CN114796494A - Pfkfb3的抑制剂在治疗视网膜退行性病变中的应用、药物和筛选方法 - Google Patents

Pfkfb3的抑制剂在治疗视网膜退行性病变中的应用、药物和筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PFKFB3的抑制剂在治疗视网膜退行性病变中的应用、药物和筛选方法，涉及生物医学领域。本发明公开了一种治疗视网膜退行性病变的新靶点PFKFB3，通过抑制或下调PFKFB3基因的表达可以起到治疗视网膜退行性病变的效果，为治疗视网膜退行性病变的治疗提供了新的思路和手段。

Description

PFKFB3的抑制剂在治疗视网膜退行性病变中的应用、药物和 筛选方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及PFKFB3的抑制剂在治疗视网膜退行性病变中的应用、药物和筛选方法。
背景技术
视网膜退行性病变(retinal degenerative diseases,RDD)是目前眼底疾病中主要致盲原因之一，是年龄相关性黄斑变性、视神经损伤、青光眼、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性等疾病的共同病理改变。虽然这些疾病的病因各不相同，包括由衰老、遗传、血管异常或眼压异常引起视网膜细胞损伤，但这类疾病全球患病人数高达5亿，不仅发病率高，且据WHO统计是不可逆致盲的首要病因，给患者和社会均带来极大的负担。根据发病机制的不同，目前已有抗VEGF治疗、基因治疗、手术治疗等不同治疗手段可以部分缓解病情，但是到疾病晚期视网膜组织萎缩仍不可避免。
针对视网膜退行性病变中普遍涉及的炎症反应，临床常用眼内注射类固醇激素类、抗补体类药物的抗炎药物，其靶点涉及炎症网络中部分体液免疫的促炎因子，对上游小胶质细胞介导的细胞免疫促炎机制及其他关键环节没有良好的作用效果，另外，玻璃体腔注射激素常见不良事件有眼压升高、并发性白内障形成以及结膜出血或玻璃体出血，较不常见报告但是较为严重的不良反应包括眼内炎、坏死性视网膜炎、视网膜脱离和视网膜裂孔，无法长期使用，而视网膜退行性疾病病程往往较长，因此不适宜眼内激素使用。
在基础研究方面靶向视网膜小胶质细胞的化合物：多聚唾液酸、转位蛋白(translocator protein,TSPO)配体、干扰素-β、米诺环素已被证实可以抑制视网膜小胶质细胞的活化，但是相关化合物的眼内应用仅限于基础研究，机制还未完全阐明。
口服类胡萝卜素、中药制剂等药物在抗氧化和神经保护中存在一定效果，但其治疗存在一定局限性，包括治疗靶点不明确、个体差异较大及剂量疗效相关性不清等，且对视网膜病变的炎症机制没有直接的治疗作用，不足以作为视网膜退行性病变的单独治疗药物或急性期一线治疗药物。
如何进一步提高疗效减缓疾病进展是目前药物开发的研究焦点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供PFKFB3的抑制剂在治疗视网膜退行性病变中的应用、药物和筛选方法。本发明公开了一种治疗视网膜退行性病变的新靶点PFKFB3，通过抑制或下调该基因的表达可以起到治疗视网膜退行性病变的效果，为治疗视网膜退行性病变的治疗提供了新的思路和手段。
本发明是这样实现的：
视网膜小胶质细胞在视网膜退行性病变的炎症环节扮演重要角色，作为视网膜的常驻免疫细胞，静息状态下负责对视网膜外环境进行免疫监视；在损伤因素刺激下，小胶质细胞激活而发挥保护和损伤组织的双重作用。小胶质细胞的异常活化转变为神经退行性小胶质细胞(neurodegenerative microglia,MGnD)和/或疾病相关小胶质细胞(disease-associated microglia,DAM)，介导视网膜炎症反应进而加重眼底原有病变，是引起视网膜退行性疾病进展的核心机制之一。针对小胶质细胞介导视网膜退行性病变中的炎症机制，目前临床尚无靶向性的调控药物。
PFKFB3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3)：6-磷酸果糖激酶-2/2,6-二磷酸果糖磷酸酶3，是细胞内糖酵解通路中代谢酶，负责催化代谢小分子果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)的合成和水解，后者是糖酵解通路的强效激活剂，在调节细胞糖酵解通量及能量代谢中具有重要作用。PFKFB3基因编码的蛋白质属于双功能蛋白质家族，参与果糖-2，6-二磷酸的合成和降解从而调节真核生物糖酵解。这种蛋白质是细胞周期进展和预防细胞凋亡所必需的。它起着细胞周期蛋白依赖性激酶1的调节剂的作用，将葡萄糖代谢与肿瘤细胞中的细胞增殖和存活联系起来，在肿瘤细胞中抑制PFKFB3可以减少肿瘤细胞糖酵解进而抑制肿瘤生长。在中枢神经系统中，抑制神经元PFKFB3可以减少氧化应激引起的细胞凋亡。目前关于PFKFB3在视网膜疾病中的研究报道认为表达于血管内皮细胞中PFKFB3可以通过诱导内皮细胞增殖及迁移调控视网膜新生血管的形成，从而成为潜在调控视网膜血管性疾病的靶点。然而，RDD病理机制主要为炎症的过度激活引起视网膜细胞发生萎缩，晚期可伴有新生血管的形成，RDD本身并非视网膜血管性疾病，因此靶向血管内皮PFKFB3表达抑制血管新生不是视网膜退行性病变的合适干预手段。此外，抑制血管内皮细胞PFKFB3影响正常视网膜血管发育、甚至会引起血供不足加重视网膜萎缩。在RDD发生、发展中，早期视网膜微环境损伤作为刺激因素活化胶质细胞、启动炎症反应，通过炎症因子、缺氧诱导因子及血管生成因子等上游机制，可共同导致视网膜退行性改变。本发明的研究首次发现视网膜小胶质细胞PFKFB3表达升高参与了致病性炎症的启动引起视网膜退行性疾病的进展。
基于此，本发明首次提出通过视网膜小胶质细胞PFKFB3调节糖酵解机制进而调控视网膜炎症水平减缓退行性疾病进展的新治疗思路；即以PFKFB3基因为靶点，通过抑制或下调其表达水平，起到改善或减缓视网膜退行性病变进展的治疗效果。
具体地，本发明提供以下几方面的内容：
第一方面，本发明提供抑制PFKFB3基因表达的抑制剂在制备用于治疗视网膜退行性病变的药物中的应用。
可选地，在一些实施方案中，所述抑制剂特异性抑制视网膜小胶质细胞中的PFKFB3基因表达。
可选地，在一些实施方案中，所述抑制剂抑制PFKFB3基因转录或抑制PFKFB3基因翻译的抑制剂(例如siRNA、shRNA和小分子抑制剂等)。
对于本领域技术人员，容易想到可以在基于转录水平或翻译水平上抑制PFKFB3基因，例如siRNA，无论使用何种水平的抑制剂，只要其用于治疗视网膜退行性病变，就属于本发明的保护范围。
此外，基于本领域公知的PFKFB3基因的核苷酸序列，本领域技术人员容易设计出合适的siRNA，有效实现对PFKFB3基因的表达抑制；无论使用核苷酸序列的siRNA，只要其用于治疗视网膜退行性病变，即属于本发明的保护范围。
可选地，在一些实施方案中，所述抑制剂是通过CRISPR技术对PFKFB3基因编辑以抑制PFKFB3基因表达的抑制剂(例如gRNA和Cas9)。
对于本领域技术人员，容易想到使用本领域通常使用的基因编辑技术例如CRISPR技术对PFKFB3基因进行编辑例如突变、缺失、敲除等以使编码的PFKFB3蛋白发生活性减弱或丧失的效果，实现与抑制PFKFB3基因表达等同的效果，也可以起到改善或减缓视网膜退行性病变进展的治疗效果。
此外，基于本领域公知的PFKFB3基因的核苷酸序列，本领域技术人员容易设计出合适的gRNA实现对PFKFB3基因的编辑，无论使用何种序列的gRNA，只要其用于治疗视网膜退行性病变，即属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明提供一种治疗视网膜退行性病变的药物，其以抑制PFKFB3基因表达的抑制剂作为活性成分。
可选地，在一些实施方案中，所述药物特异性抑制视网膜小胶质细胞中的PFKFB3基因表达。
第三方面，本发明提供一种药物筛选方法，所述药物筛选方法是以筛选出治疗视网膜退行性病变的药物为目的，其包括：
向视网膜退行性病变模型施用抑制PFKFB3基因表达的候选分子，如果在施用所述候选分子后，所述视网膜退行性病变模型的视网膜退行性病变情况较施用所述候选分子前有改善或缓解，则指示所述候选分子可以作为治疗视网膜退行性病变的候选药物。
可选地，在一些实施方案中，所述候选分子特异性抑制视网膜小胶质细胞中的PFKFB3基因表达。
第四方面，本发明提供一种治疗视网膜退行性病变的药物的制备方法，其包括：将抑制PFKFB3基因表达的抑制剂作为药物的活性成分与辅料混合。
可选地，在一些实施方案中，所述抑制剂特异性抑制视网膜小胶质细胞中的PFKFB3基因表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为在WT和PFKFB3+/-基因型小鼠分别玻璃体腔注射Aβ1-40以及进行光照损伤(Light Damage,LD)建立2种视网膜退行性损伤模型，检测到PFKFB3+/-基因型小鼠视网膜小胶质细胞活化水平低于WT小鼠(箭头：Iba1(+)的小胶质细胞)。
图2为在WT和PFKFB3+/-基因型小鼠种分别玻璃体腔注射Aβ1-40建立的视网膜退行性损伤模型中检测到PFKFB3蛋白在模型鼠视网膜组织(小胶质细胞)中表达水平上调，伴随炎症因子mRNA表达改变，PFKFB3+/-基因型小鼠视网膜组织炎症因子表达量低于WT小鼠。
图3为在WT和PFKFB3+/-基因型小鼠玻璃体腔注射Aβ1-40建立的视网膜退行性损伤模型，经OCT及眼底照相检测到造模组小鼠眼底结构改变，同时检测到PFKFB3+/-基因型小鼠视网膜色素上皮-Bruch膜-脉络膜复合体(RBCC)组织中衰老相关分泌表型低于WT小鼠。
图4为在WT和PFKFB3+/-基因型小鼠光照损伤建立的视网膜退行性损伤模型，OCT及眼底照相结构改变，PFKFB3+/-小鼠感光细胞死亡少于WT小鼠，损伤后7天感光细胞外节厚度大于WT组(箭头：感光细胞外节)。
图5为在WT和PFKFB3-kd BV2小胶质细胞系使用Aβ1-40及H2O2建立的体外损伤模型，PFKFB3-kd组BV2细胞炎症因子表达量下降；同时PFKFB3-kd组BV2细胞分泌表型降低了Aβ1-40对RPE和661W细胞的毒性和衰老表型。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用抑制剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1.构建体内Aβ1-40介导的小胶质细胞炎症活化模型，评估小胶质细胞及RPE细胞分泌表型研究：
1.1寡聚体Aβ1-40制备：将Aβ1-40溶于PBS平衡液中，37℃孵化4天，采用Westernblot验证是否形成寡聚体；
1.2视网膜退行性变模型建立：在一组WT及PFKFB3+/-基因型小鼠玻璃体腔内注射Aβ1-40 350μM/2.5μl建立视网膜-RPE退行性病变动物模型，注射等量PBS建立对照模型；在另一组WT及PFKFB3+/-基因型小鼠建立视网膜外核层退行性变模型，经阿托品扩瞳后采用150W白光12h/日照射，使小鼠视网膜外核层萎缩损伤；
1.3视网膜蜕变表型检测：通过冷泉港仪器进行眼底照相及OCT成像，评估WT和PFKFB3+/-基因型小鼠中PBS或Aβ1-40处理的视网膜表型，同时进行Iba-1免疫荧光检测小胶质细胞活化情况；
1.4小胶质细胞活化表型检测：分别取WT和PFKFB3+/-基因型小鼠的Aβ1-40干预组及PBS对照组小鼠视网膜组织，利用Real-time qPCR技术检测视网膜炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-6等)表达情况，并通过Western Blot及Real-time qPCR技术检测PFKFB3分子在视网膜组织中表达情况；
1.5 RPE细胞衰老表型检测：分别取WT和PFKFB3+/-基因型小鼠的Aβ1-40干预组及PBS对照组小鼠RBCC组织，利用Real-time qPCR技术检测衰老相关分泌表型(p16、p21、Lamin-B1等)表达情况。
2.构建体外Aβ1-40介导的BV2小胶质细胞系炎症活化模型，评估小胶质细胞分泌表型和对感光细胞、RPE的损伤/保护机制：
2.1敲低PFKFB3(PFKFB3 knock down,PFKFB3-kd)的细胞模型建立：采用lipo3000转染试剂转染PFKFB3-siRNA(mus-pfkfb3-1109：5’→3’GAGCCUGUGAUCAUGGAAUTT，3’→5’TTCUCGGACACUAGUACCUUA)处理6小时后换成完全培养基，以敲低BV2细胞中PFKFB3分子的表达量，于处理后24-48小时通过Real-time qPCR技术检测PFKFB3m的mRNA水平以评估敲低效率；
2.2 BV2炎症表型检测：在WT和PFKFB3-kd的BV2细胞系中分别检测PBS和Aβ1-40干预24小时后细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6等小胶质细胞促炎型分泌表型特征性分子的表达量；
2.3 BV2对感光细胞系(661W)和RPE细胞系(ARPE19)的保护机制探究：提取PBS、Aβ1-40和过氧化氢(H2O2)处理24小时后WT和PFKFB3-kd的BV2细胞系的上清液，离心、过滤去细胞成分，对分别ARPE19和661W细胞系进行共培养24小时，通过CCK-8试剂盒对ARPE19及661W细胞增殖/毒性进行检测，并通过β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性检测试剂盒检测ARPE19及661W细胞衰老表型。
结果见图1-图5：体内研究中显示在Aβ诱导视网膜损伤及光损伤的小鼠模型中，PFKFB3+/-基因型小鼠视网膜内小胶质细胞活化、增殖水平显著低于WT小鼠(图1)；同时，WT小鼠中Aβ处理后视网膜组织中小胶质细胞的PFKFB3分子表达水平显著上调，伴随炎症因子表达升高，而在PFKFB3+/-基因型小鼠视网膜组织内炎症标志物表达水平下降，显示了下调PFKFB3分子的炎症保护作用(图2)；此外，在Aβ诱导的视网膜损伤的PFKFB3+/-基因型小鼠中，视网膜色素上皮细胞衰老分泌表型较低，眼底整体组织损伤表型较轻，显示出下调PFKFB3分子对RPE细胞衰老机制的保护作用(图3)；而在光损伤模型中，PFKFB3+/-基因型小鼠的感光细胞凋亡水平显著低于WT小鼠，验证了下调PFKFB3分子表达对外核层完整性的保护作用(图4)。体外研究显示PFKFB3-kd组BV2细胞对ARPE19视网膜色素上皮细胞系和661W感光细胞系形成保护作用，有效减缓Aβ所导致的细胞死亡和细胞衰老过程，保护视网膜细胞微环境的稳定(图5)。通过抑制PFKFB3靶点，可以在炎症启动的上游抑制视网膜损伤，实现视网膜保护机制。上述结果表明，视网膜小胶质细胞PFKFB3蛋白可以作为视网膜退行性疾病的炎症环节中的一个新型靶点，针对此靶点合成的抑制该靶基因表达的药物能够更好延缓视网膜退行性疾病。
综上，本发明实施例治疗视网膜退行性疾病的思路具有如下特点：
1、通过下调PFKFB3基因表达进而抑制视网膜小胶质细胞的活化及促炎性分化，以保护视网膜外环境稳定，这是一种新机制，可以从上游抑制视网膜炎症因子分泌和炎症级联反应启动，且不影响小胶质细胞静息状态的免疫监视功能，PFKFB3基因是视网膜退行性疾病炎症环节的一个新治疗靶点；
2、与类固醇激素等治疗机制广泛的药物不同，通过下调PFKFB3基因表达进而抑制小胶质细胞异常活化的生物学手段，可以更加靶向性地抑制视网膜神经退行性病变中的炎症启动环节，对视网膜炎性损伤具有预防和治疗效果，且不造成激素类药物的眼内不良反应；
3、与口服类胡罗卜素类及中药制剂类相比，本发明实施例公开的治疗机制靶点明确，调节机制较为清晰，且有明确的降低炎症因子表达水平的效果，可以作为一种新型的、靶向性针对小胶质细胞介导视网膜退行性病变中神经炎症环节的治疗手段。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.抑制PFKFB3基因表达的抑制剂在制备用于治疗视网膜退行性病变的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂特异性抑制视网膜小胶质细胞中的PFKFB3基因表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是抑制PFKFB3基因转录或抑制PFKFB3基因翻译的抑制剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是通过CRISPR技术对PFKFB3基因编辑以抑制PFKFB3基因表达的抑制剂。
5.一种治疗视网膜退行性病变的药物，其特征在于，其以抑制PFKFB3基因表达的抑制剂作为活性成分。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述抑制剂特异性抑制视网膜小胶质细胞中的PFKFB3基因表达。
7.一种药物筛选方法，所述药物筛选方法是以筛选出治疗视网膜退行性病变的药物为目的，其特征在于，其包括：
向视网膜退行性病变模型施用抑制PFKFB3基因表达的候选分子，如果在施用所述候选分子后，所述视网膜退行性病变模型的视网膜退行性病变情况较施用所述候选分子前有改善或缓解，则指示所述候选分子可以作为治疗视网膜退行性病变的候选药物。
8.根据权利要求7所述的药物筛选方法，其特征在于，所述候选分子特异性抑制视网膜小胶质细胞中的PFKFB3基因表达。
9.一种治疗视网膜退行性病变的药物的制备方法，其特征在于，其包括：将抑制PFKFB3基因表达的抑制剂作为药物的活性成分与辅料混合。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述抑制剂特异性抑制视网膜小胶质细胞中的PFKFB3基因表达。
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