CN114814218A - α烯醇化酶及其多肽片段在淋巴水肿中的应用 - Google Patents

α烯醇化酶及其多肽片段在淋巴水肿中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种α烯醇化酶（Alpah‑enolase）及其多肽片段在尿液和血液中的应用，具体为尿液、血液中的α烯醇化酶及其多肽片段在原发、继发淋巴水肿疾病诊断、鉴别诊断、治疗和预后评估及机理研究中的应用。淋巴水肿是由淋巴系统发育不良或严重损伤而引起的一种慢性疾病，其显著特点为淋巴液生成和引流失衡，大量组织液在组织间隙滞留，最终导致组织广泛水肿。淋巴水肿为高致残类疾病，在世界卫生组织对致残类疾病排列中列为第２位。本发明通过研究证实，与健康人（正常对照组）相比，尿液、血液中的α烯醇化酶及其多肽片段在原发、继发淋巴水肿患者中表达升高，可用于原发、继发淋巴水肿疾病的诊断、鉴别诊断、治疗和预后评估，并且为进一步机理研究提供了依据。

Description

α烯醇化酶及其多肽片段在淋巴水肿中的应用
技术领域
本发明涉及尿液、血液α烯醇化酶及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液、血液α烯醇化酶及其多肽片段在原发、继发淋巴水肿诊断、鉴别诊断、治疗和预后评估及机理研究中的应用。
背景技术
淋巴水肿是由淋巴系统发育不良或严重损伤而引起的一种慢性疾病，其显著特点为淋巴液生成和引流失衡，大量组织液在组织间隙滞留，最终导致组织广泛水肿。淋巴水肿为高致残类疾病，在世界卫生组织对致残类疾病排列中列为第２位。主要原因是由于该病在发病初期往往得不到重视，疾病由肢体浅层软组织内体液积聚逐渐进展，经历纤维结缔组织增生、脂肪硬化，筋膜增厚及整个肢体变粗的不可逆病程。因皮肤增厚，表皮过度角化，皮下组织增生．其中包括大量增生的纤维成分，使晚期的肢体病变组织坚硬如象皮，又称为象皮肿。病人除肢体增粗外，还常伴有丹毒发作、皮肤赘疣样增生及溃疡等．部分会致残而丧失劳动能力。基于病因不同，淋巴水肿分为原发性和继发性2大类。患者约10％属于先天性淋巴系统缺陷引起的原发性淋巴水肿，起病隐匿，无明显诱因，不易诊断。其余90%是由于丝虫病、局部感染、外伤，肿瘤切除手术后所导致的继发性病变。原发性、继发性淋巴水肿的诊断与鉴别诊断目前在结合临床体征、病史的基础上，主要依赖影像学检查，但各种影像学检查手段都具有一定的局限性。目前针对该疾病，没有能够辅助疾病诊断与鉴别诊断、可作为常规早期筛查的有效的疾病标志物应用于临床
a烯醇化酶又称为非神经烯醇化酶，是烯醇化酶的3个亚型之一，主要位于细胞质，也存在于多种真核细胞的细胞膜及细胞核中，是一种在细胞能量代谢过程中具有重要作用的酶，在糖酵解过程中，可使2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，又能催化逆向反应，使磷酸烯醇式丙酮酸转化为 2 -磷酸甘油酸。近年发现ENO1除了在糖酵解中发挥作用外，还具有纤溶酶原受体作用，可以调控肿瘤生长，作为自身抗原/抗体参与免疫反应。本研究显示原发、继发淋巴水肿患者尿液、血液中α烯醇化酶较健康人组出现表达均上调。
血液是临床检测常用的样本类型，而尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液、血液蛋白或多肽研究，实现用方便、快捷、易重复的尿液、血液检测辅助原发、继发淋巴水肿患者的诊断及鉴别诊断，治疗和预后评估，也为进一步尿液、血液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液、血液α烯醇化酶及其多肽片段在制备用于原发、继发淋巴水肿疾病诊断、鉴别诊断、治疗和预后评估及机理研究等制剂的应用。
优选地，所述尿液、血液α烯醇化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(MSIITDIYAREVLDSRGNPT VEVELYTESG AFGRGIVPSG ASTGEHEAVE LRDGDKSRFM 60
GKGVTKAVDN VNKLIAKEIV GYDVTDQRAI DQAMIKLDGT PNKAKLGANA ILGVSIAAAR 120
AAADELEMPL YNYLGGFNAH VLPTPMMNVI NGGAHANNDV DFQEFMIMPV GASSVKEAIR 180
MGSETFHNLK AILNERGYST AVGDEGGFAP DLKNNEEPFE ILVEAIERAG YKPGKDIAIA 240
FDCAASEFYN EETGKYDLKG EGENGQSFTA EEFVDLLDSI VDKYPIVSIE DPLDENNWED 300
WQMATAKLGK KVQIVGDDLF VTNTDYLAKG IKMGVANSIL IKVNQIGTLT ETVEAIEMAK 360
EAGYTAIVSH RSGETEDTTI ADLVVAMNAG QIKTGSMSRT ERIAKYNQLM RIEDQLESTS 420
EYKGIHGFYN LDEAARNTIT SK）；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述制剂为淋巴水肿患者尿液、血液α烯醇化酶及其多肽片段检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合α烯醇化酶及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
优选地，所述检测方法包括直接检测α烯醇化酶及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
优选地，所述检测方法包括直接检测α烯醇化酶及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体或液相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述标准品包括α烯醇化酶标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：α烯醇化酶质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他固相载体或液相载体。
优选地，所述载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素、磁珠中的任意一种及具有类似功能的载体。
发明人首先收集了健康人、原发和继发淋巴水肿患者的尿液、血液标本，尿液标本4000r/min离心5min后，吸取上清液，采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，进行SDS-PAGE酶解。处理后的尿液、血液样本进行Label-free质谱分析。将原发、继发淋巴水肿组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。以蛋白表达量差异在1.2倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行鉴定，利用数据库检索得到差异蛋白α烯醇化酶。
本发明通过研究证实与健康人相比，α烯醇化酶及其多肽片段在淋巴水肿患者的尿液、血液中均呈高表达，从而提出检测尿液、血液α烯醇化酶及其多肽片段可用于原发、继发淋巴水肿的辅助诊断、鉴别诊断、治疗和预后评估。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1是尿液α烯醇化酶及其多肽片段在原发、继发淋巴水肿组及健康对照组中含量图。
图2是血液α烯醇化酶及其多肽片段在原发、继发淋巴水肿组及健康对照组中含量图。
具体实施方式
实施例1 尿液、血液标本的收集与处理
选取原发、继发淋巴水肿患者作为实验组，选取同期健康体检者作为正常对照组。收集各组研究对象的血液样本1ml、新鲜晨尿样本30ml，将收集的尿液标本4000r/min离心5min后，吸取上清液，每管2ml分装，所有样本-80℃冰箱保存。
实施例2 质谱分析和尿液、血液多肽的筛选
对尿液、血液样品进行蛋白提取，并对提取的蛋白浓度进行测定。尿液、血液样本进行Label-free质谱分析。将实验组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。组间比较采用t-test进行差异分析，以蛋白表达量差异在1.2倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异表达蛋白。
与健康人相比，α烯醇化酶在原发、继发淋巴水肿患者的尿液、血液中呈高表达，分别如图1，2所示，α烯醇化酶在正常对照组和原发、继发淋巴水肿组尿液、血液中的表达具有显著性差异。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京世纪坛医院
<120> α烯醇化酶及其多肽片段在淋巴水肿中的应用
<130> 1
<140> 21PENO1-CN
<141> 2021-1-18
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 442
<212> PRT
<213> Alpah-enolase
<400> 1
Met Ser Ile Ile Thr Asp Ile Tyr Ala Arg Glu Val Leu Asp Ser Arg
1 5 10 15
Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Glu Leu Tyr Thr Glu Ser Gly Ala Phe
20 25 30
Gly Arg Gly Ile Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Glu His Glu Ala
35 40 45
Val Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Arg Phe Met Gly Lys Gly Val
50 55 60
Thr Lys Ala Val Asp Asn Val Asn Lys Leu Ile Ala Lys Glu Ile Val
65 70 75 80
Gly Tyr Asp Val Thr Asp Gln Arg Ala Ile Asp Gln Ala Met Ile Lys
85 90 95
Leu Asp Gly Thr Pro Asn Lys Ala Lys Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu
100 105 110
Gly Val Ser Ile Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ala Asp Glu Leu Glu Met
115 120 125
Pro Leu Tyr Asn Tyr Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Val Leu Pro Thr
130 135 140
Pro Met Met Asn Val Ile Asn Gly Gly Ala His Ala Asn Asn Asp Val
145 150 155 160
Asp Phe Gln Glu Phe Met Ile Met Pro Val Gly Ala Ser Ser Val Lys
165 170 175
Glu Ala Ile Arg Met Gly Ser Glu Thr Phe His Asn Leu Lys Ala Ile
180 185 190
Leu Asn Glu Arg Gly Tyr Ser Thr Ala Val Gly Asp Glu Gly Gly Phe
195 200 205
Ala Pro Asp Leu Lys Asn Asn Glu Glu Pro Phe Glu Ile Leu Val Glu
210 215 220
Ala Ile Glu Arg Ala Gly Tyr Lys Pro Gly Lys Asp Ile Ala Ile Ala
225 230 235 240
Phe Asp Cys Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Glu Glu Thr Gly Lys Tyr
245 250 255
Asp Leu Lys Gly Glu Gly Glu Asn Gly Gln Ser Phe Thr Ala Glu Glu
260 265 270
Phe Val Asp Leu Leu Asp Ser Ile Val Asp Lys Tyr Pro Ile Val Ser
275 280 285
Ile Glu Asp Pro Leu Asp Glu Asn Asn Trp Glu Asp Trp Gln Met Ala
290 295 300
Thr Ala Lys Leu Gly Lys Lys Val Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu Phe
305 310 315 320
Val Thr Asn Thr Asp Tyr Leu Ala Lys Gly Ile Lys Met Gly Val Ala
325 330 335
Asn Ser Ile Leu Ile Lys Val Asn Gln Ile Gly Thr Leu Thr Glu Thr
340 345 350
Val Glu Ala Ile Glu Met Ala Lys Glu Ala Gly Tyr Thr Ala Ile Val
355 360 365
Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Thr Ile Ala Asp Leu Val
370 375 380
Val Ala Met Asn Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Met Ser Arg Thr
385 390 395 400
Glu Arg Ile Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Met Arg Ile Glu Asp Gln Leu
405 410 415
Glu Ser Thr Ser Glu Tyr Lys Gly Ile His Gly Phe Tyr Asn Leu Asp
420 425 430
Glu Ala Ala Arg Asn Thr Ile Thr Ser Lys
435 440

Claims (9)

1.尿液、血液α烯醇化酶及其多肽片段在制备用于原发、继发淋巴水肿疾病诊断、鉴别诊断、治疗和预后评估及机理研究等制剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液、血液α烯醇化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为原发、继发淋巴水肿患者尿液、血液α烯醇化酶及其多肽片段检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合α烯醇化酶及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测α烯醇化酶及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测α烯醇化酶及其多肽片段或其相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体或液相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品包括α烯醇化酶标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：α烯醇化酶控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他固相载体或液相载体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素、磁珠等中的任意一种及具有类似功能的其他载体。
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