaaaataa ttccattact tctctacgag atatttaatt aaacaataca 600

ttaagctata ctacattaat atttgacaaa aatattttac aaattaatta cctaaatata 660

aactgacaaa tggttacttt caaaatgatt tttttgaaaa gtttttcttt ttccaagcaa 720

tcagagttaa agtttgatta aataaagtat tataacataa tataaacagt aataaatata 780

aaaatatatt tttatttata atacataaaa acacctatca aaatatcatt aaattcaaac 840

tcatgacacc gtaattttca ttactcattt tcttattata taatttaatg agtgaaacta 900

gataattttg aattcaaaaa attaatattg atggataata atattagcaa acgaacgttc 960

ttctaagctt ccaaatataa tgaacactat tattattaag gatcgtagtt gaaatgataa 1020

tacttataat ttattcttaa cgagaggtct tagaaaatat aataaactct attatacgag 1080

atctttcagt gtaaatttat atttaatcga atttcaacac gaataatatc gatgagaaaa 1140

aacatgatga gcactaccaa gttggtaggt tcctaaagtc caatcaaact taatatcgtg 1200

tcagcaagcc ttatttttat agaccatatt atataaaatt ctcccaatgt cacaactaac 1260

aaaattaatt atcaaagata gtgacacaac atgtagaaaa aaataaaaat aaaaaatgga 1320

caaaattgtc aacaatgcac tgctttgaat gttgaaatta atactaaagt taagattgtt 1380

catgactaga attctaaaat ttcaccaaac ttttccaaca acttatacac cttccagatc 1440

gcgatctaac aatttatttt aattataact tttgcaacaa tttatacatc ttttagatcg 1500

cgttaacgat ttattttaat tataactttt ataattatta gataatattt tgtttgatat 1560

cttcgtcttt ttcgatcatg attgataaga taaattcaaa agattttaat agctttcact 1620

ctacttgtac tgaatacgag taattgttca ccatttgtcc aaaggtttat attttttctg 1680

tctaataata tttgttcagt attgacggtg gacacttttt taaaaattat aaataaaagg 1740

ataattttac tatatcactc attgaatatg attataaata taacgtttta aaaaatgtaa 1800

taaaaatgac tataactaat aatatatcgt ggataagtat tattggacat tttataataa 1860

tatagtactg aacaactatt gtcgaacatg atcgagtttt atatgacttt tcaaggtagg 1920

gacaaaactt acataataat caaccaaaat ctcacttcat tttttgtcct ataaatacca 1980

tctaaaactt tcaatatatc acacacactt caaagcatta tattcatctt atcctttctc 2040

tttcatatct ttttttcttt caaaatataa atacttaatc aaacattatg atgttacgtc 2100

ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca ttcagtctgg 2160

atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa gaaagccggg 2220

caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt cgtaattatg 2280

cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca ggccagcgta 2340

tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat aatcaggaag 2400

tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg tatgttattg 2460

ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg cagactatcc 2520

cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac ttccatgatt 2580

tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg aacacctggg 2640

tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg tctgttgact 2700

ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat caacaggtgg 2760

ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac ctctggcaac 2820

cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca gagtgtgata 2880

tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag ttcctgatta 2940

accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac ttgcgtggca 3000

aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg attggggcca 3060

actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg gcagatgaac 3120

atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct ttaggcattg 3180

gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc aacggggaaa 3240

ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa aaccacccaa 3300

gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt gcacgggaat 3360

atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg atcacctgcg 3420

tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt gatgtgctgt 3480

gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg gcagagaagg 3540

tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt atcatcaccg 3600

aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg tggagtgaag 3660

agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc agcgccgtcg 3720

tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata ttgcgcgttg 3780

gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg gcttttctgc 3840

tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga ggcaaacaat 3900

aagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 3960

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 4020

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 4080

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 4140

ctatgttact agatc 4155

<210> 3

<211> 3406

<212> DNA

<213> pCAMBIA- pPR10-ANT1

<400> 3

ggctttagtc aagatttcat caactccatg atttttacta taagacaatg tttggcttag 60

tcaattagat gtagacattg aaaagatttt tctatagaga agaaactata tggtatacac 120

tacatatcat tatcctcaca cccacccacc caattatcaa agaccaacta gcctctcaaa 180

aagataagta ttaaaaaaaa aattattcgt attcgatatt tatacaacta tataagatat 240

agagagaagt atttaaaata catttgaatt taacgtaaat tattaatttc atctttaata 300

tcaaatatat tcatttgttt ggctagctga acttaaaaat atccttaatt ttataagatg 360

agtgaaatac atctttatag tttcaccaga tttaggagtg ttttcaaccc ttctctcgat 420

tttttatgaa aagtttcatt tttctacaag aatttgaaac cacttgtata tcagatttag 480

ttagataagt aaaaaaattc ttataaagct attaataatt taaaaataaa actaataatt 540

tatatcaaat taaaaaataa ttccattact tctctacgag atatttaatt aaacaataca 600

ttaagctata ctacattaat atttgacaaa aatattttac aaattaatta cctaaatata 660

aactgacaaa tggttacttt caaaatgatt tttttgaaaa gtttttcttt ttccaagcaa 720

tcagagttaa agtttgatta aataaagtat tataacataa tataaacagt aataaatata 780

aaaatatatt tttatttata atacataaaa acacctatca aaatatcatt aaattcaaac 840

tcatgacacc gtaattttca ttactcattt tcttattata taatttaatg agtgaaacta 900

gataattttg aattcaaaaa attaatattg atggataata atattagcaa acgaacgttc 960

ttctaagctt ccaaatataa tgaacactat tattattaag gatcgtagtt gaaatgataa 1020

tacttataat ttattcttaa cgagaggtct tagaaaatat aataaactct attatacgag 1080

atctttcagt gtaaatttat atttaatcga atttcaacac gaataatatc gatgagaaaa 1140

aacatgatga gcactaccaa gttggtaggt tcctaaagtc caatcaaact taatatcgtg 1200

tcagcaagcc ttatttttat agaccatatt atataaaatt ctcccaatgt cacaactaac 1260

aaaattaatt atcaaagata gtgacacaac atgtagaaaa aaataaaaat aaaaaatgga 1320

caaaattgtc aacaatgcac tgctttgaat gttgaaatta atactaaagt taagattgtt 1380

catgactaga attctaaaat ttcaccaaac ttttccaaca acttatacac cttccagatc 1440

gcgatctaac aatttatttt aattataact tttgcaacaa tttatacatc ttttagatcg 1500

cgttaacgat ttattttaat tataactttt ataattatta gataatattt tgtttgatat 1560

cttcgtcttt ttcgatcatg attgataaga taaattcaaa agattttaat agctttcact 1620

ctacttgtac tgaatacgag taattgttca ccatttgtcc aaaggtttat attttttctg 1680

tctaataata tttgttcagt attgacggtg gacacttttt taaaaattat aaataaaagg 1740

ataattttac tatatcactc attgaatatg attataaata taacgtttta aaaaatgtaa 1800

taaaaatgac tataactaat aatatatcgt ggataagtat tattggacat tttataataa 1860

tatagtactg aacaactatt gtcgaacatg atcgagtttt atatgacttt tcaaggtagg 1920

gacaaaactt acataataat caaccaaaat ctcacttcat tttttgtcct ataaatacca 1980

tctaaaactt tcaatatatc acacacactt caaagcatta tattcatctt atcctttctc 2040

tttcatatct ttttttcttt caaaatataa atacttaatc aaacattatg atgaacagta 2100

catctatgtc ttcattggga gtgagaaaag gttcatggac tgatgaagaa gattttcttc 2160

taagaaaatg tattgataag tatggtgaag gaaaatggca tcttgttccc ataagagctg 2220

gtaactatta aattaactat cacgttattt ttatttgtct ttctgtctca ttttatttga 2280

cgttattacg aatatcatct gaaaatgtac gtgcaggtct gaatagatgt cggaaaagtt 2340

gtagattgag gtggctgaat tatctaaggc cacatatcaa gagaggtgac tttgaacaag 2400

atgaagtgga tctcattttg aggcttcata agctcttagg caacaggcat gcaagtttat 2460

gttttgacaa aatttgatta gtatatatta tatatacgtg tgactatttc atctaaatgt 2520

tacgttattt tacgtagatg gtcacttatt gctggtagac ttcccggaag gacagctaac 2580

gatgtgaaaa actattggaa cactaatctt ctaaggaagt taaatactac taaaattgtt 2640

cctcgcgaaa agattaacaa taagtgtgga gaaattagta ctaagattga aattataaaa 2700

cctcaacgac gcaagtattt ctcaagcaca atgaagaatg ttacaaacaa taatgtaatt 2760

ttggacgagg aggaacattg caaggaaata ataagtgaga aacaaactcc agatgcatcg 2820

atggacaacg tagatccatg gtggataaat ttactggaaa attgcaatga cgatattgaa 2880

gaagatgaag aggttgtaat taattatgaa aaaacactaa caagtttgtt acatgaagaa 2940

atatcaccac cattaaatat tggtgaaggt aactccatgc aacaaggaca aataagtcat 3000

gaaaattggg gtgaattttc tcttaattta ccacccatgc aacaaggagt acaaaatgat 3060

gatttttctg ctgaaattga cttatggaat ctacttgatg gagattataa agatgatgat 3120

gacaaggatt ataaagatga tgatgacaag taagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 3180

ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 3240

tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3300

atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3360

aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatc 3406

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> S1PR10基因检测的上游引物

<400> 4

atgaactttg ttgaaggtgg ac 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> S1PR10基因检测的下游引物

<400> 5

ggcaattgat tccaatttgt cacc 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> ACTIN的上游检测引物

<400> 6

ttgctgaccg tatgagcaag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> ACTIN的下游检测引物

<400> 7

ggacaatgga tggaccagac 20

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 8

cactgacggc tttatgccgg ctttagtcaa gatttcatca actccatga 49

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 9

acgtaacatc ataatgtttg attaagtatt tatattttga aagaaaaaaa gatatga 57

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 10

aacattatga tgttacgtcc tgtagaaacc cc 32

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 11

ccaaatgttt gaacgatctt attgtttgcc tccct 35

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 12

aacattatga tgaacagtac atctatgtct tcattggg 38

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 13

catctttata atctccatca agtagattcc ataagtcaat ttcagcag 48

Claims (7)

1.一种调控番茄外果皮表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

或包含与SEQ ID NO:1所述核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列；

或包含来源于SEQ ID NO:1所述核苷酸序列上的100个及100以上连续的核苷酸片段。

2.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括权利要求1所述启动子和调控于番茄外果皮表达的目的基因。

3.根据权利要求2所述构建体，其特征在于，所述目的基因包括GUS基因、Del/Ros1基因、ANT1/ANT1-like基因、AN2/MYB75/AN2-like基因、MYB31基因、ABCG42基因中的至少一种。

4.根据权利要求2所述构建体，其特征在于，所述构建体还包括选择标记基因，所述标记基因包括氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因或草丁嶙抗性基因。

5.权利要求1所述启动子或权利要求2所述构建体在调控与花青素相关基因于番茄外果皮中表达的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述花青素相关基因包括Del/Ros1基因、ANT1/ANT1-like基因、AN2/MYB75/AN2-like基因、MYB31基因、ABCG42基因。

7.权利要求1所述启动子或权利要求2所述构建体在延缓果实衰老、或提高果实产量、或提高果实抗病性、或延长果实货架期中的应用。

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