CN114805497B - 一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV‑B,其氨基酸序列为GHCCGDEYRKWCGKRVCRNKARCC,该多肽NaV‑B经结构预测显示主链和二硫键形成了复合卷曲的结构,且保留了核心封闭分子LYS10、ARG18和ARG22,可以靶向钠离子通道蛋白Nav1.4,形成稳定的蛋白复合体,从而为未来开发成治疗人类相关疾病的Nav通道靶向药物提供了基础;与天然提取靶向药物相比,具有更高的产率、产量和经济性,故具有非常好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B及其应用。
背景技术
电压门控钠离子通道(Voltage-gated sodium channel;Nav)广泛存在于人体中,是一种重要的跨膜结构蛋白,通过产生动作电位从而调节神经递质的分泌、血管收缩和骨骼肌兴奋性等多种生理过程。目前发现多种人类疾病同Nav通道突变有关,包括癫痫、心律不齐、肌肉麻痹、强直性肌痉挛症、疼痛综合征和自闭症等。其中,电压门控钠离子通道1.4(NaV1.4)由SCN4A基因编码,特异的在骨骼肌中表达。NaV1.4可以控制神经-肌肉接头的端板电位产生和T-tubules膜的去极化扩散,从而启动和调节骨骼肌的收缩。目前至少有五种遗传性病变同NaV1.4突变有关,包括高钾周期性瘫痪、低钾周期性麻痹、副肌酸结子、钾加重肌无力和先天性肌无力综合征,因此也是治疗药物的热点靶标之一。
多肽因其具有较高的靶向性和安全性,已经成为一种药物分子开发的主流方向。目前,通过分子模拟和对接来预测多肽同靶蛋白之间的结合模式和亲合力,已经成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。
因此,急需研究和开发可以特异地靶向钠离子通道蛋白Nav1.4,为未来开发成治疗人类相关疾病的新药提供了基础。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足,而提供一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B,该多肽是由主链和二硫键形成的复合卷曲结构,能够稳定地靶向钠离子通道蛋白Nav1.4。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足,而提供一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B在制备治疗离子通道相关疾病的药物中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
提供一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B,所述多肽NaV-B的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述技术方案中,所述多肽NaV-B的三维结构是由主链和二硫键形成的复合卷曲结构,并且保留了核心封闭分子LYS10、ARG18和ARG22。
上述技术方案中,所述多肽NaV-B可通过LYS10、ARG18和ARG22三个氨基酸位点分别靶向离子通道蛋白Nav1.4的四个结构域:ASP406、GLU409;LYS1244、GLU1248;GLU761、GLU764;ASP1539、ASN1548。
本发明还提供上述一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B在制备治疗离子通道相关疾病的药物中的应用。
上述技术方案中,所述疾病包括高钾周期性瘫痪、低钾周期性麻痹、副肌酸结子、钾加重肌无力和先天性肌无力综合征,以及由于皮下肌肉记忆性紧绷引起的面部及身体皱纹。
本发明的有益效果:
本发明开发了一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B,其氨基酸序列为GHCCGDEYRKWCGKRVCRNKARCC,该多肽NaV-B保留了核心封闭分子LYS10、ARG18和ARG22。通过对多肽三维结构的预测结构显示,NaV-B是由主链和二硫键形成了复合卷曲的结构,可以靶向钠离子通道蛋白Nav1.4,形成稳定的蛋白复合体。本发明的多肽NaV-B能够稳定地靶向钠离子通道蛋白Nav1.4,且为人工合成设计开发,与天然提取靶向药物相比,具有更高的产率、产量和经济性,从而为未来开发成治疗人类相关疾病的Nav通道靶向药物提供了基础,具有非常好的应用前景。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明,但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制,对于本领域的普通技术人员,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为本实施例的多肽NaV-B的三维结构示意图。
图2为本实施例的多肽NaV-B与钠离子通道蛋白Nav1.4的分子对接示意图。
图3为本实施例的多肽NaV-B与Nav1.4蛋白复合物对接位点的示意图。
图4为本实施例的动力学模拟平均整个蛋白RMSD值变化的示意图。
图5为本实施例的动力学模拟各氨基酸残基RMSD值变化的示意图。
具体实施方式
结合以下实施例及附图对本发明作进一步描述。
1、多肽NaV-B的设计:
根据已经报道的NaV1.4的阻断分子,进行优化组合排列,用Vector NTI10.3软件对其氨基酸序列进行比对,找出氨基酸序列的同源序列,并用Bioedit软件显示和编辑比较结果,获得多肽NaV-B的氨基酸序列。
2、多肽NaV-B的三维结构预测:
运用MODELLER软件对多肽NaV-B的三维结构进行预测:
(1)首先准备好NaV-B.ali序列文件和pdb_95.pir文件;
(2)运行prf.buid()命令寻找与目的基因相近的pdb模板,NaV-Bout.prf存放输出结果,前6行记录了MODELLER构建这个文件的相关参数,后续行对应profile.build()检测到的相似处,选择相似度高和E值比较低的模板;
(3)在pdb模板数据库中下载上述候选模板的pdb文件,运行命令for()in()筛选最佳模板;
(4)在MODELLER窗口中运行automodel()命令获取蛋白预测结果;
(5)选择DOPE score最低且GA341 score最高的结果为最佳模型;
(6)使用pymol软件打开预测结果,获得多肽NaV-B的三维结构图像,如图1所示,其中LYS10为第十位的赖氨酸,ARG18为第十八位的精氨酸,ARG22为第22位的精氨酸,-NH2为保护基团。
3、多肽NaV-B与钠离子通道蛋白Nav1.4的分子对接分析:
运用基于快速傅里叶变换的刚性蛋白对接程序的ZDOCK进行多肽-蛋白对接分析:
(1)准备好Nav1.4和多肽NaV-B的pdb文件;
(2)启动Discovery Studio 4.0,在同一个3D窗口中打开受体和配体蛋白;
(3)打开ZDOCK设置对话框,设置旋转角度(angular step size=15)、ZRank=False、对接构象分簇的参数设置(Top poses=2000、RMSD Cutoff=6.0、InterfaceCutoff=9.0和Maximum Number of Clusters=60),设置并行计算为Ture;
(4)运行ZDOCK并查看结果,筛选打分最高的模型;
(5)使用pymol软件打开对接模型,对活性口袋以及对接位点进行分析。
多肽结构、Nav1.4蛋白晶体结构以及Nav1.4-多肽复合物的对接模型结构如图2所示,其中箭头表示出的位点为活性口袋的分子对接位点。
多肽NaV-B与Nav1.4蛋白的复合物(NaV1.4-多肽NaV-B)对接位点如图3所示,氨基酸用三字母缩写表示,数字表示对应的氨基酸位置:LYS(赖氨酸),ARG(精氨酸)、ASP(天冬氨酸)、ASN(天冬酰胺);两个视角展示NaV1.4-多肽NaV-B复合物的对接方式,D1表示Nav1.4结构域1,D2表示Nav1.4结构域2,D3表示Nav1.4结构域3,D4表示Nav1.4结构域4。
4、Nav1.4-多肽NaV-B复合物的动力学模拟分析:
运用NAMD和VMD对Nav1.4蛋白晶体和多肽NaV-B-Nav1.4蛋白复合体的动力学过程进行模拟:
(1)在VMD控制面板中调取Tk console,cd进入目的文件夹,mol newfilename.pdb,用automatic PSF builder进行psf文件创建,调用top_all27_prot_lipid_na.inp脚本,加载脚本信息,生成链,完成psf文件的创建;
(2)生成了filename.pdb和filename.psf文件,重命名为original.pdb和original.psf,添加solvationbox,boundary设置为1.5;
(3)运用已经写好的minimization.namd进行能量最小化,其中脚本中的boundarydata运用findbox.tcl获取,另外准备脚本par_all36_lipid_prot_carb.prm,从cmd命令窗口输入namd2+p4 minimize.namd>dummy.out获得能量最小化;
(4)准备好nvt.namd脚本,从能量最小化的文件中进行动力学模拟过程,从cmd命令窗口输入namd2+p8 nvt.namd>dummy.out;
(5)对输出结果进行分析,确定动力学模拟过程中的升温结果及动力势能等信息,运用RMSDplot度蛋白的RSMD值进行分析绘图,结果见图4和5。
图4中的两条曲线分别表示出Nav1.4蛋白晶体以及Nav1.4-多肽NaV-B复合物的RMSD值变化,从中体现出蛋白骨架在动力学模拟时长中的活跃度。
图5中的上图为Nav1.4蛋白晶体中各氨基酸残基的RMSD值,下图为Nav1.4-多肽NaV-B复合物的氨基酸残基RMSD值,横坐标标注了氨基酸残基的位置,RMSD值用标尺所示的颜色表示。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 李威
<120> 一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly His Cys Cys Gly Asp Glu Tyr Arg Lys Trp Cys Gly Lys Arg Val
1 5 10 15
Cys Arg Asn Lys Ala Arg Cys Cys
20
Claims (1)
1. 一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B,其特征在于:所述多肽NaV-B的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
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