CN114832046A - 一种用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法及应用 - Google Patents

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CN114832046A CN202210517706.XA CN202210517706A CN114832046A CN 114832046 A CN114832046 A CN 114832046A CN 202210517706 A CN202210517706 A CN 202210517706A CN 114832046 A CN114832046 A CN 114832046A
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Abstract

本发明公开了一种用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法及应用，由β‑葡萄糖苷酶水解杨树提取物制备而得；其中，所述杨树提取物的原料为杨树加工废弃的杨木屑和/或杨树叶，所述β‑葡萄糖苷酶是经微生物发酵或重组菌表达并纯化制得。本发明提供的制备方法具有原料资源丰富、成本低、简单、环保、反应温和、提取物抗炎活性好等特点，体外抗炎活性较不使用酶水解得到的杨木屑和杨树叶提取物分别提高了30.39％和23.98％。通过本发明技术制备的提取物具有改善动物结肠炎的功效，可促进杨树资源的综合利用。

Description

一种用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法及应用
技术领域
本发明属于天然物质提取技术领域，具体涉及到一种用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法及应用。
背景技术
杨树广泛分布在我国东部地区，是我国重要的造林和木材加工树种之一。杨树树皮和枝叶中富含酚苷、黄酮、有机酸、单宁等植物次生代谢物质，在抗炎、抗菌、抗氧化等方面可以发挥一定的作用。杨树酚苷作为一系列已知的水杨醇的糖基化和酯化衍生物，具有优良的生物活性。小青杨树皮具有抗痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的作用同，颤杨树皮也能对灰葡萄孢菌、意大利青霉、黑根霉菌有良好的抑菌作用，其成分邻苯二酚，阿魏酸，2,6-二甲氧基对苯酯被证明具有抗菌活性。而从白杨提取的正丁醇萃取部分被报导清除DPPH·自由基的抗氧化能力。同时，随着杨树速生材已广泛应用到胶合板、纸浆造纸、实木胶合板、刨花板等领域，杨树木材的需求量越来越大。但在杨树的工业加工过程中，会产生大量废弃的杨木木屑和树叶，直接抛弃会造成资源浪费。另一方面，我国养殖业普遍存在抗生素摄入过多的问题，如果将天然的农林废弃物用于制备饲料添加剂，部分替代抗生素的功效，不仅有利于实现农林业的绿色、资源化利用，也有利于促进饲料养殖行业的健康发展。
随着养殖规模的扩大，肠炎对动物的危害也随之上升。炎症性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎和克罗恩病，是一组可能终身复发的肠道疾病，不仅在人类中高发，在动物养殖中也容易遇到此类问题。结肠炎患者常出现体重减轻、内出血、腹泻、腹痛、结肠黏膜广泛及黏膜下病变。目前IBD的治疗方式主要包括诱导缓解和预防复发两方面，治疗药物包括氨基水杨酸、糖皮质激素、硫嘌呤和生物制剂等。但当前用于治疗IBD的药物往往存在成本高、副作用大、疗效不理想等问题，因此，从农林废弃物中寻找廉价有效的成分，对于新型、可替代抗生素的饲料添加剂的研发具有重要意义。
自然界中的黄酮、酚苷等物质常以葡萄糖苷的形式存在。有研究表明，糖苷连接的方式以及糖基数目的多少对糖苷类物质的活性有一定的影响，减少侧链糖基的数目可以提高抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等活性。如果通过糖苷酶对杨树提取物进行催化，有助于提高其活性价值。同时，生物转化具有反应条件温和，特异性好、分离纯化容易等特点。目前关于杨树废弃物的研究，既缺乏以明确的活性功能为导向的开发利用，也缺乏有效的精深加工核心技术。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法，由β-葡萄糖苷酶水解杨树提取物制备而得；
其中，所述杨树提取物的原料为杨树加工废弃的杨木屑和/或杨树叶。
作为本发明用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述β-葡萄糖苷酶是经微生物发酵或重组菌表达并纯化制得。
作为本发明用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述β-葡萄糖苷酶来源于嗜热菌DSM 3960在大肠杆菌BL21中异源表达制备的β-葡萄糖苷酶。
作为本发明用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述水解，底物浓度1～100mg/mL，β-葡萄糖苷酶用量1～50U/mg，反应温度70～90℃，反应时间2～4h。
作为本发明用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述杨树提取物，采取乙醇热回流提取，抽滤，减压蒸发得到浸膏状物质；水溶所述浸膏状物质，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯组分；减压浓缩得到所述杨树提取物。
作为本发明用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述乙醇溶液浓度为70～90％，热回流提取温度为50～60℃，料液比为1:5，提取时间2～3h，提取3次。
作为本发明用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法的一种优选方案，其中：所述石油醚萃取时间2～6h，萃取3次；所述乙酸乙酯萃取时间为2～6h，萃取3次。
本发明的另一个目的是提供根据上述用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法制备得到的杨树转化产物。
本发明的另一个目的是提供上述杨树转化产物在制备具有改善肠炎功能的饲料添加剂产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种原料来源丰富廉价、提取加工步骤简单、反应条件温和、有利于杨树资源化利用的杨树提取物精深加工的生物制备方法。作为本发明制备的杨树转化产物，具有成分独特、抗炎活性佳、质量可控等特点。本发明的杨树转化产物在资源化利用和抗炎活性上显著优于未经生物酶转化的杨树提取物。经β-葡萄糖苷酶转化后，杨树转化产物能够抑制小鼠体重下降，改善疾病活动指数，增加结肠长度，改善结肠病理，减少炎症因子的释放。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中杨树提取物对Con A活化的淋巴细胞增殖抑制作用结果对比图；
图2为本发明选取的5种酶对杨树提取物的乙酸乙酯萃取相进行催化前后的HPLC图谱；
图3为本发明DTH3酶对杨树提取物乙酸乙酯萃取相的不同催化温度的HPLC图谱；
图4为本发明DTH3酶对杨树提取物乙酸乙酯萃取相的不同催化时间的HPLC图谱；
图5为本发明DTH3酶对杨树提取物乙酸乙酯萃取相的不同催化酶用量的HPLC图谱；
图6为本发明酶催化前后的杨树提取物对Con A活化的淋巴细胞增殖抑制作用结果对比图；
图7为本发明杨树转化产物对小鼠结肠炎的改善作用结果对比图；
图8为本发明杨树转化产物抑制小鼠结肠组织的炎症细胞浸润结果对比图；
图9为本发明杨树转化产物抑制结肠炎小鼠脾脏细胞炎症因子mRNA表达结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
(1)以杨树加工废弃物杨木屑(PM)和杨树叶(PL)为原料，将杨木屑和杨树叶于60℃烘干8h，分别粉碎过200目筛，收集杨木屑粉和杨树叶粉；
(2)用90％乙醇溶液作为溶剂，分别对杨木屑粉和杨树叶粉在60℃热回流提取，料液比为1:5，提取时间2.5h，提取3次，后抽滤、减压蒸发得到浸膏状物质；
(3)水溶浸膏状物质，依次用石油醚和乙酸乙酯对提取液进行萃取，石油醚萃取时间为4h，萃取3次，剩余溶液用乙酸乙酯萃取，取时间为4h，萃取3次收集，减压蒸发得到杨树提取物；
(4)分别收集乙醇总提取物(EE)、石油醚萃取相(PE)和乙酸乙酯萃取相(EAE)。
通过淋转实验比较三个组分的体外抗炎活性，实验方法为取Balb/c小鼠原代T淋巴细胞种96孔板(每孔5×105个，100μl)，每孔加入50μl Con A(4μg/ml)活化T淋巴细胞，对照孔仅加入50μl 1640完全培养基；向Con A活化的T淋巴细胞孔中分别加入不同浓度的提取物50μl，其中对照组仅加入50μl 1640完全培养基；培养24h后用MTT法测定560nm处吸光度，以Con A活化的T淋巴细胞未添加提取物孔为100％存活率对照，计算并分析提取物对Con A活化的T淋巴细胞的增殖影响。实验结果如图1所示。
实验结果显示，在相同浓度下，杨木屑提取物在40μg/ml浓度下对Con A活化的T淋巴细胞增殖抑制率分别为40.2％(EE)、33.6％(PE)和47.2％(EAE)，杨树叶提取物在40μg/ml浓度下对Con A活化的T淋巴细胞增殖抑制率分别为43.9％(EE)、38.5％(PE)和56.7％(EAE)，因此，选取乙酸乙酯萃取相进行进一步的抗炎活性研究。
实施例2
(1)选取实验室自产的11种酶：来源于D.thermophilum的木糖苷酶Xin-Dt(最适温度75℃，最适pH 6.0)和来源于T.thermosaccharolyticum的木糖苷酶TtGH39(最适温度50℃，最适pH 5.5)，来源于A.mulundensis的α-鼠李糖苷酶AMIHA(最适温度65℃，最适pH6.0)和来源于D.thermophilum DSM3960的α-鼠李糖苷酶DthRha(最适温度90℃，最适pH6.5)，以及7种β-葡萄糖苷酶，分别是来源于D.thermophilum DSM3960的Dth3(最适温度85℃，最适pH5.5)、来源于T.petrophlia DSM 13995的Tpebgl1(最适温度90℃，最适pH 6.0)、来源于S.islandicus的Sisbgl1(最适温度90℃，最适pH 5.5)、来源于T.thermarum DSM5069T的Tthbgl1(最适温度90℃，最适pH 4.8)、来源于T.thermarum DSM5069T的Tthbgl3(最适温度90℃，最适pH 5.0)、来源于T.petrophlia DSM 13995的Tpebgl3(最适温度90℃，最适pH 5.0)和来源于A.niger NL-1的Anibgl1(最适温度50℃，最适pH 4.8)。
(2)分别取20mg实施例1中杨木屑和杨树叶的乙酸乙酯萃取相(EAE)，溶于155μl蒸馏水中，加入50μl pH 5.5磷酸缓冲液和245μl上述5种酶(酶活40U/ml)于85℃水浴反应30min对杨树提取物进行催化，收集催化产物。其中，试验数据表明7种β-葡萄糖苷酶在催化性质上和Dth3类似，只是催化效率略有差异，其中，Dth3催化效率最高。因此，在β-葡萄糖苷酶的催化反应中，选择Dth3进行实验。
通过HPLC检测比较催化反应前后提取物的成分和含量变化。HPLC检测条件：C18色谱柱(4.6×250mm；5μm；S.No.USNH017518，USA)；流速0.8ml/min，进样量10μl；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％甲酸水；梯度洗脱程序：0～5min，93％A，5～12min，93％～85％A,12～25min，85％～70％A。实验结果如图2所示。
结果表明，鼠李糖苷酶AMIHA和DthRha几乎不能改变提取物HPLC检测到的成分，木糖苷酶Xin-Dt和TtGH39仅能改变少量成分的含量，而β-葡萄糖苷酶Dth3能显著改变杨树提取物的成分组成和含量。因此，选择杨树提取物的Dth3转化产物进行后续抗炎活性研究。
实施例3
取20mg实施例1中杨木屑和杨树叶的乙酸乙酯萃取相(EAE)，溶于155μl蒸馏水中，加入50μl pH 5.5磷酸缓冲液和245μlβ-葡萄糖苷酶Dth3(酶活40U/ml)，分别于85℃、90℃、95℃温度下水浴反应30min对杨树提取物进行催化，收集催化产物。
通过HPLC检测比较催化反应前后提取物的成分和含量变化。实验结果如图3所示。
实施例4
取20mg实施例1中杨木屑和杨树叶的乙酸乙酯萃取相(EAE)，溶于155μl蒸馏水中，加入50μl pH 5.5磷酸缓冲液和245μlβ-葡萄糖苷酶Dth3(酶活40U/ml)，分别于85℃温度下水浴反应30min、1h、2h对杨树提取物进行催化，收集催化产物。
通过HPLC检测比较催化反应前后提取物的成分和含量变化。实验结果如图4所示。
实施例5
取20mg实施例1中杨木屑和杨树叶的乙酸乙酯萃取相(EAE)，溶于155μl蒸馏水中，加入50μl pH 5.5磷酸缓冲液，分别加入245μl酶活为40U/ml、50U/ml和60U/ml的β-葡萄糖苷酶Dth3，于85℃温度下水浴反应30min对杨树提取物进行催化，收集催化产物。
通过HPLC检测比较催化反应前后提取物的成分和含量变化。实验结果如图5所示。
最终选取85℃、酶活50U/ml、反应时间2h作为催化反应条件。
实施例6
(1)60℃，8h烘干杨木屑和杨树叶废弃物，粉碎过200目筛；
(2)90％乙醇溶液作为溶剂60℃热回流提取，抽滤，减压蒸发得到浸膏状物质；
(3)水溶浸膏物质，石油醚萃取3次，剩余溶液乙酸乙酯萃取3次收集，减压蒸发得到杨木屑提取物和杨树叶提取物；
(4)各取20mg杨木屑提取物和杨树叶提取物，溶于155μl蒸馏水中，加入50μl pH5.5磷酸缓冲液和245μl Dth3酶(50U/ml)于85℃水浴反应2h，获得杨木屑转化产物(PM-D)和杨树叶转化产物(PL-D)。
体外抗炎活性检测
在96孔板中每孔接种8×105淋巴细胞，模型组与实验组加入终浓度4μg/ml Con A溶液，实验组加入不同浓度(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)的杨树提取物或杨树转化产物培养24h，于实验终点前4h向每孔加入20μl MTT(4mg/ml)，实验终点时取出96孔板，于1000×g离心，然后吸取上清，加入200μl DMSO，560nm测定吸光值。根据以下公式计算待测样品对淋巴细胞体外增值的抑制率：Con A组与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；加药组与实验组比较：*P<0.05，**P<0.01。
抑制率＝[100-(OD560(实验孔)-OD560(空白对照)/(OD560(不加药对照孔)-OD560(空白对照))×100]％
分别比较杨木屑提取物和杨树叶提取物经酶转化前后体外抗炎活性，结果如图6所示。杨木屑提取物和杨树叶提取物对增殖淋巴细胞模型的抑制率在40μg/ml浓度情况下分别为49.35％和61.53％。杨木屑转化产物和杨树叶转化产物，在40μg/ml浓度下，对增殖淋巴细胞模型的抑制率分别为79.74％和85.51％，抗炎活性得到显著提升。经β-葡萄糖苷酶转化后，杨树提取物的体外抗炎活性可分别提高30.39％和23.98％，杨树转化产物能够抑制小鼠体重下降，改善疾病活动指数，增加结肠长度，改善结肠病理，减少炎症因子的释放。
实施例7
本实施例为实施例6中获得的转化产物对小鼠结肠炎的治疗效果的研究。实验动物：BALB/c雌性小鼠购自于浙江维通利华动物实验中心，年龄8周，体重18～20g。
(1)结肠炎小鼠模型的建立
将56只8周龄健康的BALB/c小鼠随机分为7组(第一组对照组、第二组DSS模型诱导组、第三组5-ASA阳性药物治疗组、第四组杨木屑转化产物低剂量组、第五组杨木屑转化产物高剂量组、第六组杨树叶转化产物低剂量组、第七组杨树叶转化产物高剂量组)，每组8只。
第一组：正常对照，八只正常小鼠以正常常规膳食及纯饮用水摄食且为自由摄取而无任何治疗直到第10日。
第二组：八只小鼠被喂喝3.5％DSS水7天诱导结肠炎，后三天恢复正常供水。
第三组：八只小鼠被喂喝3.5％DSS水7天诱导结肠炎，后三天恢复正常供水。第4～10天每天补充300mg/kg5-氨基水杨酸经口施用。
第四组：八只小鼠被喂喝3.5％DSS水7天诱导结肠炎，后三天恢复正常供水。第4～10天每天补充20mg/kg杨木屑转化产物经口施用。
第五组：八只小鼠被喂喝3.5％DSS水7天诱导结肠炎，后三天恢复正常供水。第4～10天每天补充40mg/kg杨木屑转化产物经口施用。
第六组：八只小鼠被喂喝3.5％DSS水7天诱导结肠炎，后三天恢复正常供水。第4～10天每天补充20mg/kg杨树叶转化产物经口施用。
第七组：八只小鼠被喂喝3.5％DSS水7天诱导结肠炎，后三天恢复正常供水。第4～10天每天补充40mg/kg杨树叶转化产物经口施用。
(2)动物监控及处死
每日监控存活率、粪便情况。治疗前纪录体重，进行疾病活性指数(DAI)打分。处死后测量由盲肠末端到肛门处结肠长度。
疾病活性指数分数的测量。疾病活性指数(DAI)是每日由以下参数总结计算：
(a)体重损失(0分＝无体重损失；1分＝1–5％体重损失；2分＝6–10％体重损失；3分＝11～15％体重损失；以及4分＝>15％体重损失)；(b)粪便稠度(0分＝正常，1分＝轻度软性，2分＝软性湿润，3分＝半稀便，4分＝稀便)；(c)便血(0分＝正常，2分＝轻微出血，4分＝大量出血)
(3)组织学分析
结肠远端部分用福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度4mm，苏木精伊红(H&E)染色，用于组织学分析。光镜下观察组织学损伤及炎症反应。
(4)杨树转化产物对结肠炎相关炎症因子表达影响的检测
收集每组小鼠脾脏，研磨，Trizol提取RNA，扩增表达为cDNA，q-PCR检测炎症因子表达，所述DSS组与Control组比较：#P<0.05,##P<0.01；实验组与DSS组比较：*P<0.05,**P<0.01。
实验结果
杨树转化产物对DSS诱导的结肠炎模型小鼠的治疗作用，如图7所示，图7(a)为结肠炎模型小鼠的体重变化对比图；图7(b)为结肠炎模型小鼠的疾病活性指数对比图；图7(c)为结肠炎模型小鼠的结肠长度对比图。
图7可以观察到杨树转化产物可以改善结肠炎小鼠的体重减轻，改善小鼠病理指标，同时减轻了结肠缩短的现象，提示杨树转化产物拥有治疗结肠炎的潜在作用。
HE切片染色观察到杨树转化产物对结肠炎小鼠结肠改善的作用，如图8所示。
图8切片所示，被喂食杨树转化产物的结肠炎小鼠的结肠组织中炎症细胞浸润减少，组织破坏减少，结肠炎症环境改善，证明杨树转化产物拥有改善小鼠结肠炎的作用。
杨树转化产物减少了结肠炎小鼠炎症因子的表达，如图9所示。
图9所示，DSS诱导的结肠炎小鼠中TNF-α，IFN-γ，IL-17A炎症因子的表达升高，而杨树转化产物能够显著减少炎症因子的表达。
本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶在提高杨树废弃物抗炎活性的制备方法和应用。该提取物在水相中，底物浓度10mg/ml，β-葡萄糖苷酶用量为50U/ml，温度85℃，反应2h后，实现部分物质转化。在该转化情况下，对体外淋巴细胞增殖的抑制率分别达到了79.74％和85.51％，显著高于未经酶转化的提取物。在结肠炎小鼠模型下，杨树废弃物的酶转化产物能够改善小鼠结肠炎表征，减少炎性细胞对结肠的浸润，抑制结肠炎小鼠中TNF-α，IFN-γ和IL-17A mRNA的表达，改善炎症。本发明提供的制备方法具有原料资源丰富、成本低、简单、环保、反应温和、提取物抗炎活性好等特点，促进杨树资源在肠道黏膜恢复、调节肠道等保健功能的饲料添加剂等产品中的应用。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法，其特征在于：由β-葡萄糖苷酶水解杨树提取物制备而得；
其中，所述杨树提取物的原料为杨树加工废弃的杨木屑和/或杨树叶。
2.如权利要求1所述的用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶是经微生物发酵或重组菌表达并纯化制得。
3.如权利要求1或2所述的用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶来源于嗜热菌DSM 3960在大肠杆菌BL21中异源表达制备的β-葡萄糖苷酶。
4.如权利要求3所述的用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法，其特征在于：所述水解，底物浓度1～100mg/mL，β-葡萄糖苷酶用量1～50U/mg，反应温度70～90℃，反应时间2～4h。
5.如权利要求1、2或4任一项所述的用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法，其特征在于：所述杨树提取物，采取乙醇热回流提取，抽滤，减压蒸发得到浸膏状物质；水溶所述浸膏状物质，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯组分；减压浓缩得到所述杨树提取物。
6.如权利要求5所述的用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法，其特征在于：所述乙醇溶液浓度为70～90％，热回流提取温度为50～60℃，料液比为1:5，提取时间2～3h，提取3次。
7.如权利要求1、2、4或6任一项所述的用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法，其特征在于：所述石油醚萃取时间2～6h，萃取3次；所述乙酸乙酯萃取时间为2～6h，萃取3次。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法制备得到的杨树转化产物。
9.根据权利要求8所述杨树转化产物在制备具有改善肠炎功能的饲料添加剂产品中的应用。
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