CN114854596B - 高产蛋白质的原始小球藻突变株及其应用 - Google Patents

高产蛋白质的原始小球藻突变株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株高产蛋白质的原始小球藻突变株，其以原始小球藻(Auxenochlorella protothecoides)的野生型作为出发材料经过诱变获得的高产蛋白质的小球藻突变株，命名为YYAM002，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.45100，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。经培养实验证实，该突变体在异养BG11培养基中，黑暗环境下通入空气培养一定时间后，细胞中蛋白质含量显著高于野生型原始小球藻，使小球藻中蛋白质含量由40.93％提高到63.49％。该突变株经过半年的连续接种传代培养，细胞中蛋白质含量没有发生明显变化，由此可以推断该突变株遗传性状相对稳定，可作为规模化生产小球藻蛋白质的优良藻种，为推进藻源蛋白质的产业化提供技术基础。

Description

高产蛋白质的原始小球藻突变株及其应用
技术领域
本发明涉及微藻生物技术领域，具体涉及一株高产蛋白质的原始小球藻Auxenochlorella protothecoides突变株及其应用。
背景技术
目前世界人口正在逐年增长，粮食需求量不断增大。为了降低碳排放量，缓解肉类短缺的问题，人们逐渐开始寻找能够替代动物肉类的替代蛋白。目前已经广泛应用的替代蛋白种类有植物基蛋白，微生物蛋白以及细胞培养蛋白。这些蛋白质能够通过培养细胞的方式获得，降低了碳排放量以及能耗，同时还具有独特的风味和营养，因此广泛受到消费者的好评。数字100市场调研公司发布的《中国植物肉市场洞察》报告显示，预计10年后全球肉类市场的规模将达到1.4万亿美元，其中替代肉类的市场占比将从目前的不到1％提升到10％，超过万亿元。随着技术进步、创新企业涌现、大公司切入市场及资本投入等利好不断兑现，替代蛋白市场规模将进一步扩大，满足大众对健康、高品质蛋白的需求。
微藻是一种广泛存在于生物圈中的单细胞低等植物，具有多种不同的种类，而不同的种类其生物质的成分及含量也各不相同。小球藻是分布最广泛的淡水绿藻之一，根据研究报道，小球藻含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质、油脂和核苷酸等营养元素，其蛋白质包含了8种必需氨基酸(EAA)，且总含量达到23.35％，氨基酸评分(AAS)为64.3，优于一般植物性蛋白源。其中原始小球藻中蛋白含量最高约45.80％，能够作为人体所需营养物质的来源。虽然原始小球藻的生物量能达到很高，接近50/L；然而，作为商业化生产应用来讲，其蛋白质含量仍偏低，这限制了从小球藻中提取蛋白质的效率和藻源蛋白商业化的单位成本效益。CN108699581A提供一种异养培养的微藻的蛋白质富集方法，其通过增加发酵培养基中的铵供应以获得大于65％的蛋白质含量的藻，但该方法完全依赖于异养培养中各种条件的严格控制，其并没有提供一种可通过简单方法培养即可获得高蛋白质含量的藻株。本发明旨在通过诱变技术对原始小球藻进行诱变育种，筛选出高蛋白含量的原始小球藻藻株，为高效生产藻类蛋白提供技术支撑。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于原始小球藻目前蛋白质含量低限制了提取效率的问题，本发明提供了一株高产蛋白质的原始小球藻Auxenochlorella protothecoides突变株，该突变株细胞中能够积累更高含量的蛋白质；该突变体是以野生型原始小球藻为出发株进行诱变和筛选获得的高产蛋白质突变株，为利用小球藻生产蛋白质提供了优良藻种，并为推进藻源蛋白质的产业化提供技术支撑。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一株高产蛋白质的原始小球藻Auxenochlorellaprotothecoides突变株，命名为YYAM002，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.45100，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。
第二方面，本发明提供一种生产藻源蛋白质的方法，所述方法为：通过培养原始小球藻Auxenochlorella protothecoides突变株YYAM002生产蛋白质。
优选地，培养方法为异养培养，培养基为异养BG11培养基，培养其中碳源包含了15-30g/L葡萄糖、2-4g/L甘氨酸和0.5-1g/L酵母提取物。
优选地，培养条件为：在25℃-35℃下，于黑暗环境下向培养基中通入0.1-0.2vvm的空气。vvm为是通气比，即每分钟通气量与培养罐中实际料液体积的比值。
优选地，培养条件为：在25℃-28℃下，于黑暗环境下向培养基中入 0.1-0.2vvm的空气，培养时间为5-7天。在该条件下培养5-7天，经取样检测，细胞内蛋白质的含量达到了约63.49％，相对野生型原始小球藻提高了约22.56％。
(三)有益效果
本发明以原始小球藻(Auxenochlorella protothecoides)的野生型作为出发材料经过诱变获得的高产蛋白质的小球藻突变株，该突变体在异养 BG11培养基中，黑暗环境下通入空气培养一定时间后，细胞中蛋白质含量显著高于野生型原始小球藻，使小球藻中蛋白质含量由40.93％提高到 63.49％。该突变株还具有培养周期短的特点，只需常温黑暗通气培养约5 天，细胞中蛋白质含量即可达到接近峰值。该突变株经过半年的连续接种传代培养，细胞中蛋白质含量没有发生明显变化，由此可以推断该突变株遗传性状相对稳定，可作为规模化生产小球藻蛋白质的优良藻种，为推进藻源蛋白质的产业化提供技术基础。
附图说明
图1为优化筛选出的3株原始小球藻突变株和野生型原始小球藻突变株的SEM图片。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明提供一种高蛋白质含量的原始小球藻(Auxenochlorellaprotothecoides)突变株，命名为YYAM002，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.45100，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。
该突变株以原始小球藻(Auxenochlorella protothecoides)野生型为出发材料，采用常温常压等离子体诱变(ARTP)技术进行原始小球藻诱变，在氦气作为保护气体的条件下处理108个细胞，处理时间10-20秒。然后在异养BG11培养基上进行筛选，并进一步通过培养验证，最终获得高蛋白含量的原始小球藻藻株。该突变株在黑暗条件下，利用异养BG11培养基并通入0.1-0.2vvm空气培养5-7天后，经取样检测，藻细胞内蛋白质的含量达到了约63.49％，相对野生型原始小球藻提高了约22.56％。该突变株的蛋白质含量在经过六个月的连续传代接种培养后没有显著的下降，由此证明该突变株具有较稳定的遗传形状，能够作为规模化生产高蛋白小球藻的藻种来源。
获得本发明原始小球藻(Auxenochlorella protothecoides)突变株 YYAM002的过程如下：
1、配制原始小球藻培养基BG11
异养的原始小球藻培养基包含KH2PO4 3.5g/L，K2HPO4 2.0g/L， MgSO4.7H2O 1.5g/L，FeSO4.7H2O 0.015g/L，维生素B1 15g/L，葡萄糖 45g/L，酵母提取物1.8g/L。另外补加6g/L的甘氨酸，经过高温高压灭菌后即可得到异养原始小球藻BG11培养基。
2、培养原始小球藻
吸取一定数量的原始小球藻细胞，加入到一定体积的BG11液体培养基中，黑暗150rpm摇床培养，最终使每毫升培养基中含有2-3×106个藻细胞。将培养物放置在黑暗的恒温摇床中，28℃，200rpm摇床培养，直到达到稳定生长期。
3、诱变和初筛
取对数生长期的原始小球藻藻液，测定其细胞密度。取1.6×103cell 采用常温常压等离子体诱变(ARTP)技术进行原始小球藻诱变，在氦气作为保护气体的条件下处理108个细胞，处理时间16秒，使其致死率在 90％左右，将藻细胞重悬并涂布到异养的BG11固体平板上，在28℃黑暗倒置培养4天，即可得到具有不同突变方向的原始小球藻单克隆。
挑取所有的单克隆到新的异养BG11固体平板上，在28℃黑暗培养4天。在超净工作台上，取若干15mL离心管，加入5mL异养液体培养基BG11，用无菌的枪头挑取所有的单克隆到液体的异养BG11培养基上并标号，在28℃、220rpm摇床黑暗培养5d。首先，吸取1mL藻液通过吸光值来检测细胞密度。其次，吸取1mL藻液，5000×g离心2min，舍弃上清，加入蛋白裂解液，室温涡旋25min。利用液氮进行反复冻融4次。室温下，10000×g离心5min，收集上清用于测定蛋白质含量。
最后，事先称量若干个1.5mL离心管的重量m1，并标记编号；吸取 1mL藻液到1.5mL离心管中，5000×g离心2min，舍弃上清，60℃烘干 24小时，冷却至室温后，称量重量m2。重量m2减去重量m1再除以1mL 即为该藻种的生物量。将计算得到的蛋白质含量分别与吸光值和生物量进行比值，再从高到底排序，由此初步筛选出10株高蛋白质含量的原始小球藻突变体候选株，分别如下表。
表1-根据蛋白质含量和吸光值的比值，筛选出5株高蛋白原始小球藻突变株，分别如下：
编号 WT 3-3 1-11 3-12 3-11 3-2
蛋白质/吸光值 3.12 4.96 4.89 4.77 4.26 4.11 
表2-根据蛋白质含量和生物量的比值，筛选出5株高蛋白原始小球藻突变株，分别如下：
编号 WT 2-7 3-1 3-12 4-3 3-4
蛋白质/生物量 0.54 2.32 2.12 1.13 0.98 0.94 
4、进一步优化筛选
为了进一步得到高产蛋白质的小球藻突变株，并对高产蛋白质的小球藻突变株进行验证，对上述10个候选藻株单位干重中蛋白质的含量进行测定，测定方法如下：
取若干个无菌的250mL通气瓶，在超净工作台上加入100mL异养培养基BG11，用无菌的中枪头挑取单克隆藻落到异养培养基BG11中，在28℃中黑暗培养5天，并通入0.1-0.2vvm的空气。培养结束后，将藻液分装到50mL离心管中，室温下，5000×g离心5分钟，舍弃上清液并收集藻细胞，用20mL去离子水洗涤藻细胞，冻干机冻干24小时。称量 20mg干燥的藻粉，加入到1.5mLEP管中，加入500uL蛋白裂解液，室温涡旋20min。在液氮中反复冻融5次，11000×g离心5min，收集上清液并利用试剂盒检测其中的蛋白质浓度并计算含量。将蛋白质含量与藻粉重量进行比值，得到突变株的总蛋白含量，如表3：
表3
编号 WT 3-2 4-3 3-12
蛋白含量(％) 40.93％ 63.49％ 51.21％ 50.60％ 
经过细胞蛋白质含量的测定，最终筛选出了3株高蛋白质含量的原始小球藻突变株，其中标号为3-2的单克隆突变体藻细胞中蛋白含量最高，将其作为目标藻株，命名为YYAM002。
如图1所示，为进一步优化筛选出的3株原始小球藻突变株和野生型原始小球藻突变株的SEM图片。
5、突变体藻种稳定性验证
该突变株YYAM002在BG11异样培养基中经过半年的连续接种传代培养，细胞中蛋白质含量没有发生明显变化，突变体细胞中蛋白质含量仍然比野生型原始小球藻高出22％以上。由此证明，该突变株YYAM002 遗传性状相对稳定，可作为规模化生产小球藻蛋白质的优良藻种，并于 2022年4月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.45100，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。由于本发明的突变体属于自然诱变获得的，不同于在国内食品行业受限制使用的转基因技术，今后在食品，饲料行业将有很好的应用前景。
需说明的是，本发明中使用的异样培养基BG11的组成各组分的含量可在如下范围内调整：异养的原始小球藻培养基包含KH2PO4 0.7-7g/L、 K2HPO4 0.3-3g/L、MgSO4.7H2O0.3-2g/L、FeSO4.7H2O 0.003-0.02g/L、维生素B1 10-20g/L、葡萄糖15-30g/L、酵母提取物0.5-1g/L、甘氨酸2-4g/L；经过高温高压灭菌后即可得到异养原始小球藻培养基。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一株高产蛋白质的原始小球藻（Auxenochlorella protothecoides）突变株，命名为YYAM002，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.45100，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。
2.一种生产藻源蛋白质的方法，其特征在于，所述方法为：通过培养权利要求1所述的原始小球藻（Auxenochlorella protothecoides）突变株YYAM002生产蛋白质。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养方法为异养培养，培养基为异养BG11培养基，培养基包含了15-30 g/L葡萄糖、2-4 g/L甘氨酸和0.5-1 g/L酵母提取物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养条件为：在25℃-35℃下，于黑暗环境下向培养基中通入0.1-0.2 vvm的空气。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，培养条件为：在25℃-28℃下，于黑暗环境下向培养基中入0.1-0.2 vvm的空气，培养时间为5-7天。
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