CN114858954A - 用于注入色谱样品的方法和设备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于注入色谱样品的方法和设备。本发明公开了一种用于在色谱系统中注入稀释样品的方法，所述方法包括将样品流和稀释剂流合并以形成稀释样品流。所述稀释样品的稀释比等于所述样品和所述稀释剂的体积流速的总和除以所述样品的体积流速。在注入色谱系统流中之前，将所述稀释样品储存在保持元件中。样品稀释在相对于色谱流的低压下发生，由此允许使用较低压样品和稀释剂注射器。其他益处包括降低的可压缩性和减少的因较低压力操作造成的泄漏。所述方法避免与可能因例如样品损失、样品沉淀和样品吸附到瓶而引起错误的与手动技术相关联的问题。
Description
本申请是2017年5月4日申请的发明名称为“用于注入色谱样品的方法和设备”、申请号为201780034978.1的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2016年5月5日提交的标题为“Method and Apparatus for Injectinga Chographicographic Sample”(用于注入色谱样品的方法和设备)的美国临时专利申请No.62/332,069的在先的申请日的权益，该申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明整体涉及用于液相色谱系统的样品注入。更具体地讲，本发明涉及用于注入溶解在强色谱溶剂中的较大体积的样品的方法和设备。
背景技术
色谱法是将混合物分离成其组分的一组技术。例如，在液相色谱(LC)应用中，溶剂递送系统收取液体溶剂或溶剂的混合物，并且将流动相提供到自动取样器(也被称为注入系统或样品管理器)，其中待分析的样品被注入流动相中。具有注入样品的流动相流向色谱柱。当流动相通过柱时，样品中的各种组分被不同地保留下来，并且由此在不同时间从柱中洗脱。检测器感测从柱洗脱的分离组分并且产生输出信号或色谱图，从中可以确定分析物的种类和定量。
当将较大体积样品注入流动相中时，所得的色谱图可以呈现峰加宽。这种峰加宽是常见的现象，在某些情况下它可能对LC分析是有害的，特别是当样品溶解在“强溶剂”中时。当注入显著的样品体积时，强溶剂暂时地充当流动相。因此，样品中的分析物被不良地保留下来，并且样品穿透和峰失真可能发生。通常使用大样品体积注入来实现提高分析的灵敏度的目标；然而，当穿透和峰失真发生时，该目标不实现。
如果不能使用较小体积的样品，那么色谱工作者通常会离线稀释样品。作为另外一种选择，可以蒸发样品并且使其在与LC过程更相容的较弱溶剂中重构。附加的样品操作可能造成操作者错误、样品损失、样品沉淀、样品吸附到瓶壁，以及其他问题。
发明内容
在一个方面，本发明提供了用于在注入色谱系统流中时稀释样品的方法。该方法包括将增量体积的样品注入色谱系统流中。样品包括溶解在溶剂中的至少一种分析物。将增量体积的流动相提供到色谱系统流中。重复注入增量体积的样品和提供增量体积的流动相的步骤，直到将总体积的储存样品注入色谱系统流中。注入样品的稀释比等于样品的增量体积和流动相的增量体积的总和除以样品的增量体积的总和。
在另一个方面，本发明提供了用于稀释色谱样品的设备。该设备包括注入阀和控制模块。注入阀被配置为接纳流动相流和样品的总体积。注入阀还被配置为根据注入阀的状态来将流动相和样品中的一种提供到系统流。控制模块与注入阀连通。控制模块产生信号以将注入阀的状态控制于以下状态中的一个：第一状态，其中样品被注入系统流中；和第二状态，其中流动相被提供到系统流。控制模块还控制处于第一状态的持续时间，其中增量体积的样品被注入系统流中，并且控制处于第二状态的持续时间，其中增量体积的流体相被提供到系统流中，由此在注入后产生稀释样品。
在另一个方面，本发明提供了用于将稀释样品注入色谱系统流的方法。该方法包括将处于第一流速的第一体积的样品的第一流和处于第二流速的第二体积的稀释剂的第二流合并以形成稀释样品的第三流。样品包括溶解在溶剂中的至少一种分析物。稀释样品的稀释比等于第一流速和第二流速的总和除以第一流速。该方法还包括将稀释样品储存在保持元件中；以及将储存在保持元件中的稀释样品注入色谱系统流中。
在另一个方面，本发明提供了用于稀释色谱样品的设备。该设备包括用于提供样品流的样品注射器、用于提供稀释剂流的稀释剂注射器、T形流体管，以及注入阀、保持元件和控制模块。T形流体管与样品注射器和稀释剂注射器连通。注入阀与T形流体管连通以从其接纳稀释样品并与色谱系统流路连通。保持元件与注入阀连通。控制模块与样品注射器、稀释剂注射器和注入阀连通。控制模块控制样品注射器的第一流速和稀释剂注射器的第二流速，由此控制稀释样品的稀释比。控制模块将注入阀的状态控制于以下状态中的一个：第一状态，其中稀释样品装载到保持环路中；和第二状态，其中稀释样品从保持环路注入色谱系统流路中。
在另一个方面，本发明提供了用于为色谱系统稀释样品的方法。该方法包括采集样品针中的样品流体塞。样品流体塞具有增量体积的样品，样品包括溶解在溶剂中的至少一种分析物。在样品针中获得稀释剂流体塞。稀释剂流体塞具有增量体积的稀释剂。重复采集样品针中的样品流体塞和采集样品针中的稀释剂流体塞的步骤，直到获得交替的样品流体塞和稀释剂流体塞的堆叠，使得该堆叠包括总体积的样品。将交替的样品流体塞和稀释剂流体塞的堆叠插入色谱系统中的流动相流中。总体积的样品的稀释比等于样品流体塞的增量体积和稀释剂流体塞的增量体积的总和除以样品流体塞的增量体积的总和。
在另一个方面，本发明提供了用于稀释色谱样品的设备。该设备包括：注入阀，该注入阀被配置为接纳流动相流；样品针；样品源；稀释剂源；样品针控制器；和控制模块。样品针与注入阀流体连通。样品针控制器与样品针连通，并且被配置为控制样品针到样品源的移动以采集具有增量体积的样品的流体塞并且控制样品针到稀释剂源的移动以采集具有增量体积的稀释剂的流体塞。控制模块与注入阀和样品针控制器连通。控制模块产生命令以控制注入阀的状态以及样品和稀释剂的流体塞的采集，由此获得交替的样品流体塞和稀释剂流体塞的堆叠。样品针中的总体积的样品的稀释比等于样品流体塞的增量体积和稀释剂流体塞的增量体积的总和除以样品流体塞的增量体积的总和。
附图说明
通过结合附图参考下面的描述，可以更好地理解本发明的上述优点和其他优点，附图中相同的附图标号是指各个附图中相同的元件和特征。为清楚起见，并非每个元件都在每个附图中标记。附图不一定按比例绘制，重点在于示出本发明的原理。
图1示出了四个色谱图，其表明了增加样品体积对等度分离的峰高和峰宽的影响。
图2示出了三个色谱图，其表明了样品溶剂强度对使用100μL样品注入的等度分离的影响。
图3A示出了等度流动相的色谱图作为样品溶剂强度在注入样品体积为100μL的情况下的影响的另一个示例。
图3B示出了在更强样品溶剂的情况下使用与图3A中所示的示例相同的质量载荷和样品体积的梯度分离的色谱图。
图3C示出了在较小样品体积的情况下使用与图3B中所示的示例相同的质量载荷的梯度分离的色谱图。该图还示出了图3B的色谱图的一部分以用于比较。
图4是用于在注入色谱系统流中时稀释样品的方法的实施方案的流程图表示。
图5A是根据图4的方法的注入阀的出口处的系统流的一部分的组成的图形描绘。
图5B是图5A的流体塞的在系统流中的注入阀下游的位置处实现的被动混合的图形描绘。
图5C是图5B的流体塞另外地混合到恒定组成稀释样品流中的图形描绘。
图6是被配置为实践图4的方法的液相色谱系统的实施方案的框图。
图7是根据不同注入情景的紫外示踪剂样品随时间而变化的检测器响应的图形表示。
图8是针对在三秒注入阀循环期间的不同增量样品体积的评估结果的图形表示，其中每个曲线指示检测到的紫外示踪剂样品随时间而变化的量值。
图9是针对类似于用于图8的系统配置的加入50μL混合器和使用100μm毛细管的系统配置的评估的图形表示。
图10示出了从使用直列地位于在注入阀与色谱柱之间的50μL混合器来根据图4的方法执行的分离得到的色谱图的示例。
图11示出了用于针对以下情况分析溶解在67％乙腈的样品溶剂中的总样品体积为100μL的四种药物而获得的色谱图：(1)在不使用混合器的情况下的单次注入、(2)在使用混合器的情况下的单次注入和(3)在使用混合器的情况下的多次增量体积注入。
图12是用于将稀释样品注入色谱系统流的方法的实施方案的流程图表示。
图13是被配置为实践图12的方法的液相色谱系统的实施方案的框图。
图14是用于将稀释样品注入色谱系统流的方法的实施方案的流程图表示。
图15是被配置为实践图14的方法的液相色谱系统的实施方案的框图。
具体实施方式
在本说明书中提到“一个实施方案”或“实施方案”表示结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本教导的至少一个实施方案中。对本说明书内的特定实施方案的引用不一定都指代相同的实施方案。
如本文所用，“样品”表示待分析的一种或多种化合物和在其中溶解化合物的溶剂。“增量体积的样品”表示体积小于要注入色谱系统流中的样品的总体积的样品。“增量体积的流动相”表示体积小于用于根据下述方法在注入期间稀释样品的流动相的总体积的流动相。一般来讲，样品的增量体积的总和等于稀释样品注入中使用的样品的总体积。类似地，在稀释样品注入期间流动相的增量体积的总和等于用于在稀释样品注入期间稀释样品的流动相的总体积。样品或流动相的流体塞表示样品或流动相对系统流的离散体积贡献。
现在将参考如附图所示的本教导的实施方案来更详细地描述本教导。虽然结合各种实施方案和示例描述了本教导，但是本教导不旨在限制于此类实施方案。相比之下，本教导涵盖各种替代、修改和等同物，如本领域的技术人员将理解。能够访问本文教导的普通技术人员将认识到在本公开的范围内的附加实施方式、修改和实施方案，以及其他使用领域。
当在LC系统中使用反相柱时，优选的是将样品溶解在体积尽可能小的“弱溶剂”中，使得样品中含有的分析物可以集中在柱的顶部处并洗脱为良好形成的峰。此外，为了提高LC分离的灵敏度，通常期望在色谱柱上具有更大的质量载荷。由于样品制备或溶解度约束，样品通常溶解在强溶剂诸如乙腈(ACN)或甲醇中。举例来说，用于生物分析的常见蛋白沉淀技术(将水性样品与乙腈1∶2混合)产生67％乙腈或更高的样品含量。强溶剂的存在通过使色谱图中的峰的形状失真而基本上干扰了LC分析。
图1示出了四个色谱图，其表明了增加样品体积对等度分离的峰高和峰宽的影响。为了清楚起见，色谱图彼此竖直地偏移。在该示例中，将样品溶解在与流动相强度匹配的50％ACN的强溶剂中。色谱图10、12、14和16分别代表使用10μL、20μL、50μL和100μL样品注入体积的分离，其中每个样品注入体积具有样品分析物的相同的相对贡献。字母“A”至“E”用于表示不同的样品分析物的峰，并且字母“F”表示未保留的空标记物(尿嘧啶)的峰。
通常，随着注入样品体积增加，峰高也相应地增加；然而，对于所示的示例，这种趋势不会出现。而是，峰高基本上不变，并且峰下面积与注入样品体积成比例地增加。由于峰变得更宽而不是高度增加，因此灵敏度(或信噪比)不会随着样品体积的增加而增加。因此，可以容易地看出，在强溶剂中的大样品体积是不利的。
图2示出了样品溶剂强度对50％ACN的流动相中的等度分离的影响。为了清楚起见，三个色谱图彼此竖直地偏移。对于色谱图18、20和22，样品溶剂分别具有20％、50％和67％ACN组成。每个样品注入体积为100μL并且含有相同的分析物浓度。每次分离时的流动相流速为0.3mL/分钟，因此每次注入时的样品装载时间为20秒。
如色谱图18所示，对于20％ACN溶剂，分析物A至E在色谱柱的开始处聚集并洗脱为窄峰。空标记物F基本上不保留并洗脱为具有对应于装载时间的20秒宽度的峰。对于在50％ACN样品溶剂中的样品，如色谱图20所示，样品溶剂与流动相强度匹配。所有样品区(A至E和空标记物F)的宽度与20秒样品装载时间的宽度大致相同。第三色谱图22示出了在67％ACN样品溶剂中的样品，样品溶剂比流动相强。在该情况下，峰被主动地扫尾，使得区比20秒宽，并且峰前沿在较早的洗脱时间开始。该结果是由于区更快地通过柱(即，较少保留)。因此，峰被加宽；然而，峰因为它们被相对较弱的50％ACN流动相“推动”而在之后移动得更慢。色谱图22中的峰未被很好地解析并且与其他峰重叠。三个色谱图18、20和22表明强样品溶剂对峰宽有不利影响，而弱流动相是可接受的。通过弱样品溶剂，只要分析物被良好地保留下来，就可以注入更大的样品体积。
图3A示出了在可得自Waters Corporation of Milford，Massachusetts(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司)的Acquity I-Class
系统中使用0.3ml/min的流动相流速和2.1mm×50mm Acquity
CSH C18柱的强样品溶剂对色谱图的影响的另一个示例。100μL样品体积含有在50％乙腈含量的溶剂中的烷基苯酚。使用50％乙腈的等度流动相执行分离。大样品体积产生色谱图24中的五个峰的大的宽度，其中每个峰对应于注入样品中的组分中的特定一种。标记为“F”的剩下的峰对应于体积标记物。每个峰具有对应于注入持续时间的约20秒的宽度。
图3B示出了使用67％ACN样品体积的相同的载荷和流动相流速的结果；然而，执行梯度分离。流动相的梯度以10％ACN开始，并且组成从10％ACN线性地变化到90％ACN，每一分钟变化10％ACN。当样品以10％ACN梯度组成进入柱时，样品被部分地稀释，但是色谱图26中的每个峰仍然被样品溶剂显著地加宽。峰失真并且表现出前沿行为。峰后边界处的尖峰是由于梯度峰聚集；然而，峰A至C仍然如此加宽，使得它们重叠并且仅失真峰D和E从其他组分中解析出来。因此，梯度洗脱中存在的固有聚集效应不足以补偿由在强溶剂中注入大样品体积而引起的带加宽效应。
图3C示出了针对柱上的相同样品质量载荷的1μL注入的色谱图28。为了进行比较，图3B的色谱图26的一部分被叠加为虚线26′。关于1μL注入的色谱图28示出了五个明确定义的峰。因此，可以看出大体积样品注入的效果对高性能LC(HPLC)和超高性能LC(
或UHPLC)是有害的，特别是当样品溶解在强溶剂中时。虽然可以离线稀释样品以降低使用强溶剂的影响，但是分析物的溶解度可能被不利地影响。这种稀释可能造成样品吸附到瓶，或者可能因附加的样品处理而增加LC分析的可变性。
在微量LC中，色谱柱的体积通常小得多；然而，甚至通常使用微量柱(例如，0.15mm内径)，其中样品体积范围为1μL至5μL。将这些样品按体积缩放到UPLC级造成样品注入体积为约200倍以上，其对应于200μL至1mL的体积。这些体积显著地大于通常在标准LC分离中使用的体积。因此，如上所述，使用强样品溶剂的注入更不利地影响微量LC分离。当微量LC系统的用户进一步增加样品体积以尝试增强LC分析的灵敏度时，问题变得更加复杂。
简而言之，如本文所述的用于注入较大体积色谱样品的方法的实施方案基于将增量体积的样品引入流动相中。实际上，样品的小流体塞被流动相的流体塞分开，流动相的流体塞充当弱稀释剂。有利地，这些交替的样品塞和流动相塞的被动混合通过连接管件中或设置在色谱柱上游的附加的混合器内的运输动力学发生。通过适当的增量体积的样品和流动相以及充分混合，结果是将稀释样品递送到柱。因此，样品分析物可以聚集在柱的顶部处，并且可以在针对随后施加的梯度流动相的来自柱的流出物中观察到明显的对称峰。如果在稀释过程期间发生任何样品沉淀，样品仍然会被递送到柱，并且然后重新溶解在梯度流动相中。
图4是用于在注入色谱系统流中时稀释样品的方法100的实施方案的流程图表示。在注入发起之前将总体积的样品通常储存在通到注入阀的样品环路中。起初，注入阀使等度流动相通过阀出口而朝向色谱柱。在样品注入发起时，将总体积的待注入的样品的增量体积VS朝向柱注入(步骤110)LC系统流。如果样品环路中的总体积的样品尚未耗尽(在步骤120确定)，那么阀切换状态以将增量体积VMP的流动相提供(步骤130)到系统流中。重复步骤110至130，直到注入总体积的样品(在步骤120确定)。在迭代样品注入序列完成时或在其之后，LC系统的溶剂递送子系统将等度流动相改变为梯度流动相以执行(步骤140)分离。方法100允许根据以下比率进行有效样品稀释
(VS+VMP)/VS。
例如，如果样品塞的增量体积VS为1μL并且流动相塞的增量体积VMP为9μL，那么实现10的稀释比。在该示例中，如果从样品环路注入100μL未稀释的样品，那么注入阀将循环100次以完成稀释样品注入。应注意，由于因样品通过注入环路而可能发生的附加的区加宽，可能需要更大的体积和更长的循环来注入样品的整个体积含量。
图5A是根据图2的方法100的注入阀的出口处的系统流的一部分的组成的图形描绘。系统流从左到右对应于从注入阀到色谱柱的流。换句话说，附图中右侧的流体在比更向左的流体更早的时间上从注入阀分配。系统流包括强样品溶剂中的增量体积的样品的流体塞30A和等度流动相的后续的流体塞32A。增量体积的样品的下一个塞30B之后出现流动相的另一个塞32B。随后，出现样品塞30C和流动相塞32C，并且该过程以增量体积的样品和流动相的附加的塞(未示出)继续，直到用于LC分析的总体积的样品已经被注入系统流中。实际上，流动相的居间塞32充当样品的弱稀释剂。如图所示，流动相的塞32大致为样品的塞30的体积的两倍，从而造成约3的稀释比。
图5B示出了在系统流下游的位置处实现的流体塞的被动混合。由于流路内的传输动力学造成每个塞的内容物扩散到相邻塞中，因此没有明显的塞边界。在充分混合的情况下，系统流的组成是恒定稀释样品流，如图5C所示。例如，可以进一步在足够长的流路中的下游实现完全混合。在一些实施方案中，在注入阀与色谱柱之间的流路中设有混合器，以确保在柱的顶部处接纳充分混合的稀释样品。
样品塞和流动相塞的该循环以及系统流的后续混合有助于将样品分析物聚集在柱的顶部处，使得以梯度流动相执行的后续分离在色谱图中产生明显的对称峰。
如上所述，稀释比取决于样品和流动相的增量体积VS和VMP。例如，5μL增量体积的样品可以通过10μL增量体积的弱流动相分离以实现3的稀释比。来自注入阀的流中的液体塞的体积与阀保持在用于分配塞的特定状态的时间成比例。因此，可以通过控制注入阀的切换时间来控制稀释比。
图6是被配置为实践图4的方法100的LC系统40的框图。系统40包括溶剂管理器42和与注入阀46流体连通的样品源44(例如，样品管理器或自动采样器)。样品源44提供溶解在溶剂中的样品，该溶剂用于在样品注入开始之前装载联接到注入阀46的样品环路(未示出)。注入阀46的出口与色谱柱48流体连通，色谱柱又联接到检测器50，检测器用于确定从柱48洗脱的组分。控制模块52与注入阀46和检测器50连通。在各种实施方案中，控制模块52产生一个或多个信号以控制注入阀46的切换时间来分别提供增量体积VS和VMP的样品和流动相。控制模块52还与检测器50通信以进行数据采集和控制过程。控制模块52可以响应于以体现在具有在其上体现的计算机可读程序代码的一个或多个计算机可读介质中的计算机程序产品的形式提供的指令而向注入阀46发出命令并控制数据采集。
当注入阀46切换以将每个增量体积VS的样品注入到柱48上时，随着柱48产生高压，增量体积VS可以压缩较少的量。随后，当注入阀46切换回以提供下一个增量体积的流动相时，压力被释放，并且因此，样品环路中的扩展样品中的一些可能
出。因此，优选的是，样品环路中的样品保持在压力下以消除这种样品损失。例如，可以堵塞注入阀46上的一个或多个阀出口，以确保样品环路的内容物保持适当地加压。
使用Acquity I-Class
系统用2.1mm×50mm BEH CSH C18、1.7μm柱检查根据上述方法100的稀释的性能。使用外部注入器(例如，可得自Valco Instruments CompanyIncorporated
Houston，Texas(德克萨斯州休斯顿的Valco仪器公司
)的Cheminert 020-015H二位6通阀)在67％乙腈溶剂中以各种体积增量注入紫外(UV)示踪剂样品。起初，绕过色谱柱，并且通过100cm长的内径为125μm的毛细管将注入阀直接地联接到UV检测器。使用0.3mL/min的流速，并且针对约0.2s的增量注入间隔设定阀定时，从而造成每个样品塞的增量体积VS为约1.0μL。改变流动相的居间塞的增量体积VMP以检查不同的稀释比。
图7是根据不同注入情景的UV示踪剂样品随时间而变化的检测器响应的图形表示。曲线54示出了对在联接到注入阀的注入环路中单次注入100μL的样品的响应。在大多数的响应持续时间内，响应在约0.3吸光度单位下是平稳的。曲线56对应于对0.2s持续时间注入增量体积VS的样品的响应，每次之后是增量流动相体积VMP的0.4s居间流动相塞，总共120个增量注入循环。曲线58对应于对0.2s持续时间注入增量体积VS的样品的响应，每次之后是体积VMP的0.8s居间流动相塞，总共120个增量注入循环。由于增量体积与在连续注入增量体积的样品之间发生的注入持续时间和流动相塞持续时间成比例，因此对应于三个曲线50、52和54的稀释此分别为一、五和十。小体积流体塞的快速注入造成基本上均匀的混合物。
大量循环可能减少注入阀的寿命。因此，优选的是，在保持可接受的混合水平的同时减少循环次数。图8是针对在3.0s注入阀循环期间的不同增量样品体积VS的评估结果的图形表示，其中每个曲线指示检测到的UV示踪剂样品随时间而变化的量值。更大增量样品体积VS造成更短总注入时间。使用类似于以上针对图7描述的那些的条件和仪器(即，具有UV示踪剂在67％乙腈溶剂中的100μL样品环路、0.3ml/min的流速和具有125μm内径的100cm毛细管)进行评估。毛细管绕过色谱柱并用于被动混合系统流。
曲线60、62、64和66对应于具有分别为0.4s、0.6s、1.0s和1.8s的样品塞持续时间和分别为2.6s、2.4s、2.0s和1.2s的流动相塞持续时间的循环。因此，所有曲线都对应于3.0s的完整循环持续时间。通过降低UV检测器信号的强度，明显看出各种稀释水平。可以通过曲线中的显著波纹或峰看到发生不充分的混合。内径较大的毛细管可以改善被动混合；然而，一般优选的是，提供更有效的混合，例如，其方式是通过在色谱柱上游的系统流中包括混合器以确保在柱处接纳非均匀混合物。
评估用于系统流的配置，其中将填充有200μm氧化锆珠的50μL
混合器定位在注入阀的下游。该配置类似于提供图8中所示的结果的配置，不同之处在于毛细管具有100μm的内径。图9是评估结果的图形表示。曲线70、72、74和76的注入阀定时分别与图8的曲线60、62、64和66中的定时相同。可以看出，混合器的存在造成每个曲线中的信号纹波的显著减小，这对应于样品塞与流动相塞的基本上不均匀的混合。
在单独评估中，50μL
混合器直列地在注入阀与2.1mm×50mm CHS C18 1.7μm色谱柱之间使用。样品包括在100μL样品体积中溶解在67％乙腈中的五种烷基苯酚。操作注入阀以在3.0s的完整循环时间内提供0.5s持续时间的样品塞，从而产生6的稀释比。因此，稀释液中的乙腈浓度有效地降低到11.2％。图10示出了所得的色谱图。虽然最少保留的峰A表现出某些部分加宽，但是其他峰B、C、D和E是明确地限定的，并且色谱图80表示相对于图3B的色谱图26的大量改进，其中使用类似的配置和样品体积而没有进行样品稀释。图10中的峰表现出峰高比图3B中的峰高提高了至少三倍至多达二十倍。
图11示出了在对四种药物的LC分析中获得的结果：柚皮苷、利血平、萘普生和苯基丁酮，其对应于三个色谱图82、84和86中的峰A、B、C和D。将药物溶解在67％乙腈的样品溶剂中，总样品体积为100μL，并且使用2.1mm×50mm CSH C18 1.7μm色谱柱执行分离。对于UV检测器信号，在相同的竖直标度上示出色谱图82、84和86；然而，为了方便比较，每个色谱图相对于其他色谱图竖直地移位。
在不使用混合器的情况下单次注入100μL样品产生具有最小峰高和最宽峰宽的色谱图82。直列地在注入阀与色谱柱之间加入50μL
混合器以执行第二次注入，从而产生色谱图84，其中峰高略有改进，并且峰宽减小；然而，存在显著的峰失真。使用混合器执行第三次注入，并且通过注入22个增量体积的样品来实现6的稀释比，使得向柱的头部提供在11.2％乙腈浓度下600μL体积的有效稀释样品注入，并且产生具有明确地限定的峰的色谱图86。由于在单环路注入中的弱保留的柚皮苷的样品穿透，前两个色谱图82和84中对应于柚皮苷的峰的面积分别仅为针对增量体积样品注入的第三色谱图86中的对应的峰的面积的5％和20％。
在上述实施方案中，在注入阀处形成样品和流动相的交替的流体塞。或者，可以在样品针中形成交替的流体塞。随后，通过将针重新配置为系统流路的一部分或通过将流体塞的堆叠递送到样品环路以等待注入到系统流路中来将针中的流体塞的所得堆叠引入色谱系统内的流动相流中。
图12是用于稀释色谱系统的样品的方法200的实施方案的流程图表示并且图13是被配置为实践方法200的LC系统90的实施方案的框图。与图6的系统40中所示的那些类似的部件用类似的参考标号表示。在该实施方案中，从样品源或样品瓶90获得样品，并且使用样品针94从稀释剂源或稀释剂瓶92获得稀释剂。样品针控制器96与控制模块52通信，控制模块52发出控制信号或命令以将样品针94移入和移出样品瓶90和稀释剂瓶92，并且从对应的瓶中采集一定体积的样品和稀释剂。
根据方法200，将样品针94移动(步骤210)到样品瓶90，并且采集增量体积VS的样品的流体塞(步骤220)。将样品针94从样品瓶90取出并移动(步骤230)到稀释剂瓶92，其中采集增量体积VD的稀释剂的流体塞(步骤240)。重复步骤210至240，使得样品针94以交替的方式移动到样品瓶90并且然后移动到稀释剂瓶92，使得获得交替的样品流体塞和稀释剂流体塞的堆叠(或系列)，直到(如步骤250所确定)堆叠含有总体积的样品。因此，样品以与上文关于图4的方法100所述的方式类似的方式进行稀释，不同之处在于在色谱系统中与流动相流分开地形成堆叠。方法200根据以下比率实现有效样品稀释
(VS+VD)/VS。
举例来说，具有可被控制以实现上述样品针操作的自动化执行的样品针的样品管理器包括
2695样品管理器和
FTN，两者都可得自Waters Corporationof Milford，Massachusetts(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司)。
可以以不同的方式将流体塞的堆叠插入流动相流中。例如，流动相的流路可以由注入阀88重新配置(步骤260)以流过样品针94。以此方式，将流体塞的堆叠从针94朝向色谱柱48推出。在替代示例中，流体塞的堆叠可以装载到联接到注入阀88的样品环路98中以等待注入流动相中。
在上述各种实施方案中，通过循环注入阀或通过以交替的方式将流体塞从样品源和稀释剂源装载到样品针中在注入位置处由一系列交替的样品流体塞和稀释剂流体塞形成稀释样品。作为另外一种选择，可以形成没有离散流体塞的稀释样品，并且然后将其递送到联接到注入阀的样品环路，以等待注入LC系统流中，如下所述。
图14是用于将稀释样品注入色谱系统流中的方法300的实施方案的流程图表示，并且图15是被配置为实践方法200的LC系统150的实施方案的框图。LC系统150包括与图6的LC系统40类似的部件；然而，样品不直接地供应到注入阀88。相反，样品注射器152和稀释剂注射器154联接到T形流体管(组合器)156的两个入口，并且T形流体管156的出口连接到注入阀88上的端口。另外，提供保持元件(在此示为保持环路158)以在注入之前储存稀释样品。根据方法300，样品注射器152以第一流速FS提供(步骤310)待稀释的样品流，并且稀释剂注射器154以第二流速FD提供(步骤320)稀释剂流。两个流在T形流体管156处合并(步骤330)以形成稀释样品，该稀释样品流向联接到注入阀88的端口的保持环路158并储存(步骤340)在其中以等待注入。通常，保持环路158将具有比常规样品环路显著更大的体积，以适应显著更大的体积的稀释样品。稀释样品可以在低压下部分地填充或完全地填充保持环路158的体积，其中从环路158排出的任何液体流向废料。在替代实施方案中，保持元件是捕集柱，其可以用于代替保持环路158。
方法300根据以下比率实现样品稀释
(FS+FD)/FS。
样品稀释在相对于色谱流的低压下发生，由此消除对注射器152和154在高压下操作的要求，同时利用注射器152和154准确地递送特定体积的样品和稀释剂的能力。其他益处包括降低的可压缩性和减少的因较低压力操作造成的泄漏。
一旦将所期望的体积的稀释样品储存在保持环路158中，就可以将稀释样品注入(步骤350)LC系统流中，并且使用梯度流动相执行分离(步骤360)。
为了避免大的梯度延迟，LC系统150可以包括两个或更多个保持环路，每个环路具有不同体积。因此，可以根据所期望的稀释样品体积选择特定环路。这避免了单个保持环路的缺点，在单个保持环路中，保持环路的整个体积产生系统流路中的额外体积，从而造成大的梯度延迟。例如，可以根据特定的稀释比来确定所选择的保持环路。作为非限制性示例，保持环路可以具有几微升或更小至一毫升或更多的体积，使得能够注入未稀释的较小体积样品以及较大体积稀释样品。有利地，较小体积环路避免本来在使用较大体积保持环路的分离开始时将会发生的延迟。
作为使用多个保持环路的替代形式，可以执行逆流注入以防止将保持环路的全部体积引入LC系统流中。该技术涉及使稀释样品流入保持环路中，该保持环路可以具有显著大于被储存的稀释样品的体积的体积。为了在不注入保持环路的全部体积的情况下注入一定体积的稀释样品，阀可以被配置为使保持环路中的液体在与用于装载环路的流动方向相反的方向上移位。这允许稀释样品从其最初装载的同一端部离开保持环路。在经过足够的时间来确保样品体积从保持环路中移位并注入之后，重新配置阀以使保持环路离开活动流路，并且将由高压溶剂递送系统产生的梯度流动相引导到柱，绕过保持环路体积。
将认识到，注射器152和154可以以交替的方式操作，使得将类似于图5A中所示的那些的离散流体塞递送到保持环路158。与上述样品和稀释剂的连续流不同，样品流和稀释剂流分别包括样品和稀释剂的离散流体塞，并且离开T形流体管156的合并流包括样品和稀释剂流体塞的时间上交错的组合。在该配置中，流速与由注射器提供流体塞的速率与每个流体塞中的液体体积的乘积成比例。可以在注入阀88上游的合并流体的流路中设有混合器，但是在足够小的体积的流体塞的情况下可以省略混合器。
与其中稀释剂一般为弱流动相的高压稀释不同，通过操作两个注射器实现的稀释在稀释剂的类型方面具有提高的灵活性。注射器152或154可以抽出任何用户供应的稀释剂以用于样品稀释。
如本领域的技术人员将理解，本发明的各方面可以体现为系统、方法或计算机程序产品。因此，本发明的方面可以采取以下形式：完全硬件实施方案、完全软件实施方案(包括固件、驻留软件、微代码等)或结合软件和硬件方面的实施方案，所有这些实施方案在本文中可统称为“电路”、“模块”或“系统”。此外，本发明的方面可以采取计算机程序产品的形式，所述计算机程序产品体现在具有在其上体现的计算机可读程序代码的一个或多个计算机可读介质中。
可以利用一个或多个计算机可读存储介质的任何组合。计算机可读存储介质可以是例如，但不限于电子、磁性、光学、电磁、红外或半导体系统、设备或装置，或者前述项的任何合适的组合。计算机可读存储介质的更特定的示例(非详尽性列表)包括以下各项：具有一个或多个导线的电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪速存储器)、光纤、便携式压缩盘只读存储器(CD-ROM)、光学存储装置、磁性存储装置或前述项的任何合适的组合。如本文所用，计算机可读存储介质可以是任何有形介质，所述有形介质可以含有或存储供指令执行系统、设备或装置使用或结合指令执行系统、设备或装置使用的程序。
体现在计算机可读介质上的程序代码可以使用任何适当的介质进行传输，任何适当的介质包括但不限于无线、有线线路、光纤电缆、RF等，或者前述项的任何合适的组合。用于执行本发明的各方面的操作的计算机程序代码可以用一种或多种编程语言的任何组合来编写，所述编程语言包括面向对象的编程语言诸如Java、Smalltalk、C++等，以及常规过程编程语言诸如“C”编程语言或类似的编程语言。
以上参考根据本发明的实施方案的方法、设备(系统)和计算机程序产品的流程图和/或框图来描述本发明的各方面。将理解，可以通过计算机程序指令来实施流程图和/或框图中的每个框，以及流程图和/或框图中的框的组合。这些计算机程序指令可以被提供到通用计算机、专用计算机的处理器，或其他可编程数据处理设备，以产生机器，使得经由计算机的处理器或其他可编程数据处理设备执行的指令形成用于实施一个或多个流程图框和/或一个或多个框图框中指定的功能/动作的手段。
这些计算机程序指令还可以存储在计算机可读存储介质中，计算机可读存储介质可以指示计算机、其他可编程数据处理设备或其他装置以特定的方式运行，使得存储在计算机可读介质中的指令产生包括实施一个或多个流程图框和/或一个或多个框图框中指定的功能/动作的指令的制品。
计算机程序指令还可以加载到计算机、其他可编程数据处理设备或其他装置上，以使一系列的操作步骤在计算机、其他可编程设备或其他装置上执行来产生计算机实施的过程，使得在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实施一个或多个流程图框和/或一个或多个框图框中指定的功能/动作的过程。
虽然已经参考特定的优选的实施方案示出和描述了本发明，但是本领域的技术人员应理解，在不脱离如以下权利要求书限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
Claims (13)
1.一种用于在注入色谱系统流中时稀释样品的方法，其包括：a)将增量体积的样品注入色谱系统流中，所述样品包括溶解在溶剂中的至少一种分析物；b)将增量体积的流动相提供到色谱系统流中；和重复步骤a)和b)，直到将总体积的储存样品注入色谱系统流中，其中注入样品的稀释比等于样品的增量体积和流动相的增量体积的总和除以样品的增量体积的总和。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)和b)通过控制与样品环路和流动相源连通的注入阀来执行。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括在将所述增量体积的样品第一次注入到所述色谱系统流中之前，将总体积的所述样品装载到所述样品环路中。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品的增量体积与注入持续时间成比例，并且其中所述流动相的增量体积与在所述增量体积的样品的连续注入之间的时间成比例。
5.根据权利要求1所述的方法，其中将所述增量体积的样品注入到所述色谱系统流中持续第一持续时间，并且将所述增量体积的流动相提供到所述色谱系统流中持续第二持续时间。
6.根据权利要求5所述的方法，其中注入样品的稀释比等于第一持续时间和第二持续时间的总和除以第一持续时间的总和所得值的总和。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，注入样品的稀释比等于注入阀的循环的第一持续时间和第二持续时间之和除以注入阀的循环的第一持续时间。
8.根据权利要求1所述的方法，其还包括在将总体积的储存样品注入到色谱系统流中之后，将梯度流动相提供到色谱系统流中。
9.一种用于稀释色谱样品的设备，其包括：注入阀，该注入阀被配置为接纳流动相流和总体积的样品，注入阀还被配置为根据注入阀的状态来将所述流动相和所述样品中的一种提供到系统流；和与注入阀连通的控制模块，所述控制模块产生信号以将注入阀的状态控制于以下状态中的一个：第一状态，其中样品被注入系统流中；和第二状态，其中流动相被提供到系统流，所述控制模块还控制处于第一状态的持续时间，其中增量体积的样品被注入系统流中，并且控制处于第二状态的持续时间，其间增量体积的流体相被提供到系统流中，并在第一状态和第二状态之间反复切换，由此在注入时产生稀释样品。
10.根据权利要求9所述的设备，其中，所述稀释样品的稀释比等于所述样品和流动相的增量体积之和除以所述样品的增量体积之和。
11.根据权利要求9所述的设备，其中，所述稀释样品的稀释比等于所述注入阀的循环的第一状态和第二状态的持续时间之和除以所述注入阀的循环的第一状态的持续时间。
12.根据权利要求9所述的设备，还包括与所述注入阀的输出流体连通的混合器。
13.根据权利要求9所述的设备，还包括与所述注入阀流体连通并被配置为保持总体积的样品的样品环路。
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