CN114847469A - 一种用于3D打印可负载虾青素的Pickering高内相乳液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于3D打印可负载虾青素的Pickering高内相乳液的制备方法，属于食品工业领域。本发明的步骤如下，包括S1：以海鲈鱼为原料提取海鲈鱼蛋白；S2：将海鲈鱼蛋白溶液进行热交联、酶交联，然后依次进行高速剪切和高压均质，得到海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液；S3：将步骤S2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒与食用油混合后进行剪切乳化，获得稳定的Pickering高内相乳液。本发明无需任何表面活性剂，生物安全性好、生物相容性强。所得的Pickering高内相乳液有较强的稳定性，可有效提高对生物活性物质的保护作用；该乳液具有优异的粘弹性、自支撑性、触变恢复性，可用于3D打印食品，在新型营养物质递送体系及食品级3D打印材料应用方面具有较好的前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于3D打印可负载虾青素的Pickering高内相乳液的制备方法，属于食品工业领域。
背景技术
高内相乳液是指最小内相体积分数为0.74的超浓缩乳液，高内相乳液因其在组织工程、食品、化妆品、医药等领域的潜在应用而受到广泛关注。高内相乳液包括连续相、内相和维持乳液体系稳定性所必需的稳定剂。Pickering高内相乳液是由固体颗粒而非传统表面活性剂稳定的高内相乳液。固体颗粒不可逆地吸附在油水界面上，降低了自由能。与表面活性剂相比，所需的固体颗粒稳定剂的量较低，而由固体颗粒稳定的Pickering高内相乳液通过避免表面活性剂的副作用来优化最终产品的性能。此外，液滴被一层吸附的固体颗粒包裹，增强了Pickering高内相乳液的稳定性。因此，Pickering高内相乳液比传统乳液更能抵抗聚结、奥斯特瓦尔德熟化和相分离。Pickering高内相乳液因较高的内相使其具有更高的营养负载量，表明在作为疏水性活性物质的封装和递送系统具有很大的潜力，还可以作为膳食补充剂和营养输送系统的参考，以提高稳定性和生物可及性。此外，Pickering高内相乳液具有可调节的粘弹性，这也为功能性食品的应用提供了便利条件。
CN110498935A披露了一种大豆分离蛋白-果胶复合物稳定槲皮素的高内相乳液及其制备方法，将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，获得大豆分离蛋白溶液；将果胶溶于蒸馏水中，调节pH，获得果胶溶液；将大豆分离蛋白溶液与果胶溶液混合；调节溶液的pH为3.0～11.0；所得溶液与含槲皮素的植物油按比例混合后进行超声处理，离心后获得大豆分离蛋白-果胶复合物稳定槲皮素的高内相乳液。但是，该方法需要两步来制备Pickering高内相乳液，且没有提及是否可以用于食品工业。
近年来，3D打印食品因其能够满足各种消费者的特定需求而受到广泛关注。3D打印不仅具有引人注目的设计模型，还可用于在特定营养背景下构建具有营养成分的食品。此外，在尝试复杂的食品设计时，食品打印可以节省时间和精力。食品打印机使食品生产商能够生产出更好、更健康的食品。它还可以通过减少化学添加剂的使用量，减少浪费和过度消费来帮助解决世界粮食短缺问题，以符合食品的可持续性。此外，3D食品打印可以改变食品制造流程，减少食品浪费并改善库存控制。3D打印材料通过喷嘴挤出并通过层层沉积来生成设计的模型结构。因此，在喷嘴挤压时具有流动性以及在模型结构生成后具有自支撑性，这些因素对3D打印材料至关重要。然而，传统的3D打印产品可能缺乏生物相容性或存在潜在的安全风险，限制了其在食品行业的应用。因此，人们对开发一种基于Pickering高内相乳液的具有特定营养成分和天然材料的3D打印食品产生了极大的兴趣。
CN113306271A披露了一种用于3D打印的中高内相乳液材料及其应用，所述材料通过以下方法制备而得：1)将纤维素纳米晶体分散于含有盐的水溶液中，配置纳米材料悬浮液作为水相；2)将油水两相采用乳化方式形成乳液；3)通过离心除去乳液中多余的水分，得到中高内相乳液。但是，该方法需要分为两步来制备Pickering高内相乳液，且没有负载任何营养物质，包封效率如何是个未知数。
总的来说，制备基于Pickering高内相乳液的3D打印食品，还存在以下问题：现有的用于3D打印材料的Pickering高内相乳液多缺乏生物相容性和生物可降解性，使其具有较低的食品安全性；也没有携带能够满足人们特定营养需求的物质的Pickering高内相乳液。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是制备带有“清洁”标签的Pickering高内相乳液并作为食品级3D打印材料；该3D打印材料可负载疏水性生物活性物质满足人们对特定营养的需求。
[技术方案]
本发明提供一种提取海鲈鱼蛋白的方法，包括以下步骤：将海鲈鱼肉与水按照质量比1：(5～20)混合，在5000～20000rpm下匀浆1～5min；将所得海鲈鱼肉匀浆液调节pH至9～11，以转速100～500rpm搅拌2～4h，使蛋白在碱性环境下溶解，然后离心取上清液即获得水溶性蛋白质，将所得上清液调节pH至4～5，于2～8℃静止30～60min，使海鲈鱼蛋白析出形成沉淀，再次离心并保留沉淀物、去上清；将沉淀物冷冻干燥，得到海鲈鱼蛋白。
本发明提供一种制备用于3D打印负载虾青素的Pickering高内相乳液的方法，所得乳液可有效提高虾青素的稳定性和生物可及性，并且可应用于3D打印食品。所述方法，包括如下步骤：
S1：将海鲈鱼肉与去离子水按照质量比1：(5～20)混合，在5000～20000rpm下匀浆1～5min；将所得海鲈鱼肉匀浆液调节pH至9～11，以转速100～500rpm搅拌2～4h，离心取上清液，将所得上清液调节pH至4～5，于2～8℃静止30～60min，再次离心并保留沉淀物、去上清；将沉淀物冷冻干燥，得到海鲈鱼蛋白；
S2：将海鲈鱼蛋白溶液进行热交联、酶交联，然后依次进行高速剪切和高压均质，得到海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液；
S3：将步骤S2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液与食用油混合后进行剪切乳化，获得可用于3D打印的、可负载虾青素Pickering高内相乳液。
在某些实施方式中，S1中离心取上清液时是于8000～12000rpm离心10～60min；离心留沉淀物时是于6000～10000rpm离心10～30min。
在某些实施方式中，S2中所述热交联的温度是60～90℃、10～30min。可以选用的加热方式有水浴加热、恒温培养箱加热等。
在某些实施方式中，S2中所述酶交联是利用谷氨酰胺转氨酶催化蛋白质多肽发生分子内和分子间的共价交联，从而改善蛋白质的结构和功能。优选以10～30U/g海鲈鱼蛋白的加入量加入谷氨酰胺转氨酶后，于40～50℃进行交联反应2～6h。
在某些实施方式中，S2中所述高速剪切是指向酶交联得到的凝胶块中加入1～10倍质量的水，使用高速分散机在8000～12000rpm下剪切2～8min得到凝胶颗粒粗分散液。
在某些实施方式中，S2中所述高压均质是指将凝胶颗粒粗分散液使用高压均质机在10000～20000Psi下高压均质2～10个循环得到海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液。
在某些实施方式中，S2中配制5～20wt％的海鲈鱼蛋白溶液，搅拌溶解后，于2～8℃水合8～24h；调节pH至6～8，于60～90℃水浴10～30min；冷却至室温后，以10～30U/g海鲈鱼蛋白的加入量加入谷氨酰胺转氨酶后，于40～50℃进行交联反应2～6h，反应结束后得到凝胶块；向凝胶块中加入1～10倍的去离子水，使用高速分散机在8000～12000rpm下剪切2～8min得到凝胶颗粒粗分散液；接下来使用高压均质机在10000～20000Psi下高压均质2～10个循环得到海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液。
在某些实施方式中，S3中微凝胶颗粒分散液与食用油的体积比为4:6～1:9。
在某些实施方式中，S3中所述食用油可为玉米油、花生油、大豆油、葵花籽油的任意一种或几种的混合物。
在某些实施方式中，S3中使用的微凝胶颗粒分散液的pH调整为2～10，优选pH7～9；以海鲈鱼蛋白浓度计，微凝胶颗粒的浓度调整为0.1～10wt％，优选1～10wt％，更优选1-4wt％。
在某些实施方式中，S3中所述剪切乳化的转速为6000～12000rpm，剪切时间为1～5min。
本发明还提供制备负载了虾青素的、可用于3D打印的Pickering高内相乳液的方法，是将0.05～5％wt％的虾青素溶于食用油中，与海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液混合后进行剪切乳化，获得负载虾青素的Pickering高内相乳液。
[有益效果]
本发明使用海鲈鱼为原料，未添加任何无机材料下制备的Pickering高内相乳液生物安全性高。此外，海鲈鱼来源广泛，主要分布于太平洋西部、中国沿海及通海的淡水水体，东海、渤海较多；蛋白质含量非常丰富，脂肪含量少，是常见的海洋经济鱼类之一；所提的蛋白提取率较高，水溶性好。
本发明为了展开蛋白质构象并为酶促交联提供更多暴露的残基，先对海鲈鱼蛋白进行了热交联，此外，加热还会促进蛋白变性后凝胶化的形成。然后，本发明通过谷氨酰胺转氨酶交联海鲈鱼蛋白，从而提高蛋白质的乳化能力、凝胶能力以及热稳定性，最终制备得到海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒。
本发明用海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒作为稳定剂制备Pickering高内相乳液，该乳液具有较强的稳定性、优异的流变学性质(粘弹性)，自支撑性和触变恢复性，可作为3D打印材料，能有效保护生物活性物质。具体地，本发明用海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒作为稳定剂制备Pickering高内相乳液，在倒置后仍有自支撑力，在室温下储存80天、经过高速离心或者90℃下加热，都依然保持稳定，非常适用于3D打印，在新型营养物质递送体系及食品级3D打印材料应用方面具有较好的前景；储能模量高于损耗模量，具有凝胶状乳液的典型特征。
本发明制备的Pickering高内相乳液最高内相可达88％，可有效实现包埋疏水性功能活性物质。用于负载虾青素时，可有效提高虾青素的稳定性和生物可及性，在50℃中加热14天后，虾青素的保留水平还能达到80％以上，经紫外照射，虾青素的保留率能够达到接近90％；在模拟消化实验中，海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液应具有更高的脂解度、生物可及性。
附图说明
图1是实施例1海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒的Cryo-SEM图。
图2是实施例2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的外观图。
图3是实施例2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的Cryo-SEM图。
图4是实施例2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液于室温储存80天后的外观图。
图5是实施例2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液在8000rpm下离心10min后的外观图。
图6是实施例2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液于90℃下加热30min后的外观图。
图7是实施例2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的储能模量和损耗模量随频率变化的测量结果。
图8是实施例2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的粘度随剪切速率变化的测量结果。
图9是实施例2海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的储能模量随应力变化的测量结果。
图10是实施例3负载虾青素的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液中虾青素的包封率。
图11是实施例3负载虾青素的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液在50℃加热14天后虾青素的保留率。
图12是实施例3负载虾青素的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液在可见光/室温储存15天后虾青素的保留率。
图13是实施例3负载虾青素的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液在紫外照射30分钟后虾青素的保留率。
图14是实施例3负载虾青素的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液经过体外模拟消化实验得到的游离脂肪酸释放率。
图15是实施例3负载虾青素的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液通过体外模拟消化实验得到的生物可及性数据。
图16是实施例3负载虾青素的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液经3D打印后的外观图。
具体实施方式
虾青素包封率(％)＝(初始添加的虾青素总量-游离虾青素的量)/初始添加的虾青素总量×100％。其中，虾青素的浓度是通过萃取法获得的。简而言之，将刚制备的负载虾青素的Pickering高内相乳液在3000rpm下离心3分钟，取出含有游离虾青素的上清液与4.8mL有机试剂二氯甲烷/甲醇(2:1，v/v)混合，将样品涡旋2分钟并以8000rpm的转速离心3分钟，收集上清液。通过紫外分光光度计在480nm处测定所得上清液的吸光度，并通过虾青素的标准曲线计算虾青素的浓度。
Pickering高内相乳液的流变特性通过带有40mm平行板的流变仪测量。Pickering高内相乳液的储能模量和损耗模量随频率变化的检测方法：在0.5％的固定应变和0.1-1Hz的频率下扫描测试。Pickering高内相乳液的粘度随剪切速率变化的检测方法：在0.1-100s-1的剪切速率下获得粘度曲线。Pickering高内相乳液的储能模量随应力变化的检测方法：恢复测试在1Hz的固定频率下进行，应变分别为0.1％、100％和0.1％，持续200秒。上述所有流变测试实验均在25℃下进行测试。
Pickering高内相乳液的体外模拟消化实验过程：(1)体外消化模型用于评估负载虾青素的Pickering高内相乳液的脂质消化和虾青素的生物可及性。所有样品和模拟消化溶液在实验前在37℃下孵育10分钟。(2)口腔阶段：在模拟消化实验之前，用超纯水将Pickering高内相乳液稀释至4％食用油的水平。将7.5mL样品与等体积的含3mg/mL黏蛋白的模拟唾液混合，并将pH值调节至6.8。将口腔相混合物在37℃在100rpm下搅拌10分钟。(3)胃阶段：向经口腔阶段消化的样品中加入15mL含3.2mg/mL胃蛋白酶的模拟胃液，并将样品的pH值调节至2。胃相混合物在37℃下以100rpm的速度搅拌120分钟。(4)小肠阶段：向经胃阶段消化的样品中加入7.5mL的模拟肠液(模拟肠液中包括60mg胰酶，60mg脂肪酶，187.5mg的胆汁盐)，并将样品pH值调节至7。小肠相混合物在37℃下以100rpm的速度搅拌120分钟。
脂肪酸释放率的检测及计算方法：在小肠消化阶段，通过0.02mol/L NaOH将小肠阶段的pH值维持在7，并在2h内记录NaOH消耗量。根据NaOH的体积消耗计算整个小肠阶段释放的游离脂肪酸(FFA)的百分比。
FFA(％)＝[(CNaOH×VNaOH×Moil)/(2×moil)]×100％
CNaOH是NaOH的摩尔浓度(mol/L)，VNaOH是消耗的NaOH的体积(L)，Moil是玉米油的平均分子量(g/mol)，moil是食用油的总质量(g)。
虾青素的转化率、生物可及性指数和生物可及性的定义及检测计算方法：为了确定虾青素的生物可及性，在口腔消化阶段使用了原始的未稀释乳液。重复上述三阶段消化模型，消化液以10,000rpm离心60分钟，收集离心液的中间层虾青素胶束。从原消化液和离心后的胶束中提取并测定虾青素。虾青素的转化率、生物可及性指数和生物可及性按以下公式计算：
转化率(％)＝100％*总消化物中虾青素的浓度/虾青素的初始浓度；
生物可及性指数(％)＝100％*胶束中虾青素浓度/总消化物中虾青素浓度；
生物可及性(％)＝100％*胶束中虾青素的浓度/虾青素的初始浓度。
实施例1：海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒的制备方法
(1)将500g海鲈鱼肉与5L去离子水混合，在10000rpm下匀浆2min；将所得海鲈鱼肉匀浆液调节pH至10.5，以转速200rpm搅拌2.5h；10000rpm离心30min取上清液，将所得上清液调节pH至4.5；于4℃静止30min，8000rpm下离心15min留沉淀物；冷冻干燥后得到海鲈鱼蛋白粉；
(2)配制10wt％的海鲈鱼蛋白溶液，搅拌溶解后，于4℃水合12h；调节pH至7，于80℃水浴20min；冷却至室温后，以20U/g海鲈鱼蛋白的加入量加入谷氨酰胺转氨酶后，于45℃进行交联反应4h，反应结束后得到凝胶块；向凝胶块中加入1倍的去离子水，使用高速分散机在10000rpm下剪切4min得到凝胶颗粒粗分散液；接下来使用高压均质机在15000Psi下高压均质3个循环得海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液。
将实施例1步骤(2)中所得的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液的浓度稀释到1wt％(以海鲈鱼蛋白质量浓度计)，再将pH分别调整为3、5、7和9，相应的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液的Cryo-SEM结果如图1所示。
如图1所示，通过冷场扫描电子显微镜显示不同pH下海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒的详细结构。结果发现，单颗粒呈球形，但随着pH的变化，颗粒呈现不同的聚集状态。pH在3和5时，由于接近等电点的颗粒处于疏水状态，此时形成了较大的聚集体。pH在7和9下，相邻颗粒交联并融合成网络结构，这种结构有益于稳定乳液。
实施例2：海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的制备方法
取实施例1中步骤(2)所得的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液，以海鲈鱼蛋白浓度计，加水稀释使微凝胶颗粒的浓度分别为0.5wt％、1wt％、2wt％、3wt％和4wt％，调整pH为7；选择玉米油作为油相；将经稀释的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液与玉米油按体积比为2：8混合；将混合物进行高速剪切，高速剪切的转速为10000rpm，剪切时间为2min，得到海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液。
性能测试：
本实施例中，由不同浓度海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒制备的新鲜Pickering高内相乳液的外观图如图2所示。从图2可以看出，由不同浓度海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液都具有均匀的凝胶状态，所有样品在倒置后仍具有自支撑能力，这暗示了Pickering高内相乳液可以用于3D打印产品。
本实施例中，由不同浓度海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的Cryo-SEM结果如图3所示。如图3所示，Cryo-SEM用于直接可视化Pickering高内相乳液的液滴状态。与低浓度海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒相比，在较高颗粒浓度下制备的Pickering高内相乳液显示出更小的液滴尺寸、更小的液滴间距和更紧密的结构，这有助于提高Pickering高内相乳液的粘度和稳定性。进一步增加海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒的浓度可以提高液滴表面的颗粒覆盖率和液滴间隙的填充率，使液滴固定在Pickering高内相乳液的3D网络结构中。
本实施例中，海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液在室温下储存80天后的外观图如图4所示。如图4所示结果，在室温/可见光下储存80天后，由0.5wt％海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液显示出相分离。然而，由1-4wt％海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液表现出类似凝胶的特性，即使将样品瓶倒置，它们仍然可以在瓶底保持自支撑状态。
本实施例中，海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液经8000rpm离心10min后的外观图如图5所示。如图5所示，离心试验的视觉外观结果与储存实验的结果一致。由0.5％海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液离心后顶部观察到油层，而1-4wt％海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液仍然稳定。
本实施例中，海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液在90℃下加热30min后的外观图如图6所示。如图6所示，热处理并未导致Pickering高内相乳液的视觉外观发生任何显著变化，这证明了海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液具有良好的耐热性和优异的高温灭菌潜力。
本实施例中，Pickering高内相乳液的储能模量和损耗模量随频率变化的测量结果如图7所示。如图7所示，在整个频率范围内，所有样品的储能模量均高于损耗模量，表明了Pickering高内相乳液的固体粘弹性行为。随着海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒浓度的增加，Pickering高内相乳液的储能模量也随之提高。此外，所有样品的储能模量几乎比损耗模量高一个数量级，表明强大的网络结构。并且，在恒定应变下，储能模量几乎与频率无关，表现出凝胶状乳液的典型特征。
本实施例中，Pickering高内相乳液的粘度随剪切速率变化的测量结果如图8所示。如图8所示，所有Pickering高内相乳液都表现出典型的剪切稀化行为。Pickering高内相乳液的这种剪切稀化行为可能支持其在3D打印中的应用。此外，Pickering高内相乳液的粘度与海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒的浓度呈正相关。
本实施例中，Pickering高内相乳液的储能模量随应力变化的测量测过如图9所示。如图9所示因此，通过三区间触变性实验研究了Pickering高内相乳液在应变下的恢复特性。Pickering高内相乳液以0.1％、100％和0.1％交替应变，观察Pickering高内相乳液储能模量的变化。当应变为0.1％时，Pickering高内相乳液的储能模量变化不大。当应变从0.1％增加到100％时，所有样品的储能模量显著下降。当应变降低到0.1％时，Pickering高内相乳液的储能模量恢复到初始状态。此外，海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒浓度越高，Pickering高内相乳液的恢复特性越强。
实施例3：一种用于3D打印可负载虾青素的Pickering高内相乳液的制备方法
取实施例1中步骤(2)所得的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液，以海鲈鱼蛋白浓度计，加水稀释使微凝胶颗粒的浓度分别为0.5wt％、1wt％、2wt％、3wt％和4wt％，调整pH为7；选择玉米油作为油相，将0.1wt％的虾青素溶于玉米油中；将经稀释的微凝胶颗粒分散液与含虾青素的玉米油按体积比2：8混合；然后进行高速剪切，高速剪切的转速为10000rpm，剪切时间为2min，得到负载虾青素的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液。
性能测试：
如图10所示的是海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒对Pickering高内相乳液封装虾青素能力的影响。虾青素在Pickering高内相乳液中的包封率分别为86.87(0.5wt％)、87.43(1wt％)、88.82(2wt％)、90.49(3wt％)、92.17(4wt％)，所有Pickering高内相乳液都具有相当高的封装效率。此外，更高浓度的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒可以提高Pickering高内相乳液中虾青素的包封效率。
负载虾青素的Pickering高内相乳液在50℃中加热14天后，测得Pickering高内相乳液中虾青素的保留率如图11所示。随着时间的增加，所有样品中虾青素的保留量逐渐下降，但未包封的玉米油中虾青素(Con：是指直接将0.01wt％虾青素溶于玉米油)保留量下降更为显著，14天后玉米油中虾青素的保留率仅为47.61％。用海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液包裹的虾青素的保留水平显著增加，表明Pickering高内相乳液系统可以提高虾青素的稳定性。此外，不同浓度的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液中虾青素的保留水平分别为65.94(0.5wt％)、73.39(1wt％)、76.39(2wt％)、79.50(3wt％)和82.60(4wt％)。较高浓度的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒可以提高Pickering高内相乳液中虾青素的保留水平。
负载虾青素的Pickering高内相乳液在室温/可见光下储藏15天后，测得Pickering高内相乳液中虾青素的保留率如图12所示。储存15天后，虾青素的保留率按以下顺序列出：43.87％(CON：玉米油)<72.20％(0.5wt％)<81.36％(1wt％)<84.98％(2wt％)<87.96％(3wt％)<90.2％(4wt％)。该结果表明，由海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液递送系统可以增加虾青素的保留水平。此外，增加海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒的浓度可以提高Pickering高内相乳液对虾青素的保护作用。
负载虾青素的Pickering高内相乳液在紫外灯(348mJ/cm2)照射30分钟后，测得Pickering高内相乳液中虾青素的保留率如图13所示。UVB激光照射30分钟后，玉米油和Pickering高内相乳液中虾青素保留率分别为77.97％(Con：玉米油)、81.65％(0.5wt％)、84.15％(1wt％)、86.21％(2wt％)、87.33％(3wt％)和89.33％(4wt％)。玉米油中的虾青素直接暴露在UVB激光下，破坏效果最为明显。Pickering高内相乳液则保持了虾青素的稳定性，并且随着海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒浓度的增加，保护效果得到改善。
简而言之，由海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液可以作为疏水性生物活性物质的有效传递系统并保护它们免于降解。
负载虾青素的Pickering高内相乳液经体外模拟消化后，测得Pickering高内相乳液的自由脂肪酸释放率如图14所示。所有样品的脂质在前30分钟内被快速消化，随后30分钟脂解速率下降，在后60分钟游离脂肪酸释放曲线接近水平线达到最高值。在整个肠道消化阶段，所有由海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液都显示出比玉米油更高的游离脂肪酸释放，这表明无论海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒的浓度如何，Pickering高内相乳液都可以促进脂质分解。消化120min后，样品的脂解度分别为61.03％(Con：玉米油)、65.30％(0.5wt％)、85.45％(1wt％)、93.38％(2wt％)、95.82％(3wt％)和98.26％(4wt％)。结果表明，较高浓度的海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液的脂解度更高。
负载虾青素的Pickering高内相乳液经体外模拟消化后，测得虾青素的转化率，生物可及性指数和生物可及性如图15所示。基于Pickering高内相乳液的递送系统显著增强了虾青素的转化率(Transformation)、生物可及性指数(Bioaccessibility index)和生物可及性(Bioaccessibility)。在未包封的玉米油中虾青素的生物可及性仅为29.83％，相比之下，0.5wt％海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液中虾青素的生物可及性显著提高到39.37％。不同浓度海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液中虾青素的生物可及性为：39.37％(0.5wt％)<44.25％(1wt％)<47.36％(2wt％)<48.27％(3wt％)<51.17％(4wt％)。Pickering高内相乳液中虾青素的生物可及性与海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒的浓度呈正相关。此外，本发明中虾青素的生物可及性与游离脂肪酸释放呈正相关。
因此，海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液可用作有效的递送系统，以提高虾青素的生物可及性。
将负载虾青素Pickering高内相乳液进行3D打印，取上述乳液装入3D打印机的物料桶中，计算机程序控制机器，本发明中3D打印食品的形状为“苹果形”，结果如图16所示。基于以上对Pickering高内相乳液的环境稳定性和流变特性的分析结果，研究了不同浓度海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的负载虾青素的Pickering高内相乳液的在3D打印食品中的潜力。结果表明，由0.5wt％海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液具有相对较差的自支撑的“苹果”形状。然而，由1-4wt％海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液打印的“苹果”具有完整的形状、清晰的轮廓和高清晰度，并且能够保留印刷结构。因此，海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒稳定的负载虾青素的Pickering高内相乳液在3D打印中具有广泛的应用价值和前景。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种制备Pickering高内相乳液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将海鲈鱼蛋白溶液进行热交联、酶交联，然后依次进行高速剪切和高压均质，得到海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液；
(2)将步骤(1)所得海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液与食用油混合后进行剪切乳化，获得Pickering高内相乳液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热交联的温度是60～90℃、10～30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶交联是利用谷氨酰胺转氨酶催化蛋白质多肽发生分子内和分子间的共价交联，优选以10～30U/g海鲈鱼蛋白的加入量加入谷氨酰胺转氨酶后，于40～50℃进行交联反应2～6h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中配制5～20wt％的海鲈鱼蛋白溶液，搅拌溶解后，于2～8℃水合8～24h；调节pH至6～8，于60～90℃水浴10～30min；冷却至室温后，以10～30U/g海鲈鱼蛋白的加入量加入谷氨酰胺转氨酶后，于40～50℃进行交联反应2～6h，反应结束后得到凝胶块；向凝胶块中加入1～10倍的去离子水，使用高速分散机在8000～12000rpm下剪切2～8min得到凝胶颗粒粗分散液；接下来使用高压均质机在10000～20000Psi下高压均质2～10个循环得到海鲈鱼蛋白微凝胶颗粒分散液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，使用的微凝胶颗粒分散液的pH调整为2～10，优选pH7～9；以海鲈鱼蛋白浓度计，微凝胶颗粒的浓度调整为0.1～10wt％，优选1～10wt％，更优选1-4wt％；微凝胶颗粒分散液与食用油的体积比为4:6～1:9。
6.海鲈鱼蛋白在制备Pickering高内相乳液中的应用。
7.应用权利要求1-5任一项所述方法制备得到的Pickering高内相乳液。
8.权利要求7所述Pickering高内相乳液在包埋、负载或递送营养物质中的应用。
9.权利要求7所述Pickering高内相乳液在3D打印食品中的应用。
10.一种提取海鲈鱼蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将海鲈鱼肉与水混合、匀浆；将所得海鲈鱼肉匀浆液调节pH至9～11，搅拌使蛋白在碱性环境下溶解，然后离心取上清液即获得水溶性蛋白质，将所得上清液调节pH至4～5，静置，使海鲈鱼蛋白析出形成沉淀，再次离心并保留沉淀物、去上清；将沉淀物冷冻干燥，得到海鲈鱼蛋白。
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