CN114806940A - 一种除臭优势菌的筛选、制备方法及其应用 - Google Patents

一种除臭优势菌的筛选、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种除臭优势菌的筛选、制备方法及其应用，方法具体包括：S1、称取样品进行菌株的分离纯化；S2、通过初筛和复筛对除臭优势菌进行筛选；S3、提取细菌DNA并进行菌种鉴定；S4、采用五点对峙法筛选出无拮抗菌种；S5、将菌剂复配为复合菌剂并进行正交设计；S6、通过不同复配比菌种进行除氨除硫并记录不同复配比的去除率数据，得出复合菌剂中各菌种的除氨除硫配比；S7、制备固态菌剂；所述复合菌剂中的菌种包括苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌和乳杆菌。本发明从餐厨垃圾生化仓样品中分离得到降解氨气和硫化氢的细菌、酵母菌、芽孢杆菌及放线菌等，成本低、除臭效率高且适应广。

Description

一种除臭优势菌的筛选、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物除臭技术领域，具体涉及一种除臭优势菌的筛选、制备方法及其应用。
背景技术
餐厨垃圾处置过程中产生的恶臭污染物种类较为复杂，恶臭强度相对较高，恶臭物质种类按其组成可分成5类：含硫化合物，如硫化氢、二氧化硫、硫醇等；含氮化合物，如氨气、胺类、吲哚等；卤素及衍生物，如氯气、卤代烃等；烃类及芳香烃；含氧有机物，如醇、酚、醛、酮等。气相色谱检测表明，餐厨垃圾臭气的主要成分为氨(NH3)和硫化氢(H2S)。
恶臭污染物质的特性表现在以下几个方面：(1)恶臭物质的污染源分布广泛；(2)恶臭物质的浓度一般较低，有的甚至低达10-9mo1/L，且处理后要求其浓度更低；(3)臭气一般是由多组分混和物构成，产生恶臭的物质多达1万种以上，气味强度与实际分子浓度不一定成线性关系。
目前常用的除臭方法主要包括：物理方法、化学方法和生物方法。
物理方法是指不改变恶臭物质的化学性质，而是采用掩蔽、稀释、吸附等方式改变大气中恶臭物质的浓度，以此来达到除臭目的。物理方法除臭方面的研究主要集中在活性炭吸附方面，目前物理除臭方法工艺比较成熟，但对所处理气体和处理环境的要求较高、且处理成本也很昂贵。
化学方法是通过一些化学反应，如氧化、燃烧等化学反应使恶臭物质转化为无味的物质。常见的化学处理方法有氧化、热分解、焚烧等。化学除臭法虽然可以快速高效的去除浓度高的恶臭物质，但是化学物质也会对环境造成严重危害，引起二次污染。
生物除臭技术与物理和化学技术相比，过程中不需添加化学物质，可在常温(10℃-40℃)和常压下进行，比物理方法和化学方法的成本更低，操作更简单。它是利用微生物的生物化学作用将恶臭物质吸收转化成供自身生长的营养物质并代谢出体外，以达到去除臭味的目的。臭气的最终产物主要是水、二氧化碳、盐类等，不会造成二次污染。
微生物一般都是在液相环境下进行降解反应，即可以把微生物处理恶臭气体的过程划分为以下三个阶段。
第一阶段：恶臭物质与微生物接触并溶于水溶液中，完成由气相扩散到液相的传质过程。
第二阶段：溶解于液相的恶臭气体向细胞壁和细胞膜扩散继而被微生物所吸收，不溶于水的物质附着在微生物体外，后由微生物分泌物分解为可溶性物质，再渗入细胞。
第三阶段：进入细胞后，恶臭成分被当作微生物的营养物质，随微生物的生长代谢被分解成无毒无害的物质排除体外。
因此，微生物菌剂除臭法具有很大优势：如成本较低，只需要前期投入少量菌种即可，后期不需要或者添加量不多，因为腐熟料中残留很多数量的微生物菌株；除臭过程较短，5-7天就能够达到除臭的效果；对餐厨垃圾具有减量化作用；菌种适应性强，能以餐厨垃圾为养分快速繁殖代谢。
但是目前除臭菌剂的研究还主要存在以下问题：
(1)目前，除臭菌剂中菌种种类较少，一般只有1-3种，因此除臭效率不是很高；
(2)微生物除臭菌剂的复配，对于菌种间合适比例和菌种间的拮抗作用考虑不全，导致产品质量和使用效果上不稳定，相关问题层出不穷；
(3)餐厨垃圾好氧堆肥工艺存在高温阶段，温度能达到60-70℃，会影响除臭菌剂中菌种的活性，最终影响除臭效果；
(4)微生物除臭菌剂成品中实际活菌数目少以及保藏时间短，菌剂投入到实际应用场景效果不佳；
(5)微生物除臭菌剂实际使用过程中，大部分人会忽视菌床培育过程，也不会添加菌剂引诱剂，这就不利于菌剂的扩大培养。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种除臭优势菌的筛选、制备方法及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种除臭优势菌的筛选、制备方法，具体包括：
S1、称取样品进行菌株的分离纯化；
S2、通过初筛和复筛对除臭优势菌进行筛选；
S3、提取细菌DNA并进行菌种鉴定；
S4、采用五点对峙法筛选出无拮抗菌种；
S5、将菌剂复配为复合菌剂并进行正交设计；
S6、通过不同复配比菌种进行除氨除硫并记录不同复配比的去除率数据，得出复合菌剂中各菌种的除氨除硫配比；
S7、制备固态菌剂；
所述复合菌剂中的菌种包括苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌和乳杆菌。本发明从餐厨垃圾生化仓样品中，通过选择培养基的初筛和复筛，分离得到降解氨气和硫化氢的细菌、酵母菌、芽孢杆菌及放线菌等，成本低、除臭效率高且适应广；微生物除臭菌剂中添加苏云金芽孢杆菌，其晶体蛋白对蚊、蝇等昆虫具有毒杀作用，对细菌没有抑制作用。
进一步的，复合菌剂中苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌与乳杆菌的除氨除硫配比是6：1：2：1：6：2：6。本发明微生物除臭菌剂中各菌种间不存在拮抗作用，通过正交的多因素多水平分析，得到最佳除臭菌种复配比
进一步的，步骤S1包括：
S101、称取餐厨垃圾样品，置于装有灭菌生理盐水和若干已灭菌玻璃珠的三角瓶，摇匀使分散充分，所述餐厨垃圾样品与灭菌生理盐水比例为1:9；
S102、通过使用无菌水将样品稀释为不同浓度梯度的稀释液；
S103、取100μL不同浓度稀释液涂布于不同培养基平板上，置于30℃恒温培养箱培养5天；
S104、通过平板稀释分离法进一步分离纯化，纯化后的单一菌株在显微镜下根据形态特征分类编号并于4℃斜面保存备用。
进一步的，对除臭优势菌进行筛选具体包括：
S201、初筛：取新鲜的餐厨垃圾置于容器中，按照3％的接种量将稀释液接种于容器中，混合均匀后密封，30℃静置培养7天；
S202、复筛：将新鲜餐厨垃圾加入广口瓶中，接种纯化得到的菌液，每个菌种三次重复；
接种除氨菌的广口瓶中设有盛有20mL硼酸吸收液的小烧杯，接种脱硫菌的广口瓶中放置盛有20mL碱性锌氨络盐吸收液的小烧杯，广口瓶盖上盖子后用双层塑料膜密封；
置于30℃培养箱中培养，每隔一段时间取出小烧杯，检测NH3和H2S的释放量，选出除臭效果好的菌种斜面保存。
进一步的，提取细菌DNA包括：
S301、1mL的细胞悬液在8000g下离心2min，弃去上清液并用400μL STE Buffer冲洗细胞两次，在8000g下离心2min，弃去上清；
S302、将200μL TE Buffer悬浮细胞和100μL的Tris-saturated phenol加到离心管中，涡旋混合60s；
S303、在4℃用13000g离心5min从有机相中分离出水相，取160μL上清液转移到干净的EP管中；
S304、加40μL的TE Buffer到EP管中，用100μL氯仿混合，在4℃，13000g离心5min；
S305、用氯仿提取的方法纯化裂解液直到没有白色的界面出现，重复两到三遍；
S306、取160μL上清液到干净的EP管中，加40μL TE和5μL的RNase并在37℃下放置10min，分解RNA；
S307、将100μL的氯仿加到离心管中，混合后，在4℃，13000g离心5min；
S308、将150μL的上清液转移到干净的EP管中，所述150μL的上清液包含有纯化的用于序列实验的DNA，并在-20℃下保存。
进一步的，五点对峙法包括：将经过菌种鉴定后的菌株接种在LB或PDA固体培养基平板中央，在距离菌种点3cm处点种待筛选细菌，并以不接种细菌作为对照，置于27℃培养箱中培养，直到对照长满整个平板为止，筛选出无拮抗菌种，重复3次，进行复筛。
进一步的，菌剂的复配包括：
S501、菌种的活化与扩大培养：挑取斜面培养基中的单菌落至装有15mL液体培养基的三角瓶中，30℃恒温培养箱培养24h；
菌种经过活化后，按照2％的接种量接入装有200mL液体培养基的三角瓶中扩大培养；
S502、菌剂的复配：所述苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌与乳杆菌的配制体积为100mL的菌悬液，有效活菌数>1×109CFU/mL，并进行正交设计。
进一步的，固态菌剂的制备方法包括：
S701、载体的制备：选择麦麸、麦壳、锯末、活性炭作为混合载体，麦麸：麦壳：锯末：活性炭相应质量比例为10:5:2:2，研磨，过筛网，灭菌30min，放在烘箱中烘干备用；
S702、供试菌种的制备：挑取斜面培养基中的单菌落至装有液体培养基的三角瓶中，30℃恒温培养箱培养24h；菌种经过活化后，按照2％的接种量接入装有液体培养基的三角瓶中扩大培养；
S703、配置方法：将各个菌种的混合液与混合载体搅拌均匀，再依次加入丙三醇、薄荷精油、葡糖糖和海藻糖，混匀，放在35℃烘箱中烘至含水率为25％，固态剂型制备完成。本发明微生物除臭菌剂采用的是固态发酵剂型，有利菌种保藏与运输。此外，菌剂中添加了菌剂引诱剂，有利于菌种数目的增大即同等数量菌种所花时间变短。
进一步的，固态菌剂配置方法中各个菌种的混合液与载体按照2.5∶1的比例，葡糖糖的含量0.1-0.3g/ml，海藻糖含量0.05g/mL，薄荷精油的含量10mg/mL，丙三醇的含量为各个菌种的混合液体积的5％。本发明薄荷精油与菌剂的协同使用，能够持久消除环境恶臭，无其他污染。丙三醇和海藻糖的功效主要是有利于菌种的保存。
本发明还提供了一种除臭优势菌的应用，除臭优势菌根据上述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法制备，将所述除臭优势菌加入生物反应器对废气进行除臭。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：
1.本发明一种除臭优势菌的筛选、制备方法及其应用从餐厨垃圾生化仓样品中，通过选择培养基的初筛和复筛，分离得到降解氨气和硫化氢的细菌、酵母菌、芽孢杆菌及放线菌等，且微生物除臭菌剂中各菌种间不存在拮抗作用，通过正交的多因素多水平分析，得到最佳除臭菌种复配比；本发明微生物除臭菌剂中存在常温菌和高温菌，可以避免堆肥高温阶段除臭菌剂无活性；且微生物除臭菌剂采用的是固态发酵剂型，有利菌种保藏与运输，此外，菌剂中添加了菌剂引诱剂，有利于菌种数目的增大，同等数量菌种所花时间变短，微生物除臭菌剂中添加了苏云金芽孢杆菌，其晶体蛋白对蚊、蝇等昆虫具有毒杀作用，且对细菌没有抑制作用；
2.本发明微生物除臭菌剂成本低，效率高，适应广，除臭周期短，通过微生物菌种对散发恶气物质的有机物进行腐熟发酵，将发出臭味的物质转化为无味物质，从根本上解决臭味的来源，对环境无污染，无化学物质残余，十分环保；
3.本发明微生物除臭菌剂菌种符合生物安全法规，微生物菌种均从生化仓餐厨垃圾长期胁迫选择环境中筛选得到，不会对周围环境和生态平衡造成危害，所有菌株安全性高，均是免做毒理试验的菌株，无论对使用者还是施用环境来讲，都是安全的；
4.本发明微生物菌剂采用固态剂型，微生物更易存活，保存时间长，保存成本低，运输方便，更适合大规模生产和应用；且使用混合载体，可以提高菌种活菌数目，延长保存时间；薄荷精油与菌剂的协同使用，能够持久消除环境恶臭，无其他污染，辅助成分中，丙三醇和海藻糖都可以有利于菌种的保存。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
实施例1
本实施例一种除臭优势菌的筛选、制备方法，具体包括：
S1、称取样品进行菌株的分离纯化；
S2、通过初筛和复筛对除臭优势菌进行筛选；
S3、提取细菌DNA并进行菌种鉴定；
S4、采用五点对峙法筛选出无拮抗菌种；
S5、将菌剂复配为复合菌剂并进行正交设计；
S6、通过不同复配比菌种进行除氨除硫并记录不同复配比的去除率数据，得出复合菌剂中各菌种的除氨除硫配比；
S7、制备固态菌剂；
所述复合菌剂中的菌种包括苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌和乳杆菌。本发明从餐厨垃圾生化仓样品中，通过选择培养基的初筛和复筛，分离得到降解氨气和硫化氢的细菌、酵母菌、芽孢杆菌及放线菌等；微生物除臭菌剂中添加苏云金芽孢杆菌，其晶体蛋白对蚊、蝇等昆虫具有毒杀作用，对细菌没有抑制作用。
本实施例菌株的分离纯化包括：
S101、取餐厨垃圾样品10g，置装有90mL灭菌生理盐水和若干已灭菌玻璃珠的三角瓶，摇匀20min，使分散充分；
S102、用无菌水将样品稀释成10-1-10-8不同浓度梯度；
S103、取100μL不同浓度稀释液涂布于不同培养基平板上置于30℃恒温培养箱培养5d；
S104、通过平板稀释分离法进一步分离纯化，纯化后的单一菌株在显微镜下根据形态特征分类编号后于4℃斜面保存备用。
本实施例对除臭优势菌的筛选包括：
S201、初筛：取新鲜的餐厨垃圾200g置于1000mL大烧杯中，按照3％的接种量将菌液接种于烧杯中，用玻璃棒将培养液与餐厨垃圾混合均匀，密封烧杯，对照组(CK)为等量的无菌水，每组3个重复，30℃静止培养7d，通过感官方法判断微生物的除臭效果。感官法判断标准：0级，未闻到任何气味，无任何反应；1级，勉强闻到气味，但不明显；2级，闻到较弱气味；3级，很容易闻到气味；4级，臭味很大，想离开；5级，臭味极强，立即离开；
S202、将200g新鲜餐厨垃圾加入1000mL广口瓶中，接种5mL纯化得到的菌液，每个菌种三次重复，同时接种5ml无菌水作为对照。在接种除氨菌的广口瓶中放一个盛有20mL硼酸吸收液的50mL小烧杯(用来吸收产生的NH3)；接种脱硫菌的广口瓶中放一个盛有20mL碱性锌氨络盐吸收液的50mL小烧杯(用来吸收产生的H2S)广口瓶盖盖后用双层塑料膜密封。置于30℃培养箱中培养，每隔3、5、8、11、16、21、25天取出小烧杯，检测NH3和H2S的释放量，选出除臭效果好的菌种斜面保存，以待下一步研究。
NH3的测定采用硼酸吸收凯氏法；H2S的测定采用亚甲基蓝分光光度法。
测定方法：硼酸吸收凯氏法
原理：NH3被硼酸吸收，然后用标准酸(硫酸)滴定，根据标准酸的用量从而可以计算出氮的含量。
NH3+H3BO3＝NH3·H3BO3；NH3·H3BO3+HCl＝NH4Cl+H3BO3。
测定方法：亚甲基蓝分光光度法。
原理：空气中的硫化氢被碱性氢氧化镉悬浮液吸收，形成硫化镉沉淀。吸收液中加入聚乙烯醇硫酸铵可以减低硫化镉的光分解作用。然后，在硫酸溶液中，硫化氢和对氨基二甲基苯胺溶液及三氯化铁溶液作用，生成亚甲基蓝。根据颜色深浅，比色定量。
本实施例菌种鉴定包括细菌DNA的提取：
S301、1mL的细胞悬液在8000g下离心2min。弃去上清液以后，用400μL STE Buffer(100mM NaCl，10mM Tris/HCl、1mM EDTA、pH 8.0)冲洗细胞两次。然后在8000g下离心2min，弃去上清；
S302、用200μLTE Buffer(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.0)悬浮细胞，然后用100μL的Tri s-saturated phenol(pH 8.0)加到离心管中，涡旋混合60s；
S303、接着在4℃下用13000g离心5min以从有机相中分离出水相，然后取160μL上清液转移到干净的1.5mL EP管中；
S304、加40μL的TE Buffer到EP管中，然后用100μL氯仿混合，在4℃，13000g离心5min；
S305、用氯仿提取的方法纯化裂解液直到没有白色的界面出现；这个过程要重复两到三遍；
S306、取160μL上清液到干净的1.5mL EP管中，再加40μLTE和5μL的RNase(10mg/mL)并在37℃下放置10min，以分解RNA；
S307、接着将100μL的氯仿加到离心管中，混合后，在4℃下13000g离心5min；
S308、再将150μL的上清液转移到干净的1.5mL EP管中。
此时的上清液包含有纯化的DNA，而且可以直接用于序列实验并可以在-20℃下保存。接着就可以用分光光度计测A260/A280ratios。
引物序列为
27F：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'
1492R：5TACGGCTACCTTGTTACGACTT3'
PCR扩增包括PCR反应体系(25μL)：2.5μL 10×Buffer、0.5μL 10mM dNTP、引物各1μL、0.3μL(5U/μL)的Taq酶和1μLDNA模板。
PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物的检测：取2μL PCR产物，点样于1.5％的琼脂糖凝胶中，以100bp Marker作为标准分子量，100V电压，电泳40min，EB染色，用凝胶成像系统观察结果。
通用16srRNA引物扩增出来的片段大约1500bp，凝胶成像系统观察到所有菌株在1500bp处都产生绿色荧光，说明每个菌种的16srRNA得到提取。用小刀将每个菌种在1500bp处的荧光条带分别切下，并做好标记，然后送到测序公司测序。
从测序公司测序后，将所得序列在网站eztaxon-e.ezbiocloud.net核酸序列数据库中进行同源序列比较，菌种16srRNA菌种序列比对结果见表1：
表1
Figure BDA0003608727150000111
菌种YHZN-1、YHZN-2、YHZN-3、YHZN-4、YHZN-5、YHZN-6、YHZN-7分别是苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌与乳杆菌。
本实施例拮抗作用采用五点对峙法：将菌种鉴定后的菌株接种在LB或PDA固体培养基平板中央，然后在距离菌种点3cm处点种待筛选细菌。以不接种细菌作为对照，置于27℃培养箱中培养，直到对照长满整个平板为止，筛选出无拮抗菌种。重复上述步骤3次，进行复筛，确保菌种间无拮抗作用
菌株间如果不存在拮抗作用，在五点对峙法平板上表现为两个菌种之间不会出现真空带，或两个菌种最终会混合生长在一块。
试验证明表1中的菌种YHZN-1、YHZN-2、YHZN-3、YHZN-4、YHZN-5、YHZN-6、YHZN-7两两之间不存在拮抗作用。
本实施例菌剂的复配包括：
S501、菌种的活化与扩大培养
挑取斜面培养基中的单菌落至装有15mL液体培养基的200mL三角瓶中，30℃恒温培养箱培养24h。其中，高氏1号培养基用于放线菌的培养、LB培养基用于细菌的培养、麦芽汁琼脂培养基用于酵母菌的培养。
菌种经过活化后，按照2％的接种量接入装有200mL液体培养基的500mL三角瓶中扩大培养。放线菌的培养条件是35℃180rpm18h；细菌的培养条件是30℃200rpm 18h；酵母菌的培养条件是28℃200rpm 16h；
S502、菌剂的复配：
将苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌与乳杆菌，各个菌种配制体积为100mL的菌悬液，有效活菌数>1×109CFU/mL，并进行正交设计。正交试验因素水平如表2所示，试验正交表L18(37)如表3所示：
表2
Figure BDA0003608727150000121
表3
Figure BDA0003608727150000122
Figure BDA0003608727150000131
本实施例不同复配比菌种除氨除硫效果通过查询正交表格所得，不同复配比对NH3和H2S的去除率数据如表4所示：
表4
Figure BDA0003608727150000132
Figure BDA0003608727150000141
其中，实验组7的效果最佳。查询正交表格，苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌与乳杆菌7种菌种的配比是6：1：2：1：6：2：6。
本实施例固态菌剂制备方法为:
S701、载体的制备:选择麦麸、麦壳、锯末、活性炭作为混合载体，其相应质量比例为10:5:2:2(麦麸：麦壳：锯末：活性炭)，将其研磨，过30目筛网，121℃灭菌30min，然后放在105℃烘箱中烘干备用。
S702、供试菌种的制备:挑取斜面培养基中的单菌落至装有15mL液体培养基的200mL三角瓶中，30℃恒温培养箱培养24h。其中，高氏1号培养基用于放线菌的培养、LB培养基用于细菌的培养、麦芽汁琼脂培养基用于酵母菌的培养。
菌种经过活化后，按照2％的接种量接入装有400mL液体培养基的1000mL三角瓶中扩大培养。放线菌的培养条件是35℃180rpm 18h；细菌的培养条件是30℃200rpm 18h；酵母菌的培养条件是28℃200rpm 16h。
S703、配置方法:复合微生物菌液与载体按照2.5∶1的比例，葡糖糖的含量0.1-0.3g/ml，海藻糖含量0.05g/mL，薄荷精油的含量10mg/mL，丙三醇为复合微生物菌液体积的5％。
因此，7种菌液各400ml(有效活菌数>1×109CFU/mL)，混合载体添加量为1120g，葡糖糖添加量为500g，海藻糖140g，薄荷精油28g，丙三醇140mL。首先，7个菌种的混合液与混合载体搅拌均匀，再依次加入丙三醇、薄荷精油、葡糖糖和海藻糖。混匀后，放在35℃烘箱中烘至含水率为25％，固态剂型制备完成。
本实施例微生物除臭菌剂采用的是固态发酵剂型，有利菌种保藏与运输。此外，菌剂中添加了菌剂引诱剂，有利于菌种数目的增大(同等数量菌种所花时间变短)。薄荷精油与菌剂的协同使用，能够持久消除环境恶臭，无其他污染。丙三醇和海藻糖的功效主要是有利于菌种的保存。
本实施例中的培养基及配置为：
LB培养基配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，加15g～20g琼脂粉，蒸馏水1000毫升，pH7.4，121℃灭菌20min。
高氏1号培养基配方：可溶性淀粉(20g)，KNO3(1g)，K2HPO4(0.5g)，MgSO4·7H2O(0.5g)，NaCl(0.5g)，FeSO4·7H2O(0.01g)，琼脂20g，pH＝7.4-7.6。
麦芽汁琼脂培养基：麦芽膏粉130g，琼脂15g，氯霉素0.1g，pH6-6.2，121℃灭菌20min。
高氏1号培养基配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH 7，121℃灭菌20min。该培养出用于放线菌的分离，培养及保种所用。
本实施例麦芽膏粉提供真菌生长所需碳源，能源和氮源，琼脂是培养基的凝固剂，氯霉素抑制细菌的生长。该培养出用于酵母菌的分离，培养及保种所用。
实施例2
本实施例提供了一种除臭优势菌的应用，除臭优势菌可以根据实施例1的一种除臭优势菌的筛选、制备方法进行制备，将制备出的除臭优势菌加入生物反应器对废气进行除臭。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，具体包括：
S1、称取样品进行菌株的分离纯化；
S2、通过初筛和复筛对除臭优势菌进行筛选；
S3、提取细菌DNA并进行菌种鉴定；
S4、采用五点对峙法筛选出无拮抗菌种；
S5、将菌剂复配为复合菌剂并进行正交设计；
S6、通过不同复配比菌种进行除氨除硫并记录不同复配比的去除率数据，得出复合菌剂中各菌种的除氨除硫配比；
S7、制备固态菌剂；
所述复合菌剂中的菌种包括苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌和乳杆菌。
2.根据权利要求1所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，所述复合菌剂中苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌与乳杆菌的除氨除硫配比是6：1：2：1：6：2：6。
3.根据权利要求1所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
S101、称取餐厨垃圾样品，置于装有灭菌生理盐水和若干已灭菌玻璃珠的三角瓶，摇匀，所述餐厨垃圾样品与灭菌生理盐水比例为1:9；
S102、通过使用无菌水将样品稀释为不同浓度梯度的稀释液；
S103、取100μL不同浓度稀释液涂布于不同培养基平板上，置于30℃恒温培养箱培养5天；
S104、通过平板稀释分离法进一步分离纯化，纯化后的单一菌株在显微镜下根据形态特征分类编号并于4℃斜面保存备用。
4.根据权利要求3所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，所述对除臭优势菌进行筛选具体包括：
S201、初筛：取新鲜的餐厨垃圾置于容器中，按照3％的接种量将稀释液接种于容器中，混合均匀后密封，30℃静置培养7天；
S202、复筛：将新鲜餐厨垃圾加入广口瓶中，接种纯化得到的菌液，每个菌种三次重复；
接种除氨菌的广口瓶中设有盛有20mL硼酸吸收液的小烧杯，接种脱硫菌的广口瓶中放置盛有20mL碱性锌氨络盐吸收液的小烧杯，广口瓶盖上盖子后用双层塑料膜密封；
置于30℃培养箱中培养，每隔一段时间取出小烧杯，检测NH3和H2S的释放量，选出除臭效果好的菌种斜面保存。
5.根据权利要求4所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，所述提取细菌DNA包括：
S301、1mL的细胞悬液在8000g下离心2min，弃去上清液并用400μL STE Buffer冲洗细胞两次，在8000g下离心2min，弃去上清；
S302、将200μL TE Buffer悬浮细胞和100μL的Tris-saturated phenol加到离心管中，涡旋混合60s；
S303、在4℃用13000g离心5min从有机相中分离出水相，取160μL上清液转移到干净的EP管中；
S304、加40μL的TE Buffer到EP管中，用100μL氯仿混合，在4℃，13000g下离心5min；
S305、用氯仿提取的方法纯化裂解液直到没有白色的界面出现，重复两到三遍；
S306、取160μL上清液到干净的EP管中，加40μL TE和5μL的RNase并在37℃下放置10min，分解RNA；
S307、将100μL的氯仿加到离心管中，混合，在4℃，13000g离心5min；
S308、将150μL的上清液转移到干净的EP管中，所述150μL的上清液包含有纯化的用于序列实验的DNA，并在-20℃下保存。
6.根据权利要求5所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，所述五点对峙法包括：将经过菌种鉴定后的菌株接种在LB或PDA固体培养基平板中央，在距离菌种点3cm处点种待筛选细菌，并以不接种细菌作为对照，置于27℃培养箱中培养直到对照长满，筛选出无拮抗菌种，重复3次，进行复筛。
7.根据权利要求6所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，所述菌剂的复配包括：
S501、菌种的活化与扩大培养：挑取斜面培养基中的单菌落至装有15mL液体培养基的三角瓶中，30℃恒温培养箱培养24h；
菌种经过活化后，按照2％的接种量接入装有200mL液体培养基的三角瓶中扩大培养；
S502、菌剂的复配：所述苏云金芽胞杆菌、毕赤酵母、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、放线菌与乳杆菌的配制体积为100mL的菌悬液，有效活菌数>1×109CFU/mL，并进行正交设计。
8.根据权利要求7所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，所述固态菌剂的制备方法包括：
S701、载体的制备：选择麦麸、麦壳、锯末、活性炭作为混合载体，所述麦麸：麦壳：锯末：活性炭相应质量比例为10:5:2:2，研磨，过筛网，灭菌30min，放在烘箱中烘干备用；
S702、供试菌种的制备：挑取斜面培养基中的单菌落至装有液体培养基的三角瓶中，30℃恒温培养箱培养24h；菌种经过活化后，按照2％的接种量接入装有液体培养基的三角瓶中扩大培养；
S703、配置方法：将各个菌种的混合液与混合载体搅拌均匀，并依次加入丙三醇、薄荷精油、葡糖糖和海藻糖，混匀，放入35℃烘箱中烘至含水率为25％，固态剂型制备完成。
9.根据权利要求8所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法，其特征在于，所述固态菌剂配置方法中各个菌种的混合液与载体按照2.5∶1的比例，葡糖糖的含量为0.1-0.3g/ml，海藻糖含量为0.05g/mL，薄荷精油的含量为10mg/mL，丙三醇的含量为各个菌种的混合液的体积的5％。
10.一种除臭优势菌的应用，其特征在于，除臭优势菌根据权利要求1-9任一所述的一种除臭优势菌的筛选、制备方法制备，将所述除臭优势菌加入生物反应器对废气进行除臭。
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