CN114891662A - 一株恶臭假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株恶臭假单胞菌及其应用。所述菌株分类命名为分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ZTB‑A29，已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20897。本发明的恶臭假单胞菌可去除环境中氨气和/或硫化氢，氨气24h去除率达83.21%，硫化氢的24h去除率达78.96%，可应用于畜禽粪污、垃圾和公共场所除臭，应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株恶臭假单胞菌及其应用。
背景技术
厕所、垃圾中转站、污水处理站等异味严重影响着周边环境与居民健康,迫切需求高效的除臭措施来净化空气，改善空气质量。生物除臭剂的诞生，大大改善了垃圾投放点、垃圾中转站、垃圾填埋场、养殖场、公厕等恶臭源影响范围下生活的广大人民的生活环境。生物除臭技术在20世纪50年代发展起来，80年代在德国和荷兰等国家处理臭气取得较好效果，当前生物除臭已成为处理恶臭的主要技术。生物除臭主要是通过微生物的生理代谢将具有臭味的物质加以转化，使目标污染物被有效分解去除，以达到恶臭的治理目的。含氮化合物和含硫化合物被认为是主要的恶臭物质，高效除臭微生物的分离和筛选是除臭微生物制剂的重要前提。因此筛选高效除臭功能微生物，开发高效除臭微生物制剂已成为当前的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一株恶臭假单胞菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株恶臭假单胞菌，所述菌株分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ZTB-A29，已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20897，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述恶臭假单胞菌的菌落特征及菌体形态为：
将菌株ZTB-A29在NA平板上培养24h后形成的菌落为淡黄色、半透明、无光泽、圆形、无流动性，菌落直径4-5mm；菌体呈杆状，革兰氏染色呈阴性，无芽孢，无荚膜。
上述恶臭假单胞菌的生理生化特征为：
ZTB-A29接触酶反应呈阴性，V．P测定呈阴性，MR测定呈阳性，葡萄糖产酸试验阳性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产H2S试验呈阳性。
将上述恶臭假单胞菌的16S rDNA序列（SEQ ID NO.1）与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：ZTB-A29与Pseudomonas putida同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Pseudomonas putida（CP026115.2）的相似度达99.72%。结合菌落形态、生理生化特征和16SrDNA序列分析，鉴定ZTB-A29为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。
本发明的优点在于：
本发明所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ZTB-A29能有效去除厕所、垃圾场、养殖场等场所氨气和硫化氢等臭气的浓度，去除异味，从而显著改善空气质量。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
本发明所述一株恶臭假单胞菌，其分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ZTB-A29，已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20897，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
以下实施例中所用到的培养基如下：
NH3选择性固体培养基：蔗糖50.0g，25%氨水10.0mL，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4 0.1g，1wt%ZnSO4 5.0mL，NaCl 2.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。
NH3选择性液体培养基：蔗糖50.0g，25%氨水10.0mL，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4 0.1g，1wt%ZnSO4 5.0mL，NaCl 2.0g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。
H2S选择性培养基：葡萄糖5.0g，K2HPO4 0.5g，KNO3 1.0g，MgCl2 0.5g，NaCl 0.5g，NH4Cl 0.5g，Na2CO3 1.0g，FeCl2 0.01g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌15min。
实施例1 恶臭假单胞菌的分离筛选与鉴定
（1）筛选过程：
通过梯度稀释法，从福建红树植物中分离出319株分离物。通过三区划线法对分离到的内生细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转移到NA斜面上保存备用。通过菌株对NH3、H2S的降解活性进行筛选，初步筛选出6株具有较强除臭活性的内生菌株，最终筛选出一株具有良好除臭效果的内生细菌，标记为ZTB-A29。
（2）菌落特征及菌落形态：
将ZTB-A29在NA平板上培养24h后形成菌落的为淡黄色、半透明、无光泽、圆形、无流动性，菌落直径4-5mm；电镜下菌体呈杆状，革兰氏染色呈阴性，无芽孢，无荚膜。
（3）生理生化特征：
ZTB-A29接触酶反应呈阴性，V．P测定呈阴性，MR测定呈阳性，葡萄糖产酸试验阳性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产H2S试验呈阳性。
（4）除氨活性菌株初选
除NH3菌株初筛：配置NH3选择性固体培养基，定量200mL装入锥形瓶中，高压灭菌并冷却至适当温度后注入0.5mL浓度为25%的氨水，然后倒平板。待平板冷却后将分离得到的菌株点接至NH3选择性固体培养基平板上，置于30℃恒温培养3d后观察菌落生长情况，测量菌落直径并记录。菌落直径越大表明该菌株降解NH3的活性越强。
表1 氨降解活性菌株的初步筛选
注：D：菌落直径。
氨降解活性：“-”：无活性（菌落直径：0mm）；“+”：有活性（菌落直径:1-5mm）；
“++”：较强活性（菌落直径：6-10mm）；“+++”：很强活性（菌落直径：＞10mm）。
（5）除臭菌株复筛
除NH3菌株筛选：取30mL NH3选择性液体培养基装于摇瓶中，高压灭菌后注入30μL浓度为25%的氨水备用。将以上初筛出的具较强降解NH3活性的菌株接种至NB液体培养基，置于180r/min摇床上30℃恒温培养2~3d后，按5%(V/V)接种量接种至以上NH3选择性液体培养基中，摇瓶密封后置于180r/min摇床上30℃恒温培养3d后观察菌液变化，若菌液浑浊表明该菌株具有降解NH3的活性。
除H2S菌株筛选：将以上筛选出的具有NH3降解活性的菌株接种至NB液体培养基上置于180r/min摇床内30℃恒温培养2~3d后，按5%(V/V)的接种量接种至装有200mL H2S选择性培养基的烧杯中，在烧杯中放置一个50mL无菌小烧杯，内装有12mL 25%(V/V)H2SO4，向小烧杯中加入4g硫化亚铁(FeS)后密封，在30℃、180r/min摇床上恒温培养3~7d后，观察菌液浑浊情况，若浑浊表明有降解H2S的活性。
表2 ZTB-A29的除臭效果测定
注： 菌液不浑浊：“-”： 菌液浑浊：“+”。
（6）16S rDNA序列分析
菌株ZTB-A29的16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示。将所测的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：ZTB-A29与Pseudomonas putida同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Pseudomonas putida（CP026115.2）的相似度达99.72%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，初步鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。
实施例2 ZTB-A29对畜禽粪污的除臭效果测定
将500g新鲜猪粪加入到5L带盖的圆形塑料容器内，向其中加入25mL的恶臭假单胞菌ZTB-A29菌液（菌液浓度为108 cfu/ mL）混合均匀，盖好密封盖。对照组以同样的方式加入25mL无菌水。每个处理设置3个重复；分别于30℃恒温箱中培养3天，采用感官法评定臭味等级（臭味等级划分6级：0级：无臭味，用“-”表示；1级：基本无臭味，用“+”表示；2级：轻微臭味，用“++”表示；3级：轻度臭味，用“+++”表示；4级：臭味显著，用“++++”表示；5级：臭味难以忍受，用“+++++”表示）。
表3 ZTB-A29除臭效果评定
从表3中可以看出，实验组新鲜猪粪经ZTB-A29处理后臭味明显降低，仅表现出微弱臭味，臭味等级为2级，而对照处理组仍然是臭味难以忍受，臭味等级为5级。可见，恶臭假单胞菌ZTB-A29除臭效果显著。
实施例3 ZTB-A29对公厕的除臭效果测定
选取某学校教学楼一个臭味显著的公厕（男厕），关闭门窗，取菌液浓度为108cfu/ mL恶臭假单胞菌ZTB-A29发酵菌液，稀释20倍，用喷壶分别将菌液喷洒在蹲位口、小便池、地漏、地面、角落等地，用量为100mL/m2。分别在喷洒菌液第0小时，第1小时和第2小时采用感官法评定臭味等级（臭味等级划分6级：0级：无臭味，用“-”表示；1级：基本无臭味，用“+”表示；2级：轻微臭味，用“++”表示；3级：轻度臭味，用“+++”表示；4级：臭味显著，用“++++”表示；5级：臭味难以忍受，用“+++++”表示）。
表4 ZTB-A29的除臭效果测定
通过以上测定可以看出，菌株ZTB-A29在公厕除臭方面具有显著作用效果，且操作简便、绿色环保，除臭效果显著。
实施例4 ZTB-A29对生活垃圾的除臭效果测定
选取某学校一生活垃圾集中存放点，将500克新鲜的生活垃圾分别放入带密封盖的5L塑料桶内，向其中加入50mL的恶臭假单胞菌ZTB-A29菌液（菌液浓度为108 cfu/ mL）混合均匀，盖好密封盖。对照组以同样的方式加入50mL无菌水。检测24小时后桶内的NH3浓度和H2S浓度，测定结果如下表5所示。
表5 ZTB-A29的除臭效果测定
从表5 可以看出，经菌株ZTB-A29处理后，塑料桶内臭气强度显著降低，其中氨气浓度降低了83.21%，硫化氢浓度降低了78.96%，说明恶臭假单胞菌ZTB-A29除臭效果显著，能有效的减少空气中恶臭物质的浓度，有利于改善生活环境。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建亮洁环境服务有限公司，闽江学院
<120> 一株恶臭假单胞菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1430
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tratcaaccg tggtaaccgt cctcccgaag gttagactag ctacttctgg tgcaacccac 60
tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cgacattctg 120
attcgcgatt actagcgatt ccgacttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccggact 180
acgatcggtt ttgtgagatt agctccacct cgcggcttgg caaccctctg taccgaccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggccgtaagg gccatgatga cttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtctccttag agtgcccacc attacgtgct ggtaactaag 360
gacaagggtt gcgctcgtta cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 420
gccatgcagc acctgtgtca gagttcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagttctct 480
gcatgtcaag gcctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540
cttgtgcggg cccccgtcaa ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg 600
gtcaacttaa tgcgttagct gcgccactaa aatctcaagg attccaacgg ctagttgaca 660
tcgttttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac 720
ctcagtgtca gtatcagtcc aggtggtcgc cttcgccact ggtgttcctt cctatatcta 780
cgcatttcac cgctacacag gaaattccac caccctctac cgtactctag cttgccagtt 840
ttggatgcag ttcccaggtt gagcccgggg ctttcacatc caacttaaca aaccacctac 900
gcgcgcttta cgcccagtaa ttccgattaa cgcttgcacc ctctgtatta ccgcggctgc 960
tggcacagag ttagccggtg cttattctgt cggtaacgtc aaaacagcaa ggtattagct 1020
tactgccctt cctcccaact taaagtgctt tacaatccga agaccttctt cacacacgcg 1080
gcatggctgg atcaggcttt cgcccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg 1140
agtctggacc gtgtctcagt tccagtgtga ctgatcatcc tctcagacca gttacggatc 1200
gtcgccttgg tgagccatta ccccaccaac tagctaatcc gacctaggct catctgatag 1260
cgcaaggccc gaaggtcccc tgctttctcc cgtaggacgt atgcggtatt agcgttcctt 1320
tcgaaacgtt gtcccccact accaggcaga ttcctaggca ttactcaccc gtccgccgct 1380
gaatcaagga gcaagctccc gtcatccgct cgacttgcat ggtaggcctc 1430
Claims (3)
1.一株恶臭假单胞菌，其特征在于：所述菌株分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ZTB-A29，已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20897，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌，其特征在于：所述菌株的16Sr DNA测序结果如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌在去除畜禽粪污、垃圾和公共场所臭味中的应用。
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Also Published As
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