CN114796229A - 6-Thioinosine在抑制ZIKV复制中的应用 - Google Patents

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CN114796229A CN202210509794.9A CN202210509794A CN114796229A CN 114796229 A CN114796229 A CN 114796229A CN 202210509794 A CN202210509794 A CN 202210509794A CN 114796229 A CN114796229 A CN 114796229A
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施一
熊江然
王敏
傅立峰
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    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Abstract

本发明公开了6‑Thioinosine在抑制ZIKV复制中的应用。本发明发现6‑Thioinosine可以抑制寨卡病毒在细胞内的复制，本发明采用酶联免疫吸附实验得到6‑Thioinosine在细胞中抑制ZIKV复制的EC50值为18.82±4.66μM；采用间接免疫荧光的实验方法得到6‑Thioinosine在细胞中抑制ZIKV复制的EC50值为16.69±7.89μM；采用CCK‑8方法检测了6‑Thioinosine的细胞毒性，CC50值为112.2μM，SI指数(CC50/EC50)为5.962。本发明为研发有效抑制ZIKV的药物提供了科学依据。

Description

6-Thioinosine在抑制ZIKV复制中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，6-Thioinosine在抑制ZIKV复制中的应用。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是黄病毒科，黄病毒属的蚊媒病毒，于1947年首次从乌干达寨卡森林中的一只哨兵猴体内分离出来。ZIKV是基因组大小约10.8kb的单股正链RNA病毒，其基因组编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中非结构蛋白NS5的C端具有RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)活性，参与病毒基因组的复制，在ZIKV的生命周期中发挥重要作用。
ZIKV主要经蚊媒传播，也可通过胎盘垂直传播(Brasil et al.,2016)、性传播(Foy et al.,2011)和血液传播(Bierlaire et al.,2017)。蚊媒传播的主要传播媒介为埃及伊蚊 (Aedes aegypti)，非洲伊蚊(Aedes aegypti)与白纹伊蚊(Aedes albopictus)等(Marchette et al.,1969)。蚊虫通过叮咬已感染ZIKV的灵长类动物或是人类后感染ZIKV，再通过叮咬的方式将病毒传播至其它生命体(Herrera et al.,2017)。另外，有研究表明孕妇在怀孕期间感染ZIKV后，病毒会经胎盘传至胎儿体内，胎儿患小头畸形 (Soares deSouza et al.,2016)的风险大幅增加(Hamel et al.,2015)。当ZIKV的感染发生在妊娠早期时，胎儿发育异常的频率会更高(Dang et al.,2016)。除母婴传播外，性传播也是ZIKV的传播途径之一，临床研究发现，在感染ZIKV 6个月之后，14％的患者精液样本中仍然可以检测到ZIKV的核酸(Mead et al.,2018)。同时，研究表明ZIKV还可以通过输血的方式经血液传播(Barjas-Castro et al.,2016)。
ZIKV感染人体后，在皮肤(Hamel et al.,2015)、胎盘(Quicke et al.,2016)、大脑 (Garcez et al.,2016)和生殖器官(Yockey et al.,2016)等多种组织和器官中都可以检测到ZIKV。感染ZIKV后，大部分患者表现为无症状，仅有20％-25％的患者出现发热、皮疹、关节炎或关节痛以及非化脓性结膜炎等临床症状(Colombo et al.,2017)。但是研究者们发现ZIKV感染会导致其他严重疾病，如严重的血小板减少症(Zea-Vera and Parra,2017)，眼部异常(de Paula Freitas et al.,2016)以及新生儿的听力损伤(Leal et al.,2020)等。
目前没有批准用于临床治疗ZIKV感染的特效药或预防ZIKV感染的疫苗，为抵御ZIKV带来的潜在风险，急需开发有效抑制ZIKV感染的小分子抑制剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制寨卡病毒的复制或增殖。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一应用：
1.6-Thioinosine在制备抑制黄病毒科病毒复制或增殖产品中的应用；
2.6-Thioinosine在抑制黄病毒科病毒复制或增殖中的应用；
3.6-Thioinosine在制备治疗或辅助治疗黄病毒科病毒所致疾病产品中的应用；
4.6-Thioinosine在治疗或辅助治疗黄病毒科病毒所致疾病中的应用；
5.6-Thioinosine在制备预防或辅助预防黄病毒科病毒感染产品中的应用；
6.6-Thioinosine在预防或辅助预防黄病毒科病毒感染中的应用；
上文中，所述黄病毒科病毒可为寨卡病毒。在本发明的一个实施例中，所述寨卡病毒为寨卡病毒SZ_SMGC-1。
本发明还提供了下述X1)-X3)中的任一种产品：
X1)抑制黄病毒科病毒复制或增殖的产品，含有6-Thioinosine；
X2)治疗或辅助治疗黄病毒科病毒所致疾病的产品，含有6-Thioinosine；
X3)预防或辅助预防黄病毒科病毒感染的产品，含有6-Thioinosine。
上述产品中，所述黄病毒科病毒可为寨卡病毒。在本发明的一个实施例中，所述寨卡病毒为寨卡病毒SZ_SMGC-1。
上文中，所述抑制黄病毒科病毒复制或增殖可为抑制所述黄病毒科病毒在哺乳动物、器官、组织或细胞中的复制或增殖。所述治疗或辅助治疗黄病毒科病毒所致疾病可为治疗或辅助治疗所述黄病毒科病毒在哺乳动物、器官、组织或细胞中所致的疾病。所述预防或辅助预防黄病毒科病毒感染可为预防或辅助预防所述黄病毒科病毒在哺乳动物、器官、组织或细胞中的感染。
在本发明的一个实施例中，所述细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。
本发明发现6-Thioinosine可以抑制寨卡病毒在Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)内的复制，本发明采用酶联免疫吸附实验得到6-Thioinosine在Vero中抑制ZIKV复制的EC50值为 18.82±4.66μM；采用间接免疫荧光的实验方法得到6-Thioinosine在Vero细胞中抑制ZIKV复制的EC50值为16.69±7.89μM；采用CCK-8方法检测了6-Thioinosine的细胞毒性，CC50值为112.2μM，SI指数(CC50/EC50)为5.962。本发明为研发有效抑制ZIKV的药物提供了科学依据。
附图说明
图1为6-Thioinosine化学结构式(A)以及EC50曲线(B)。
图2为IFA检测候选化合物抗ZIKV活性。
图3为细胞毒性测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验。
下述实施例中的ZIKV病毒为文献(王奇慧等，深圳口岸输入寨卡病毒的基因和生物学特性分析，科学通报，2016年8月，第61卷，第22期)中的寨卡病毒SZ_SMGC-1，经高福课题组同意后，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
6-Thioinosine：上海陶术生物科技有限公司产品，货号：T7621。
3.2.17-deaza-2’-C-methyladenosine(7DMA)：上海皓元生物医药科技有限公司货号： HY-10244。
实施例1、6-Thioinos ine可以抑制ZIKV的复制
1、ELISA实验初步筛选50μM可抑制ZIKV复制的小分子化合物
采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对179种小分子化合物进行50μM单浓度初筛，步骤如下：
(1)准备细胞：在100μL含10％FBS，1％PS(PS：青霉素-链霉素混合溶液，上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0222))的DMEM培养基中，将Vero细胞以104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中过夜培养。
(2)病毒感染：使用含1％PS的DMEM培养基将ZIKV病毒稀释至100TCID50，得到病毒稀释液。使用50μL病毒稀释液感染细胞1h，保留3个细胞孔不进行病毒感染，用作空白对照。
(3)配置含有小分子化合物的维持液：用含2％FBS，1％PS的DMEM培养基将上述179种小分子化合物(所有化合物均用DSMO溶解，初始浓度均为10mM)以及阳性对照药物7DMA(DMSO 溶解，初始浓度为10mM)稀释至50μM，即得到含有待测小分子化合物的维持液。
(4)添加维持液：步骤(2)结束后弃去病毒液，实验组每孔加入100μL的步骤(3) 得到的含有待测小分子化合物的维持液。同时设阴性对照组(即进行ZIKV感染且所用维持液为100μL 2％FBS，1％PS的DMEM培养基)、空白对照组(即未进行ZIKV感染且所用维持液为100μL 2％FBS，1％PS的DMEM培养基)以及阳性对照(即维持液为含有50μM7DMA的2％FBS，1％PS的DMEM培养基)。每组均设3个复孔。
(5)观察细胞病变：在37℃，2％CO2培养箱中连续培养96h，显微镜下观察并记录细胞病变情况。
(6)PBS清洗细胞：96h后弃去培养液，用pH为7.2-7.4的PBS缓冲液轻缓地清洗细胞，200μL/孔，清洗2遍。
(7)4％多聚甲醛固定：清洗后加入100μL/孔的4％多聚甲醛对细胞进行固定，室温固定20min.
(8)封闭：弃去固定液，用PBST(含0.5％吐温20的PBS)清洗细胞两遍。随后用PBST配制的5％脱脂牛奶封闭，100μL/孔，37℃培养箱中封闭1h。
(9)一抗孵育：PBST清洗细胞5遍后加入PBST稀释的抗ZIKV-E蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司，货号：40543-MM09-50)的一抗稀释液，按照1:1000比例稀释一抗，50 μL/孔，在37℃培养箱中孵育1h.
(10)二抗孵育：PBST清洗细胞5遍后加入PBST稀释的辣根酶标记山羊抗小鼠二抗(柏奥易杰(北京)科技有限公司，货号：BE0102-100)的稀释液，二抗按照1:2500比例稀释，50μL/孔，在37℃培养箱中孵育1h。
(11)显色：PBST清洗细胞5遍，然后加入TMB底物，50μL/孔。室温下避光显色10min，需确保每一块96孔板显色时长一致。
(12)终止反应：加入2M的HCL终止显色，50μL/孔。
(13)OD450检测：酶标仪检测实验孔在波长为450nm处的吸光度值(OD450)。将实验孔与对照孔进行对比，分析化合物在50μM浓度下是否具有抑制ZIKV的活性。
结果显示，在179个化合物中，有23个化合物在初筛中表现出较好(抑制率>50％)的抗ZIKV活性，其中一个为6-Thioinosine。
2、ELISA、IFA和噬斑实验检测6-Thioinosine的抗ZIKV活性
2.1 ELISA测定6-Thioinosine剂量依赖抑制ZIKV的EC50值
(1)准备细胞：在100μL含10％FBS，1％PS的DMEM培养基中，将Vero细胞以104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中过夜培养。
(2)稀释病毒：用DMEM培养基将ZIKV病毒稀释至100TCID50，得到感染细胞所用的病毒液。
(3)稀释6-Thioinosine：利用含2％FBS，1％PS的DMEM培养基将6-Thioinosine按照 2倍梯度稀释，得到浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.563μM这7个浓度的6-Thioinosine溶液作为维持液。同时设阴性对照组(即进行ZIKV 感染且所用维持液为100μl 2％FBS，1％PS的DMEM培养基)、空白对照组(即未进行ZIKV感染且所用维持液为100μl 2％FBS，1％PS的DMEM培养基)以及阳性对照(即所用维持液为含有50μM7DMA的2％FBS，1％PS的DMEM培养基)。每组均设3个复孔
(3)ZIKV感染细胞：步骤(1)结束后将50μL步骤(2)的病毒液添加至铺满细胞的 96孔板中，放入培养箱中吸附感染细胞1h，将病毒液弃去,保留3个细胞孔不进行病毒感染，用作空白对照。；
(4)添加抑制剂：弃去病毒液后将上述7个浓度的6-Thioinosine溶液分别加入对应的细胞孔中，每孔100μL，在培养箱中继续培养96h。
(5)观察细胞病变：在37℃，2％CO2培养箱中连续培养96h，显微镜下观察并记录细胞病变情况。
(6)PBS清洗细胞：96h后弃去培养液，用pH为7.2-7.4的PBS缓冲液轻缓地清洗细胞，200μL/孔，清洗2遍。
(7)4％多聚甲醛固定：清洗后加入100μL/孔的4％多聚甲醛对细胞进行固定，室温固定20min.
(8)封闭：弃去固定液，用PBST(含0.5％吐温20的PBS)清洗细胞两遍。随后用PBST配制的5％脱脂牛奶封闭，100μL/孔，37℃培养箱中封闭1h。
(9)一抗孵育：PBST清洗细胞5遍后加入PBST稀释的抗ZIKV-E蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司，货号：40543-MM09-50)的一抗稀释液，按照1:1000比例稀释一抗，50 μL/孔，在37℃培养箱中孵育1h.
(10)二抗孵育：PBST清洗细胞5遍后加入PBST稀释的辣根酶标记山羊抗小鼠二抗(柏奥易杰(北京)科技有限公司，货号：BE0102-100)的稀释液，二抗按照1:2500比例稀释，50μL/孔，在37℃培养箱中孵育1h。
(11)显色：PBST清洗细胞5遍，然后加入TMB底物，50μL/孔。室温下避光显色10min，需确保每一块96孔板显色时长一致。
(12)终止反应：加入2M的HCL终止显色，50μL/孔。
(13)OD450检测：酶标仪检测实验孔在波长为450nm处的吸光度值(OD450)。将实验孔与对照孔进行对比，分析化合物在50μM浓度下是否具有抑制ZIKV的活性。
实验结果显示6-Thioinosine以剂量依赖的方式抑制ZIKV在Vero细胞中的复制。6-Thioinosine浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.563 μM时对Vero细胞的抑制率分别为99.175±4.711、95.661±9.272、66.935±8.32、 39.85±5.147、17.684±7.211、6.594±8.101、4.622±2.913％。实验所得数据使用Graphpad Prism8.0进行统计分析，得到6-Thioinosine抑制ZIKV在Vero细胞中复制的EC50值为18.82 ±4.66μM。6-Thioinosine结构式以及EC50曲线见图1。
2.2间接免疫荧光实验(indirect immunofluorescence assay,IFA)
(1)准备细胞：在100μL含10％FBS，1％PS的DMEM培养基中，将Vero细胞以104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中过夜培养。
(2)稀释病毒：用DMEM培养基将ZIKV病毒稀释至100TCID50，得到感染细胞所用的病毒液；
(3)稀释6-Thioinosine：利用含2％FBS，1％PS的DMEM培养基将6-Thioinosine按照 2倍梯度稀释，得到浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM 这6个浓度的6-Thioinosine溶液作为维持液。同时设阴性对照组(即进行ZIKV感染且所用维持液为100μl 2％FBS，1％PS的DMEM培养基)、空白对照组(即未进行ZIKV感染且所用维持液为100μl 2％FBS，1％PS的DMEM培养基)以及阳性对照(即所用维持液为含有50μM7DMA 的2％FBS，1％PS的DMEM培养基)。每组均设3个复孔。
(3)感染细胞：将病毒液添加至铺满细胞的96孔板中，放入培养箱中吸附感染1h，然后将病毒液弃去，然后将上述7个浓度的6-Thioinosine溶液分别加入对应的细胞孔中。在培养箱中继续培养96h。
(4)观察细胞病变：在37℃，2％CO2培养箱中连续培养96h，显微镜下观察并记录细胞病变情况。
(5)PBS清洗细胞：96h后弃去培养液，用pH为7.2-7.4的PBS缓冲液轻缓地清洗细胞，200μL/孔，清洗2遍。
(6)4％多聚甲醛固定：清洗后加入100μL/孔的4％多聚甲醛对细胞进行固定，室温固定20min.
(7)封闭：弃去固定液，用PBST(含0.5％吐温20的PBS)清洗细胞两遍。随后用PBST配制的5％脱脂牛奶封闭，100μL/孔，37℃培养箱中封闭1h。
(8)一抗孵育：PBST清洗细胞5遍后加入PBST稀释的抗ZIKV-E蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司，货号：40543-MM09-50)的一抗稀释液，按照1:1000比例稀释，50μL/ 孔，在37℃培养箱中孵育1h。
(9)二抗孵育：PBST清洗细胞5遍后加入荧光抗体稀释液(北京博奥森生物技术有限公司，货号：C01-04004-100ml)稀释的FITC标记山羊抗人二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZF-0308)，按照1:500比例稀释，30μL/孔，在37℃培养箱中避光孵育1h。
(10)细胞核染色：用PBST避光清洗细胞5遍，然后加入DAPI染核液(北京博奥森生物技术有限公司，货号：C02-04002)，30μL/孔。室温下避光染色10min，需确保每一块96孔板染色时长一致。
(11)清洗细胞：PBST避光清洗细胞5遍，然后加入PBS缓冲液，30μL/孔，避光放置，等待检测。
(12)检测：CQ1共聚焦荧光显微镜进行荧光检测，并对病毒感染细胞进行计数。
(13)分析：使用GraphPad 8.0对实验数据进行统计分析。
实验结果如图2所示。6-Thioinosine以剂量依赖的方式抑制ZIKV，在100μM和50μM浓度下，大部分病毒被抑制；在25μM浓度下可以抑制超过50％的ZIKV，但是在12.5μM 时，只能抑制少部分病毒，病毒量与阴性对照十分接近。因此得到结论，6-Thioinosine可以抑制ZIKV的增殖。通过对病毒感染的细胞进行荧光计数，得到IFA实验中6-Thioinosine 抑制ZIKV在Vreo细胞中复制的EC50为16.69±7.89μM(图2)。
3、CCK-8实验检测6-Thioinosine细胞毒性
(1)准备细胞：在100μL含10％FBS，1％PS的DMEM培养基中，将Vero细胞以104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中过夜培养。
(2)稀释抑制剂：使用含1％青霉素-链霉素混合溶液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0222)的DMEM培养基将6-Thioinosine按照2倍梯度稀释，得到120μM、60μM、 30μM、15μM、7.5μM、3.25μM、1.625μM、0.8125μM这8个浓度的6-Thioinosine 溶液。
(3)添加抑制剂：步骤(1)结束后将含有不同浓度6-Thioinosine的培养基添加细胞孔中。同时设置空白对照(利用含1％青霉素-链霉素混合溶液的DMEM培养基处理，培养基中不含6-Thioinosine)。然后在37℃，5％CO2的培养箱中孵育96h。
(4)添加CCK-8试剂检测细胞毒性：96h后弃去培养基上清，使用PBS清洗两遍，然后在每个细胞孔中添加100μLDMEM培养基以及10μLCCK-8试剂，随后放置到37℃培养箱内孵育2h，
(5)酶标仪上读取OD450值。
(6)数据处理：数据用graphpad8.0处理，计算获得半数细胞毒性浓度(CC50)。
实验结果如图3所示，6-Thioinosine的细胞毒性结果显示，CC50值为112.2μM。当6-Thioinosine浓度低于60μM时，细胞毒性小于25％，当6-Thioinosine浓度为120μM时，细胞毒性大于50％，CC50值为112.2μM，远大于EC50值18.82±4.66μM，SI指数(CC50/EC50) 为5.962。说明，6-Thioinosine在低于60μM时细胞毒性很小。
本实施例中，细胞培养步骤如下：
(1)细胞复苏：
1)将冻存于液氮罐中的Vero细胞取出，快速转移至提前准备好的37℃恒温水浴锅中，并轻轻摇晃，使其在1min之内融化。确保融化过程中所有细胞都处于37℃的温度环境之中，使细胞快速度过-5℃-0℃这一最易受损温度段，以保证细胞的存活率。水浴锅液面不能高于冻存管口处，避免细胞污染。
2)解冻后的细胞悬液在离心机中进行离心，室温，1 000rmp/min，离心5min。
3)弃上清，使用1mL的含10％FBS，1％PS的DMEM培养基进行重悬，吹打混匀后接种至细胞培养皿，十字法轻轻摇晃细胞培养皿，确保细胞均匀分布后放入37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中。
(2)细胞传代：
1)在显微镜下观察细胞，确保细胞状态良好且无污染后将细胞培养皿转移至生物安全柜中。
2)使用预热至37℃的PBS将细胞清洗2遍。
3)加入适量胰酶进行细胞消化。将已添加胰酶的细胞培养皿放在显微镜下观察，待细胞变圆且有少数脱落时将胰酶倒掉，继续放入37℃培养箱中消化1min。
4)使用10％FBS，DMEM培养基终止消化，并吹打混匀为单细胞悬液。
5)将细胞悬液按照1:3或1:4进行传代。
(3)细胞冻存：
1)观察细胞状态，选取细胞状态良好且处于对数生长期的细胞进行冻存。
2)加入适量胰酶进行细胞消化。将已添加胰酶的细胞培养皿放在显微镜下观察，待细胞变圆且有少数脱落时将胰酶倒掉，继续放入37℃培养箱中消化1min。
3)消化完成后将细胞悬液转移至15mL离心管，1 000rmp/min，5min，使用1mL细胞冻存液对管底的细胞进行重悬，吹打混匀为单细胞悬液，按1:3的比例分装至细胞冻存管中，放入提前降温至室温的细胞冻存盒内。
4)将冻存盒放入-80℃冰箱进行冻存。24h后将细胞从-80℃转移至液氮罐中保存。若无细胞冻存盒，则遵循“慢冻速溶”的原则，进行4℃、-20℃、-80℃温度梯度降温冻存，每个温度保留时间为1～2h。
ZIKV扩增步骤如下：
(1)准备细胞：感染前一天将C6/36细胞接种传代至密封的T175细胞培养瓶中，细胞密度以第二天病毒接种前细胞长满90％为宜，使用含有10％FBS，1％PS的RPMI1640培养基，细胞在28℃，无CO2的培养箱中进行培养。
(2)病毒接种：将ZIKV以MOI＝0.01接种至C6/36细胞中，使用2％FBS，RPMI1640培养基稀释病毒液，接种前用PBS清洗细胞1-2遍，然后将稀释好的病毒液铺到细胞培养瓶中。培养瓶放置到28℃温度环境下使病毒吸附感染细胞1h。
(3)病毒增殖：1h后补入2％FBS，RPMI1640培养基，在培养箱终静置培养5-8天(第5天收集第一批上清，换液3天后，即感染后第8天收集第二批上清)，期间观察细胞病变情况。
(4)病毒冻存：将收集的病毒液以1 2000rmp/min的转速离心30min，离心后病毒液混匀分装至病毒冻存管中，放入-80℃冰箱保存。
噬斑实验测定病毒滴度步骤如下：
(1)准备细胞：Vero细胞消化，接种于6孔细胞培养板中，接种密度以第二天细胞单层长满为宜。未长满单层不能进行实验，细胞过密则会影响ZIKV的感染效率。
(2)接种病毒：使用维持液(2％FBS，1％PS，DMEM培养基)将ZIKV进行10倍稀释，设置6个稀释度，每个稀释度3个复孔。在单层长满Vero细胞的6孔板中加入500μL不同稀释度的病毒液，放入37℃的培养箱中培养1h。500μL病毒液刚好覆盖6孔板底部，为防止细胞晾干，每隔15min轻晃6孔板一次。
(3)加低熔点琼脂糖：将低熔点琼脂糖粉末配制成4％的低熔点琼脂，使用前需112℃高温高压灭菌20min。将4％琼脂糖在70℃水浴锅中融化，并在融化后调整水浴锅温度至37℃，使琼脂糖降温至37℃备用。弃去病毒液后向每个细胞孔加入2mL琼脂盖(4％低熔点琼脂糖与维持液3:1混合液)，待琼脂盖凝固后，将6孔板放入细胞培养箱进行培养，4-6 天观察出斑情况。
(4)固定染色：观察到明显的病毒噬斑后，向每个细胞孔加入3mL的4％多聚甲醛进行固定，1h后弃去固定液与琼脂盖，用去离子水轻柔的清洗细胞孔2-3次。加入1mL的结晶紫溶液，室温染色30min，回收结晶紫溶液，并用去离子水清洗细胞孔2-3次。
(5)计数并计算病毒滴度：计数不同稀释度病毒液感染细胞产生的噬斑，并计算出病毒滴度。计算公式为：噬斑形成单位(Plaque forming unit，PFU)＝(平均出斑数×病毒稀释度)/病毒接种体积(mL)，病毒滴度以PFU/mL表示。
TCID50方法测定病毒滴度步骤如下：
(1)准备细胞：将Vero细胞以1×104/孔、100μL/孔接种于96孔细胞培养板，过夜培养至细胞长满85％-90％。
(2)病毒接种：用DMEM培养基将病毒液10倍稀释，准备8个浓度梯度，即将ZIKV稀释101至108倍。用PBS将前一天准备的96孔细胞培养板清洗2遍，目的是除去血清，以防止影响病毒感染效率。然后将稀释好的病毒按照浓度梯度添加至96孔板中，放入37℃，5％ CO2培养箱中，病毒感染吸附细胞1h。1h后弃去病毒接种液，每孔加入150μL含2％FBS， 1％PS的DMEM培养基作为细胞生长的维持液，随后放进培养箱中培养5-7天。每个稀释度设置6个复孔，同时设DMEM组作为阴性对照。
(3)计算TCID50值：接种病毒后每24h观察1次细胞，标记出现病变的细胞孔，做好记录，直至连续3天不能观察到新的病变孔后，停止观察，对病变孔进行计数，采用 Reed-Muench方法计算ZIKV的TCID50。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.6-Thioinosine在制备抑制黄病毒科病毒复制或增殖产品中的应用。
2.6-Thioinosine在抑制黄病毒科病毒复制或增殖中的应用。
3.6-Thioinosine在制备治疗或辅助治疗黄病毒科病毒所致疾病产品中的应用。
4.6-Thioinosine在治疗或辅助治疗黄病毒科病毒所致疾病中的应用。
5.6-Thioinosine在制备预防或辅助预防黄病毒科病毒感染产品中的应用。
6.6-Thioinosine在预防或辅助预防黄病毒科病毒感染中的应用。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述黄病毒科病毒为寨卡病毒。
8.下述X1)-X3)中的任一种：
X1)抑制黄病毒科病毒复制或增殖的产品，含有6-Thioinosine；
X2)治疗或辅助治疗黄病毒科病毒所致疾病的产品，含有6-Thioinosine；
X3)预防或辅助预防黄病毒科病毒感染的产品，含有6-Thioinosine。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述黄病毒科病毒为寨卡病毒。
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