CN114886900B

CN114886900B - Evacetrapib在制备抗菌药物中的应用

Info

Publication number: CN114886900B
Application number: CN202210593633.2A
Authority: CN
Inventors: 孙雪松; 雷丹; 房祖业
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2022-05-27
Filing date: 2022-05-27
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2042-05-27
Also published as: CN114886900A

Abstract

本发明公开了evacetrapib在制备抗菌药物中的应用，其中evacetrapib对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度为2～4μg/mL。相较于已有抗生素克林霉素，evacetrapib能够避免耐药细菌的形成。本发明还提供了一种抗菌药物，使用evacetrapib治疗肺炎小鼠，显示出较好的体内疗效，相比对照组，显著提高小鼠存活率至42.9％；且治疗剂量对小鼠无肝、脾、肾组织毒性，安全性好。这项研究表明，evacetrapib是一种治疗革兰氏阳性菌感染的有潜力的药物。

Description

Evacetrapib在制备抗菌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及evacetrapib在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

20世纪40～80年代被称为抗生素的黄金时代，在这一时期开发出了许多新的抗生素。然而，自1990年代后期，新抗生素的发现和开发已经显著放慢，过去30年中只有三个新的抗生素获得美国FDA批准。在抗生素发现越来越困难的时期，细菌对抗生素的耐药性却逐年增加，使细菌耐受临床治疗浓度的抗生素，导致抗生素失去治疗的效力。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是院内和社区感染的重要病原菌之一，常见的金黄色葡萄球菌感染性疾病如毛囊炎、疖疮、脓疱、乳腺炎、伤口感染和葡萄球菌烫伤皮肤综合征等，而更严重的感染性疾病如菌血症、肺炎、心内膜炎、骨和关节感染以及中毒性休克综合征等。抗生素耐药是金黄色葡萄球菌感染性疾病患者死亡率增加的重要原因。研究数据表明，在美国，每年超过80000例侵入性感染和超过11 000例死亡是由耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)引起的。预计到2050年，抗生素耐药性将导致约3亿人死亡，给全球经济造成高达100万亿美元的损失。

在这种情况下，至关重要的是促进可有效替代的新化合物的发现。新药物的发现，开发和注册是一个昂贵且耗时的过程，其成本估计为15亿美元，并且通常需要10到17年的时间才能完成，且失败率很高。

毫无疑问，抗生素开发渠道需要振兴。然而，答案可能不仅是新药的开发，还可能是对先前已停产的化合物的重新研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供evacetrapib在制备抗菌药物中的应用，evacetrapib对革兰氏阳性菌(耐药菌/敏感菌)具有抑制作用，且能对革兰氏阳性菌生物膜进行清除；本发明的目的之二在于提供一种抗菌药物，该抗菌药物可以用于治疗肺炎小鼠，且疗效剂量不具有组织毒性，安全性好。

本发明提供了evacetrapib在制备抗菌药物中的应用。

实验结果表明，evacetrapib具有抑菌作用，对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)为2～4μg/mL。在耐药性发展实验中，在14天的连续药物压力下培养，S.aureus(29213)、S.aureus(Newman)和S.aureus(MRSA ATCC43300)未对evacetrapib产生耐药，evacetrapib能够避免耐药菌株的形成；evacetrapib在体内对MRSA感染的小鼠肺炎模型具有疗效；所使用的药物剂量未对小鼠产生肝、脾、肾组织毒性，安全性好。

细菌生物膜是治疗金黄色葡萄球菌感染的重大挑战，可以通过在组织和医疗设备表面黏附，以其低代谢状态使许多感染复杂化。生物膜的细胞外聚合基质阻碍了抗生素的扩散，许多抗生素缺乏根除已建立的生物膜的能力。实验数据表明，0.5μg/mL的evacetrapib能对S.aureus(MRSA ATCC43300)生物膜进行清除。

老药新用作为开发新的治疗细菌感染类药物方法变得越来越重要，这些药物已知的安全概况、药代动力学特性、制造过程为加快药物的重新利用提供了便捷，并且大大降低了药物的研发成本和研发周期。

Evacetrapib是CETP(胆固醇酯转移蛋白)的一种有效的选择性抑制剂，作为胆固醇调节剂进行了研究，以降低高危心血管疾病患者的心血管风险和死亡率。Evacetrapib可通过抑制CETP来减少脂质交换。CETP的作用是将胆固醇酯从抗动脉粥样硬化的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)转移到动脉粥样硬化的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白(VLDL-C)。HDL-C参与胆固醇逆向转运，其血液水平已显示与心血管风险呈负相关。

到目前为止，暂未发现有关evacetrapib在抗细菌方面的研究报道。本发明首次提供药物evacetrapib在制备抗菌药物中的应用，evacetrapib能够对革兰氏阳性菌进行比较彻底的清除，并且对多种临床耐药菌株具有较低的抑菌浓度，这将扩大其在临床的应用范围，使其成为有潜力的抗菌药物。

优选的，所述抗菌药物为抗革兰氏阳性菌药物。

优选的，所述革兰氏阳性菌选自葡萄球菌、链球菌、肠球菌的一种或两种以上。

优选的，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌；

所述链球菌为肺炎链球菌；

所述肠球菌为粪肠球菌。

实验结果表明，evacetrapib对肺炎链球菌的最小抑菌浓度为2μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2μg/mL。

优选的，所述革兰氏阳性菌为耐药革兰氏阳性菌和/或非耐药革兰氏阳性菌；

所述耐药革兰氏阳性菌为单耐药革兰氏阳性菌和/或多重耐药的革兰氏阳性菌。

Evacetrapib对耐药革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度为2～4μg/mL。

优选的，所述耐药革兰氏阳性菌选自耐β-内酰胺类抗生素的革兰氏阳性菌、耐氨基糖苷类抗生素的革兰氏阳性菌、耐酰氨醇类抗生素的革兰氏阳性菌、耐林可霉素类抗生素的革兰氏阳性菌中的一种或两种以上。

本发明中，耐β-内酰胺类抗生素的革兰氏阳性菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；

耐氨基糖苷类抗生素的革兰氏阳性菌包括耐庆大霉素金黄色葡萄球菌；

耐喹诺酮类抗生素的革兰氏阳性菌包括耐环丙沙星金黄色葡萄球菌；

耐林可霉素类抗生素的革兰氏阳性菌包括耐克林霉素金黄色葡萄球菌。

Evacetrapib对临床多耐药金黄色葡萄球菌株的最小抑菌浓度为2～4μg/mL。

本发明还提供了一种抗菌药物，包括：evacetrapib。

优选的，还包括：抗生素。

优选的，所述抗生素选自β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、酰氨醇类抗生素中的一种或两种以上。

优选的，所述β-内酰胺类抗生素为氨苄西林；

所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素；

所述酰氨醇类抗生素为氯霉素。

实验结果表明，evacetrapib与氨苄西林、庆大霉素、氯霉素联用均具有相加作用，为临床治疗细菌感染、多重耐药感染及重症感染提供了新思路。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明evacetrapib在制备抗菌药物中的应用，是申请人首次提供药物evacetrapib在制备抗菌药物中的应用，evacetrapib能够对革兰氏阳性菌进行比较彻底的清除，并且对多种耐药菌株具有较低的抑菌浓度，这将扩大其在临床的应用范围，使其具有作为抗菌感染作用的药物开发潜力。

(2)本发明抗菌药物中，evacetrapib具有革兰氏阳性菌的生物膜清除能力。重要的是，在药物压力下连续传代14代，S.aureus(29213-cip)、S.aureus(Newman)和S.aureus(MRSA ATCC43300)菌株均未对evacetrapib产生耐药，因此该药物的使用能够避免耐药菌株的产生。

(3)Evacetrapib原本开发用于心血管疾病的保护防治，临床研究未显示任何肝、肾或肌肉安全问题，血压或盐皮质激素活性无不良影响。重新研究停产药物，使得旧药物“复活”，开发利用前景好，对多耐药革兰氏阳性治疗具有重要现实意义，为多耐药革兰氏阳性菌感染的临床治疗提供一种新的用药选择。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中evacetrapib对受试革兰氏阳性菌的最低抑菌浓度(MIC)图；

图2为本发明实施例1中不同浓度evacetrapib对金黄色葡萄球菌的生长影响图；

图3为本发明实施例2中evacetrapib对金黄色葡萄球菌单耐药株的最小抑菌浓度(MIC)图；

图4为本发明实施例3中evacetrapib对多重耐药金黄色葡萄球菌临床菌株的最小抑菌浓度(MIC)图；

图5为本发明实施例4中evacetrapib分别与氨苄西林、庆大霉素、氯霉素联用的结果图；

图6为本发明实施例5中evacetrapib对S.aureus(MRSA ATCC43300)的时间杀伤曲线图；

图7为本发明实施例7中evacetrapib对S.aureus(MRSA ATCC43300)生物膜的清除效果图；

图8为本发明实施例8中评估细菌对evacetrapib的耐药性图；

图9为本发明实施例9中evacetrapib对肺炎模型小鼠的治疗效果图，其中，A为肺炎模型小鼠的存活曲线，B为肺炎模型小鼠的肺部载菌量图，C为健康组、感染组和治疗组的小鼠肺部组织图以及肺部H&E染色图；

图10为evacetrapib对小鼠脏器的毒性测试结果图，其中，A为对照组和药物组小鼠肝、脾和肾的H&E染色图，B为对照组和药物组小鼠血液中AST结果图，C为对照组和药物组小鼠血液中ALT结果图。

具体实施方式

本发明提供了evacetrapib在制备抗菌药物中的应用，evacetrapib能够对包括耐药革兰氏阳性菌在内的革兰氏阳性菌具有抑制作用，且对革兰氏阳性菌生物膜进行清除。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施方式中，使用的药物、试剂和耗材的信息如下：

Evacetrapib购于陶素公司(Topscience)；DMSO购于广州斯佳生物科技公司；胰蛋白胨干粉(货号LP0042)、酵母提取物(货号LP0021)、Todd-Hewitt broth(货号CM0189)均购于Sigma；胰蛋白胨大豆肉汤干粉(货号024051)购于广州环凯微生物；氯化钠购于广州化工；7cm细菌培养皿购于洁特生物。

培养基的配制如下：

(1)TSB液体培养基：取胰蛋白胨大豆肉汤干粉(货号024051)30g加入1L蒸馏水中混匀，121℃灭菌15min，即得。

(2)LB液体培养基：取胰蛋白胨干粉10g、酵母提取物5g和氯化钠10g(固体培养基需再加入15g琼脂粉)加入1L蒸馏水中混匀，灭菌30min，即得。

(3)THYE液体培养基：取酵母提取物干粉5g和Todd-Hewitt broth干粉36.4g加入1000mL水中混匀，加入121℃灭菌15min，即得。

仪器采用生物安全柜、酶标仪(Biotek)、紫外分光光度计和恒温培养箱(Thermo)。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1测定evacetrapib的抗菌作用

本实施例对evacetrapib的抗菌作用进行测定。

本实施例受试菌株信息如下：

肺炎链球菌(S.pneumoniae D39)购自中国典型培养物保藏中心；金黄色葡萄球菌(S.aureus Newman)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA ATCC43300)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；粪肠球菌(179521)，来自南方医科大学检验科，属于多耐药菌株，菌株耐药信息见表3；革兰氏阴性菌中的大肠杆菌(E.coli BW25113)来自美国模式培养物集存库。

本实施例中，最低抑菌浓度(MIC)测定各个菌株三个单克隆。

1.实验步骤

1.1Evacetrapib对受试菌株MIC的测定。

肺炎链球菌，按5％的接种量接种到0.5％THYE液体培养基过夜活化，次日再按5％的量转接一次到新鲜培养基培养，当OD₆₀₀达0.6左右取出，取5μL菌液加入48孔板，同时将5mg/mL evacetrapib母液稀释后以1μg/mL为浓度梯度，设置工作浓度范围在1～7μg/mL，每个浓度三个生物学重复，随后用0.5％THYE培养基补至500μL每孔进行培养，将培养板置于5％CO₂，37℃恒温培养箱中进行培养12h。

大肠杆菌按1％的接种量接种到新鲜的LB液体培养基过夜活化，次日再按1％的量转接到新鲜培养基培养至OD₆₀₀到0.6左右，取5μL菌液加入48孔板，同时将10mg/mLevacetrapib母液稀释后加入孔板，设置工作浓度范围在20～100μg/mL，每个浓度三个生物学重复。随后用LB液体培养基补至500μL进行培养，整个培养过程放置200rpm，37℃恒温培养箱进行培养12h。

金黄色葡萄球菌、粪肠球菌按1％的接种量接种到TSB液体培养基过夜活化，次日再按1％的量转接一次到新鲜培养基培养。培养细菌至对数中期，按1％转接到48孔板，同时将5mg/mL evacetrapib母液稀释后以1μg/mL为浓度梯度，设置工作浓度范围在1～7μg/mL，每个浓度三个生物学重复。随后用TSB培养基补至500μL进行培养，将培养板置于200rpm，37℃恒温培养箱中进行培养12h。

本实施例采用酶标仪在波长为600nm的条件下对菌液浓度进行测定，吸光值OD₆₀₀<0.1的孔，即肉眼未见细菌生长的最低药物浓度则记为MIC，进而得到evacetrapib对上述革兰氏阳性细菌的MIC，并用DMSO作为阴性对照。

1.2Evacetrapib对金黄色葡萄球菌的生长影响

S.aureus(MRSA ATCC43300)和S.aureus(Newman)按1％的接种量接种到TSB液体培养基过夜活化，次日再按1％的量转接一次到新鲜培养基培养。培养至对数中期后取5μL菌液加入48孔板，同时将5mg/mL evacetrapib母液稀释成1×MIC、3/4×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC，每个浓度三个生物学重复，以1％DMSO作为生长影响的阴性对照。随后用TSB培养基补至500μL进行培养，将培养板置于酶标仪EPOCH2TC(Biotek)中检测细菌生长情况。程序使用动力学检测模型，37℃，280cpm，每30min检测一次，培养24h。数据导出使用Graphpadprim分析。

2.实验结果

结果请参阅图1和表1，图1为本发明实施例1中evacetrapib对肺炎链球菌(D39)、粪肠球菌(179521)、S.aureus(MRSA ATCC43300)、S.aureus(Newman)和S.aureus(29213)的最低抑制浓度(MIC)图，表1为本发明实施例1中evacetrapib对上述革兰氏阳性菌、E.coli(BW25113)的MIC(测定时间为12h)。结果表明，evacetrapib对上述革兰氏阳性细菌的MIC为2～3μg/mL。然而evacetrapib未能抑制大肠杆菌的生长，这可能归因于革兰氏阴性菌的特异性细胞外膜。

请参阅图2，为本发明实施例1中不同浓度的evacetrapib对金黄色葡萄球菌的生长影响图。A图是S.aureus(MRSA ATCC43300)的生长曲线，B图是S.aureus(Newman)的生长曲线。结果表明，evacetrapib在MIC时能完全抑制S.aureus Newman和S.aureus MRSA(ATCC43300)的生长。

表1本发明实施例1中evacetrapib对本实施例受试菌株的最小抑菌浓度(MIC)

实施例2测定evacetrapib对金黄色葡萄球菌单耐药菌株的最低抑菌浓度(MIC)

本实施例受试菌株信息如下：

金黄色葡萄球菌(29213)的敏感株来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；金黄色葡萄球菌单耐克林霉素菌株(29213-Cli)、金黄色葡萄球菌单耐庆大霉素菌株(29213-Gen)、金黄色葡萄球菌单耐环丙沙星菌株(29213-Cip)由金黄色葡萄球菌(29213)通过连续传代获得抗性发展。

其中，S.aureus(29213-Cli)、S.aureus(29213-Gen)、S.aureus(29213-Cip)的抗性发展方式为：分别测出克林霉素、庆大霉素、环丙沙星对S.aureus(29213)原代敏感株的最小抑制浓度(MIC)；在存在亚抑菌浓度(1/2MIC)的抗生素水平下，将指数期的金黄色葡萄球菌按1％接种到新鲜的TSB培养基中，37℃，200rpm培养12h后测定新代细菌的MIC，再以新代细菌的亚抑菌浓度连续传代，重复上述步骤，直到金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药倍数发展到40倍以上。

1.实验步骤

挑取S.aureus MRSA(ATCC43300)、S.aureus(29213-Cli)、S.aureus(29213-Gent)和S.aureus(29213-Cip)的三个单克隆保存液，按1％的接种量接种到TSB液体培养基过夜活化。次日再按1％的量转接一次到新鲜TSB培养基培养。当OD₆₀₀到0.8左右，取5μL菌液加入48孔板，同时5mg/mL evacetrapib母液稀释后以1μg/mL为浓度梯度，设置工作浓度范围在1～7μg/mL。随后用TSB培养基补至500μL，在37℃，200rpm恒温培养箱进行培养12h，再利用酶标仪在波长为600nm的条件下对培养后的菌液浓度进行测定，吸光值OD₆₀₀<0.1的孔，即肉眼未见细菌生长的最低药物浓度则记为MIC，进而得知evacetrapib对耐药金黄色葡萄球菌的MIC，并用DMSO作为阴性对照。

2.实验结果

结果请参阅图3和表2，图3为本发明实施例2中evacetrapib对金黄色葡萄球菌耐药株的最小抑菌浓度(MIC)图，表2为本发明实施例2中evacetrapib对金黄色葡萄球菌耐药株的MIC值(测定时间为12h)。Evacetrapib以2～3μg/mL的浓度抑制金黄色葡萄球菌单耐药株的生长，这表明evacetrapib的抗菌功效可能不受细菌耐药模式的影响。

表2本发明实施例2中evacetrapib对金黄色葡萄球菌耐药株的最小抑菌浓度(MIC)

实施例3测定evacetrapib对临床分离的多重耐药金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)

本实施例的受试菌株为临床分离的多重耐药金黄色葡萄球菌(168272，168023，166534，166138，168293，168205，179634，179148，179459，178425，178524，178360)，来自南方医科大学检验科。上述编号为相应菌株在南方医科大学检验科的系统编号，相关菌株的耐药情况如表3所示。

表3相关菌株的耐药情况(MIC单位：μg/mL)

1.实验步骤

挑取临床分离的多重耐药金黄色葡萄球菌单克隆，保种-80℃备用。活化临床菌液，按1％的接种量接种到TSB液体培养基过夜活化。次日再按1％的量转接一次到新鲜TSB培养基培养。当OD₆₀₀到0.8左右，取5μL菌液加入48孔板，同时将5mg/mL evacetrapib母液稀释后以1μg/mL为浓度梯度，设置工作浓度范围在1～7μg/mL。随后用TSB培养基补至500μL进行培养，置于200rpm，37℃摇床进行培养12h，再利用酶标仪在波长为600nm的条件下测定MIC，吸光值OD₆₀₀<0.1的孔，即肉眼未见细菌生长的最低药物浓度则记为MIC，进而得到evacetrapib对耐多种抗生素的金黄色葡萄球菌的MIC，并用DMSO作为阴性对照。

2.实验结果

结果如图4和表4所示，图4为本发明实施例3中evacetrapib对多耐药金黄色葡萄球菌临床菌株的最小抑菌浓度(MIC)图，表4为本发明实施例3中evacetrapib对多耐药金黄色葡萄球菌的MIC值(测定时间为12h)。结果表明，evacetrapib对临床多耐药革兰氏阳性细菌具有广泛的抗菌作用，MIC为2～4μg/mL。

表4本发明实施例2中evacetrapib对多重耐药金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)

实施例4测定evacetrapib与抗生素联合用药的效果

1.实验步骤

本实施例选择了三种不同的抗生素分别与evacetrapib联合用药，分别是β-内酰胺类抗生素氨苄西林(Ampicillin，Amp)、氨基糖苷类抗生素庆大霉素(Gentamicin，Gen)、酰氨醇类抗生素氯霉素(chloramphenicol，Chl)。首先分别检测了三种抗生素对S.aureus(MRSA ATCC43300)的MIC，测定MIC的方法方式同实施例1中MIC的测定方式。再利用三种不同类型的抗生素分别与evacetrapib联合用药，即在96孔板中使用棋盘试验法测定不同浓度配比下抗生素和evacetrapib的联用结果。在孔板中加入抗生素后用TSB培养基补充到198μL，而后加入2μL指数期的菌液，200rpm，37℃恒温培养箱进行培养12h，再利用酶标仪在波长为600nm的条件下对培养后的菌液浓度进行测定，吸光值OD₆₀₀<0.1的孔对应的联合用药组合在96孔板中进行三个生物学复孔进行验证，而后通过计算抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration，FIC)判断相互作用。

其中，FIC＝联合用药时甲药MIC/单独应用甲药时MIC+联合用药时乙药MIC/单独应用乙药时MIC，FIC指数为FIC≤0.5、0.5<FIC≤1、1<FIC≤2、FIC>2时分别表示协同、相加、无关、拮抗作用。

2.实验结果

结果请参阅图5，为本发明实施例4中evacetrapib分别与氨苄西林、庆大霉素、氯霉素联用的结果图。结果表明，evacetrapib与氨苄西林、庆大霉素、氯霉素联用均具有相加作用，为临床治疗细菌感染、多重耐药感染及重症感染提供了新思路。

实施例5测定evacetrapib对金黄色葡萄球菌MRSA(ATCC 43300)的时间杀伤曲线

1.实验步骤

本实施例中以DMSO作为阴性对照组。

S.aureus(MRSA ATCC43300)在TSB培养基中过夜培养后，1％转接到新鲜TSB培养基中，培养到OD₆₀₀＝0.8，随后，将细胞在TSB培养基中1:100稀释至3×10⁶CFU/mL，分别加入DMSO、evacetrapib以1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、9μg/mL浓度梯度在37℃、200rpm孵育，按指定时间点进行连续稀释，涂布在琼脂平板上，37℃培养24小时测定活细胞数(CFU/mL)。

2.实验结果

结果请参阅图6，为本发明实施例5中evacetrapib对S.aureus(MRSA ATCC43300)的时间杀伤曲线图。结果表明，evacetrapib的杀伤能力具有剂量依赖性，6μg/mL的evacetrapib在2小时内就能有效杀死S.aureus(MRSA ATCC43300)。

实施例6测定evacetrapib对生物膜的清除能力

1.实验步骤

S.aureus(MRSA ATCC43300)经过夜活化后，以1％转接到48孔板(500uL体系)后，在37℃培养箱中造膜24h，随后去除上清，用PBS洗去悬浮细胞，分别加入TSB稀释好的1％DMSO、evacetrapib(1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC)，每个梯度四个生物学重复，37℃培养箱孵育24h后吸走上清，用PBS洗生物膜，37℃干燥3h后室温干燥，以0.25％结晶紫染色10min，去除多余的结晶紫后，PBS洗三次，剩余的生物膜用无水乙醇溶解，1:5稀释后用酶标仪在570nm处测量吸光度。

2.实验结果

请参阅图7，为本发明实施例6中evacetrapib对生物膜的清除效果图。结果表明，与空白组DMSO相比，evacetrapib(1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC)对金黄色葡萄球菌生物膜的清除能力具有显著性差异。

实施例7评估细菌对evacetrapib的耐药性

1.实验步骤

通过连续药物压力培养来检测细菌的耐药性发展，将指数期的S.aureus(Newman)、耐环丙沙星金黄色葡萄球菌(29213-Cip)和S.aureus(MRSA ATCC43300)按1％稀释到含有不同药物浓度的evacetrapib的TSB培养基(500μL每孔)，37℃，200rpm下培养12h后检测MIC。在亚抑菌浓度的evacetrapib存在下，按1％的接种量将指数期细菌传代到新的TSB培养基中。重复上述步骤，每隔12h传代一次，且检测每一代的MIC，连续传代14天。以克林霉素(Clindamycin，Cli)连续培养的金黄色葡萄球菌(Newman)作为阳性对照，二甲基亚砜(1％DMSO)作为生长对照。通过将相应的代次的MIC除以第一天的初始MIC来计算MIC移位。

2.实验结果

结果请参阅图8，为本发明实施例7中在亚MIC水平的evacetrapib和克林霉素存在下，连续传代过程中获得耐药性的结果图。如图所示，克林霉素的耐药性水平在14个连续传代中显著升高，与首代相比MIC提高11倍。相比之下，金黄色葡萄球菌在亚MIC水平的evacetrapib存在下连续传代也未能产生可检测的耐药性，表明evacetrapib可能避免耐药细菌的产生。

实施例8测试evacetrapib对肺炎模型小鼠的治疗效果

1.实验步骤

取14只4-5周龄的Balb/c小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)随机分成感染组(7只)和药物组(7只)，从小鼠的右侧鼻腔分别滴入30uL金黄色葡萄球菌临床菌株MRSA(166138)菌液(3×10⁹CFU/小鼠)，2小时后，药物组10mg/kg灌胃给药，感染组(10％DMSO+30％PEG300+5％Tween-80+55％Saline)溶剂灌胃。接种后将小鼠保持直立1min以保证小鼠充分吸收。而后以10mg/kg evacetrapib或溶剂每天灌胃一次，观察小鼠的行为，记录死亡率和体重，第七天对存活的小鼠肺部进行H&E染色切片观察，并取部分记录肺部载菌。

2.实验结果

结果请参阅图9，为本发明实施例8中evacetrapib对肺炎模型小鼠的治疗效果图，其中，A为肺炎模型小鼠的存活曲线，B为肺炎模型小鼠肺部载菌量的变化图，C为健康组、感染组与药物治疗组肺部新鲜组织图以及肺部H&E染色图。存活实验表明，肺炎模型小鼠经过evacetrapib治疗七天，显著提高了小鼠的存活率42.8％。小鼠的肺部细菌负荷量的结果图显示，evacetrapib治疗的小鼠的肺部细菌的数量降低了1.65个log₁₀ CFU。组织H&E染色表明，健康的小鼠肺组织呈浅粉色，肺泡腔无炎性细胞浸润。MRSA感染的小鼠肺部大量炎性细胞浸润，大部分区域的肺泡轮廓不清，肺泡壁变形，肺泡腔充满红细胞，严重出血。Evacetrapib治疗后，肺泡腔炎症细胞数量明显减少，充血量减少，表明小鼠肺部炎症得到改善，与肺部载菌量结果一致。总体而言，evacetrapib使MRSA在小鼠肺炎模型中的致病性降低，保护了小鼠免受MRSA的致命性感染。

实施例9测试evacetrapib对小鼠脏器的毒性

1.实验步骤

取10只4-5周龄的Balb/c小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)随机分成对照组(5只)和药物组(5只)，第一天药物组小鼠每只按10mg/kg evacetrapib灌胃给药，对照组给以溶剂(10％DMSO+30％PEG300+5％tween-80+55％Saline)。接种后将小鼠保持直立1min以保证小鼠充分吸收。而后以10mg/kg evacetrapib或溶剂每天灌胃一次，观察小鼠的行为，连续给药7天，随后观察5天。对肝、脾和肾进行H&E染色切片观察，并检测血液中肝功能指标谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)的酶活性。

2.实验结果

结果请参阅图10，为为本发明实施例9evacetrapib对小鼠脏器的毒性测试结果图，其中，A为对照组和药物组小鼠肝、脾和肾的H&E染色图，B为对照组和药物组小鼠血液中AST结果图，C为对照组和药物组小鼠血液中ALT结果图。结果表明，对照组的肝功能指标ALT与AST在实验室测量的变化方面没有相关的差异，肝、脾和肾H&E染色未见变化。总体而言，接受evacetrapib10 mg/kg的健康小鼠没有观察到肝脾肾组织毒性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.Evacetrapib在制备抗菌药物中的应用；其特征在于，所述抗菌药物为抗革兰氏阳性菌的药物；所述革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌中的一种或两种以上。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为耐药金黄色葡萄球菌和/或非耐药金黄色葡萄球菌；所述耐药金黄色葡萄球菌为单耐药金黄色葡萄球菌和/或多重耐药的金黄色葡萄球菌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述耐药金黄色葡萄球菌选自耐β-内酰胺类抗生素的金黄色葡萄球菌、耐氨基糖苷类抗生素的金黄色葡萄球菌、耐喹诺酮类抗生素的金黄色葡萄球菌、耐克林霉素的金黄色葡萄球菌中的一种或两种以上。

4.一种抗菌药物，其特征在于，所述抗菌药物为抗葡萄球菌、链球菌、肠球菌中任一种细菌的药物；所述药物包括evacetrapib和抗生素。

5.根据权利要求4所述的抗菌药物，其特征在于，所述抗生素选自β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、酰氨醇类抗生素中的一种或两种以上。

6.根据权利要求5所述的抗菌药物，其特征在于，所述β-内酰胺类抗生素为氨苄西林；所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素；所述酰氨醇类抗生素为氯霉素。