CN114854830A - 一种核酸恒温扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸恒温扩增方法，所述方法包括如下步骤：1)核酸提取：样品放入裂解液中，提取核酸得到核酸提取液；2)恒温扩增：核酸提取液加入恒温扩增液中进行恒温扩增，扩增温度50‑70℃，扩增时间20‑30min；所述恒温扩增液中含Bst DNA聚合酶，或Bst DNA聚合酶以及M‑MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶和Rnase H核酸内切酶中的一种或多种。本发明方法成本低，且极大提高了扩增的特异性，提高了扩增温度，缩短了扩增时间，且灵敏度并没有降低。

Description

一种核酸恒温扩增方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体是一种恒温扩增核酸的方法。

背景技术

核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，自1869年被人类首次发现以来，许多研究者在核酸的提取方法上进行了不懈的探索，对核酸提取的各种材料和试剂进行了改进，十二烷基磺酸钠、酚、脲、盐酸胍等各种各样的化学试剂被纷纷应用到核酸提取实验中。然而，传统的核酸提取技术中所包含的沉淀和离心等操作需要用到大量的生物样本，而且传统提取技术步骤较为繁杂，费时长，收率低，很难实现自动化操作，大部分方法还需要操作人员直接接触有毒的化学试剂，因此，随着分子生物学以及高分子材料学的快速发展，传统的从液相系统中分离提取核酸的方式逐渐被以固相吸附物载体为基础的新方法所取代。这类新兴的核酸分离提取方法主要包括：旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法、纳米磁珠提取法等。不管是采用具体的哪种方法来分离和提取核酸，总的来说，这类方法的操作步骤主要可以分为三个部分，第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的载体上，并且这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，而对其他的生化组分如蛋白质、多糖、脂类不能具有亲和力和吸附力。第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。离心柱法提取核酸曾经应用得很普及，市场上的多数质粒DNA提取试剂盒都是在离心柱法的基础上发展而来的。该方法采用特殊的硅基质吸附材料，特点是：高盐酸性缓冲液存在时可特异性吸附DNA，除去RNA与蛋白质等不能结合的杂质，而低盐碱性缓冲液可洗脱结合在吸附柱上的DNA，然而这种方法的缺点是样本需求量大，耗费样品较多，对于某些珍稀样本其应用受到很大的局限，同时离心柱法提取核酸需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，特别是在基因诊断、突发疫情的监测和控制等领域，使用离心柱法提取核酸需要大量的操作人员及仪器设备才能满足需求。

目前有很多针对病毒的一步法核酸提取方法，如CN107058288A、CN107267667A、CN111607591A等等。这些已经报道的一步法核酸提取方法具有如下缺点：1)只针对病毒这种结构简单容易裂解的样本，或2)需要加热，如95℃10min，或3)加入裂解液后需要离心，取上清进行扩增检测，或4)需要对样品做个前处理，比如稀释，或5)裂解液成分复杂，一是成本高，二是可能会对后续的核酸扩增有抑制作用。

目前实现核酸扩增和检测的方法很多，市场上应用较多的是实现DNA扩增和检测的方法—PCR(即聚合酶链式反应)以及实现RNA扩增和检测的方法--NASBA或SAT。

其中，PCR是目前核酸扩增方法中最稳定，使用最多的一种核酸扩增方法。但也有一定的缺点：一、PCR检测的灵敏度低，且需要借助成本极高的热循环仪，扩增时间较长；二、在进行对RNA病毒的相关检测时，需要加入除了Taq DNA聚合酶以外的另外一种酶--反转录酶，RNA模板需要在反转录酶的作用下先反转录从cDNA，再合成双链DNA，才能在Taq酶的作用下开启PCR反应。反转录酶目前市面上使用较多的是AMV和M-MLV，无论是那种反转录酶，其成本都比Taq酶高很多；三、PCR的扩增时间长，使用常规酶的话，完成一次检测反应需要的扩增时间是60分钟左右，使用快速酶并配合升降温速率极高的热循环仪，完成一次核酸检测反应需要的扩增时间一般大于30分钟。所以对于PCR来说，不管是仪器还是扩增所需的酶，成本都相对较高，并且扩增周期长，检测灵敏度相对偏低。

由于PCR扩增技术对仪器设备要求较高，通常需要较高的成本，因此一系列核酸恒温扩增技术被开发出来，比如，环介导等温扩增技术(LAMP)、链置换扩增技术(SDA)、环型DNA结合的滚环扩增技术(RCA)、Qβ复制技术、核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术Helicase-Dependent Amplification(HDA)、多重置换扩增(multipledisplacement amplification，MDA)，等等。

现有技术存在的不足(核酸扩增)：PCR的灵敏度低，且需要借助成本极高的热循环仪，扩增时间较长；LAMP和NASBA可以在恒温条件下对核酸进行扩增和检测，不需要热循环仪。但NASBA需要借助3种酶，其中反转录酶的成本较高，且整个扩增反应的周期较长；而LAMP不太擅长扩增120bp以下的片段；并且NASBA和LAMP扩增两种方法对靶标基因的要求较为苛刻，引物设计难度较大，且极易出现污染和假阳性现象，错误率极高。

NASBA技术有诸多缺陷：一是需要借助多种酶，AMV、RNase H、T7 RNA聚合酶等；二是AMV不易体外合成，萃取成本较高；三是RNase H和T7的耐热性较低，须在低温下进行，对靶标基因序列要求较高，引物设计难度高，同时特异性不够好极易产生假阳性现象；四是对120-250bp的片段扩增效率较高，产物太长扩增效率急剧下降等；五是NASBA扩增方法周期极长；六是产物主要为RNA，不易用染料法进行实时检测。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种核酸恒温扩增方法，该方法成本低，且极大提高了扩增的特异性，提高了扩增温度，缩短了扩增时间，且灵敏度并没有降低，同时该扩增方法产生的扩增产物可以使用普通荧光染料，对扩增过程中产物的量进行实时监测，达到定量所扩增靶标的目的。

为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种核酸恒温扩增方法，所述方法包括如下步骤：

1)核酸提取：

样品放入裂解液中，提取核酸得到核酸提取液；

2)恒温扩增：

核酸提取液加入恒温扩增液中进行恒温扩增，扩增温度50-70℃，扩增时间20-30min；

所述恒温扩增液中含Bst DNA聚合酶，或Bst DNA聚合酶以及M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶和Rnase H核酸内切酶中的一种或多种；酶量为8-30U。

优选地，当采用单酶反应时，本发明所采用的酶可以是Bst DNA聚合酶，即单独只有Bst DNA聚合酶可以反应，8U Bst DNA聚合酶/20ul反应体系。

当采用二酶反应时，本发明所采用的酶可以是Bst DNA聚合酶+M-MLV逆转录酶，或Bst DNA聚合酶+AMV逆转录酶；也按照单酶反应原理反应，只是加了一种逆转录酶后，对于RNA模板的扩增效率更高；8U Bst DNA聚合酶+20U逆转录酶/20ul反应体系。

当采用三酶反应时，本发明所采用的酶可以是：Bst DNA聚合酶+T7 RNA聚合酶+RNase H。按照三酶反应原理进行反应。

本发明中，单酶Bst DNA聚合酶的功能可以由2种酶代替：Phi29 DNA聚合酶+M-MLV逆转录酶，或Phi29 DNA聚合酶+AMV逆转录酶，但Bst DNA聚合酶被Phi29 DNA聚合酶代替后，反应温度需要降到30℃，特异性会变差。

本发明中，所述恒温扩增液中还含有Tris-HCl 20～40mM，pH＝8～8.5；KCl10～20mM；NaCl 5～10mM；MgSO₄ 15～20mM；dNTP 1～4mM；NTP 2～4mM；0.5～1.0M甜菜碱。

优选地，所述恒温扩增液中还含有Tris-HCl 25mM，pH＝8.5；KCl 20mM；NaCl10mM；MgSO₄ 20mM；dNTP 2mM；NTP 4mM；0.8M甜菜碱；引物。

本发明中，所述裂解液包括缓冲液以及添加剂。

优选地，所述缓冲液为0.85～0.9％生理盐水、PBS缓冲液和Tris缓冲液中的一种或多种。本发明中的缓冲液均可采用本领域的公知标准配方。

优选地，所述PBS缓冲液组成为：0.2M KH₂PO₄和0.2M Na₂HPO₄，按照一定比例配成，PH＝7.0～8.0。

所述的Tris缓冲液组成为：Tris浓度5～30mM。

优选地，所述添加剂为NP-40(乙基苯基聚乙二醇)、Tween 20、Triton X 100和EDTA中的一种。如0.1～1％NP-40或Tween 20或Triton X 100；5～30mM的EDTA。

本发明的扩增反应体系可以是如下：

Tris-HCl 20-40mM，pH＝8-8.5；KCl 10-20mM；NaCl 5-10mM；MgSO₄ 15-20mM；

DTT 5-12mM；dNTP 1-4mM；NTP 2-4mM；适量BSA、DMSO、Tween 20、海藻糖、甜菜碱等。

本发明中，Bst DNA聚合酶可以购买得到。可以使用具有反转录酶活性的Bst DNA聚合酶，如新海基因Bst 4.0DNA/RNA聚合酶，先达基因RT-Bst LAMP MasterMix，也可以使用市面上其他有同等功能的Bst DNA聚合酶。该酶在60-65度之间具有很好的反转录活性，可有效解决具有二级复杂结构的RNA模板的反转录。同时该酶具有很强的链置换能力，酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高。

T7 RNA聚合酶：购买得到，比如NEB Hi-T7耐热RNA聚合酶(货号：M0470T)，也可以使用市面上其他有同等功能的T7 RNA聚合酶。

酶的性能：Hi-T7耐热RNA聚合酶使用T7噬菌体启动子进行体外转录；使用帽类似物时，提高共转录的加帽效率；减少了dsRNA副产物的形成，从而使高温合成RNA的免疫原性降低；适合在较高温度下进行体外转录，在37-56℃有活性。

该酶的反转录效率高于AMV和M-MLV反转录酶；且该酶对高温的耐受性更高，在56℃高温下依然有很高的反转录活性。

RNase H：购买得到，比如NEB耐热RNase H(货号：M0523S)，也可以使用市面上其他有同等功能的酶。

酶的性能：耐热RNase H特异性识别并切割RNA-DNA杂交体中RNA序列的磷酸二酯键，同时保持DNA序列完整。这种热稳定的核酸酶具有与大肠杆菌RNase H相同的酶学性质，但在更高的温度下具有活性。该酶对高温的耐受性更高，可以在50℃下反应，且活性很高。

本发明快速核酸提取裂解液配方：

1)缓冲体系可以选用以下缓冲液：

DNase/RNase Free H₂O水；0.85～0.9％生理盐水；PBS缓冲液；Tris缓冲液。

所述的PBS缓冲液：0.2M KH₂PO₄，0.2M Na₂HPO₄，按照一定比例配成缓冲液，PH＝7.0～8.0。

所述的Tris缓冲液配方：Tris浓度5～30mM。

2)添加剂选自以下物质：

1)不同浓度的去污剂，如0.1～1％NP-40(乙基苯基聚乙二醇)或Tween 20或Triton X 100；

2)5～30mM的EDTA。

与现有的扩增方法原理不同之处在于：

如图2和图3，本发明使扩增反应进入多个扩增循环；该扩增技术使用了一种新的酶组合方式，利用多种酶不同的活性，完成同一个扩增反应，使反应更快，灵敏度更高；该扩增技术使用的多种酶都是耐高温的酶，能够保证扩增反应的特异性，并且对于不同GC含量的靶标都能高效的扩增。

本发明对酶的种类和配比以及反应体系及配方进行了设计，采用的酶具有多种功能，且耐热，因此扩增时不挑靶标，引物易于设计，且灵敏度更高，特异性更强，且扩增时间短；检测方法可以有多种选择：实时检测的多种方法及重点法检测的多种方法。可以配套的核酸扩增体系。

本发明的恒温扩增方法具有如下优点：

1)在恒温条件下进行，不需要借助昂贵的热循环仪，原理简单，反应过程简单且实用；

2)扩增温度可以为50-70℃之间，根据检测靶标及引物退火温度不同，可以在不同扩增温度进行扩增，实现高灵敏度和高特异性，扩增反应温度较高，完美解决低温下特异性不好的问题；

3)酶试剂成本低，可以是单酶进行扩增，也可以2～3种酶配合完成；该扩增方法涉及1种或2种或3种酶，根据使用方法而定，其中一种酶Bst DNA聚合酶具有反转录酶活性及DNA聚合酶活性，T7 RNA聚合酶为耐高温酶，其反应温度提高到60℃左右；优选地，只需要一种价格很低的聚合酶就能完成所有反应，不需要额外的反转录酶先对RNA进行反转录；

4)可以对DNA模板进行扩增也可以对RNA模板进行扩增，对RNA模板的扩增效率更高；该扩增方法对靶标的GC含量，Tm值，长度等无特殊要求；

5)扩增效率比常规的PCR反应高，并且该方法可以通过引物的特殊设计，实现更高效的扩增效率；该扩增方法对引物的设计要求较低，不像NASBA扩增和LAMP扩增一样特殊区段不能设计或设计难度高；

6)扩增周期极短：扩增时间在30分钟以内，优选只需要20-30分钟，通常只需要8～16分钟就能完成整个扩增过程。

7)产物量可用多种荧光染料染色后成像；可以实时监测，也可以用终点法进行检测；

8)该扩增方法可以借助探针或分子信标等方法实现多重扩增和检测；

本发明包含的快速核酸提取方法有如下特点：1)除了病毒外，还可以裂解和提取细胞核酸(组织细胞或者培养细胞，组织块需要提前研磨)；2)除了提取RNA外，还可以提取DNA；3)不需要加热；4)裂解时间短(对于拭子样品，只需要顺时针旋转3下，逆时针旋转3下)；5)裂解后不需要离心，可以直接取裂解液进行核酸检测；6)不影响扩增，甚至利于扩增，裂解液可以直接溶解冻干的扩增球，不需要额外加水，且对核酸扩增反应无抑制；7)样本不需要稀释；8)裂解液成分简单易配，成本低；9)可配套使用的扩增体系包含本发明所述的扩增方法及PCR、qPCR。

跟NASBA技术的区别如下：

1)酶不同。NASBA必须是3种酶，AMV，RNase H，T7，缺一不可。而本发明是单酶BstDNA聚合酶，或者二酶(Bst DNA聚合酶+M-MLV逆转录酶，或Bst DNA聚合酶+AMV逆转录酶)，或者三酶(Bst DNA聚合酶+T7 RNA聚合酶+RNase H)。

2)模板不同。NASBA扩增只对RNA有好的扩增效果，而对DNA扩增效率很低。而本发明对RNA及DNA的扩增效果都很好。

3)反应原理不同。本发明在于Bst DNA聚合酶及配合其他酶之后多种酶的组合反应以及引物的巧妙设计。Bst DNA聚合酶的反应原理与AMV是截然不同的，Bst DNA聚合酶具有链置换功能，以及反转录的功能，只是单酶就可以实现极高的扩增灵敏度。在配合多酶及多引物组合后，可以实现更快的扩增。

4)反应温度不同。AMV逆转录酶的耐热性差，NASBA只能在42℃及以下反应，对于GC含量稍高的基因，引物难以设计，扩增的灵敏度很低，特异性也不好。而本发明可以在50℃或更高的温度进行反应，扩增灵敏度及特异性不因靶标基因GC含量高或者低而受影响。

5)对扩增模板的要求不同。扩增靶标GC含量高或者低都可进行高效准确的检测。

附图说明

图1是单酶(Bst DNA聚合酶)的反应原理图；

图2是反应体系中Bst DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶同时存在时反应原理图；

图3是反应体系中Bst DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、RNase H都存在时反应原理图；

图4是实施例1荧光强度随时间变化的曲线图；

图5是实施例1对照组荧光强度随时间变化的曲线图；

图6是实施例1荧光强度随时间变化的曲线图；

图7是实施例1对照组荧光强度随时间变化的曲线图；

图8是实施例2荧光强度随时间变化的曲线图；

图9是实施例2对照组荧光强度随时间变化的曲线图；

图10是实施例3荧光强度随时间变化的曲线图；

图11是实施例3对照组荧光强度随时间变化的曲线图。

具体实施方式

下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明的扩增反应流程如下：

一、单酶反应：Bst DNA聚合酶

Bst DNA聚合酶具有反转录功能、DNA聚合酶功能及链置换功能。如图1所示，首先，该酶具有反转录酶的活性，可以以RNA为模板进行反转录，得到cDNA序列，酶链置换的活性伴随反转录，即在同一条序列上设计多条反转录引物的情况下，多条引物可以同时进行反转录，并且可以进行链置换功能，把已经完成反转录的cDNA序列从RNA模板上置换下来，方便后续的引物结合和反转录。其次，该酶具有5’-3’DNA聚合酶活性，可以以cDNA为模板合成互补链，形成双链，同样的链置换活性可支持多条引物同时结合模板进行扩增。

二、二酶反应：Bst DNA聚合酶及T7 RNA聚合酶

如图2所示，引物有2条，与普通PCR引物设计方法一致，只是都在5’端加了T7promoter序列。首先，其中一条引物与RNA链结合，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸形成cDNA，另一条引物与cDNA结合，形成两端都带有T7 promoter双链的dsDNA，然后T7 RNA聚合酶识别T7 promoter双链，以dsDNA为模板，形成正链或负链RNA序列，进入扩增循环。每循坏一次产物都会放大100-200倍。

三、三酶反应：Bst DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶及RNase H酶

如图3所示，引物设计：5’和3’端各2条引物，其中两端靠外的引物(引物R1和引物F1)为普通的PCR引物，靠内的引物(引物R2和引物F2)分3段，从5’到3’端依次是特定的随机序列、T7 promoter正向序列、靶标特异性序列，其中两端特定的随机序列为反向互补序列。反应原理二酶的原理类似，通过Bst DNA聚合酶形成dsDNA，再通过T7 RNA聚合酶识别T7promoter双链进行产物的放大，并形成多个反应循环，与图2不同的是，形成了一个中间产物①。

实施例1单酶反应

1)靶标：健康人口腔拭子。

模板制备方法：取装有350ul裂解液的1.5ml离心管，打开盖子，取拭子，于咽喉部反复刮取10次，将拭子投入裂解液中，顺时针转3圈，逆时针转3圈，折断拭子头，盖上管盖。取裂解液作为模板，直接进行恒温扩增。

2)靶标基因：Actin基因。

3)引物：

Actin基因引物：

引物为Actin基因上面，分别与靶标序列一致的连续的4条上游引物-F1,F2,F3,F4，以及与靶标序列反向互补的连续的4条下游引物-R1,R2,R3,R4。

4)裂解液组合如下：

0.5％Triton-X-100，其余用DEPC H₂O至350ul。

5)反应液组合如下：

Tris-HCl 40mM，pH＝8.5；KCl 10mM；NaCl 5mM；MgSO₄ 15mM；dNTP 1mM；NTP 2mM；0.5M甜菜碱；8U Bst DNA聚合酶；0.5×SYBR Green I；引物R1,R2,R3,R4,F1,F2,F3,F4各0.2uM；其余用DEPC H₂O补至20ul。

6)设置ABI QuantStudio3荧光定量PCR仪，程序：50℃10s，50℃50s(搜集荧光)，30cycles。

3次实验结果如下：

表1第1次实验结果

表2第2次实验结果

表3第3次实验结果

第1次实验结果荧光强度随时间变化的曲线如图4所示，第2次实验结果荧光强度随时间变化的曲线如图5所示，第3次实验结果荧光强度随时间变化的曲线如图6所示。

7)对照组：

同时使用qPCR金标准对同一管样品进行检测。

提取试剂：zymo R1051；

扩增试剂：全式金AQ322-01；

引物：

RP-F：AGATTTGGACCTGCGAGCG；

RP-P：5'-Cy5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3'；

RP-R：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT；

反应体系：

反应程序：

对照组实验结果荧光强度随时间变化的曲线如图7所示。

CT值分别是：27.297，27.768，27.873，28.173，28.192，28.550，27.785，27.265，27.548，26.449，26.345，27.805。

结果分析：

本发明的扩增方法比qPCR扩增方法灵敏度更高。

实施例2：

1)靶标：

健康人口腔拭子与含相应靶基因片段的SARS-COV-2假病毒混合；

模板制备方法：

取装有350ul裂解液的1.5ml离心管，打开盖子，取拭子，于咽喉部反复刮取10次，将拭子投入裂解液中，顺时针转3圈，逆时针转三圈，折断拭子头，盖上管盖。加入10ul一定浓度SARS-COV-2假病毒。取原液及稀释10倍的样品作为模板，直接进行恒温扩增，扩增温度50-70℃，扩增时间40min。

2)靶标基因(SARS-COV-2N基因)片段：

GCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGA

AATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGC

TTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAA

GC％＝103/198＝52.02％；

3)引物：

N-F1：GCCAAAAGGCTTCTACGCA；

N-R1：TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA；

N-F2：

GAGCCTTGTTGGATATAGATAATACGACTCACTATAGGGCAATCCTGCTAACAATGCT；

N-R2：

TCTATATCCAACAAGGCTCTAATACGACTCACTATAGGGAGCAGCAAAGCAAGAGCAG；

4)裂解液组合如下：

20mM Tris-HCl；

0.5％Tween 20；

其余用DEPC H₂O至350ul；

5)反应液组合如下：

Tris-HCl 25mM，pH＝8.5；

KCl 20mM；

NaCl 10mM；

MgSO₄ 20mM；

dNTP 2mM；

NTP 4mM；

0.8M甜菜碱；

12U Bst DNA聚合酶；

30U T7 RNA聚合酶；

0.5U RNase H；

0.5×SYBR Green I；

引物F1和R1各0.8mM；

引物F2和R2各1.4mM；

其余用DEPC H₂O至20ul；

6)设置ABI QuantStudio3荧光定量PCR仪，程序：50℃10s，50℃50s(搜集荧光)，40cycles。

荧光强度随时间变化的曲线如图8所示。

从图8可以看出，原液做了3个复孔，稀释10倍的样品做了3个复孔。原液CT值分别是：13.633、13.255、14.259；稀释10倍的样品CT值分别是：16.703、16.913、15.986。

7)对照组：同时使用qPCR金标准对同一管样品进行检测。

提取试剂：zymo R1051

扩增试剂：全式金AQ322-01

引物：

N-F：GCAGTCAAGCCTCTTCTCG；

N-P：5'-Fam-CATCACGTAGTCGCAACAG-BHQ2-3'；

N-R：CAAGAGCAGCATCACCGCC；

反应体系：

反应程序：

qPCR反应结果如图9所示：

从图9可以看出，原液做了3个复孔，稀释10倍的样品做了3个复孔。原液CT值分别是：19.373、19.479、19.434；稀释10倍的样品CT值分别是：22.765、23.131、23.078。

结果分析：实施例1扩增的靶标序列GC含量为52.02％，中等偏上。从结果看，本发明的扩增方法比qPCR扩增方法灵敏度更高。

实施例3：

1)靶标：

健康人口腔拭子与含SARS-COV-2S基因片段的体外转录产物混合；

模板制备方法：

取装有350ul裂解液的1.5ml离心管，打开盖子，取拭子，于咽喉部反复刮取10次，将拭子投入裂解液中，顺时针转3圈，逆时针转三圈，折断拭子头，盖上管盖。加入10ul一定浓度SARS-COV-2S基因体外转录产物。取原液及稀释10倍的样品作为模板，直接进行恒温扩增，扩增温度50-70℃，扩增时间40min。

2)靶标基因(SARS-COV-2S基因)片段：

TATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGA

ACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTT

ATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAA

CCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACC

CTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACT

TTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTT

TTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATT

ATTCT

GC％＝183/489＝37.42％；

3)引物：

N-F1：TATTCTAAGCACACGCCTA；

N-R1：AGAATAATCAGCAACACAG；

N-F2：

GAGCCTTGTTGGATATAGATAATACGACTCACTATAGGGTTAGTGCGTGATCTCCCTC；

N-R2：

TCTATATCCAACAAGGCTCTAATACGACTCACTATAGGGTTGCTGATTCTCTTCCTGT；

4)裂解液组合如下：

20mM Tris-HCl；

0.5％Tween 20；

用DEPC H₂O补至350ul；

5)反应液组合如下：

Tris-HCl 25mM，pH＝8.5；

KCl 20mM；

NaCl 10mM；

MgSO₄ 20mM；

dNTP 2mM；

NTP 4mM；

0.8M甜菜碱；

12U Bst酶；

30U T7 RNA聚合酶；

0.5U RNase H；

0.5×SYBR Green I；

引物F1和R1各0.8mM；

引物F2和R2各1.4mM；

其余用DEPC H₂O补至20ul。

6)设置ABI QuantStudio3荧光定量PCR仪，程序：50℃10s，50℃50s(搜集荧光)，40cycles。

荧光强度随时间变化的曲线如图10所示。

如图10所示，原液做了3个复孔，稀释10倍的样品做了3个复孔。原液CT值分别是：13.934、14.860、14.980；稀释10倍的样品CT值分别是：20.088、19.493、20.520。

7)对照组：同时使用qPCR金标准对同一管样品进行检测。

模板：与MAP方法一样的模板；

扩增试剂：全式金AQ322-01

引物：

S-F：GCACTTGACCCTCTCTCAG；

S-P：5'-Fam-TTTAGAGTCCAACCAACAG-BHQ2-3'；

S-R：GATGCAAATCTGGTGGCGT；

反应体系：

反应程序：

qPCR反应结果如图11所示：

从图11可以看出，原液做了3个复孔，稀释10倍的样品做了3个复孔。原液CT值分别是：17.855、19.147、18.498；稀释10倍的样品CT值分别是：20.572、21.058、21.423。

结果分析：实施例3扩增的靶标序列GC含量为37.42％，较低。从结果看，本发明扩增方法比qPCR扩增方法灵敏度更高。

说明本申请的扩增效率不受靶标GC含量影响。

本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。

本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 北京谊安和景生物科技有限公司

<120> 一种核酸恒温扩增方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 198

<212> DNA

<213> SARS-COV-2 N基因(SARS-COV-2 N Gene)

<400> 1

gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt caagcctctt ctcgttcctc 60

atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc agcagtaggg gaacttctcc 120

tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct ttgctgctgc ttgacagatt 180

gaaccagctt gagagcaa 198

<210> 2

<211> 489

<212> DNA

<213> SARS-COV-2 S 基因(SARS-COV-2 S Gene)

<400> 2

tattctaagc acacgcctat taatttagtg cgtgatctcc ctcagggttt ttcggcttta 60

gaaccattgg tagatttgcc aataggtatt aacatcacta ggtttcaaac tttacttgct 120

ttacatagaa gttatttgac tcctggtgat tcttcttcag gttggacagc tggtgctgca 180

gcttattatg tgggttatct tcaacctagg acttttctat taaaatataa tgaaaatgga 240

accattacag atgctgtaga ctgtgcactt gaccctctct cagaaacaaa gtgtacgttg 300

aaatccttca ctgtagaaaa aggaatctat caaacttcta actttagagt ccaaccaaca 360

gaatctattg ttagatttcc taatattaca aacttgtgcc cttttggtga agtttttaac 420

gccaccagat ttgcatctgt ttatgcttgg aacaggaaga gaatcagcaa ctgtgttgct 480

gattattct 489

Claims (6)

1.一种核酸恒温扩增方法，所述方法包括如下步骤：

1)核酸提取：

样品放入裂解液中，提取核酸得到核酸提取液；

2)恒温扩增：

核酸提取液加入恒温扩增液中进行恒温扩增，扩增温度50-70℃，扩增时间20-30min；

所述恒温扩增液中含Bst DNA聚合酶，或Bst DNA聚合酶以及M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶和Rnase H核酸内切酶中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的核酸恒温扩增方法，其特征在于，所述恒温扩增液中还含有Tris-HCl 20～40mM，pH＝8～8.5；KCl 10～20mM；NaCl 5～10mM；MgSO₄15～20mM；dNTP 1～4mM；NTP 2～4mM；0.5～1.0M甜菜碱。

3.根据权利要求1所述的核酸恒温扩增方法，其特征在于，所述裂解液包括缓冲液以及添加剂。

4.根据权利要求3所述的核酸恒温扩增方法，其特征在于，所述缓冲液为0.85～0.9％生理盐水、PBS缓冲液和Tris缓冲液中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的核酸恒温扩增方法，其特征在于，所述PBS缓冲液组成为：KH₂PO₄和Na₂HPO₄，pH＝7.0～8.0；

所述的Tris缓冲液组成为：Tris浓度5～30mM。

6.根据权利要求3所述的核酸恒温扩增方法，其特征在于，所述添加剂为NP-40、Tween20、Triton X 100和EDTA中的一种。

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