CN114788895A - 一种pha复合材料、pha微球的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于材料技术领域，公开了一种PHA复合材料、PHA微球的制备方法及其应用。该PHA复合材料的制备方法包括：将PHA溶于溶剂中，然后与聚合物混合，再去溶剂，制得。该PHA微球的制备方法包括：将制备的PHA复合材料溶于溶剂中，得到油相；将聚乙烯醇或透明质酸溶于水中，制得水相；将油相和水相混合得混合物，经乳化后，固化，即制得。制备的PHA微球的粒径为20‑60μm，静态水接触角为60‑90度，对牛血清白蛋白的吸附浓度大于4000μg/g；具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性，能够广泛应用于制备细胞培养物、组织填充物和医美产品。本发明提供的制备方法简单，操作步骤少。
Description
技术领域
本发明属于材料技术领域，具体涉及一种PHA复合材料、PHA微球的制备方法及其应用。
背景技术
随着人类年龄增长或受某些疾病影响，人体中肌肉和胶原蛋白组织会产生不同程度的功能性退化，造成皮肤凹陷、胃液反流等问题，因此人们发明了多种填充剂，以此来填补凹陷皮肤或通过异物刺激肌肉和胶原蛋白的再生长，如玻尿酸、牛胶原蛋白等。但这些物质作为填充剂所起到的填充效果维持时间较短，需要频繁在注射保持其填充效果。为达到长期填充效果，人们又尝试使用生物的不可降解的材料制作成微球作为填充剂，如聚乙烯醇(PVA)，聚甲基丙基酸甲酯(PMMA)等。尽管这些填充剂的填充效果维持时间明显增长，但这些材料在体内留存过久，会释放有害物质，并因此引发一系列的副反应，危害人体健康。
近年来，生物可降解的高分子材料走入人们的视野，该类型材料对人体无毒无排斥反应，并可以随着人体代谢逐渐降解后排出体外，且可以通过调节材料的分子量等参数，使降解时间从一周到长达数年不等。聚羟基脂肪酸酯，英文名为polyhydroxyalkanoates，简称PHA，是一种天然的高分子生物材料，由微生物合成的一种细胞内聚酯。由于PHA具有良好的生物相容性能、生物可降解性，是当下最为理想的生物医学材料之一。PHA在体内与细胞具有良好的细胞相容性，细胞可以在此种支架上良好生长，且该种支架可以降解为CO2和H2O。
目前，在将PHA材料制备可注射微球时，通常是制备纯PHA微球，或者通过化学合成的PHA复合材料，纯的PHA微球是疏水性的，其静态水接触角大于150度，无法与细胞进行良好地粘附，用于组织填充时，其相容性差。且，目前PHA微球的粒径高，分散性高，利用其作为医美注射微球时，还需要对其进行筛分，步骤繁琐。
因此，亟需提供一种PHA微球的制备方法，能够制备出具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性，且粒径均一可控的PHA微球。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种PHA微球的制备方法，能够制备出具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性，且粒径均一可控的PHA微球。
本发明第一方面提供了一种PHA复合材料的制备方法。
具体地，一种PHA复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将PHA溶于溶剂中，然后与聚合物混合，再去溶剂，制得所述PHA复合材料；
所述聚合物为聚乙二醇(PEG)、胶原蛋白、透明质酸或聚赖氨酸中的一种。
优选地，所述聚合物为聚乙二醇，如PEG4000、PEG6000等。聚乙二醇具有优异的水溶性、生理惰性、温和性、润滑性等。通过选用聚乙二醇对PHA改性，可以提高PHA的亲水性，使其具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性。
优选地，所述PHA(聚羟基脂肪酸酯)包括但不限于聚-β-羟丁酸(PHB)，3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物(PHBV)，3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚酯(PHBHHx)，以及聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P34HB)。
优选地，所述PHA的重均分子量为20000-1000000；进一步优选地，所述PHA的重均分子量为30000-200000。
优选地，所述聚乙二醇的重均分子量为400-20000。通进一步优选地，所述聚乙二醇的重均分子量为2000-10000。过对聚乙二醇的分子量进行控制，可以进一步提高PHA复合材料的细胞粘附性。
优选地，所述溶剂选自N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氯甲烷或乙腈中的至少一种。
优选地，所述聚合物占所述PHA复合材料的质量的1％-90％；进一步优选地，所述聚合物占所述PHA复合材料的质量的10％-80％；更优选地，所述聚合物占所述PHA复合材料的质量的20％-60％。
优选地，所述去溶剂的过程为于20-100℃下旋转蒸发后，进行冷冻干燥。
更为具体地，一种PHA复合材料的制备方法，包括以下步骤：
向重均分子量为2000-1000000的PHA中加入溶剂，制备浓度为5-40mg/mL的PHA溶液；然后取400mLPHA溶液，然后加入聚乙二醇(PEG)、胶原蛋白或聚赖氨酸中的一种，搅拌溶解，于20-100℃下旋转蒸发，进行冷冻干燥，制得PHA复合材料。
本发明第二方面提供了一种PHA微球的制备方法。
具体地，一种PHA微球的制备方法，包括以下步骤：
将上述制备方法制得的PHA复合材料溶于溶剂中，得到油相；将聚乙烯醇或透明质酸溶于水中，制得水相；将所述油相和所述水相混合得混合物，将所述混合物乳化后，固化，即制得PHA微球。
优选地，所述溶剂选自N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氯甲烷或乙腈中的至少一种。
优选地，在所述油相中，所述PHA复合材料的质量浓度为0.1-80mg/mL；进一步优选地，在所述油相中，所述PHA复合材料的质量浓度为5-60mg/mL；更优选地，在所述油相中，所述PHA复合材料的质量浓度为10-50mg/mL。
优选地，在所述水相中，聚乙烯醇或透明质酸的质量百分比为0.1％-8％；进一步优选地，在所述水相中，聚乙烯醇或透明质酸的质量百分比为0.5％-5％；更优选地，在所述水相中，聚乙烯醇或透明质酸的质量百分比为0.5％-3％。
优选地，所述油相和所述水相的体积比为1：(3-15)；进一步优选地，所述油相和所述水相的体积比为1：(5-10)。
优选地，所述乳化的压强为0.005-0.05MPa；进一步优选地，所述乳化的压强为0.005-0.03MPa；更优选地，所述乳化的压强为0.008-0.015MPa。因为人体吞噬细胞的存在，用于医美的PHA微球的直径通常需要在20μm以上，但微球过大又会堵塞针头，甚至引起皮肤破裂。因此用于注射的微球粒径通常为20-60μm。本申请通过对制备方法的控制，尤其是乳化中压强的控制，能够使PHA微球的粒径控制在20-60μm，其分布均匀，可较少筛分的工艺。
优选地，所述固化的过程为向乳化后的混合物中加入水，搅拌，去溶剂。
选选地，所述去溶剂的过程包括挥发法、固液分离法和喷雾干燥法等。
更为具体地，一种PHA微球的制备方法，包括以下步骤：
将上述制备方法制备的PHA复合材料溶于溶剂中，配制成质量浓度为0.1-80mg/mL的PHA复合材料溶液，即得到油相；将聚乙烯醇或透明质酸溶于水中，制得质量百分比为0.1％-8％的水相；然后将所述油相和所述水相按照1：(3-15)的体积比混合，得混合液；再将所述混合液于0.005-0.05MPa的压强下进行乳化，最后经固化，干燥，制得所述PHA微球。
本发明第三方面提供了一种PHA微球。
具体的，一种PHA微球，由上述制备方法制得，所述PHA微球的粒径为20-60μm；所述PHA微球的静态水接触角为60-90度；所述PHA微球对牛血清白蛋白的吸附浓度大于4000μg/g。
优选地，所述PHA微球的粒径为20-40μm；所述PHA微球的静态水接触角为60-80度；所述PHA微球对牛血清白蛋白的吸附浓度大于4000μg/g。
优选地，所述聚合物占所述PHA微球的质量的1％-90％；进一步优选地，所述聚合物占所述PHA微球的质量的10％-80％；更优选地，所述聚合物占所述PHA微球的质量的20％-60％。
本发明第四方面提供了上述PHA微球在制备组织填充物或医美产品中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明采用聚合物聚乙二醇(PEG)、胶原蛋白或聚赖氨酸对PHA进行改性，制得PHA复合材料；再利用该PHA复合材料为油相，与水相进行乳化，制备PHA微球。通过对原料和工艺的控制，使制得的PHA微球的粒径能够控制在20-60μm，静态水接触角为60-90度，对牛血清白蛋白的吸附浓度大于4000μg/g；具有良好亲疏水性和优异的细胞粘附性，且粒径均一可控，能够广泛应用于制备组织填充物和医美产品。
(2)本发明提供的制备方法简单，操作步骤少，不需要复杂的筛分就能得到均一的PHA微球。
附图说明
图1为实施例1制备的PHA微球的扫描电镜图；
图2为实施例1制备的PHA微球的粒径分布图；
图3为牛血清白蛋白吸附实验中的标准曲线图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种PHA复合材料的制备方法，包括以下步骤：
以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/mL的P34HB(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6W)溶液；然后取400mL P34HB溶液，加入8g PEG4000，搅拌溶解，放入1L的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得PHA复合材料(PEG4000&P34HB)。
一种PHA微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的PHA复合材料配制成质量浓度为30mg/mL的PHA复合材料溶液，即得到油相；
(2)将聚乙烯醇(PVA)溶于280mL水中，配制PVA质量浓度为1.5％的水相；取40mL步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015MPa，检查气密性：0.03MPa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012MPa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280mL水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得PHA微球。实施例1制备的PHA微球的扫描电镜图如图1所示，由图1可知，微球的粒径均一，球形良好。
实施例2
一种PHA复合材料的制备方法，包括以下步骤：
以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/mL的PHA(PHA的重均分子量为3-6W)溶液；然后取400mL P34HB溶液，加入0.89g PEG4000，搅拌溶解，放入1L的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得PHA复合材料(PEG4000&P34HB)。
一种PHA微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的PHA复合材料配制成质量浓度为30mg/mL的PHA复合材料溶液，即得到油相；
(2)将聚乙烯醇(PVA)溶于280mL水中，配制PVA质量浓度为1.5％的水相；取40mL步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015MPa，检查气密性：0.03MPa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012MPa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280mL水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得PHA微球。
实施例3
一种PHA复合材料的制备方法，包括以下步骤：
以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/mL的P34HB(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6W)溶液；然后取400mL P34HB溶液，加入3.4g PEG4000，搅拌溶解，放入1L的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得PHA复合材料(PEG4000&P34HB)。
一种PHA微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的PHA复合材料配制成质量浓度为30mg/mL的PHA复合材料溶液，即得到油相；
(2)将聚乙烯醇(PVA)溶于280mL水中，配制PVA质量浓度为2.0％的水相；取40mL步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015MPa，检查气密性：0.03MPa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012MPa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280mL水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得PHA微球。
对比例1
一种PHA复合材料的制备方法，包括以下步骤：
以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/mL的P34HB(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6W)溶液；然后取400mL P34HB溶液，加入100g PEG4000，搅拌溶解，放入1L的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得PHA复合材料(PEG 4000&P34HB)。
一种PHA混合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的PHA复合材料配制成质量浓度为30mg/mL的PHA复合材料溶液，即得到油相；
(2)将聚乙烯醇(PVA)溶于280mL水中，配制PVA质量浓度为1.5％的水相；取40mL步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015MPa，检查气密性：0.03MPa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012MPa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280mL水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得PHA混合物。在该方法下所制得的材料，球形皱缩严重，95％呈不规则碎片状，无法制成微球。
对比例2
一种PHA复合材料的制备方法，包括以下步骤：
以二氯甲烷为溶剂，制备浓度为20mg/mL的P34HB(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6W)溶液；然后取400mL P34HB溶液，加入90g PEG4000，搅拌溶解，放入1L的旋蒸瓶中，于45℃油浴温度下旋转蒸发20h，采用-10℃冷凝水回收溶剂；再将旋转蒸发后的膏状物于-40℃下冷冻干燥，制得PHA复合材料(PEG 4000&PHA)。
一种PHA混合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用二氯甲烷作为溶剂，将上述方法制备的PHA复合材料配制成质量浓度为30mg/mL的PHA复合材料溶液，即得到油相；
(2)将聚乙烯醇(PVA)溶于280mL水中，配制PVA质量浓度为1.5％的水相；取40mL步骤(1)制备的油相与水相混合，得混合液；
(3)将混合液加入到中科森辉常规膜乳化器中，设置缓冲压力为0.015MPa，检查气密性：0.03MPa，6.1μm，无气泡；然后搭载使用6.1um膜管，调试乳化压力为0.012MPa，乳化搅拌转速为220r/min，乳化60min；乳化结束后，加入280mL水，于120r/min的转速下搅拌40h，自然挥发掉有机溶剂；最后冻干31h，制得PHA混合物。此方法下无法成球，制备的材料呈块状。
对比例3
对比例3为实施例1中使用的纯P34HB(聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)，重均分子量为3-6W)。
产品效果测试
(1)静态水接触角数据
在室温下，将实施例1-3制备的PHA微球和对比例3中纯PHA，进行干燥，然后放到静态接触角测定仪上进行测试，分别在每个试样取六个点进行测量，计算平均值。
(2)采用激光粒度仪分析PHA微球的粒径分布，测试PHA微球的平均粒径以及span值(粒径分布离散程度)。
(3)牛血清白蛋白(BSA)吸附实验
a.绘制蛋白生长曲线：将BSA配成3mg/mL的溶液，用分光光度计全波长扫描，检测蛋白的最大吸收波长为278.58nm。然后配置0.5、1、1.5、3、4、5mg/mL等系列浓度梯度的溶液，在278.58nm处检测各浓度的溶液的吸光值，绘制标准曲线。标准曲线如图3所示。
b.然后配制5mg/mL的牛血清白蛋白溶液，分别孵育实施例1-3制备的PHA微球，具体孵育过程为：取10mL牛血清白蛋白溶液，分别加入0.03g实施例1-3制备的PHA微球，于25℃下孵育5小时，然后检测孵育后牛血清白蛋白溶液(上清溶液)的吸光值，根据标准曲线计算具体的吸附浓度。
测试结果如表1所示。
表1
由表1可知，经检测，纯PHA的静态水接触角为155度，而实施例1-3经过PEG改性后制备的PHA微球的静态水接触角在60-90度之间，尤其实施例1和3制备的PHA微球的静态水接触角在60-80度，还出现散晕，细胞能够更好地粘附、培养，更适用于组织填充、医美注射等。且经过检测，实施例1-3制备的PHA微球各个点位、正反、内外部的接触角都基本一致，其均匀度高，材料具有一体性。
由表1可知，本发明制备的PHA微球的平均粒径在20-60μm，更精确的为20-40μm，且span值较小，粒径分布集中。其中实施例1制备的PHA微球的粒径分布图如图2所示。本发明通过对原料组分的选择以及乳化压力的控制，能够将PHA微球的粒径控制在20-60μm，其分布均匀，可较少筛分的工艺。
生物材料与生理环境相接触时，生物材料想要在体内不被排斥，没有严重的填充物相关副作用，需要很好的细胞粘附性，而细胞粘附性中一个很重要的点，在于细胞表面粘附有大量蛋白，而蛋白吸附是一个重要的细胞粘附推动力。CT1电荷球是常用的细胞培养微载体，数值越高，蛋白吸附性越好。经测试CT1电荷球吸附牛血清白蛋白的值600μg/g。由表1可知，实施例1制备的PHA微球对牛血清白蛋白的吸附浓度为4800μg/g；实施例2制备的PHA微球对牛血清白蛋白的吸附浓度为4100μg/g；实施例3制备的PHA微球对牛血清白蛋白的吸附浓度为4300μg/g。经对比分析，本发明制备的PHA微球具有优异的蛋白吸附性，吸附浓度是CT1电荷球的7-8倍，进而表明其具有优异的细胞粘附性，可以用于医美填充、细胞培养、植入医疗器械等。
实验发现，其他PHA材料，如聚-β-羟丁酸(PHB)，3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物(PHBV)，3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚酯(PHBHHx)，采用相同的方法制备PHA微球材料，能够达到类似的效果。
Claims (10)
1.一种PHA复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将PHA溶于溶剂中，然后与聚合物混合，再去溶剂，制得所述PHA复合材料；
所述聚合物为聚乙二醇、胶原蛋白、透明质酸或聚赖氨酸中的一种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PHA的重均分子量为20000-1000000。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氯甲烷或乙腈中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物占所述PHA复合材料的质量的1％-90％。
5.一种PHA微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1-4中任一项所述的制备方法制得的PHA复合材料溶于溶剂中，得到油相；将聚乙烯醇或透明质酸溶于水中，制得水相；将所述油相和所述水相混合得混合物，将所述混合物乳化后，固化，即制得PHA微球。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述油相中，所述PHA复合材料的质量浓度为0.1-80mg/mL；在所述水相中，聚乙烯醇或透明质酸的质量百分比为0.1％-8％。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述油相和所述水相的体积比为1：(3-15)。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乳化的压强为0.005-0.05MPa。
9.一种PHA微球，由权利要求5-8中任一项所述的制备方法制得，所述PHA微球的粒径为20-60μm；所述PHA微球的静态水接触角为60-90度；所述PHA微球对牛血清白蛋白的吸附浓度大于4000μg/g。
10.权利要求9所述的PHA微球在制备组织填充物或医美产品中的应用。
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