CN114829378A - 基于肽的合成氯离子转运蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人类疗法领域。具体地，本发明涉及新型的合成的基于肽的氯离子转运蛋白及其组合物，以及治疗、减少、抑制或控制受试者的CFTR介导的病状诸如囊性纤维化的方法。

Description

基于肽的合成氯离子转运蛋白
发明领域
本发明涉及人类疗法领域。具体地，本发明涉及新型的合成的基于肽的氯离子转运蛋白及其组合物，以及治疗、减少、抑制或控制受试者的CFTR介导的病状诸如囊性纤维化的方法。
背景技术
细胞穿透肽(CPP)或蛋白转导结构域(PTD)是具有少于30个氨基酸残基且具有适当的大小、电荷和极性以穿过细胞膜的小肽。这些肽的主要特征包括它们使用内吞作用和能量非依赖性途径穿过细胞膜的能力、它们的高细胞渗透速率以及它们的低细胞毒性和与几乎没有免疫反应相关的安全性。
目前，已报告了1800多种不同的CPP，其中绝大多数已针对不同的应用进行了实验测试。CPP根据货物的类型、它们的物理化学性质(阳离子、疏水性、两性)、它们的内化机制以及它们的结构特征(线性或环状性质)进行分类。
细胞穿透肽(CPP)已被用于转运各种材料(肽、蛋白质、DNA、RNA等)穿过生物屏障，诸如质膜(JP Richard等人,Journal of Biological Chemistry,2003,278,第585页)。然而，此类系统以前从未用于或被建议用于转运离子穿过膜。
尽管基于CPP的疗法所靶向的途径和细胞类型多种多样，但仍然没有经FDA批准的CPP缀合药物，并且迄今为止已经中断了若干临床试验。与CPP缀合药物的使用相关的问题包括：(1)由于对蛋白水解降解的频繁易感性导致的体内稳定性问题；(2)免疫原性问题；(3)由于药物被细胞内化后不能从内体中逃逸导致的效率低下；(4)由于赋形剂的降解导致的毒性；以及(5)由于CPP缺乏位点特异性导致的毒性或效率低下。(L Gomes dos Reis、DTraini,Expert Opinion on Drug Delivery,2020,17(5),第647页；J Habault、JL Poyet,Recent Advances in Cell Penetrating Peptide-Based Anticancer Therapies,Molecules,2019,24(5),第927页)
已进行了密集的研究工作，致力于使用人工化合物开发合成离子通道。主要策略与单分子通道的合成或自组装超分子通道的设计有关。这些合成离子转运蛋白或离子通道可以补充细胞离子通道受损或丧失的功能(N Busschaert、PA Gale,Angewandte ChemieInternational Edition 2013,52,第1374页)并用于治疗通道病和相关疾病。
开发了从有机小分子到超分子系统的具有不同分子质量的各种人工氯化物转运蛋白。这些化合物与氯离子一起被动扩散穿过膜，或在膜中形成通道，从而促进被动离子转运。这些化合物的通常缺点是它们的毒性。已经证明，一些转运蛋白增加细胞内氯化钠浓度，提高细胞活性氧物类(ROS)水平，触发线粒体释放细胞色素c并诱导半胱天冬酶活化，所有这些都导致细胞凋亡(SK Ko等人,Nat Chem 2014,6,第885页)。另一方面，已有人提出可以通过人工氯化物转运蛋白的利用选择性地杀死肿瘤细胞(D de
Figure BDA0003679692820000021
等人；Chemistry–AEuropean Journal,2011,17,第14074页)。
这些化合物可因扰乱细胞内的化学梯度、触发细胞凋亡、导致致瘤细胞的死亡而用于肿瘤学中。氯化物转运蛋白在白血病、淋巴瘤、骨髓纤维化和肥大细胞增多症的情况下是有效的(S Parikh等人；Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia,2010,10,第285页)。
诸如慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化(CF)、支气管扩张、肺结核和肺癌等呼吸疾病是导致死亡的主要原因，而且数量逐年增加。对可以促进肺相关疾病的新疗法的开发的新工具的需求尚未得到满足，因为其已被认为是最大的治疗失败。生物活性分子(肽、蛋白质和核酸)领域是可以开发呼吸疾病的潜在新治疗的领域(L Gomes dos Reis、DTraini,Expert Opinion on Drug Delivery,2020,17(5),第647页)。
CF是以多器官病理和由CFTR的功能或表达受损导致的显著降低的预期寿命为特征的最常见的常染色体隐性遗传病。在CF中，由于CFTR基因的基因突变导致囊性纤维化跨膜转导调节子(CFTR)蛋白的缺失或功能减弱，氯化物转运受损(BP O'Sullivan、SDFreedman,Lancet,2009,373,第1891页)。近来的治疗剂开发显著提高了CF患者的预期寿命，但平均死亡年龄(通常由呼吸衰竭造成)仍为31.4岁(A Orenti等人,ECFSPR AnnualReport,2016)。此外，31％的CF患者存在由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的慢性肺部感染，而所有CF患者中的83％需要胰酶替代疗法，这给患者和医疗系统都带来了沉重的负担。
因此，非常需要开发合成氯离子转运蛋白，所述蛋白可以潜在地用于通道替代疗法，以治疗与阴离子转运失调相关的疾病–诸如囊性纤维化(CF)。
此类治疗剂的口服递送将是期望的，但是由于基于肽的生物活性物质在胃肠道中的不稳定性、它们的低渗透性和极快速的清除，这对于药物配方师和药物递送专家来说仍然是一个未解决的挑战(S Gupta等人,Drug Delivery,2013,20,第237-246页)。尽管囊性纤维化是一种全身性疾病，尤其影响肺、消化系统和生殖系统，但肺部感染和肺部并发症是导致死亡的主要原因，占病例的最高至85％。(C Martin等人,Journal of CysticFibrosis,2016,15,第204-212页)。已知异常的粘液粘度和产生促进CF发病机制(C Ehre等人,The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2014,52,第136–145页)。此外，已知超浓缩粘液，伴随增加的气道粘连，在动物模型中诱发CF样疾病(M Mall等人,Nature Medicine,2004,10,第487-493页)。对年轻CF患者的支气管肺泡灌洗液的分析表明，异常粘稠的粘液积聚，伴随增加的总粘蛋白和炎症因子浓度，推动了CF疾病的早期发病机制(CR Esther等人,Science Translational Medicine,2019,11,第1-11页)。粘液粘度的增加是由氯离子的细胞分泌减少造成的，这导致流体分泌受损并且气道上皮细胞的顶端钠吸收增加(H Li等人,Current Opinion in Pharmacology,2017,34,第91-97页)。离子转运的这些改变最终导致顶端气道表面液体的酸化和高度降低。
在CF患者中，纤毛运动由于这些改变而受损，并且粘稠的粘液层无法从较小的气道中去除。这导致慢性咳嗽并且增加肺部感染的可能性和频率。水化疗法已被证明将CF痰液样本校正至接近正常的粘弹性，从而强化了施用水化剂对CF患者产生有益结果的临床发现(BE Tildy和DF Rogers,Pharmacology,2015,95,第117-132页)。因此，直接施用至肺部的合成氯离子转运蛋白可以通过增加粘液层的电解质水平并从而促进水从上皮细胞中转运出来而缓解与高度粘稠的粘液层相关的症状(与引起疾病的突变无关)。最终，这可导致粘液层流变特性的改善(D Schieppati等人,Respiratory Medicine,2019,153,第52-59页)。这得到了粘液样本分析的支持：其中已证明，将粘液稀释(水化)2倍，从5.2％稀释至2.6％，使复数粘度降低8倍(DB Hill等人,European Respiratory Journal,2018,52,第1-11页)。
虽然VX(或‘卡托(caftor)’)化合物诸如依伐卡托(ivacaftor)、鲁玛卡托(lumacaftor)、替扎卡托(tezacaftor)、依来卡托(elexacaftor)及其组合(如在上市药品Kalydeco、Orkambi、Symdeko和Trikafta中所发现的)有效改善氯离子转运，但它们的使用仅限于CFTR基因的某些突变。此外，存在许多被发现对此类卡托疗法没有反应或不耐受的患者。这些患者的治疗是一项未满足的医疗需求，合成氯离子转运蛋白可在其中发挥重要作用。此外，将这些普遍有效的离子通道转运蛋白与已确定的囊性纤维化治疗相组合可导致改善的治疗结果。
发明内容
1.一种式(X)的化合物：
Figure BDA0003679692820000041
或药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合，其中，
n＝0-10
k＝1-200
X＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基、保护基、C1-10酰基、生物素、荧光和放射性示踪剂、烷基、环烷基和酰基，其被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代
Y＝O、S、NH、CH2、N-OR，
Z＝C1-10烷基或环烷基、芳基、保护基、C1-10酰基、生物素、荧光和放射性示踪剂、烷基、环烷基和酰基，其被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代
R＝H、OH、O-烷基、NH、N-烷基、SH、S-烷基、烷基、烯基、炔基、NH-NH2、
R2＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基，这些被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代，并形成环系，并且是糖基化的，并且
R3＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基，这些理想地被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代，并且可理想地形成环系，并且可以是糖基化的，以及立体异构体，包括对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、对映异构体的混合物或其组合，以及其多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯和前药。
2.根据要点1所述的化合物，其中所述肽结构域包含一个或多个带正电荷的残基。
3.根据要点1或2所述的化合物，其中所述肽结构域包含精氨酸或赖氨酸侧链。
4.根据要点1至3中任一项所述的化合物，其中所述肽结构域包含一个或多个细胞膜穿透结构域(CPP)，诸如阳离子、两性、疏水性或两亲性CPP，选自由以下组成的组：SP、pVEC、聚精氨酸(精氨酸链段)、转运肽(transportan)、TAT和穿透素(penetratin)，或与SEQID NO:16、17、18、19、24或25中的任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性并具有细胞穿透活性的其变体，优选地选自：TAT或穿透素的残基48-60，或其变体。
5.根据要点1至4中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(I)：
Figure BDA0003679692820000051
任选地，其中所述化合物的分子量(MW)为2537.4道尔顿。
6.根据要点5所述的化合物，其中所述化合物选自药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
7.根据要点1至4中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(II)：
Figure BDA0003679692820000052
任选地，其中所述化合物的分子量(MW)为2628.4道尔顿。
8.根据要点7所述的化合物，其中所述化合物选自药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
9.根据要点1至4中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(III)：
Figure BDA0003679692820000053
任选地，其中所述化合物的分子量(MW)为2405.3道尔顿。
10.根据要点9所述的化合物，其中所述化合物选自药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
11.根据要点1所述的化合物，其中所述化合物具有式(IV)：
Figure BDA0003679692820000061
任选地，其中所述化合物的分子量(MW)为2004.4道尔顿。
12.根据要点11所述的化合物，其中所述化合物选自药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
13.根据要点1至12中任一项所述的化合物，其中所述化合物在100nM至100μM的浓度范围内不诱导细胞凋亡或坏死。
14.根据要点1至12中任一项所述的化合物，其中当以100nM与10μM之间的浓度应用于HEK-293细胞时，所述化合物降低细胞内氯离子浓度，任选地以剂量依赖性方式。
15.根据要点1至12中任一项所述的化合物，其中当以100nM至10μM的浓度应用于3D胰腺类器官时，所述化合物降低细胞内氯离子浓度，任选地以剂量依赖性方式。
16.根据要点1至12中任一项所述的化合物，其中当在不存在CFTR的情况下以100nM至10μM的浓度应用于胰腺导管片段时，所述化合物降低细胞内氯离子浓度，任选地以剂量依赖性方式。
17.一种药物组合物，其包含根据要点1至12中任一项所述的化合物，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
18.一种药物组合物，其包含根据要点1至12中任一项所述的化合物，其中所述药物组合物被配制用于通过选自由以下组成的组的途径施用：口服、肺部、直肠、结肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、眼部、耳部、颊、鼻和局部施用；和/或被配制为选自由以下组成的组的剂型：液体分散体、凝胶、气雾剂、软膏、霜剂、冻干制剂、片剂、胶囊；和/或呈现为选自由以下组成的组的剂型：控释制剂、速溶制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂以及混合的速释和控释制剂；和/或呈现为灌肠制剂、离子电渗疗法应用、涂覆植入式医疗装置；或其组合。
19.根据要点17或18中任一项所述的药物组合物，其用于制造药物。
20.根据要点17至19中任一项所述的药物组合物，其用于治疗、减少、抑制或控制人类受试者的与囊性纤维化相关的粘稠痰液或粘液，其中所述药物组合物增加所述粘稠粘液或痰液的电解质含量，诸如氯化物，任选地其中所述药物组合物作为液体媒介物中的溶液或悬浮液，或作为干燥粉末，通过肺部或气雾剂递送施用至所述人类受试者的肺。
21.根据要点1至12中任一项所述的化合物或根据要点17至20中任一项所述的组合物，其用于疗法。
22.根据要点1至12中任一项所述的化合物，或根据要点17至20中任一项所述的组合物，其用于治疗选自以下的CFTR介导的疾病：囊性纤维化、哮喘、烟雾诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰腺功能不全、因先天性双侧输精管缺如(CBAVD)导致的男性不育、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲霉病(ABPA)、肝病、遗传性肺气肿、粘多糖贮积症、氯化物通道病诸如先天性肌强直(汤姆森(Thomson)和贝克尔(Becker)形式)、III型巴特氏综合征(Bartter's syndrome type III)、Dent病、过度惊吓反应症(hyperekplexia)、癫痫。
23.一种治疗、减少、抑制或控制人类受试者的与囊性纤维化相关的粘稠痰液或粘液的方法，其中所述方法包括施用根据要点1至12中任一项所述的化合物或根据要点17至20中任一项所述的组合物，其中所述方法增加所述粘稠粘液或痰液的电解质含量，诸如氯化物，任选地其中所述药物组合物作为液体媒介物中的溶液或悬浮液，或作为干燥粉末，通过肺部或气雾剂递送施用至所述人类受试者的肺。
24.一种治疗、减少、抑制或控制受试者的囊性纤维化的至少一种体征或症状的方法，其中所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的一种或多种根据要点1至12中任一项所述的化合物或根据要点17至20中任一项所述的组合物，任选地与一种或多种治疗剂组合，其中所述体征或症状与气道或呼吸系统相关并且包括以下中的一种或多种：异常粘稠的粘液积聚；总粘蛋白含量增加；炎症因子浓度升高；氯离子的细胞分泌减少；流体分泌受损；气道上皮细胞的顶端钠吸收增加；顶端气道表面液体的酸化和高度降低；慢性咳嗽；慢性肺部感染，以及其组合。
25.根据要点17至20中任一项所述的药物组合物，或根据要点23至24中任一项所述的方法，其中所述化合物优选地选自式(I)、(II)、(III)和(IV)。
附图说明
本发明的新型特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下阐述利用了本发明原理的说明性实施方案和随附图示(在本文也为“附图”和“图”)的具体实施方式，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述附图中：
图1示出式(II)和式(III)对HEK 293细胞的细胞活力的影响。条形图汇总了式(II)和式(III)对细胞活力的影响。所表示的值突出显示细胞总数的百分比。结果以细胞总数的％(活/凋亡/坏死)示出。如图表上看出，没有观察到坏死细胞死亡。对于式(II)和式(III)的化合物，分别在10和100μM中观察到有限的凋亡细胞死亡率。然而，大多数细胞在处理中存活下来。这些结果表明，即使在较高浓度下，测试化合物也没有体外毒性。
图2示出式(I)-式(III)肽对HEK 293细胞的细胞内Cl-水平的影响。每个条件下4-6次实验的细胞内Cl-水平的平均迹线。用HEPES缓冲的细胞外溶液灌注HEK293细胞。由于Cl-从胞质溶胶到细胞外空间的转运，式(I)-式(III)的施用诱导细胞内Cl-水平的降低(反映为荧光强度的增加)。在这一系列实验中，式(I)-式(III)表现出剂量依赖性效应，并且式(II)和式(III)在每个所测试的浓度下均具有类似的最大效果。尽管式(I)还表现出对细胞内Cl-的体外影响，但由于毒性未对其进一步研究。
图3示出I-III肽对HEK 293细胞的细胞内Cl-水平的影响。最大荧光强度变化的条形图。II和III诱导了最高的最大反应，而所有测试化合物均表现出剂量依赖性效应。
图4示出式(II)对胰腺类器官中的细胞内Cl-水平的影响。每个条件下4-6次实验的细胞内Cl-水平的平均迹线。用HEPES缓冲的细胞外溶液灌注胰腺类器官。由于CFTR的活性，细胞外Cl-的去除诱导细胞内Cl-水平的降低(反映为荧光强度的增加)(小图1)。施用处于含140mM Cl-的HEPES缓冲溶液中的式(II)降低细胞内Cl-水平。而在不存在细胞外Cl-的情况下，细胞内Cl-的下降明显更高。
图5示出式(II)对胰腺类器官中的细胞内Cl-水平的影响。最大荧光强度变化的条形图。在不存在细胞外Cl-的情况下，式(II)的效果与CFTR的效果相当。
图6示出式(II)和式(III)对CFTR敲低的胰腺导管片段中的细胞内Cl-水平的影响。导管片段用于提供CLTR2和CLTR-ITC可以在存在或不存在CFTR蛋白的情况下转运Cl-的证据。使用siGLO作为转染对照，并且用siRNA处理siCFTR导管片段以敲低CFTR表达，以模拟囊性纤维化。CLTR2和CLTR-ITC能够在siGLO(对照)以及siCFTR处理的导管片段中转运Cl-。
图7示出治疗期间动物体重的变化(A)以及CFTR敲除小鼠中肺实质密度和肺纤维化的降低(B-C)。
具体实施方式
细胞穿透肽是通常包含介于5与30个之间的氨基酸残基的小寡肽。它们通常带正电荷并且已知在水性环境中具有随机构象，但是在非极性细胞膜中，它们显示出折叠成螺旋构象的倾向(C Bechara、S Sagan,FEBS Letters,2013,587,第1693页)。它们可以通过直接途径或经由内吞作用通过囊泡模式穿过膜。已知细胞穿透肽转运从有机小分子到基因编码DNA的各种货物(JP Richard等人,Journal of Biological Chemistry,2003,278,第585页)。
合成离子转运蛋白或离子通道可以模拟天然离子通道的功能，从而使得对通道替代疗法的未满足的临床需要切实可行(N Busschaert、PA Gale,Angewandte ChemieInternational Edition,2013,52,第1374页.)。可能用于通道替代疗法以治疗由阴离子转运失调造成的疾病(诸如囊性纤维化(CF))的脂质双层氯离子转运蛋白的开发是目前感兴趣的领域。在CF中，氯化物转运受损是受囊性纤维化跨膜转导调节子(CFTR)阴离子通道的单基因突变影响的疾病的主要原因(BP O'Sullivan、SD Freedman,Lancet,2009,373,第1891页)。
基于CPP的治疗可与目前在CF中使用的疗法相组合，因为其各自的作用机制完全不同并产生协同作用。CPP疗法可以增强粘液溶解药物和气道清除技术的效果，因为CPP的应用可增加粘液的水合作用。在与VX化合物的联合应用中发现了协同效应，因为基于CPP的氯离子转运与功能性CFTR在膜中的存在无关。
已经开发了从有机小分子到超分子系统的具有不同分子质量的各种合成氯化物转运蛋白。这些化合物与氯离子一起被动扩散穿过膜，或在膜中形成通道，从而为被动离子转运开辟道路(N Busschaert、PA Gale,Angewandte Chemie International Edition2013,52,第1374页)。
目前已经描述了2000多种CFTR基因突变，而关于疾病易患性仅表征了159种突变(R Bolia等人,J Paediatr Child Health,2018,54,第609页)。全球85％的患者中最常见的突变类型是位置508处的苯丙氨酸缺失(F508del)，然而，迄今为止，根据引起的CFTR缺陷将突变分为七个不同的组(K De Boeck、MD Amaral,Lancet Respir Med,2016,4,第662页)。I类突变，包括引入提前终止密码子的移码、剪接或无义突变；II类突变，其在内质网(ER)处导致错误折叠和蛋白质生物发生受损；V类突变，其由于启动子或剪接异常而导致合成减少；以及VI类突变，其使ER后区室和/或质膜上的CFTR通道不稳定。而III类和IV类突变分别有损门控和通道孔电导，从而选择性地损害CFTR功能。在VII类突变中，无法检测到mRNA。目前CF的临床治疗是基于CFTR调节剂疗法。
CFTR调节剂包括依伐卡托
Figure BDA0003679692820000091
鲁玛卡托/依伐卡托
Figure BDA0003679692820000092
替扎卡托/依伐卡托
Figure BDA0003679692820000093
以及依来卡托/替扎卡托/依伐卡托(TrikaftaTM)。这些药物可以增加CFTR的开放状态概率并从而增加离子通过通道孔的流出，或者可以促进CFTR蛋白折叠。尽管这些药物具有有益效果，但它们的临床使用仅限于具有特定类型的CFTR基因突变的有限患者群体。使用基于CPP的合成氯离子转运蛋白的通道替代疗法可以克服当前治疗的严重限制，因为即使在完全不存在CFTR蛋白的情况下，此类合成氯化物转运蛋白也可促进氯化物穿过生物屏障流出。因此，氯化物通道替代疗法可提供不依赖突变的治疗，因为Cl离子转运不需要CFTR蛋白，并且因此可以在早期用于患者，由此不必在开始此类疗法之前对其患者特异性突变进行表征。此外，还存在若干具有极罕见突变的患者，所述突变尚未归入目前的突变类别。基于CPP的治疗可应用于这些患者而没有任何明确的限制。
本发明的合成氯离子转运蛋白化合物与氯离子一起被动扩散穿过膜，或在膜中形成通道，从而为被动离子转运开辟道路。
合成氯离子转运蛋白可以以不依赖突变的方式使用，因此所有CF患者都可使用根据本发明的化合物进行治疗。
本文所述的化合物具有如下通式：
Figure BDA0003679692820000101
其中，
n＝0-10；
k＝1-200；
X＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基、保护基、C1-10酰基、生物素、荧光和放射性示踪剂、烷基、环烷基和酰基，其可以被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代；
Y＝O、S、NH、CH2、N-OR；
Z＝C1-10烷基或环烷基、芳基、保护基、C1-10酰基、生物素、荧光和放射性示踪剂、烷基、环烷基和酰基，其可以被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代；
R＝H、OH、O-烷基、NH、N-烷基、SH、S-烷基、烷基、烯基、炔基、NH-NH2；
R2＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基，这些理想地被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代，并且可理想地形成环系，并且可以是糖基化的，还包括药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
R3＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基，这些理想地被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代，并且可理想地形成环系，并且可以是糖基化的，还包括药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
在本发明的一个实施方案中，本文所述化合物的一个或多个肽结构域包含一个或多个带正电荷的残基。
在本发明的另一个实施方案中，本文所述化合物的一个或多个所述肽结构域包含精氨酸或赖氨酸侧链。
在本发明的另一个实施方案中，本文所述化合物的一个或多个所述肽结构域是细胞膜穿透肽(CPP)，诸如阳离子、两性、疏水性或两亲性CPP。
在本发明的另一个实施方案中，本文所述化合物的一个或多个所述肽结构域是选自以下中的一种或多种的细胞膜穿透肽：
a)HIV-TAT蛋白或其易位活性衍生物，诸如TAT的残基48至60：GRKKRRQRRRPPQ(SEQID NO:1)，
b)TAT 49-57肽：RKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)，
c)YGRKKRRQRRRP(SEQ ID NO:3)(含有TAT49-57的较长肽)，
d)GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:4)(含有TAT49-57的较长肽)，
e)具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:5)的穿透素，
f)具有序列RQIKIFFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:6)的穿透素变体W48F，
g)具有序列RQIKIWFQNRRMKFKK(SEQ ID NO:7)的穿透素变体W56F，
h)具有序列RQIKIWFQNRRMKFKK(SEQ ID NO:8)的穿透素变体，
i)具有序列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:9)的转运肽，
j)具有序列GWYLNSAGYLLGK(e-Cys)INLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:10)的转运肽-27，
k)具有序列GWYLNSAGYLLGK(e-Cys)INLKALAAL(SEQ ID NO:11)的转运肽-22，
l)单纯疱疹病毒蛋白VP22或来自不同疱疹病毒的其易位活性同源物诸如MDV蛋白UL49，
m)Pep-1，具有序列KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:12)，
n)Pep-2，具有序列KETWFETWFTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:13)。
在一些实施方案中，本文所述化合物的一个或多个所述肽结构域可以是具有SEQID NO:1的氨基酸序列的TAT，或与SEQ ID NO:1具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性并具有细胞穿透活性的其变体；或具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的穿透素，或与SEQ ID NO:5具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性并具有细胞穿透活性的其变体。
在一些实施方案中，本文所述化合物的一个或多个所述肽结构域可包含或由以下组成：SEQ ID NO:2至4或6至13中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2至4或6至13中的任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性并具有细胞穿透活性的序列。
在本发明的其他实施方案中，所述肽结构域包含一个或多个细胞膜穿透结构域，其选自由以下组成的组：SP、pVEC、聚精氨酸(精氨酸链段)、转运肽、TAT和穿透素，或与SEQID NO:1至13中的任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性并具有细胞穿透活性的其变体，优选地选自：TAT或穿透素的残基48-60，或其变体。
在本发明的另一个实施方案中，本文所述的化合物在100nM至100μM的浓度范围内不诱导细胞凋亡或坏死。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的化合物是两性的。
在本发明的一个实施方案中，任选地当应用到上皮表面中或上时，任选地以100nM至10nM的浓度范围，当应用于HEK-293细胞时，本发明的化合物以剂量依赖性方式降低细胞内(Cl-)氯离子浓度。
在本发明的另一个实施方案中，任选地当应用于组织或器官时，任选地以100nM至10nM的浓度范围，当应用于3D胰腺类器官时，本发明的化合物以剂量依赖性方式降低细胞内Cl-浓度。
在本发明的一个实施方案中，在不存在CFTR的情况下，本发明的化合物在100nM至10μM的浓度范围内以剂量依赖性方式降低胰腺导管片段中的细胞内氯离子浓度。
在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物以1,64mg/bwkg的剂量降低cftr敲除小鼠的肺纤维化和肺实质密度。
在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物可用于治疗CFTR介导的疾病，所述疾病选自囊性纤维化、哮喘、烟雾诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰腺功能不全、因先天性双侧输精管缺如(CBAVD)导致的男性不育、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲霉病(ABPA)、肝病、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着症、凝血-纤维蛋白溶解缺陷症诸如蛋白C缺陷症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷症诸如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积病诸如I细胞病/假Hurler、粘多糖贮积症、Sandhof/Tay-Sachs、Crigler-Najjar II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症(hyperinsulemia)、糖尿病、拉伦侏儒症(Laron dwarfism)、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退症、黑色素瘤、1型聚糖病CDG(glycanosis CDG type 1)、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全症、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺陷症、尿崩症(DI)、神经生长性(neurophyseal)DI、肾原性(neprogenic)DI、夏-马-图三氏(Charcot-Marie Tooth)综合征、佩-梅二氏(Perlizaeus-Merzbacher)病、神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、进行性核上性麻痹、皮克氏病(Pick's disease)、若干聚谷氨酰胺神经障碍诸如亨廷顿氏病(Huntington's)、I型脊髓小脑性共济失调、脊髓和延髓肌萎缩、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubal pallidoluysian)和强直性肌营养不良，以及海绵状脑病，诸如遗传性克雅二氏病(hereditary Creutzfeldt-Jakob disease)(由朊病毒蛋白加工缺陷引起)、法布里病(Fabry disease)、斯-施二氏(Straussler-Scheinker)综合征、COPD、干眼病或舍格伦综合征(Sjogren's disease)、骨质疏松症、骨质减少症、骨愈合和骨生长(包括骨修复、骨再生、减少骨吸收和增加骨沉积)、戈汉综合征(Gorham's Syndrome)；氯化物通道病，诸如先天性肌强直(汤姆森和贝克尔形式)、III型巴特氏综合征、Dent病、过度惊吓反应症、癫痫；溶酶体贮积病、安格尔曼综合征(Angelmansyndrome)和原发性纤毛运动障碍(PCD)(纤毛的结构和/或功能的遗传性病症，包括具有内脏逆位的PCD(也被称为卡塔格内综合征(Kartagener syndrome))、没有内脏逆位的PCD和纤毛发育不全)。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的化合物可用于治疗呈现出一种或多种CFTR突变的囊性纤维化患者，所述突变包括I类(例如G542X、W1282X、R553X、Glu831X)、II类(例如F508del、N1303K、I507del)、III类(例如G551D、S549N、V520F)、IV类(例如R117H、D1152H、R374P)或V类突变(例如3849+10kbC>T、2789+5G>A、A455E)。CF患者可呈现为任何此类CFTR突变的纯合子或杂合子，例如F508del纯合子。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的化合物可用于治疗通道病，所述通道病是由位于所有细胞和许多细胞器的膜中的离子通道的功能障碍引起的一组异质性病症，包括呼吸系统疾病(例如，囊性纤维化)和泌尿系统疾病(例如，巴特综合征)。
在本发明的另一个实施方案中，通过在合适的凝胶树脂诸如TentaGel(R)RAM树脂上使用Rink酰胺接头延长肽链来制备本发明的化合物。偶联优选地分两步进行，即，在第一步骤中，在三个小时的振荡下将Fmoc保护的氨基酸、脲鎓偶联剂O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)溶解在作为溶剂的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，接着利用氨基酸、HATU和DIPEA进行第二偶联；然后用DMF、甲醇和DCM洗涤树脂，并且在洗涤后优选地使用2％DBU和2％哌啶的DMF溶液分两步进行脱保护步骤，反应时间为15分钟和5分钟。在氨基酸偶联后，产生硫脲元素，由此游离的N末端与特定的异硫氰酸酯在碱性条件下在DMF中发生反应。在完成序列和硫脲构建体之后，用TFA/水/dl-二硫苏糖醇(DTT)/TIS在0℃下持续1h进行切割。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗有需要的受试者的通道病的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本文公开的化合物，任选地与一种或多种治疗剂组合。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗有需要的受试者的CFTR介导的疾病的方法，所述疾病选自囊性纤维化、哮喘、COPD、烟雾诱发的COPD和慢性支气管炎纤维化，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本文公开的化合物，任选地与一种或多种治疗剂组合，优选地其中所述CFTR介导的疾病是囊性纤维化。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗有需要的人类受试者的囊性纤维化的方法，其中所述方法包括向人类受试者施用治疗有效量的一种或多种本文公开的化合物，任选地与一种或多种治疗剂组合，其中所述受试者的年龄介于2岁与5岁之间，或介于6岁与11岁之间，或12岁以上。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗、减少、抑制或控制受试者的囊性纤维化的方法，其中所述方法包括同时、单独或顺序地向受试者施用(i)一种或多种治疗剂，以及(ii)治疗有效量的一种或多种本文公开的化合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗、减少、抑制或控制受试者的囊性纤维化的至少一种体征或症状的方法，其中所述方法包括向人类受试者施用治疗有效量的一种或多种本文公开的化合物，任选地与一种或多种治疗剂组合，其中所述体征或症状与气道或呼吸系统相关并且包括以下中的一种或多种：异常粘稠的粘液积聚；总粘蛋白含量增加；炎症因子浓度升高；氯离子的细胞分泌减少；流体分泌受损；气道上皮细胞的顶端钠吸收增加；顶端气道表面液体的酸化和高度降低；慢性咳嗽；慢性肺部感染，以及其组合。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗、减少、抑制或控制受试者的囊性纤维化的至少一种体征或症状的方法，其中所述方法包括同时、单独或顺序地向受试者施用(i)一种或多种治疗剂，以及(ii)治疗有效量的一种或多种本文公开的化合物，其中所述体征或症状与气道或呼吸系统相关并且包括以下中的一种或多种：异常粘稠的粘液积聚；总粘蛋白含量增加；炎症因子浓度升高；氯离子的细胞分泌减少；流体分泌受损；气道上皮细胞的顶端钠吸收增加；顶端气道表面液体的酸化和高度降低；慢性咳嗽；慢性肺部感染，以及其组合。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种药物组合物，其用于治疗、减少、抑制或控制人类受试者的与囊性纤维化相关的粘稠痰液或粘液，其中所述药物组合物增加所述粘稠粘液或痰液的电解质含量，诸如氯化物，任选地其中所述药物组合物作为液体媒介物中的溶液或悬浮液，或作为干燥粉末，通过肺部或气雾剂递送施用至所述人类受试者的肺。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗、减少、抑制或控制人类受试者的与囊性纤维化相关的粘稠痰液或粘液的方法，其中所述方法包括施用化合物，其中所述方法增加所述粘稠粘液或痰液的电解质含量，诸如氯化物，任选地其中所述药物组合物作为液体媒介物中的溶液或悬浮液，或作为干燥粉末，通过肺部或气雾剂递送施用至所述人类受试者的肺。
实施例
实施例1
利用Fmoc化学，在TentaGel R RAM树脂(0.19mmol/g)(E Bayer,Angew.Chem.Int.Ed.,1991,30,第113页.)上使用Rink酰胺接头以0.4mmol规模手动延长肽链。偶联分两步进行。在第一步骤中，在三个小时的振荡下，在作为溶剂的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中使用3当量的Fmoc保护的氨基酸、3当量的脲鎓偶联剂O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)(LA Carpino,Am.Chem.Soc.,1993,115,第4379页.)和6当量的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。第二偶联使用1当量氨基酸、1当量HATU和2当量的DIPEA进行。在偶联步骤之后，将树脂用DMF洗涤3次，用甲醇洗涤一次并用DCM洗涤3次。通过这些偶联条件，没有观察到截短序列。使用2％DBU和2％哌啶的DMF溶液分两步进行脱保护步骤，反应时间为15分钟和5分钟。
使用与前述相同的溶剂洗涤树脂。在氨基酸偶联后，产生硫脲元素。游离的N末端与特定的异硫氰酸酯在碱性条件下在DMF中发生反应。在完成序列和硫脲构建体之后，用TFA/水/dl-二硫苏糖醇(DTT)/TIS在0℃下持续1h进行切割。使用TFA/水/dl-二硫苏糖醇(DTT)/TIS(90/5/2.5/2.5)在0℃下持续1h进行切割。使用Phenomenex Luna C18
Figure BDA0003679692820000163
10μm柱(10mm x250mm)通过反相HPLC进行纯化。117HPLC设备由JASCO制造并且所使用的溶剂体系如下：0.1％TFA的水溶液；0.1％TFA、80％乙腈的水溶液；在60min期间使用线性梯度，流速为4.0mL min-1，并且在206nm处进行检测。使用具有Phenomenex Luna C18
Figure BDA0003679692820000164
5μm柱(4.6mm x 250mm)的JASCO HPLC系统，通过分析型HPLC确定级分纯度并且将纯级分汇集并冻干。纯化的肽通过质谱进行表征。
式(I)：
Figure BDA0003679692820000161
该化合物的分子量(MW)为2537.4Da；保留时间为12.8min并且其色谱性能：梯度：5->80％25min，A洗脱液：0.1％TFA水，B洗脱液：0.1％TFA 80％ACN 20％水(柱：PhenomenexLuna C18(2)5um，100A，250*4.6mm)。
式(II)：
Figure BDA0003679692820000162
该化合物的分子量(MW)为2628.4Da；保留时间为14.9min并且其色谱性能：梯度：5->80％25min，A洗脱液：0.1％TFA水，B洗脱液：0.1％TFA80％ACN 20％水(柱：PhenomenexLuna C18(2)5um，100A，250*4.6mm)；CF3基团的典型IR波数：1132cm-1、951.6cm-1、887.2cm-1；HRMS：2628.357Da；19F NMR(376.5MHz，DMSO-d6，4mg/mL 298K)-61.5ppm
Figure BDA0003679692820000171
1H NMR信号分配，DMSO-d6，4mg/mL 298K
式(III)：
Figure BDA0003679692820000172
该化合物的分子量(MW)为2405.3Da；保留时间为13.5min，并且其色谱性能：梯度：5->80％25min，A洗脱液：0.1％TFA水，B洗脱液：0.1％TFA80％ACN 20％水(柱：PhenomenexLuna C18(2)5um，100A，250*4.6mm)N＝C＝S基团的典型IR波数：1390cm-1、1274cm-1、1042cm-1；N＝C键的典型IR波数：2095cm-1，HRMS：2405.279Da；
式(IV)：
Figure BDA0003679692820000181
该化合物的分子量(MW)为2004.4Da；保留时间为13.9min，并且其色谱性能：梯度：5->80％25min，A洗脱液：0.1％TFA水，B洗脱液：0.1％TFA 80％ACN 20％水(柱：PhenomenexLuna C18(2)5um，100A，250*4.6mm)
实施例2
式(I)-(式(III)的化合物对细胞命运的影响
为了研究根据本发明的化合物对细胞命运的影响，根据制造商的说明使用细胞凋亡/坏死检测试剂盒(Abcam目录号：ab176750)。简单来说，将HEK-293细胞与各种浓度的CPP一起在37℃下孵育30min。然后将细胞洗涤3次，在200μL测定缓冲液中孵育并在室温下向其中加载CytoCalcein 450、Nuclear Green和Apopxin Deep Red，持续30-60min。在此之后，洗涤细胞并对其成像。使用Zeiss LSM880共聚焦显微镜，根据每种染料使用不同的通道和波长捕获图像：CytoCalcein 450(Ex/Em＝405/450nm)，Nuclear Green(Ex/Em＝490/520nm)和Apopxin Deep Red(Ex/Em＝630/660nm)。对于每个条件，捕获五张图像，并由两名独立的研究人员对细胞总数进行计数。结果以细胞总数的％(活/凋亡/坏死)示出(图1)。如图可以看出，没有观察到坏死细胞死亡。对于式(I)和式(II)的化合物，分别在10和100μM中观察到有限的凋亡细胞死亡率。然而，大多数细胞在处理中存活下来。这些结果表明，即使在较高浓度下，测试化合物也没有体外毒性。
使用浓度为1-100μM的穿透素作为对照，其对细胞损伤没有影响。相反，如绿色质膜信号所展示，式(I)以浓度依赖性方式诱导细胞凋亡，因此未选择该化合物进行进一步分析。另一方面，式(II)和式(III)即使在100μM下也显示出可忽略不计的毒性，并且97.3％的细胞在孵育后是活的。这表明所应用的化合物在应用过程中不会损伤肺上皮细胞，从而可以限制副作用。
实施例3
式(I)-式(III)在不含细胞外Cl-的培养基中对2D HEK 293细胞中的细胞内Cl-水平的影响
为了评估CPP的生物活性，通过在0.05％Pluronic F-127的存在下持续30min向HEK-293细胞中加载5μM N-(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基溴化喹啉鎓(MQAE；ThermoFischer；目录号：E3101)来测量细胞内Cl-水平的变化。将细胞用不含Cl-的外部溶液浸泡，并在37℃下以2-3ml/min的灌注速率用不同浓度的CPP处理。感兴趣区域(ROI)通过xcellencesoftver(Olympus)确定，并且通过用配备有340/11nm激发滤光片的MT20光源激发细胞来确定Cl-的变化。激发和发射波长通过400nm分束器分开并且通过Hamamatsu ORCA-ER CCD相机捕获发射光。每秒获得一个测量结果。在进一步分析期间，将荧光信号针对初始荧光强度归一化(F1/F0)并表示为归一化的MQAE荧光(图2)。计算最大荧光强度变化(图3)。值得注意的是，归一化的荧光强度的增加代表细胞内Cl-浓度的降低。N：4-5次独立实验/每个测试条件。
所有所测试的CPP均以剂量依赖性方式降低细胞内Cl-浓度(图2-3)。在100nM中，只有式(I)表现出中等反应，而在1和10μM中，所有合成氯离子转运蛋白均降低细胞内Cl-浓度。通过式(II)和式(III)获得最高反应。对照穿透素肽没有影响。
实施例4
在存在或不存在细胞外Cl-的情况下，式(II)对3D胰腺类器官中的细胞内Cl-水平的影响
为了测试CPP在原代3D细胞中的Cl-转运能力，如上所述向类器官上加载MQAE，并将其浸泡在标准HEPES缓冲溶液中(图4)。从细胞外溶液中去除细胞外Cl-导致细胞内Cl-减少，这最大可能是由于Cl-通过CFTR从胞质溶胶中流出。正如预期的那样，使用100μMCFTRinh172对CFTR进行药理学抑制几乎完全消除了荧光增加。在存在和不存在细胞外Cl-的情况下，式(II)的施用均诱导细胞内Cl-流出，这不受CFTR活性的影响(图5)。N：4-5次独立实验/每个测试条件。
实施例5
在不存在细胞外Cl-的情况下，式(I)和式(III)对CFTR敲低的胰腺导管片段中的细胞内Cl-水平的影响
为了测试CPP的生物活性，用siRNA处理分离的小鼠胰腺导管片段以改变CFTR表达。对于转染对照，使用指示剂(SiGLO Green；Dharmacon；目录号：D-001630-01-50)和siCFTR(SMARTpool：ON-TARGETplus Cftr siRNA；Dharmacon；目录号：L-042164-00-0005)。将导管片段保存在培养溶液中，并在12h后在6孔板中的无血清培养基中使用Lipofectamine 2000与siRNA双链体根据制造商的方案进行转染(20-40nM/孔)。在将双链体添加到细胞中6小时后，将培养基更换为含有血清的完全补料培养基。在48h后收获导管片段并用于测量(图6)。
式(I)和式(II)均在不含Cl-的细胞外培养基中在siGlo和siCFTR细胞中诱导Cl-流出，进一步表明所测试的合成氯离子转运蛋白转运Cl-穿过质膜。N：4-5次独立实验/每个测试条件。
实施例6
式(II)对cftr敲除小鼠的肺纤维化严重程度的影响
为了评估体内施用的式(II)对肺组织学参数的影响，本实施例使用了Cftrtm1UncTg(FABPCFTR)1Jaw/J小鼠(Jackson Laboratory，品系号：002364)。FABP-hCFTR-CFTR双转基因小鼠携带FABP-hCFTR转基因[大鼠脂肪酸结合蛋白2，指导人类囊性纤维化跨膜转导调节子(ATP结合盒亚家族C，成员7)基因的表达的肠道启动子]和囊性纤维化跨膜转导调节子同源基因(Cftr)的靶向敲除突变。本研究中使用的小鼠为8-12周龄，野生型(WT)动物的体重为20-25克并且CFTR敲除动物的体重为15-17克，所有组的性别比为1:1。实验是在遵守用于保护用于科学目的的动物的NIH指南和欧盟指令2010/63/EU的情况下进行的。该研究由国家动物实验科学伦理委员会(National Scientific Ethical Committee on AnimalExperimentation)授权，许可证号为XXI./1540/2020。将式(II)溶解于生理盐水中，浓度为10μM。经处理的小鼠在连续氧气流(2L/min)的雾化器中在5分钟内接受溶解在生理盐水溶液中的400μL式(II)。对照动物接受作为媒介物的生理盐水。将小鼠分为如下4个治疗组：野生型对照(第1组)、CFTR敲除对照(第2组)、经治疗的野生型(第3组)、经治疗的CFTR敲除(第4组)。每天进行治疗，持续4周。在实验结束时，小鼠接受末端麻醉并取出肺。将肺固定以用于组织学检查，并进行三色染色以评估肺实质密度和肺纤维化。对切片进行数字化并且如下对纤维化进行评分。1388X1038分辨率的照片是使用Zeiss ICc3相机用10x和40x放大物镜拍摄的。如先前所述，在FIJI ImageJ包(v2.1.0/1.53e，Java 1.8..0_172 64位)中进行背景光照的校正(使用40x物镜拍摄的图像)(https://imagejdocu.list.lu/howto/ working/how_to_correct_background_illumination_in_brightfield_microscopy)。使用具有内置正像素计数v9宏的Leica Aperio Image Scope(12.4.3.5008)进行Massons三色纤维化染色的anylin blue分量的分析，其中色调阈值极限值设置为0,607并且色调宽度为0,12(阈值极限值130-130、130-230)。正像素计为纤维化，负像素计为组织。使用具有内置正像素计数v9宏且没有色调极限值(0-175；175-255)的Leica Aperio Image Scope(12.4.3.5008)进行空气/组织比例的分析。支气管和血管区域被排除在分析之外。
动物的体重监测表明，所有组中的动物均保持其初始体重(图7.A)。与对照组相比，式(II)的体内施用显著降低CFTR敲除小鼠的肺实质密度(35.2±5.2％相对于26.4±2.2％)和肺纤维化(26.7±2.4％相对于22.4±1.6％)(图7.B-C)。治疗期间未观察到不良事件。在治疗的动物中未观察到毒性的临床体征。

Claims (25)

1.一种式(X)的化合物：
Figure FDA0003679692810000011
或药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合，其中，
n＝0-10
k＝1-200
X＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基、保护基、C1-10酰基、生物素、荧光和放射性示踪剂、烷基、环烷基和酰基，其被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代
Y＝O、S、NH、CH2、N-OR，
Z＝C1-10烷基或环烷基、芳基、保护基、C1-10酰基、生物素、荧光和放射性示踪剂、烷基、环烷基和酰基，其被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代
R＝H、OH、O-烷基、NH、N-烷基、SH、S-烷基、烷基、烯基、炔基、NH-NH2、
R2＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基，这些被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代，并形成环系，并且是糖基化的，并且
R3＝H、C1-10烷基或环烷基、芳基，这些理想地被N、O、S、P、Se、Si、As、卤化物取代，并且可理想地形成环系，并且可以是糖基化的，以及立体异构体，包括对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、对映异构体的混合物或其组合，以及其多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯和前药。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述肽结构域包含一个或多个带正电荷的残基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述肽结构域包含精氨酸或赖氨酸侧链。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述肽结构域包含一个或多个细胞膜穿透结构域(CPP)，诸如阳离子、两性、疏水性或两亲性CPP，选自由以下组成的组：SP、pVEC、聚精氨酸(精氨酸链段)、转运肽、TAT和穿透素，或与SEQ ID NO:16、17、18、19、24或25中的任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性并具有细胞穿透活性的其变体，优选地选自：TAT或穿透素的残基48-60，或其变体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(I)：
Figure FDA0003679692810000021
任选地，其中所述化合物的分子量(MW)为2537.4道尔顿。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述化合物选自药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(II)：
Figure FDA0003679692810000022
任选地，其中所述化合物的分子量(MW)为2628.4道尔顿。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中所述化合物选自药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(III)：
Figure FDA0003679692810000023
任选地，其中所述化合物的分子量(MW)为2405.3道尔顿。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中所述化合物选自药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(IV)：
Figure FDA0003679692810000031
任选地，其中所述化合物的分子量(MW)为2004.4道尔顿。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述化合物选自药学上可接受的立体异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋混合物、多晶型物、互变异构体、溶剂化物、盐、酯、前药或其组合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中所述化合物在100nM至100μM的浓度范围内不诱导细胞凋亡或坏死。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中当以100nM与10μM之间的浓度应用于HEK-293细胞时，所述化合物降低细胞内氯离子浓度，任选地以剂量依赖性方式。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中当以100nM至10μM的浓度应用于3D胰腺类器官时，所述化合物降低细胞内氯离子浓度，任选地以剂量依赖性方式。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中当在不存在CFTR的情况下以100nM至10μM的浓度应用于胰腺导管片段时，所述化合物降低细胞内氯离子浓度，任选地以剂量依赖性方式。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中所述药物组合物被配制用于通过选自由以下组成的组的途径施用：口服、肺部、直肠、结肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、眼部、耳部、颊、鼻和局部施用；和/或被配制为选自由以下组成的组的剂型：液体分散体、凝胶、气雾剂、软膏、霜剂、冻干制剂、片剂、胶囊；和/或呈现为选自由以下组成的组的剂型：控释制剂、速溶制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂以及混合的速释和控释制剂；和/或呈现为灌肠制剂、离子电渗疗法应用、涂覆植入式医疗装置；或其组合。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的药物组合物，其用于制造药物。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的药物组合物，其用于治疗、减少、抑制或控制人类受试者的与囊性纤维化相关的粘稠痰液或粘液，其中所述药物组合物增加所述粘稠粘液或痰液的电解质含量，诸如氯化物，任选地其中所述药物组合物作为液体媒介物中的溶液或悬浮液，或作为干燥粉末，通过肺部或气雾剂递送施用至所述人类受试者的肺。
21.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物或根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其用于疗法。
22.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，或根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其用于治疗选自以下的CFTR介导的疾病：囊性纤维化、哮喘、烟雾诱发的COPD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰腺功能不全、因先天性双侧输精管缺如(CBAVD)导致的男性不育、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲霉病(ABPA)、肝病、遗传性肺气肿、粘多糖贮积症、氯化物通道病诸如先天性肌强直(汤姆森和贝克尔形式)、III型巴特氏综合征、Dent病、过度惊吓反应症、癫痫。
23.一种治疗、减少、抑制或控制人类受试者的与囊性纤维化相关的粘稠痰液或粘液的方法，其中所述方法包括施用根据权利要求1至12中任一项所述的化合物或根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其中所述方法增加所述粘稠粘液或痰液的电解质含量，诸如氯化物，任选地其中所述药物组合物作为液体媒介物中的溶液或悬浮液，或作为干燥粉末，通过肺部或气雾剂递送施用至所述人类受试者的肺。
24.一种治疗、减少、抑制或控制受试者的囊性纤维化的至少一种体征或症状的方法，其中所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的一种或多种根据权利要求1至12中任一项所述的化合物或根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，任选地与一种或多种治疗剂组合，其中所述体征或症状与气道或呼吸系统相关并且包括以下中的一种或多种：异常粘稠的粘液积聚；总粘蛋白含量增加；炎症因子浓度升高；氯离子的细胞分泌减少；流体分泌受损；气道上皮细胞的顶端钠吸收增加；顶端气道表面液体的酸化和高度降低；慢性咳嗽；慢性肺部感染，以及其组合。
25.根据权利要求17至20中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求23至24中任一项所述的方法，其中所述化合物优选地选自式(I)、(II)、(III)和(IV)。
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