CN114832104B - 手性纳米仿生光敏蛋白在制备促进受损神经元轴突再生药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及手性纳米仿生光敏蛋白在制备促进受损神经元轴突再生药物中的应用。本发明利用一种具有类似光敏蛋白特性的手性氢氧化镍超小纳米粒子，可穿过血脑屏障进入阿尔茨海默症(AD)小鼠脑中受损的神经元细胞并与细胞膜受体相结合，在近红外光作用下，引起钙离子流动，进而激活Wnt5a/JNK通路。通过两个月的光照治疗，AD小鼠脑中RhoA和ROCK表达量下降，受损神经元的轴突再生长，同时AD小鼠脑脊液中的标志蛋白含量下降，以及记忆、认知能力得到恢复。本发明可应用于AD模型小鼠的神经元修复，对于缓解神经元损伤等中枢神经系统疾病方面提供了可能。

Description

手性纳米仿生光敏蛋白在制备促进受损神经元轴突再生药物 中的应用

技术领域

本发明涉及材料化学技术领域，尤其是涉及手性纳米仿生光敏蛋白在制备促进受损神经元轴突再生药物中的应用。

背景技术

神经元是神经系统结构和功能的基本单位，调节和控制人体的生命活动和健康，一旦受损会引起大脑永久性损伤，导致运动、记忆和认知功能障碍，受损神经元的修复、再生对于维持正常的神经活动至关重要。因此，建立能够增强神经元的内在再生能力，使受损神经元轴突再生和功能恢复的可行性方法，在缓解阿尔茨海默症等中枢神经损伤疾病中具有巨大的应用前景。近年来，随着纳米技术的发展，手性纳米材料因其独特的光学性质，已被广泛应用于生物分子水平和细胞水平上的生物学行为调控。之前的研究报道，手性金纳米膜在圆偏振光作用下可用于细胞的生长和分化，但是该研究未能实现对受损神经元的修复，以及对光-手性纳米材料-细胞调控三者之间的内在机制缺少深刻的解释。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了手性纳米仿生光敏蛋白在制备促进受损神经元轴突再生药物中的应用。本发明将光遗传学和纳米科学相结合，构建一种具有类似光敏蛋白特性的手性金属氢氧化物纳米粒子，通过对其表面功能化修饰和对尺寸的调控，使其能够穿过血脑屏障进入阿尔茨海默症(AD)小鼠脑中受损的神经元细胞并与细胞膜受体相结合，在光照作用下，激活膜受体引起钙离子内流，进而激活Wnt5a/JNK通路，引起下游基因RhoA/ROCK下调，促使受损神经元的轴突再生长，同时AD小鼠的认知、记忆能力得到提高，此发明对于缓解阿尔茨海默症等中枢神经系统损伤疾病具有重要的意义。

本发明的目的在于提供手性纳米仿生光敏蛋白在制备促进受损神经元轴突再生药物中的应用，所述手性纳米仿生光敏蛋白为手性金属氢氧化物纳米粒子；所述药物是在近红外光照射下实现促进受损神经元轴突再生的。

在本发明的一个实施例中，所述手性纳米仿生光敏蛋白的粒径为≤5nm。

在本发明的一个实施例中，所述手性纳米仿生光敏蛋白的剂量为1.5-3mg/kg_。

在本发明的一个实施例中，所述药物的给药频率为每隔5-10天一次，连续1-3个月。

在本发明的一个实施例中，所述近红外光的波长范围为900-1100nm。

在本发明的一个实施例中，所述近红外光的光能量为400-800mW/cm²。

在本发明的一个实施例中，所述药物的剂型选自片剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、干混悬剂或注射剂；所述片剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、干混悬剂均为可注射型制剂。

在本发明的一个实施例中，所述药物还包括药学上可接受的载体。

在本发明的一个实施例中，所述载体选自崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述崩解剂选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲纤维素钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙和藻酸中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，通过优化合成过程中加入的手性配基种类(谷胱甘肽、谷胱甘肽、天冬氨酸、组氨酸)、元素种类(Ni、Cu、Co)和剂量(500-1000mg)，调节手性金属氢氧化物纳米粒子的粒径，使其在体内转运蛋白的作用下能够高效地穿过血脑屏障，以及具有更高的近红外光响应性能。

在本发明的一个实施例中，所述将合成的手性金属氢氧化物纳米粒子在近红外光照射下，可诱导阿尔茨海默症小鼠脑中受损神经元的轴突再生长的方法如下：

将1.5-3mg/kg的D型、L型和DL型金属氢氧化物纳米粒子通过尾静脉的方式分别注入十月龄的3xTg三转基因阿尔茨海默症小鼠体内，每隔5-10天注射一次，连续注射两个月。在此期间，将阿尔茨海默症小鼠暴露在900-1100nm激光(400-800mW/cm²)连续照射1-3个月。结束后发现阿尔茨海默症小鼠脑中受损神经元的轴突再生长，同时小鼠的认知、运动能力得到提升。

本发明的机理：

本发明中具有近红外光响应性能的手性金属氢氧化物纳米粒子，通过尾静脉的方式注入阿尔茨海默症小鼠体内，在转运蛋白的作用下可以穿过血脑屏障，进入AD小鼠脑中受损的神经元中。

所述的手性金属氢氧化物纳米粒子可与神经元表面的膜受体结合，在近红外光作用下，加速钙离子的流动，进而激活了非经典Wnt通路，导致下游基因RhoA/ROCK的表达量下降，促进了受损神经元的轴突再生长。

所述的手性金属氢氧化物纳米粒子在近红外光作用下调控受损神经元的轴突再生，使阿尔茨海默症小鼠的神经元轴突长度恢复到正常小鼠的水平，同时小鼠的认知和记忆能力能到提升。

本发明的技术方案具有以下优点：

本发明提出了手性纳米仿生光敏蛋白在制备促进受损神经元轴突再生药物中的应用，利用具有近红外光响应性能的手性氢氧化镍纳米粒子，在近红外光照作用下激活Wnt通路，使受损神经元的轴突再生长。

本发明的手性纳米仿生光敏蛋白具有近红外光响应性能同时能穿过血脑屏障，可诱导阿尔茨海默症小鼠脑中受损神经元的轴突再生长且恢复到正常小鼠的水平，此发明为实现受损神经元的修复提供可靠的理论基础，对于缓解阿尔茨海默症等中枢神经系统损伤疾病具有重要的意义。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为本发明实施例1中手性金属氢氧化物纳米粒子的透射电镜(TEM)图；

图2为本发明实施例1中不同配基、不同元素合成的手性氢氧化镍纳米粒子的圆二色光谱图；

图3为本发明实施例1中不同粒径氢氧化镍纳米粒子穿过血脑屏障在脑中富集统计图；

图4为本发明实施例2中多次注射氢氧化镍纳米粒子在脑中富集统计图；

图5为本发明实施例2中受损神经元的轴突再生长图；

图6为本发明实施例3中小鼠行为学统计图；

图7为本发明实施例3中检测小鼠脑脊液中Aβ和p-Tau蛋白含量图；

图8为本发明实施例4中钙离子成像统计图；

图9为本发明实施例4中基因分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1具有近红外光响应性能的手性金属氢氧化物纳米粒子的性能调控：

手性金属氢氧化物纳米粒子合成过程中的配基种类优化：将手性配基(谷胱甘肽、天冬氨酸、组氨酸)与Ni、Cu、Co离子以摩尔浓度比为100:1的方式混合在一起，调节反应溶液的pH至8.5左右，室温下混合搅拌反应12h，得到粒径均≤5nm的手性金属氢氧化物纳米粒子(GSH-Ni、His-Ni、Asp-Ni、GSH-Cu、Asp-Co)，不同手性金属氢氧化物纳米粒子透射电镜(TEM)图如1所示。对所得的不同配基、不同元素合成的手性金属氢氧化物纳米粒子进行圆二色光谱分析，结果如图2所示。由图2的结果可知，谷胱甘肽合成的手性氢氧化镍纳米粒子(GSH-Ni)在近红外区具有较强的光响应能力，其他配基或者元素制备的手性金属氢氧化物纳米粒子在近红外区的手性信号较弱。

手性氢氧化镍纳米粒子的尺寸调控：通过延长反应时间和提高反应温度，调节了手性氢氧化镍纳米粒子的粒径尺寸(≤5nm，10nm，50nm)，通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测小鼠脑中Ni元素的含量，不同粒径的手性氢氧化镍纳米粒子穿过血脑屏障在脑中富集统计图如图3所示。由图3的结果可知，由于血脑屏障的存在，只有小粒径(≤5nm)的手性氢氧化镍纳米粒子可以穿过血脑屏障，而10nm、50nm粒径的手性氢氧化镍纳米粒子无法进入大脑。

实施例2手性氢氧化镍纳米粒子修复受损神经元轴突再生。

将40μg的手性氢氧化镍纳米粒子通过尾静脉的方式注入AD小鼠体内，每5天注射一次，连续注射两个月，并用980nm的激光(600mW/cm²)连续照射两个月(每天光照12h)。通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测不同时间点(6h，12h，24h，2天，3天，7天，15天，30天，45天，和60天)AD小鼠脑中Ni元素的含量，多次注射手性氢氧化镍纳米粒子在AD小鼠脑中富集统计图如图4所示。由图4发现随着注射次数的增加，Ni元素在脑中的含量逐渐增加，说明氢氧化镍纳米粒子可以高效地穿过血脑屏障。

提取野生型小鼠(WT)，AD小鼠，以及L型、DL型、D型氢氧化镍纳米粒子和近红外光处理的AD小鼠的海马区部位的神经元细胞，并进行荧光染色，通过共聚焦显微镜检测神经元的轴突长度，检测结果如图5所示，由图5的结果可以看出，经D型氢氧化镍纳米粒子和光照作用后，AD小鼠脑中的神经元轴突再生长，轴突长度达到180-210μm左右，与野生型小鼠脑中神经元轴突长度相当；而未处理的AD小鼠脑中神经元只有40-60μm左右；注射L型氢氧化镍纳米粒子的AD小鼠脑中神经元轴突长度为80-110μm左右。此结果说明具有光响应性能的手性氢氧化镍纳米粒子在近红外光作用下可诱导受损神经元再生长，并且D型手性氢氧化镍纳米粒子的效果最好。

实施例3手性氢氧化镍纳米粒子在近红外光照作用下，降低阿尔茨海默症小鼠脑脊液中Aβ和p-Tau蛋白的含量，并缓解运动、认知障碍。

将40μg的手性氢氧化镍纳米粒子通过尾静脉的方式注入AD小鼠体内，每5天注射一次，连续注射两个月，并用980nm的激光(600mW/cm²)连续照射两个月(每天光照12h)。通过水迷宫实验检测野生型小鼠(WT)、未处理的AD小鼠以及L型、DL型、D型氢氧化镍纳米粒子和近红外光处理的AD小鼠的运动、认知能力是否得到改善，得到不同分组的AD小鼠的行为学统计图如图6所示。由图6的结果显示，经过训练后，注射D-型氢氧化镍纳米粒子和经过近红外光照处理的AD小鼠找到目标月台的时间最短，说明注射D-型氢氧化镍纳米粒子和经过近红外光照处理的AD小鼠的运动、记忆能力得到提高，“痴呆”症状得到缓解。

此外，本发明通过抽取野生型小鼠(WT)，AD小鼠，以及L型、DL型、D型氢氧化镍纳米粒子和近红外光处理的AD小鼠的脑脊液，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测AD病理标志蛋白(Aβ和p-Tau蛋白)的变化，不同分组的AD小鼠脑脊液中Aβ和p-Tau蛋白含量图如图7所示。由图7的结果显示，D-型氢氧化镍纳米粒子和经过近红外光处理的AD小鼠脑脊液中的Aβ和p-Tau蛋白的含量均降低到野生型小鼠的水平，结果说明AD小鼠的病理标志蛋白含量恢复到正常值，病理症状缓解。

实施例4手性氢氧化镍纳米粒子促进受损神经元轴突再生的机制分析。

将1×10⁶个AD小鼠脑中的神经元细胞提出后，与浓度为100ng/mL的手性氢氧化镍纳米粒子共孵育，4h后加入激光光照(980nm；400mW/cm²)，此时用特异性指示剂来标记Ca²⁺，在激光共聚焦显微镜下实时监测指示剂荧光强度的变化，用于表示Ca²⁺随时间的流动过程，结果如图8所示。由图8的结果显示，D-型氢氧化镍纳米粒子和光照处理的神经元细胞检测到了较多的Ca²⁺流动，出现此结果的原因是D-型纳米粒子与细胞膜受体的结合率较高。接下来，对Ca²⁺流动引起的基因变化进行RT-PCR分析，分析结果如图9所示。由图9的结果证明了手性氢氧化镍纳米粒子在近红外光光照作用下引起Ca²⁺的瞬时流动，进一步激活了Wnt5a/JNK通路，Wnt5a、pJNK基因上调，而RhoA、ROCK下调，因此诱导了受损神经元轴突再生长。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.手性纳米仿生光敏蛋白在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用，所述手性纳米仿生光敏蛋白为谷胱甘肽作为手性配基合成的手性氢氧化镍纳米粒子；所述药物是在近红外光照射下实现促进受损神经元轴突再生；所述手性纳米仿生光敏蛋白的粒径≤5 nm。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述手性纳米仿生光敏蛋白的剂量为1.5-3 mg/kg。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药频率为每隔5-10天一次，连续1-3个月。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述近红外光的波长范围为900-1100 nm。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述近红外光的光能量为400-800 mW/cm²。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自片剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、干混悬剂或注射剂。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述载体选自崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述崩解剂选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲纤维素钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙和藻酸中的一种或多种。

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