CN114813557A - 一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于对羟基苯丙氨酸检测技术领域，尤其涉及一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，所采用的试剂盒由以下试剂组成：试剂A：PH＝10±0.2缓冲液；试剂B：4‑氨基安替比林20g/L；试剂C：铁氰化钾溶液80g/L，所述试剂B为称取1.0g 4‑AAP溶于试剂A后，定容至50mL后得4‑AAP储备液；将该储备液用5mL氯仿萃取两次后得试剂B，低温密闭保存；所述试剂C为称取4.0g铁氰化钾溶于试剂A后，定容至50mL即得试剂C，低温避光保存；本发明具有以下有益效果：本发明所需试剂构成简单，费用低廉；可实现定量检测；实验操作便捷，利用现有临床实验室常规仪器即可检测，不需额外购置大型实验设备，并且可以与现今临床实验室流水线设备相结合，实现短时间大规模检测。
Description
技术领域
本发明属于对羟基苯丙氨酸检测技术领域，尤其涉及一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
恶性肿瘤患者细胞的代谢物(对羟基苯丙氨酸及其衍生物)可经尿液排出体外，检测其尿液中的对羟基苯丙氨酸是一种无创、无痛、快速、便捷的筛查恶性肿瘤方法，在恶性肿瘤的早发现、早诊断、早治疗及预后判断方面具有重要意义。已有研究显示，恶性肿瘤中的对羟基苯丙氨酸及其代谢衍生物含量显著高于健康人和良性肿瘤患者；检查对羟基苯丙氨酸及其代谢衍生物在诊断恶性肿瘤的敏感性为89.8％，阴性预测值为91.4％，提示对羟基苯丙氨酸在恶性肿瘤(尤其是未经治疗的恶性肿瘤)的筛查中具有重要价值。
目前，测定对羟基苯丙氨酸及其代谢衍生物含量的方法主要有高效液相色谱法、质谱法和毛细管电泳法等，但需要购置特定仪器且使用的仪器昂贵、试剂消耗量大且分析时间较长，不能满足大规模的癌症筛查要求。
为了满足临床大规模恶性肿瘤筛查的需要，URC(Urine-test Reagent forCancer Screen and Monitoring)试剂盒近年来被应用于临床体外尿液筛查监测肿瘤。URC试剂盒常用于高危人群早期癌症筛查。URC试剂盒主要检测原理是体内有癌细胞活动时,尿中对羟基苯丙氨酸及其代谢物明显升高，URC试剂中的汞(有毒试剂)可与对羟基苯丙氨酸结合发生特征性显示反应，通过肉眼观察反应生成的沉淀颜色变化，进而实现定性判断尿液中对羟基苯丙氨酸的含量，从而判断受试者体内是否有对羟基苯丙氨酸异常代谢。然而，使用URC方法检测尿液对羟基苯丙氨酸尚存在以下缺点：①无法定量分析且存在人为主观影响：利用人肉眼对反应沉淀产物的颜色深浅推测尿液中对羟基苯丙氨酸含量，无法实现定量检测，且存在检测人员对检测判断的主观性，最终影响其在肿瘤疾病临床早期诊断及疗效评估中的精准应用；②不环保：检测产生的废弃汞盐可污染环境；③检测结果易受干扰：易受到尿液的颜色，药物，尿中所含蛋白、还原性物质、尿液酸碱度以及无机盐的干扰，从而影响检测结果准确性；④不安全：在检测过程中使用含汞试剂，其可通过呼吸道、皮肤或消化道等不同途径侵入人体，造成人体肝、肾、大脑等器官受损。
针对上述现有检测方法的现况，即高效液相色谱法、质谱法和毛细管电泳法等定量方法存在需要购置特定仪器、费用高昂、耗时长、不适合大规模应用，以及定性的 URC方法虽然不需购买昂贵的仪器，但实际应用存在不安全、不环保、不准确等不足，急需研究出一种具有费用低廉、检测速度快，并适用于临床实验室现有仪器、不需额外购置仪器，操作便捷、满足大规模的癌症筛查要求的检测方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术中的不足，提供一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，其具有费用低廉、检测速度快，并适用于临床实验室现有仪器、不需额外购置仪器，操作便捷、满足大规模的癌症筛查要求。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，其特征在于：所采用的试剂盒由以下试剂组成：试剂A：PH＝10±0.2缓冲液；试剂B：4-氨基安替比林20g/L；试剂C：铁氰化钾溶液80g/L。
进一步的，所述试剂B为称取1.0g 4-AAP溶于试剂A后，定容至50mL后得4- AAP储备液；将该储备液用5mL氯仿萃取两次后得试剂B，低温密闭保存。
进一步的，所述试剂C为称取4.0g铁氰化钾溶于试剂A后，定容至50mL即得试剂C，低温避光保存。
一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)、将试剂A、试剂B和试剂C制备后在室温平衡20分钟；
步骤(2)、准备洁净、容量大于2mL的带塞离心管、洁净96孔板；
步骤(3)、向离心管中加入100μL待测样品，再依次加入400μL试剂A、400μ L试剂B，离心管加塞充分混匀后，加入70μL试剂C，充分混匀；
步骤(4)、将步骤(3)得到的溶液，常温、避光反应25分钟后，取反应后溶液 200μL加入96孔板中，在478nm处检测反应后溶液吸光度，代入特定标准曲线中，即求得待测样品对羟基苯丙氨酸浓度。
本发明的工作原理为：本发明基于铁氰化钾在碱性条件下，可催化对羟基苯丙氨酸与4-氨基安替比林反应，生成一种具有特征性橙红色得醌类物质，该物质在478nm 有特异性吸收峰，通过测定反应后混合溶液在478nm处吸光度，可实现尿液中对羟基苯丙氨酸的定量检测。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
1、本发明所需试剂构成简单，费用低廉；实验操作便捷，利用现有临床实验室常规仪器即可检测，不需额外购置大型实验设备，并且可以与现今临床实验室流水线设备相结合，实现短时间大规模检测。
2、本发明检测对羟基苯丙氨酸的线性范围宽，可满足实际应用中对恶性肿瘤有临床筛查价值的浓度范围需要。
3、本发明所使用的试剂对人体基本无毒，使用相对安全。
4、所需标本来源为尿液，无需有创操作即可获得，可满足大规模的癌症筛查要求；为恶性肿瘤早发现、早诊断、早治疗、以及治疗效果评估和预后判断提供新的思路，为尽早控制肿瘤患者病情发展、减轻患者家庭及社会经济负担提供必要保障。
附图说明
为了更加清晰的理解本发明，通过结合说明书附图与示意性实施例，进一步介绍本专利，附图与实施例是用来解释说明，并不构成对本专利的限定。
图1为本发明中的全波长扫描图；
图2为本发明中的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明所有试剂均为分析纯级别的普通化学试剂，制备过程都在常温、常压下进行。
实施例1
一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，所采用的试剂盒由缓冲液、4-氨基安替比林、铁氰化钾的水溶液组成，其中缓冲液为市售PH＝10缓冲液，4-氨基安替比林的浓度为20g/L，铁氰化钾的浓度为80g/L。
制备过程如下：所述试剂B为准确称取1.0000g 4-氨基安替比林溶于试剂A后，用试剂A定容至50mL后得4-氨基安替比林储备液；将该储备液用5mL氯仿萃取两次后得试剂B，低温密闭保存。所述试剂C为称取4.0000g铁氰化钾溶于试剂A后，用试剂A定容至50mL即得试剂C，低温避光保存。
实施例2
确认检测波长：准备洁净、容量大于2mL的带塞离心管、洁净96孔板。向离心管中加入100μL浓度为600mg/L的L-酪氨酸溶液(以纯水为空白对照)，再依次加入400μL试剂A、400μL试剂B，离心管加塞充分混匀后，加入70μL试剂C，充分混匀。常温、避光反应20分钟后，取反应后溶液200μL加入96孔板中，在酶标仪中，对反应后溶液进行全波长扫描。
如图1所示的结果：在478nm处，L-酪氨酸组反应后产物有最大吸收峰，且空白组在此处吸光度小于0.1，取478nm为本试剂盒检测对羟基苯丙氨酸的检测波长。
实施例3
对羟基苯丙氨酸标准溶液的配置：准确称取0.1200g L-酪氨酸，溶于纯水中(用稀氨水助溶)，定容至200mL，即得600mg/L L-酪氨酸储备液，再由此储备液配置浓度分别为0、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L的系列标准梯度溶液，具体如表1所示：
表1 Try梯度浓度配方A(纯水)
实施例4
标准曲线的制作：准备洁净、容量大于2mL的带塞离心管、洁净96孔板。依次、分别向离心管中加入上述[实施例3]所配置标准梯度溶液100μL，再依次加入400μ L试剂A、400μL试剂B，离心管加塞充分混匀后，加入70μL试剂C，充分混匀。常温、避光反应25分钟后，取反应后溶液200μL加入96孔板中，在478nm处检测反应后溶液吸光度。如图2所示，以L-酪氨酸毫摩尔浓度(mmol/L)为横坐标，吸光度 (Abs)为纵坐标，求得回归方程为：y＝1.0704c+0.0040(c：mmol/L)，线性相关系数为0.999。
实施例5
使用本发明的试剂盒对临床样本及标准品的重复性检测：
标准曲线的制作：准备洁净、容量大于2mL的具塞离心管、洁净96孔板。离心管编号，依次、分别向离心管中加入100μL临床标本(经URC实验判定为阳性/阴性的标本)，再依次加入400μL试剂A、400μL试剂B(空白对照组以以缓冲液为对照)，离心管加盖充分混匀后，加入70μL试剂C，充分混匀。常温、避光反应25分钟后，取反应后溶液200μL加入96孔板中，在478nm处检测反应后溶液吸光度，如表2所示。
表2临床标本及标准品检测结果
从上表检测的临床样品和标准品可以看出，通过尿液中对羟基苯丙氨酸浓度，可以有效区分临床诊断为“胃癌”、“胃新生物”的肿瘤患者，与临床诊断为“糖尿病”、“溃疡性结肠炎”的非肿瘤患者。本试剂盒检测对氨基苯丙氨酸的重复性良好，且能定量检测尿液中对羟基苯丙氨酸浓度，满足大规模的尿液对羟基苯丙氨酸浓度监测，实现癌症筛查。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，其特征在于：所采用的试剂盒由以下试剂组成：试剂A：PH＝10±0.2缓冲液；试剂B：4-氨基安替比林；试剂C：铁氰化钾溶液。
2.根据权利要求1所述的一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂B为称取1.0g 4-AAP溶于试剂A后，定容至50mL后得4-AAP储备液；将该储备液用5mL氯仿萃取两次后得试剂B，低温密闭保存。
3.根据权利要求1所述的一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂C为称取4.0g铁氰化钾溶于试剂A后，定容至50mL即得试剂C，低温避光保存。
4.根据权利要求1所述的一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述4-氨基安替比林的浓度为20g/L。
5.根据权利要求1所述的一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述铁氰化钾的浓度为80g/L。
6.一种尿液对羟基苯丙氨酸定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)、将试剂A、试剂B和试剂C制备后在室温平衡20分钟；
步骤(2)、准备洁净、容量大于2mL的带塞离心管、洁净96孔板；
步骤(3)、向离心管中加入100μL待测样品，再依次加入400μL试剂A、400μL试剂B，离心管加塞充分混匀后，加入70μL试剂C，充分混匀；
步骤(4)、将步骤(3)得到的溶液，常温、避光反应25分钟后，取反应后溶液200μL加入96孔板中，在478nm处检测反应后溶液吸光度，代入特定标准曲线中，即求得待测样品对羟基苯丙氨酸浓度。
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-
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|---|---|---|---|---|
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