CN114786710A - 工程改造红细胞用于治疗溶酶体贮积病 - Google Patents

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Abstract

提供了治疗患有溶酶体贮积病的受试者的方法，包括工程改造Lin‑造血干细胞和/或祖细胞以得到表达多肽的工程化红细胞，其中所述多肽可以是α‑GAL A或GRHPR。还提供了在体外从Lin‑造血干细胞和/或祖细胞产生红细胞的方法，通过该方法产生的红细胞，和包含该红细胞的组合物。

Description

工程改造红细胞用于治疗溶酶体贮积病
发明领域
本公开内容涉及生产红细胞的方法，包括(i)工程改造造血干细胞和/或祖细胞以表达多肽，例如涉及溶酶体贮积病的酶，和(ii)在体外将经工程改造的造血干细胞和/或祖细胞分化为成熟红细胞，其中成熟红细胞表达所述多肽。本公开内容的方面还涉及包含这些红细胞的组合物以及这些红细胞的治疗用途。在一些实施方案中，所述用途包括治疗患有溶酶体贮积病(例如法布里(Fabry)病或II型原发性高草酸尿症)的受试者。
发明背景
溶酶体贮积病(LSD)是一组罕见的代谢疾病，其特点是缺乏功能性个体溶酶体酶。大多数LSD是以常染色体隐性或X连锁性状遗传的，并通常出现在婴儿期和儿童期，尽管成人发病形式也会出现。LSD的实例包括法布里病、戈谢氏(Gaucher)病和II型原发性高草酸尿症(PH2)。
LSD的传统治疗方法是酶替代疗法(ERT)，其中通常通过大剂量静脉内注射将功能性酶递送至给患者。在ERT中，患者必须在其余生中反复施用这些功能酶。
目前可用于治疗LSD的ERT有几个局限性。首先，患者在输注酶后通常会产生免疫应答或过敏反应。尽管抗体应答因特定的酶分子和个体患者而异，但在接受ERT治疗的患者中已观察到显著的免疫应答。将治疗酶与PEG缀合可能会降低患者的免疫应答。然而，研究表明，许多使用PEG缀合酶治疗的患者产生抗PEG抗体。值得注意的是，PEG可能会对缀合酶的活性产生不利影响，导致治疗的功效降低。其次，之前的ERT使用体外表达的重组酶，这些重组酶通常缺乏对酶摄取和细胞内转运至关重要的适当糖基化修饰。第三，由于半衰期短、生物利用度有限和/或与血浆蛋白的相互作用，治疗酶可能在体内失活或消失。第四，酶的生产和纯化往往很耗时，并因此用ERT进行治疗非常昂贵。例如，目前治疗I型戈谢氏病患者平均每年花费18万美元，治疗法布里病患者平均每年花费21.5万美元。
因此，任何ERT的成功应用都需要仔细选择和使用合适的载体，以向患者递送治疗酶。一些已知的递送载体包括抗体、可溶性和生物可降解聚合物、多糖和其他载体、微囊、微粒、脂蛋白、脂质体和红细胞。
有几种方法使用工程改造的RBC来递送包括酶在内的治疗剂，尽管每种方法都有其自身的局限性。例如，在2003年，Murciano等人发现，在合适的渗透压下，通过包封可以产生工程改造的RBC。然而，这一过程会破坏细胞膜的完整性，缩短红细胞的寿命，并影响肽的化学性质。此外，很难控制包封的多肽的释放。2010年，Zaitsev等人发现，通过与RBC特异性抗体(如抗血型糖蛋白抗体)融合，外来货物可以在RBC表面上表达，外来多肽可以在红细胞表面上表达。然而，这种功效是有限的，因为这种附着于RBC的方式是非共价的，并且容易解离，因此减少了可供递送的货物的循环半衰期和质量。2014年，Shi等人通过添加可被sortase A识别的LPXTG基序，对红细胞膜蛋白的C末端进行了修饰。经修饰的膜蛋白将经由sortase介导的转肽作用与RBC膜蛋白共价连接。虽然不破坏膜的完整性也不缩短红细胞的生命周期，但这种方法优选地与在N末端内含有(G)n序列的膜蛋白一起使用，因此其应用仅限于某些膜蛋白。2017年，Huang等人在祖细胞中对RBC进行遗传工程改造，并在成熟RBC表面上表达VNA-GPA和Kell-VNA。这种工程改造RBC在不对靶膜或细胞造成影响或损伤的情况下发挥作用。
仍然需要新的方法来使用红细胞安全有效地递送治疗性多肽如酶，以治疗溶酶体贮积病如法布里病和II型原发性高草酸尿症。
发明概述
本公开内容涉及生产红细胞的方法，包括(i)工程改造造血干细胞和/或祖细胞，以表达与溶酶体贮积病有关的酶，和(ii)在体外将经工程改造的造血干细胞和/或祖细胞分化为成熟红细胞，其中所述成熟红细胞表达该酶。本公开内容的方面进一步涉及包含这些红细胞的组合物以及这些红细胞用于治疗溶酶体贮积病(例如法布里病和II型原发性高草酸尿症)的用途。
以下段落总结了本公开内容的某些实施方案。该列表仅是示例性的，并不是本公开内容提供的所有实施方案。
实施方案1.一种治疗患有溶酶体贮积病的受试者的方法，包括向患有溶酶体贮积病的受试者施用有效量的红细胞，其中所述红细胞经工程改造以表达多肽，并且其中所述多肽的表达有助于治疗溶酶体贮积病。
实施方案2.实施方案1所述的方法，其中所述溶酶体贮积病是法布里病，并且其中所述多肽是α半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体。
实施方案3.实施方案2所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案4.实施方案2-3中任一项所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
实施方案5.实施方案1所述的方法，其中所述溶酶体贮积病是II型原发性高草酸尿症(PH2)，并且其中所述多肽是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
实施方案6.根据实施方案5所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案7.根据实施方案5-6中任一项所述的方法，其中所述多肽由与SEQ IDNO:4具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述红细胞是从经工程改造以表达所述多肽的Lin-造血干细胞和/或祖细胞分化的。
实施方案9.实施方案8的方法，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含编码所述多肽的病毒载体，任选地是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。
实施方案10.实施方案8所述的方法，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含编码所述多肽的非病毒载体。
实施方案11.根据实施方案8-10中任一项所述的方法，其中所述红细胞是从Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞分化的。
实施方案12.一种产生红细胞的方法，包括以下步骤：(a)工程改造Lin-造血干细胞和/或祖细胞以表达多肽；和(b)在体外将经工程改造的Lin-造血干细胞和/或祖细胞分化为成熟红细胞，其中在所述成熟红细胞中表达所述多肽。
实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其中所述多肽的表达提供用于酶替代疗法的酶。
实施方案14.根据实施方案12-13中任一项所述的方法，其中所述多肽是α半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体。
实施方案15.实施方案14所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案16.根据实施方案14-15中任一项所述的方法，其中所述多肽由与SEQ IDNO:2具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
实施方案17.实施方案12-13中任一项的方法，其中所述多肽是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
实施方案18.实施方案17的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案19.根据实施方案17-18中任一项所述的方法，其中所述多肽由与SEQ IDNO:4具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
实施方案20.实施方案12-19中任一项所述的方法，其中步骤(a)的Lin-造血干细胞和/或祖细胞通过以下产生：(1)从受试者中分离外周血单核细胞(PBMC)；(2)从所述PBMC中分离Lin-造血干细胞和/或祖细胞，任选地通过免疫选择性方法；和(3)在干细胞培养基中培养分离的Lin-造血干细胞和/或祖细胞。
实施方案21.实施方案20所述的方法，其中所述干细胞培养基包含rhIL-3和/或rhSCF。
实施方案22.实施方案12-21中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括将所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞与编码所述多肽的病毒载体接触，任选地所述病毒载体为鼠干细胞病毒载体(MSCV)。
实施方案23.实施方案12-21中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括将所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞与编码所述多肽的非病毒载体接触。
实施方案24.实施方案12-23中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：(1)在分化培养基中培养所述经工程改造的Lin-造血干细胞和/或祖细胞；(2)检测CD235a、CD117、CD71和/或所述多肽的表达水平；和任选地(3)测量所述多肽的酶活性。
实施方案25.根据实施方案24所述的方法，其中所述分化培养基包含rhEpo。
实施方案26.根据实施方案12-25中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包括Lin-且CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
实施方案27.通过实施方案12-26中任一项所述的方法产生的红细胞。
实施方案28.一种包含实施方案27所述的红细胞的组合物。
实施方案29.一种治疗患有溶酶体贮积病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的实施方案27的红细胞或实施方案28的组合物。
实施方案30.一种工程改造Lin-造血干细胞和/或祖细胞的方法，包括使Lin-造血干细胞和/或祖细胞与编码多肽的载体接触，任选地所述多肽是α半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体，或者是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
实施方案31.实施方案30所述的方法，其中所述载体是病毒载体，任选地是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。
实施方案32.实施方案30所述的方法，其中所述载体是非病毒载体。
实施方案33.实施方案30-32中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案34.实施方案33所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
实施方案35.实施方案30-32中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案36.实施方案35所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:4具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
实施方案37.实施方案30-36中任一项所述的方法，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞通过以下产生：(1)从受试者中分离外周血单核细胞(PBMC)；(2)从所述PBMC中分离Lin-造血干细胞和/或祖细胞，任选地通过免疫选择性方法；和(3)在干细胞培养基中培养分离的Lin-造血干细胞和/或祖细胞。
实施方案38.实施方案37的方法，其中所述干细胞培养基包含rhIL-3和/或rhSCF。
实施方案39.实施方案30-38中任一项所述的方法，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包括Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
实施方案40.一种表达多肽的红细胞，其中所述多肽是α半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体，或者是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
实施方案41.实施方案40所述的红细胞，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列，或者包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
实施方案42.实施方案41所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
实施方案43.实施方案40-42中任一项所述的红细胞，其中所述红细胞是从经工程改造以表达所述多肽的Lin-造血干细胞和/或祖细胞分化的。
实施方案44.实施方案43所述的红细胞，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含编码所述多肽的病毒载体，任选地是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。
实施方案45.实施方案43所述的红细胞，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含编码所述多肽的非病毒载体。
实施方案46.实施方案43-45中任一项所述的红细胞，其中所述红细胞是从Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞分化的。
实施方案47.一种治疗患有法布里病或II型原发性高草酸尿症(PH2)的受试者的方法，包括向所述受试者施用实施方案40-46中任一项的红细胞。
实施方案48.实施方案40-46中任一项的红细胞用于治疗法布里病或II型原发性高草酸尿症(PH2)的用途。
实施方案49.一种经工程改造以表达多肽的Lin-造血干细胞和/或祖细胞，其中所述多肽是α-半乳糖苷酶A(α-半乳糖苷酶A)或其功能性变体，或者是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
实施方案50.实施方案49所述的Lin-造血干细胞和/或祖细胞，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列，或者包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
实施方案51.实施方案50所述的Lin-造血干细胞和/或祖细胞，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
实施方案52.实施方案49-51中任一项所述的Lin-造血干细胞和/或祖细胞，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包括Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
实施方案53.一种产生红细胞的方法，包括将实施方案49-52中任一项所述的经工程改造的Lin-造血干细胞和/或祖细胞在体外分化为成熟红细胞，其中在所述成熟红细胞中表达所述多肽。
附图说明
图1描绘了工程改造造血干细胞和/或祖细胞以表达涉及LSD的酶，并随后在体外将经工程改造的造血干细胞和/或祖细胞分化为携带该酶的成熟红细胞的一般步骤。
图2描绘了可用于测试体外酶活性以及使用已建立的LSD动物模型测试体内酶功能的代表性测定法。
图3显示了分化的红细胞的FACS分析的示例。使用以下标记标志物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。
图4显示了通过实时成像在NSG小鼠中工程改造的红细胞的组织分布。通过尾静脉注射将Dir标记的RBC注射到NSG小鼠中，并在注射红细胞后1h、5h、48h和5天通过体内成像检查标记的红细胞的后续分布。小鼠#1：不处理；小鼠#2：仅2uM Dir，溶于PBS中；小鼠#3：1x108在体外从PBMC分化的人红细胞，并用2μM Dir标记；小鼠#4：仅转导空白载体的1x108在体外从PBMC分化的人红细胞，并用2μM Dir标记；小鼠#5：转导酶1对应基因克隆的载体，在体外从PBMC分化的1x108人红细胞，并用2uM Dir标记；和小鼠#6：转导酶2对应基因克隆的载体，在体外从PBMC分化的1x108人红细胞，在体外从PBMC分化并用2uM Dir标记。
图5显示了注射红细胞后，组织样品的图像示例。将Dir染色的红细胞静脉内注射到每只小鼠的尾静脉。注射后7天处死小鼠，并对组织样品进行成像。小鼠#1：不处理；小鼠#2：仅2uM Dir，溶于PBS中；小鼠#3：1x108在体外从PBMC分化的人红细胞，并用2μM Dir标记；小鼠#4：仅转导空白载体的1x108在体外从PBMC分化的人红细胞，并用2μM Dir标记；小鼠#5：转导酶1对应基因克隆的载体，在体外从PBMC分化的1x108人红细胞，并用2uM Dir标记；和小鼠#6：转导酶2对应基因克隆的载体，在体外从PBMC分化的1x108人红细胞，在体外从PBMC分化并用2uM Dir标记。
图6显示了在体外分化13天后，对经工程改造以表达α-GAL A的红细胞的FACS分析。使用以下标记标志物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。Y585-PE：PI；B525-FITC：GFP；R660-APC：CD235a；B650-PC5.5：CD71；UV450：Hochest33342。
图7显示了在体外分化18天后，对经工程改造以表达α-GAL A的的红细胞中蛋白质表达水平的FACS分析。使用以下标记标志物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。Y585-PE：PI；B525-FITC：GFP；R660-APC：CD235a；B650-PC5.5：CD71；UV450：Hochest33342。
图8显示了使用从体外分化红细胞中提取的蛋白质进行的代表性αGal A酶活性测定法。
图9显示了在体外分化9天后，感染有MSCV对照载体或MSCV-hGRHPR-His的红细胞中hGRHPR表达水平的Western印迹分析。空白：无病毒感染的红细胞；MSCV：感染有MSCV的红细胞；MSCV-hGRHPR-His：感染有MSCV-hGRHPR-His的红细胞。
图10显示了在体外分化13天后，对经工程改造以表达GRHPR的红细胞的FACS分析。使用以下标记标志物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。Y585-PE：PI；B525-FITC：GFP；R660-APC：CD235a；B650-PC5.5：CD71；UV450：Hochest33342。
图11显示了在体外分化18天后，对经工程改造以表达GRHPR的红细胞的FACS分析。使用以下标记物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。Y585-PE：PI；B525-FITC：GFP；R660-APC：CD235a；B650-PC5.5：CD71；和UV450：Hochest33342。
图12显示了代表性的GRHPR酶活性测定法，其使用从体外分化10天后的经工程改造以表达GRHPR的红细胞中提取的蛋白质。
图13显示了代表性的GRHPR酶活性测定法，其使用从体外分化18天后的经工程改造以表达GRHPR的红细胞中提取的蛋白质。
详细描述
本文所述的公开内容和实施方案仅被解释为示例性的，而不是限制本发明的范围。尽管本文使用了特定术语，但除非另有说明，它们仅在一般和描述性意义上使用，不用于限制。
定义
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。
多肽的“功能性变体”是与全长多肽序列不同，但保留与全长多肽序列相同或基本相同的功能的多肽序列。功能性变体可以与相应的天然分子拥有更多、更少或相同数量的残基，和/或可以包含一个或多个氨基酸取代。确定特定蛋白质功能的方法是众所周知的。例如，可以使用已建立的测定试剂盒来确定多肽的酶促功能。实施例1和2中公开了一些酶测定法。
如本文所用，“溶酶体贮积病”是由于机体成分正常转换产生的物质的分解代谢所需的看家酶活性不足而导致的危及生命的疾病。LSD的示例包括戈谢氏病(葡萄糖脑苷脂酶缺陷)、法布里病(α半乳糖苷酶缺陷)、Hunter病(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺陷)、Hurler病(α-L艾杜糖醛酸苷酶(iduronidase)缺陷)和II型原发性高草酸尿症(乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶缺陷)。
如本文所用，“造血干细胞和/或祖细胞”的特征是存在合适的细胞表面抗原并且它们能够产生成熟的血细胞，例如红细胞、血小板和白细胞。例如，实施例1和2中公开的一些Lin-造血干细胞和/或祖细胞具有自我更新的能力或有限的自我更新能力，但它们可以在体外分化为成熟红细胞。造血干细胞和/或祖细胞可以在骨髓和/或外周血单核细胞中找到。
如本文所用，术语“红细胞”和“成熟红细胞”可互换使用，并指来源于造血干细胞和/或祖细胞的终末分化细胞。它们缺乏细胞核和大多数细胞器。在人类中，在骨髓中产生红细胞是对血液缺氧的应答，其是由肾脏释放红细胞生成素(EPO)介导的。EPO导致红系前体细胞的数量增加，并诱导这些细胞增殖和分化为成熟红细胞。在大约120天的循环后，由于红细胞不含细胞核或任何其他再生能力，它们通过肝脏、脾脏和淋巴结中巨噬细胞的吞噬活动或通过血浆中的溶血而从循环中清除。巨噬细胞吞噬后，RBC中的功能酶释放到巨噬细胞中。
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的聚合物。除非特别限定，术语“核酸”或“多核苷酸”包括含有已知天然核苷酸类似物的多核苷酸，其具有与参考核酸类似的结合性质，并以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是相应天然存在的氨基酸的化学类似物或修饰衍生物。
如本文所用，术语“序列同一性”涉及氨基酸或核酸序列的相似性。序列同一性由相同残基的百分比决定。本领域已知序列比对的标准方法。例如，Blast算法可从各种公共来源如NCBI获得。
如本文所用，术语“载体”或“表达载体”指可将编码蛋白质的cDNA插入其中的媒介物。一种示例的载体类型是“非病毒载体”(例如质粒)，它指的是环形双链DNA环，额外的DNA片段可以连接到该环中。另一种示例的载体类型是“病毒载体”，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。合适的病毒载体的示例包括逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体和杂合载体。例如，参见实施例1和2中使用的MSCV载体。在一些实施方案中，“载体”包括本领域已知的一个或多个控制蛋白质表达的调节序列。
如本文所用，术语“治疗”或“处理”是指预防或缓解病况，减缓病况的发生或发展速度，降低病况发展的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减少或终止与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病况，或这些的一些组合。关于治疗LSD，术语“治疗”或“处理”可指提供作为ERT的功能酶，其有助于治疗LSD患者，从而改善LSD的至少一个或多个症状。
如本文所用，术语“施用”或“施用至”是指通过导致组合物至少部分定位在所需部位或组织位置的方法或途径将组合物，例如红细胞的组合物，置于受试者体内。例如，可以通过肌内注射、皮下注射或静脉内注射将组合物施用至受试者。
如本文所用，术语“有效量”指足以减少疾病或病症的至少一个或多个症状或者提供所需效果的治疗剂、药物组合物或药物制剂的量。关于根据本公开内容的红细胞的施用，“有效量”可根据诸如LSD患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在LSD患者中引发所需应答的能力等因素而变化。
如本文所用，术语“受试者”指向其提供本发明的方法和组合物的治疗的动物，例如人类。
红细胞经工程改造以表达多肽
作为体内药物转运载体，红细胞具有以下一个或多个优点：(1)红细胞是血液中最丰富的细胞，占人类细胞总数的四分之一，并通过循环广泛分布于人体；(2)红细胞寿命长(人类约120天，小鼠约50天)。此外，衰老或受损的红细胞可以被肝脏和脾脏中的巨噬细胞清除，不会引起显著的免疫应答；(3)红细胞具有生物相容性，尤其是使用自体红细胞时；(4)成熟红细胞没有细胞核、线粒体或其他细胞器。因此，对RBC前体的DNA的任何修饰在其去核后被消除，并且在其输注到受体后不会导致致畸性和致瘤性；和(5)红细胞保护药物物质免于过早失活和/或降解，以及保护生物体不受药物毒性影响。
LSD包括罕见的代谢性疾病，其特征是缺乏功能性个体溶酶体酶。LSD的示例包括法布里病(实施例1)和II型原发性高草酸尿症(PH2)(实施例2)。
LSD对那些受其影响的人有破坏性的影响。传统的治疗方法是ERT，通常通过大剂量静脉内注射给予患者功能酶。仍然需要新型药物载体，包括工程改造的红细胞，用于安全有效地递送治疗性多肽，如用于酶替代治疗的酶。
在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞经工程改造以表达涉及LSD的酶，其中该酶的表达有助于治疗LSD患者。以下段落进一步总结了根据本公开内容的红细胞的某些实施方案。该列表是示例性的，并不是所有红细胞实施方案的全部。根据本公开内容的工程改造红细胞的方法可适于递送用于LSD治疗的其他多肽。
(a)经工程改造以表达α半乳糖苷酶A的红细胞
在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞经工程改造以表达与法布里病相关的多肽。在这些实施方案中，所述多肽是α-半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体。
在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞表达的多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的多肽，SEQ ID NO:1是人α半乳糖苷酶A的全长序列。在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞表达具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。
人α半乳糖苷酶A的全长序列：
MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞表达由以下核酸序列编码的多肽，所述核酸序列具有与SEQ ID NO:2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞表达由SEQ ID NO:2的核酸序列编码的多肽。
人α半乳糖苷酶A基因的全长序列：
ATGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACATCTGGGCTGCGCGCTTGCGCTTCGCTTCCTGGCCCTCGTTTCCTGGGACATCCCTGGGGCTAGAGCACTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGAAAAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTGGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCCTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTAATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTTAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGCTTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACATAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCAGATGTCATTAAAAGACTTACTTTAA(SEQ ID NO:2)。
(b)经工程改造以表达乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶的红细胞
在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞经工程改造以表达与II型原发性高草酸尿症(PH2)相关的多肽。在这些实施方案中，所述多肽是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞表达以下多肽，所述多肽包含与SEQID NO:3具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:3是人GRHPR的全长序列。在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞表达具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。
人GRHPR的全长序列：
MRPVRLMKVFVTRRIPAEGRVALARAADCEVEQWDSDEPIPAKELERGVAGAHGLLCLLSDHVDKRILDAAGANLKVISTMSVGIDHLALDEIKKRGIRVGYTPDVLTDTTAELAVSLLLTTCRRLPEAIEEVKNGGWTSWKPLWLCGYGLTQSTVGIIGLGRIGQAIARRLKPFGVQRFLYTGRQPRPEEAAEFQAEFVSTPELAAQSDFIVVACSLTPATEGLCNKDFFQKMKETAVFINISRGDVVNQDDLYQALASGKIAAAGLDVTSPEPLPTNHPLLTLKNCVILPHIGSATHRTRNTMSLLAANNLLAGLRGEPMPSELKL(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞表达由以下核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQ ID NO:4具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞表达由SEQ ID NO:4的核酸序列编码的多肽。
人GRHPR基因的全长序列：
ATGAGACCGGTGCGACTCATGAAGGTGTTCGTCACCCGCAGGATACCCGCCGAGGGTAGGGTCGCGCTCGCCCGGGCGGCAGACTGTGAGGTGGAGCAGTGGGACTCGGATGAGCCCATCCCTGCCAAGGAGCTAGAGCGAGGTGTGGCGGGGGCCCACGGCCTGCTCTGCCTCCTCTCCGACCACGTGGACAAGAGGATCCTGGATGCTGCAGGGGCCAATCTCAAAGTCATCAGCACCATGTCTGTGGGCATCGACCACTTGGCTTTGGATGAAATCAAGAAGCGTGGGATCCGAGTTGGCTACACCCCAGATGTCCTGACAGATACCACCGCCGAACTCGCAGTCTCCCTGCTACTTACCACCTGCCGCCGGTTGCCGGAGGCCATCGAGGAAGTGAAGAATGGTGGCTGGACCTCGTGGAAGCCCCTCTGGCTGTGTGGCTATGGACTCACGCAGAGCACTGTCGGCATCATCGGGCTGGGGCGCATAGGCCAGGCCATTGCTCGGCGTCTGAAACCATTCGGTGTCCAGAGATTTCTGTACACAGGGCGCCAGCCCAGGCCTGAGGAAGCAGCAGAATTCCAGGCAGAGTTTGTGTCTACCCCTGAGCTGGCTGCCCAATCTGATTTCATCGTCGTGGCCTGCTCCTTAACACCTGCAACCGAGGGACTCTGCAACAAGGACTTCTTCCAGAAGATGAAGGAAACAGCTGTGTTCATCAACATCAGCAGGGGCGACGTCGTAAACCAGGACGACCTGTACCAGGCCTTGGCCAGTGGTAAGATTGCAGCTGCTGGACTGGATGTGACGAGCCCAGAACCACTGCCTACAAACCACCCTCTCCTGACCCTGAAGAACTGTGTGATTCTGCCCCACATTGGCAGTGCCACCCACAGAACCCGCAACACCATGTCCTTGTTGGCAGCTAACAACTTGCTGGCTGGCCTGAGAGGGGAGCCGATGCCTAGTGAACTCAAGCTGTAG(SEQ ID NO:4)。
对表达与LSD相关的酶的造血干细胞和/或祖细胞进行工程改造和体外分化
对红细胞进行工程改造的已知方法通常需要从受试者(例如LSD患者)中分离CD34+骨髓造血干细胞或CD34+脐带造血干细胞。虽然这些分离的细胞可以在体外分化为红细胞，但从这两种来源获取细胞时，会给受试者造成显著的疼痛和/或伤害。此外，CD34+脐带造血干细胞只能在婴儿出生后的特定时间段期间获得，且难以分离，这给这些造血干细胞的临床应用造成了明显障碍。
根据本公开内容的红细胞在体外分化自从受试者(例如LSD患者)的外周血单核细胞(PBMC)中分离出来的造血干细胞和/或祖细胞。然后将分离的造血干细胞和/或祖细胞在干细胞培养基中培养一段时间。这种方法允许造血干细胞和/或祖细胞的约7-10次增殖，所得的细胞数量比之前所报道的高约10-50倍。在体外分化后，该方法产生大量的成熟红细胞，适合递送用于ERT的LSD酶。因此，根据本公开内容的方法允许大规模红细胞工程改造来递送包括酶在内的治疗性多肽。此外，数据表明当施用至受试者时，这些红细胞的代谢率与正常成熟红细胞的代谢率相同，而正常成熟红细胞没有经过工程改造来表达酶。该方法可用于工程改造红细胞来表达另一种治疗酶，大大扩展了工程改造红细胞来治疗LSD的应用。
在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞是在体外从造血干细胞和/或祖细胞分化的，所述造血干细胞和/或祖细胞经工程改造以表达与LSD相关的酶。在一些实施方案中，所述造血干细胞和/或祖细胞是Lin-造血干细胞和/或祖细胞。在一些实施方案中，所述造血干细胞和/或祖细胞是Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞从来自受试者的外周血单核细胞(PBMC)中分离。本领域已知从受试者中分离PBMC的方法。在一些实施方案中，受试者患有LSD，并且向同一受试者施用在体外分化的红细胞以治疗LSD。在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞使用本领域常规实施的免疫选择性方法从PBMC中分离。例如，造血干细胞和/或祖细胞可以是Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞，并使用Lin和CD34免疫选择性珠子进行分离。
在一些实施方案中，通过本领域已知的转染/感染方法，对造血干细胞和/或祖细胞进行工程改造以表达与LSD相关的酶。在一些实施方案中，在用编码与LSD相关的酶的载体/病毒转染/感染之前，将分离的造血干细胞和/或祖细胞在允许造血干细胞和/或祖细胞自我更新的干细胞培养基中进行培养。参见例如实施例1和实施例2。在一些实施方案中，干细胞培养基含有rhIL-3和/或rhSCF。
在一些实施方案中，将分离的造血干细胞和/或祖细胞在干细胞培养基中培养约3、4、5、6、7或8天，然后用编码与LSD相关的酶的载体/病毒进行转染/感染。在一些实施方案中，将分离的造血干细胞和/或祖细胞在干细胞培养基中培养约4天，然后用编码与LSD相关的酶的载体/病毒转染/感染。在一些实施方案中，将分离的造血干细胞和/或祖细胞在干细胞培养基中培养约5天，然后用编码与LSD相关的酶的载体/病毒转染/感染。在一些实施方案中，将分离的造血干细胞和/或祖细胞在干细胞培养基中培养约6天，然后用编码与LSD相关的酶的载体/病毒转染/感染。在一些实施方案中，将分离的造血干细胞和/或祖细胞在干细胞培养基中培养约7天，然后用编码与LSD相关的酶的载体/病毒转染/感染。
在一些实施方案中，分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基的孵育允许造血干细胞和/或祖细胞的约5-20倍复制。在一些实施方案中，分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基的孵育允许造血干细胞和/或祖细胞的约7-20倍复制。在一些实施方案中，分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基的孵育允许造血干细胞和/或祖细胞的约9-20倍复制。在一些实施方案中，分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基的孵育允许造血干细胞和/或祖细胞的约5-15次增殖。在一些实施方案中，分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基的孵育允许造血干细胞和/或祖细胞的约7-15倍复制。在一些实施方案中，分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基的孵育允许造血干细胞和/或祖细胞的约9-15次增殖。在一些实施方案中，分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基的孵育允许造血干细胞和/或祖细胞的约5-10倍复制。在一些实施方案中，分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基的孵育允许造血干细胞和/或祖细胞的约7-10次增殖。
在一些实施方案中，在分离的造血干细胞和/或祖细胞与干细胞培养基孵育后，造血干细胞和/或祖细胞经工程改造以表达与LSD相关的酶。在一些实施方案中，酶是α-GAL A或其功能性变体。在这些实施方案中，酶具有与SEQ ID NO:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:1是人α半乳糖苷酶A的全长序列。在一些实施方案中，酶是具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，酶由与SEQ ID NO:2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，酶由SEQ ID NO:2的核酸序列编码。
在其他实施方案中，酶为GRHPR或其功能性变体。在这些实施方案中，酶具有与SEQID NO:3具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:3是人GRHPR的全长序列。在一些实施方案中，酶是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，酶由与SEQID NO:4具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，酶由SEQ ID NO:4的核酸序列编码。
在一些实施方案中，使用本领域已知的技术，通过病毒载体将编码酶的DNA序列引入造血干细胞和/或祖细胞。在一些实施方案中，用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体感染造血干细胞和/或祖细胞。在一些实施方案中，病毒载体是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。参见实施例1和2。
在一些实施方案中，使用本领域已知的技术，通过非病毒载体(例如质粒)将编码酶的DNA序列引入造血干细胞和/或祖细胞。通过非病毒载体转染细胞可通过使用阳离子脂质体、DNA-蛋白质复合物(例如多聚赖氨酸-DNA复合物)或本领域已知的其他方法来实现。
用编码与LSD相关的酶的载体(病毒或非病毒载体)转染/感染后，造血干细胞和/或祖细胞在分化培养基中培养约10-21天、约10-20天、约10-19天、约10-18天、约10-17天、约10-16天、约10-15天，约10-14天、约10-13天、约10-12天、约10-11天、约21天、约20天、约19天、约18天、约17天、约16天、约15天、约14天、约13天、约12天或约11天，从而使造血干细胞和/或祖细胞分化为表达与LSD相关的酶的成熟红细胞。在一些实施方案中，分化培养基含有rhEpo，其诱导这些细胞以增殖并分化为成熟红细胞。
为了监测体外分化阶段，定期收集培养的细胞并对其分析适当标志物的表达水平，以指示红细胞的分化和成熟。在一些实施方案中，对细胞分析CD235a、CD117、CD71和Hoechst 33342的表达水平。
在一些实施方案中，可使用本领域已知的已建立的测定法，定期收集培养的细胞并对其分析与LSD有关的酶的表达水平和活性。例如，可以通过检测细胞裂解物(例如，超声处理)中的酶蛋白来监测酶水平。参见实施例2。可以通过合适的底物测定法来监测酶的活性。底物测定法可包括，例如，使用合成的特定底物评估酶的活性，该底物在酶的直接作用下释放荧光团，该荧光团可被容易地量化。参见实施例1和2。
制备方法
本公开内容提供了产生经过工程改造以表达与LSD有关的多肽的红细胞的方法。在一些实施方案中，LSD为法布里病，并且多肽是α-半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体。在这些实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，SEQID NO:1是人α半乳糖苷酶A的全长序列。在一些实施方案中，多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽由与SEQ ID NO:2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO:2的核酸序列编码。
在其他实施方案中，LSD为II型原发性高草酸尿症，并且多肽是GRHPR或其功能性变体。在这些实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO:3具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:3是人GRHPR的全长序列。在一些实施方案中，多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽由与SEQ ID NO:4具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO:4的核酸序列编码。
在一些实施方案中，产生红细胞的方法包括以下步骤：(a)工程改造分离的造血干细胞和/或祖细胞以表达多肽；和(b)在体外将所述经工程改造的造血干细胞和/或祖细胞分化为成熟红细胞，其中所述多肽在所述红细胞中表达。在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞可以是Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
在一些实施方案中，这些方法还包括(1)使用本领域已知的方法从受试者中分离外周血单核细胞(PBMC)；(2)使用免疫选择性方法从PBMC中分离造血干细胞和/或祖细胞；和(3)在干细胞培养基中培养分离的造血干细胞和/或祖细胞。在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞可以是Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞，并且可以使用Lin和CD34免疫选择性珠子进行分离。在一些实施方案中，干细胞培养基含有刺激分离的造血干细胞和/或祖细胞自我更新的rhIL-3和/或rhSCF。
在一些实施方案中，产生红细胞的方法中(a)的工程改造步骤包括用编码与LSD有关的多肽的载体/病毒来转染/感染分离的造血干细胞和/或祖细胞。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。在一些实施方案中，载体是非病毒载体，例如质粒。在一些实施方案中，载体包括一个或多个本领域已知的调控序列，以控制多肽的表达。
在一些实施方案中，产生红细胞的方法中(b)的体外分化步骤包括在含有rhEpo的分化培养基中培养表达与LSD有关的多肽的造血干细胞和/或祖细胞约10-21天、约10-20天、约10-19天、约10-18天、约10-17天、约10-16天、约10-15天、约10-14天、约10-13天、约10-12天、约10-11天、约21天、约20天、约19天、约18天、约17天、约16天、约15天、约14天、约13天、约12天或约11天，从而使造血干细胞和/或祖细胞分化为成熟红细胞。可以通过分析适当标志物的表达水平来监测体外分化过程，所述标志物指示红细胞的分化和成熟阶段。参见实施例1和实施例2。
根据本公开内容的方法产生红细胞，其表达由转染/感染到造血干细胞和/或祖细胞的载体/病毒编码的多肽。在一些实施方案中，多肽是与LSD有关的酶，并且可以使用本领域已知的已建立的酶活性测定法来测量多肽的活性。
一旦产生，根据本公开内容的红细胞可以保存在本领域已知的合适介质中。在一些实施方案中，根据本公开内容的红细胞可在合适的培养基中冷冻保存并以等分试样形式储存。一旦打开，可以保留等分试样给患有LSD的一名受试者专用。
本公开内容还提供了工程改造造血干细胞和/或祖细胞的方法，包括用编码多肽的载体/病毒来转染/感染分离的造血干细胞和/或祖细胞，其中多肽是α-GAL A或其功能性变体，或者GRHPR或其功能性变体。在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞是从来自患有LSD的受试者的PBMC中分离的Lin-造血干细胞和/或祖细胞。在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞是从来自患有LSD的受试者的PBMC中分离的Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。在这些实施方案中，通过编码多肽的载体将多肽引入造血干细胞和/或祖细胞，其中所述载体可以是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。在一些实施方案中，载体是非病毒载体，例如质粒。在一些实施方案中，载体包括一个或多个本领域已知的调控序列，以控制多肽的表达。
组合物
本公开内容提供了包含根据本公开的红细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物是包含本文提供的红细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
用于药物组合物的药学上可接受的载体是本领域已知的并且可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒介物、非水性媒介物、抗菌剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、隔离剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂和/或其他无毒辅助物质。
本文提供的包含红细胞的组合物的实例包括用于施用的液体制备物，包括无菌悬浮液和乳剂。此类组合物可与合适的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、葡聚糖等)混合。组合物可包含辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、凝胶或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，具体取决于施用的途径和所需的制备物。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物方便地作为液体制备物提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液或粘性组合物，其可缓冲至所选的pH。液体制备物通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物便于施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触时间。
合适载体和其他添加剂的选择将取决于具体的施用途径和特定剂型的性质，例如液体剂型，例如，是否将组合物配制成溶液、悬浮液、凝胶或其他液体形式，例如时间释放形式或液体填充形式。
可使用药学上可接受的防腐剂或细胞稳定剂来增加组合物的寿命。如果需要防腐剂，则选择不会影响本公开内容的红细胞的活力或功效的试剂完全在本领域技术人员的能力范围内。
治疗方法
本公开内容还提供了治疗患有LSD的受试者的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所公开的红细胞。在一些实施方案中，LSD是法布里病。在这些实施方案中，红细胞表达多肽，其是α-半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体。在这些实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:1是人α半乳糖苷酶A的全长序列。在一些实施方案中，多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽由与SEQ ID NO:2具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，多肽由SEQ IDNO:2的核酸序列编码。
在其他实施方案中，LSD为II型原发性高草酸尿症。在这些实施方案中，红细胞表达多肽，其是GRHPR或其功能性变体。在这些实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO:3具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，SEQ ID NO:3是人GRHPR的全长序列。在一些实施方案中，多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽由与SEQ ID NO:4具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO:4的核酸序列编码。
当施用本发明的红细胞时，通常将其配制成单位剂型可注射形式(溶液、悬浮液或乳液)。适合注射的药物制剂包括无菌水溶液和分散液。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。此外，可以添加增强组合物的稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。
在当前自体干细胞疗法的人体研究中，已经使用了范围在1×107到4×107个细胞的经验剂量，并取得了令人鼓舞的结果。然而，不同的情况可能需要优化注射到目标组织中的细胞数量。因此，待施用的细胞数量对于接受治疗的受试者有所不同。例如，本文公开的红细胞的治疗有效量可根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在受试者中引发所期望应答的能力等因素而变化。
在某些实施方案中，施用剂量可在治疗过程中发生变化。具有本领域普通技能的医学专业人员可确定并开具有效量的所需药物组合物。例如，医生可以以比达到期望的治疗效果所需剂量低的水平开始给药，并逐渐增加剂量，直到达到期望效果。医生也知道在从最后一次施用起去除功能性红细胞后，何时需要重新施用红细胞。
本文公开内容的红细胞可通过本领域已知的任何适当途径施用，例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或皮内注射。具有本领域普通技能的医学专业人员可以容易地确定适当的给药途径。例如，可以经由局部注射，包括导管施用，来施用红细胞。
在一些实施方案中，可以通过检查所表达的多肽的酶活性和/或LSD患者中受缺陷酶影响的组织例如肾脏的病理状况来评估治疗方法的功效。对于给定的LSD，本领域技术人员已知在施用根据本公开内容的红细胞之后如何检查治疗方法的功效。
实施例
实施例1：工程改造造血干细胞和/或祖细胞以表达α半乳糖苷酶A用于治疗法布里病
1.1.法布里病
法布里病(OMIM 301500)是一种X-连锁溶酶体贮积症，由编码溶酶体酶α-半乳糖苷酶A的GLA基因中的突变引起。该基因的缺陷导致溶酶体中α-半乳糖苷酶活性的丧失或降低，并导致球三糖神经酰胺(globotriaosylceramide，Gb3)的积累，这进而导致各种细胞类型的损伤，包括毛细血管内皮细胞、肾细胞、心肌细胞和神经细胞。法布里病患者表现出多种进行性临床症状，其中许多最早出现在儿童早期，包括神经病理性疼痛和/或胃肠道(GI)问题。随着患者年龄的增长，他们往往会出现终末期器官衰竭或者危及生命的心血管或脑血管疾病。病人的预期寿命一般在50岁左右。
两种ERT药物已被批准用于治疗法布里病。第一种是
Figure BDA0003592493870000241
(agalsidasealfa)，第二种是
Figure BDA0003592493870000242
(agalsidase beta)。这些药物中的每一种都通过静脉内施用重组α-半乳糖苷酶A向患者提供功能性α-半乳糖苷酶A。
本实施例提供了使用ERT来治疗法布里病患者。如图1所示，从患有法布里病的受试者中分离造血干细胞和/或祖细胞，并将其工程改造以表达功能性α-半乳糖苷酶A。随后，工程改造的造血干细胞和/或祖细胞在体外分化为表达α-半乳糖苷酶A的成熟红细胞。这些红细胞的体外和体内功能可使用图2中所述的方法进行检查。
本实施例中公开的方法允许造血干细胞和/或祖细胞的约7-10倍复制，并且在体外分化后，该方法产生大量成熟红细胞，适合为ERT递送功能性α-半乳糖苷酶A。此外，当施用至受试者时，这些红细胞可以在受试者体内循环很长时间(在人类中约120天)，并发挥特定代谢其靶标Gb3的功能。备选地，在肝脏清除步骤中，携带该酶(即α-半乳糖苷酶A)的老的和/或受损的红细胞可以被靶向至巨噬细胞进行清除，恢复肝脏的代谢活动。
1.2.编码α-GAL A的病毒的产生
为了构建编码α-GAL A的病毒载体，使用本领域已知的标准分子克隆技术将编码人α-GAL A的多肽(SEQ ID NO:1)的α-GAL A cDNA(X05790.1；SEQ ID NO:2)插入鼠干细胞病毒(MSCV)载体。将得到的载体MSCV-α Gal A用于病毒包装。
以MSCV-α Gal A:pSPAX2:VSVG＝2:1:1的比例包装病毒。将HEK 293T细胞在6孔板中培养至80％至90％的汇合，并使用本领域常规实施的磷酸钙转染方法将含有MSCV-α GalA:pSPAX2:VSVG＝2μg:1μg:1μg的溶液转染到细胞中。转染后12小时，通过培养基交换去除磷酸钙。在转染后48小时和72小时收集上清液，然后通过0.45μm滤器进行过滤。
在4℃的温度以70000RCF的速度对经过滤的上清液进行超速离心2小时。超速离心后，去除上清液，并使用第1.3节中披露的第1阶段培养基重新悬浮团粒，并使用本领域已知的ELISA对病毒滴度进行定量。病毒在使用前储存在-80℃。
1.3.表达α-GALA的红细胞的产生
从患有法布里病的患者采集全血。使用本领域已知的技术，在淋巴细胞分离溶液(LymphoprepTM，STEMCELL Technologies)存在下从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。
使用本领域已知的技术，例如免疫选择方法，使用人类谱系细胞耗竭集-DM(BDBiosciences)来分离造血干细胞和/或祖细胞，以获得Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
然后立即将分离的Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞培养在含有细胞因子组合(StemSpanTMCC110 S，TEMCELL Technologies)和青霉素-链霉素(Gibco)的干细胞培养基(StemSpanTMSFEM，STEMCELL Technologies)。细胞培养在37℃、5％CO2下进行4天，以允许造血干细胞和/或祖细胞的扩增。
第5天，将干细胞培养基更换为第1阶段培养基，并将细胞在37℃、5％CO2下培养一天。第1阶段培养基包含Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Sigma-Aldrich)、10-15％胎牛血清(FBS，Gibco)、5-10％人血浆(Plasma)、1-4mM谷氨酰胺、1-2％牛血清白蛋白(BSA)、300-600μg/ml全人转铁蛋白(Sigma-Aldrich)、8-13μg/ml重组人胰岛素(Sigma-Aldrich)、2％青霉素-链霉素(Gibco)、3-5ng/ml重组人白细胞介素3(rhIL-3，Peprotech)、4-7U/ml重组人红细胞生成素(rhEpo，Amgen)和100ng/ml重组人干细胞因子(rhSCF，Peprotech)。
在第6天，使培养的细胞感染第1.2节中制备的MSCV-αGal A病毒。使用第1阶段培养基以1x105/mL的密度重新悬浮细胞。根据最终病毒浓度5×107TU/ml-5×108TU/ml来确定病毒剂量，并根据感染量，将10μg/ml的聚凝胺添加到浓缩病毒溶液中5分钟。短暂孵育后，将病毒溶液添加到细胞中。使用水平转子离心机以500xg速度、32℃温度下90分钟进行离心感染。感染后12小时，将培养基更换为新鲜的第1阶段培养基，并在37℃在5％CO2下进一步培养细胞。
第14天，将培养基更换为第2阶段培养基，并将细胞在37℃在5％CO2下培养约7天。第2阶段培养基包含Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Sigma-Aldrich)、15％胎牛血清(FBS，Gibco)、5-10％人血浆(Plasma)、1-4mM谷氨酰胺、1-2％牛血清白蛋白(BSA)、300-600μg/ml全人转铁蛋白(Sigma-Aldrich)、8-13μg/ml重组人胰岛素(Sigma-Aldrich)、2％青霉素-链霉素(Gibco)和1-5U/ml重组人红细胞生成素(rhEpo，Amgen)。
上一段所述的体外分化期中，每2-4天更换培养基，并通过流式细胞仪检测CD235a、CD117、CD71、Hoechst 33342和GFP的表达水平，如图3所示。
CD235a是血液血型糖蛋白A，它是一种在成熟红细胞和红系前体细胞中表达的单一跨膜糖蛋白。CD225a是在红细胞表面上的标志物。
CD117是肥大细胞/干细胞生长因子受体，其在造血干细胞和其他细胞的表面上表达。
CD71是转铁蛋白受体1，它是一种跨膜糖蛋白，由通过两个二硫键连接的两个单体组成。每个单体与转铁蛋白分子结合而产生铁-转铁蛋白-转铁蛋白受体复合物，该复合物通过内吞作用进入细胞。
Hoechst33342是一种成熟的荧光染料，用于染色细胞DNA。
GFP表示绿色荧光蛋白。该蛋白由通过T2A与MSCV-α Gal A连接的荧光报告基因编码，并因此与α Gal A共表达。GFP信号的强度表明α Gal A的表达水平。例如，阳性GFP信号表明α Gal A在受感染的细胞中表达水平。
图6显示在体外分化10天后，经工程改造以表达α-GAL A的红细胞中蛋白质表达水平的FACS分析。使用以下标记标志物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。
图7显示在体外分化18天后，经工程改造以表达α-GAL A的红细胞中蛋白质表达水平的FACS分析。使用以下标记标志物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。
1.4.表达α-GALA的红细胞的体外表征
通过Western印迹和流式细胞术检查红细胞中α-GAL A的表达水平。
通过表征Gal A酶活性(Biovision)来分析红细胞的体外功能。从红细胞中提取αGal A酶后，用α Gal A酶活性检测试剂盒(Biovision)来检测酶活性。在这种检测方法中，αGal A的底物与荧光团4-MU偶联，这样当底物被α Gal A水解时，荧光团4-MU暴露，从而产生可检测的荧光信号(Ex/EM：360/44)。
图8显示了代表性的αGal酶活性测定法，其使用从体外分化的红细胞中提取的蛋白质。数据表明，体外分化过程成功地产生了表达具有强酶活性的α Gal A的红细胞。此外，从体外分化的红细胞中提取的α Gal A的酶活性呈剂量依赖性增加。
1.5.表达α-GAL A的红细胞的体内表征
将荧光标记的红细胞静脉内注射到每只免疫缺陷小鼠的尾静脉中，并通过本领域中经常使用的活体成像(图4)和/或免疫组织化学(图5)分析红细胞的分布。将表达α-GAL A的红细胞的存活率与不表达α-GAL A的野生型红细胞进行比较。
可以使用法布里病小鼠模型(α-Gal A KO小鼠)检查红细胞的体内功能。将红细胞施用至α-Gal A KO小鼠，并通过检查Gb3的水平和/或肾脏等组织的病理状况可以监测体内功效。
实施例2：工程改造造血干细胞和/或祖细胞以表达GRHPR来治疗II型原发性高草酸尿症
2.1.II型原发性高草酸尿症
II型原发性高草酸尿症(PH2)(OMIM 260000,604296)是由乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)基因中的致病变异引起的常染色体隐性遗传病。当GRHPR的活性降低时，乙醛酸盐不能有效地转化为乙醇酸盐。乙醛酸盐在细胞中的积累进而又刺激其通过乳酸脱氢酶(LDH)氧化成草酸，而草酸可以与钙结合形成草酸钙，这是一种硬质化合物，是肾结石和膀胱结石的主要成分。
GRHPR在所有组织中表达，在肝脏中水平最高。该疾病的特征是草酸钙在肾脏和泌尿道中的积累，这通常会导致肾结石的发展和进行性肾功能衰竭。PH2的临床表现一般较1型原发性高草酸尿症轻，并且约10％的原发性高草酸尿症患者被诊断为PH2。
截至今天，PH2的治疗选择是有限的。患者通常接受肝肾联合移植，并且移植后必须长期服用免疫抑制剂。一些患者可能需要再次移植和/或患上癌症。
该实施例提供了使用ERT来治疗PH2患者。如图1所示，来自受试者的造血干细胞和/或祖细胞经分离和工程改造以表达功能性GRHPR。随后，经工程改造的造血干细胞和/或祖细胞在体外分化为表达GRHPR的成熟红细胞。这些红细胞的体外和体内功能可以使用图2中描述的方法进行检查。
本实施例中公开的方法允许造血干细胞和/或祖细胞复制约7-10倍，并且在体外分化后，该方法产生适合递送功能性GRHPR用于ERT的大量成熟红细胞。此外，当施用至受试者时，这些红细胞可以在受试者体内循环很长时间(在人类中约为120天)，并发挥特异性代谢其靶标乙醛酸盐的作用。可替代地，在肝脏清除步骤中，携带该酶(即GRHPR)的老的和/或受损的红细胞可以被靶向至巨噬细胞进行清除，从而恢复肝脏的代谢活动。
2.2.编码GRHPR的病毒的产生
为了构建编码GRHPR的病毒载体，使用本领域已知的标准分子克隆技术将编码人GRHPR的多肽(SEQ ID NO:3)的GRHPR cDNA(AGXT,NM_012203.1；SEQ ID NO:4)插入鼠干细胞病毒(MSCV)载体中。所得载体MSCV-hGRHPR用于病毒包装。
以MSCV-hGRHPR:pSPAX2:VSVG＝2:1:1的比例包装病毒。HEK293T细胞在6孔板中生长至80％至90％的汇合，并使用本领域已知的磷酸钙转染方法将含有MSCV-hGRHPR:pSPAX2:VSVG＝2μg:1μg:1μg的溶液转染到细胞中。转染后12小时，通过培养基更换去除磷酸钙。在转染后48小时和72小时收集上清液，然后通过0.45μm滤器进行过滤。
在4℃的温度以70000RCF的速度对经过滤的上清液进行超速离心2小时。超速离心后，去除上清液，并使用如第2.3节中所述的第1阶段培养基重悬团粒，使用本领域已知的ELISA对病毒滴度进行定量。病毒储存于-80℃直到使用。
2.3.表达GRHPR的红细胞的产生
从患有法布里病的患者采集全血。使用本领域已知的技术，在淋巴细胞分离溶液(LymphoprepTM，STEMCELL Technologies)存在下从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。
使用本领域已知的技术，例如免疫选择方法，使用人类谱系细胞耗竭集-DM(BDBiosciences)来分离造血干细胞和/或祖细胞，以获得Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
然后立即将分离的Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞培养在含有细胞因子组合(StemSpanTMCC110 S，TEMCELL Technologies)和青霉素-链霉素(Gibco)的干细胞培养基(StemSpanTMSFEM，STEMCELL Technologies)中。细胞培养在37℃、5％CO2下进行4天，以允许造血干细胞和/或祖细胞的扩增。
第5天，将干细胞培养基更换为第1阶段培养基，并将细胞在37℃、5％CO2下培养一天。第1阶段培养基包含Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Sigma-Aldrich)、10-15％胎牛血清(FBS，Gibco)、5-10％人血浆(Plasma)、1-4mM谷氨酰胺、1-2％牛血清白蛋白(BSA)、300-600μg/ml全人转铁蛋白(Sigma-Aldrich)、8-13μg/ml重组人胰岛素(Sigma-Aldrich)、2％青霉素-链霉素(Gibco)、3-5ng/ml重组人白细胞介素3(rhIL-3，Peprotech)、4-7U/ml重组人红细胞生成素(rhEpo，Amgen)和100ng/ml重组人干细胞因子(rhSCF，Peprotech)。
在第6天，使培养的细胞感染第2.2节中制备的MSCV-hGRHPR病毒。使用第1阶段培养基以1x106/mL的密度重新悬浮细胞。根据最终病毒浓度5×107TU/ml-5×108TU/ml来确定病毒剂量，并根据感染量，将10μg/ml的聚凝胺添加到浓缩病毒溶液中5分钟。短暂孵育后，将病毒溶液添加到细胞中。使用水平转子离心机以500xg速度、32℃温度下90分钟进行离心感染。感染后12小时，将培养基更换为新鲜的第1阶段培养基，并在37℃在5％CO2下进一步培养细胞。
第14天，将培养基更换为第2阶段培养基，并将细胞在37℃在5％CO2下培养约7天。第2阶段培养基包含Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Sigma-Aldrich)、15％胎牛血清(FBS，Gibco)、5-10％人血浆(Plasma)、1-4mM谷氨酰胺，1-2％牛血清白蛋白(BSA)，300-600μg/ml全人转铁蛋白(Sigma-Aldrich)，8-13μg/ml重组人胰岛素(Sigma-Aldrich)，2％青霉素-链霉素(Gibco)和1-5U/ml重组人红细胞生成素(rhEpo，Amgen)。
上一段所述的体外分化期中，每2-4天更换培养基，并通过流式细胞术检测CD235a、CD117、CD71、Hoechst 33342和GFP的表达水平，如图3所示。
CD235a是血液血型糖蛋白A，它是一种在成熟红细胞和红系前体细胞中表达的单一跨膜糖蛋白。CD225a是在红细胞表面上的标志物。
CD117是肥大细胞/干细胞生长因子受体，其在造血干细胞和其他细胞的表面上表达。
CD71是转铁蛋白受体1，它是一种跨膜糖蛋白，由通过两个二硫键连接的二个单体组成。每个单体与转铁蛋白分子结合而产生铁-转铁蛋白-转铁蛋白受体复合物，该复合物通过内吞作用进入细胞。
Hoechst33342是一种成熟的荧光染料，用于染色细胞DNA。
GFP表示绿色荧光蛋白。该蛋白由通过T2A与MSCV-αGal A连接的荧光报告基因编码，并因此与GRHPR共表达。GFP信号的强度表明GRHPR的表达水平。例如，阳性GFP信号表明GRHPR在受感染的细胞中表达水平。
图10显示在体外分化10天后，经工程改造以表达hGRHPR的红细胞中蛋白质表达水平的FACS分析。使用以下标记标志物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。
图11显示在体外分化18天后，经工程改造以表达hGRHPR的红细胞中蛋白质表达水平的FACS分析。使用以下标记标志物：CD235a、CD117、CD71、Hoechst33342和GFP。
2.4.表达GRHPR的红细胞的体外表征
通过Western印迹和流式细胞术检查红细胞中GRHPR的表达水平。图9显示了用MSCV对照载体或MSCV-hGRHPR感染的红细胞中GRHPR的表达水平的Western印迹分析。数据显示，在从用MSCV-hGRHPR感染的造血干细胞和/或祖细胞分化的红细胞中表达GRHPR。
通过表征GRHPR酶活性来分析红细胞的体外功能。图12显示了代表性的GRHPR酶活性测定法，其使用从已在体外分化10天的红细胞中提取的蛋白质。数据表明，体外分化过程成功地产生了表达功能性GRHPR的红细胞。
图13显示了代表性的GRHPR酶活性测定法，其使用从已在体外分化18天的红细胞提取的蛋白质。数据表明，在体外分化过程结束时(即体外分化18天后)，那些去核的成熟红细胞(通过10μm滤器进行过滤的)成功地产生了表达功能性GRHPR的红细胞。
2.5.表达GRHPR的红细胞的体内表征
将荧光标记的红细胞静脉内注射到每只免疫缺陷小鼠的尾静脉中，并通过本领域中经常使用的活体成像(图4)和/或免疫组织化学(图5)分析红细胞的分布。将表达GRHPR的红细胞的存活率与不表达GRHPR的野生型红细胞进行比较。
可以使用PH2疾病小鼠模型(GRHPR KO小鼠)检查红细胞的体内功能。将红细胞施用至GRHPR KO小鼠中，并通过检查乙醛酸盐的水平和/或肾脏等组织的病理状况可以监测体内功效。
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Claims (53)

1.一种治疗患有溶酶体贮积病的受试者的方法，包括向患有溶酶体贮积病的受试者施用有效量的红细胞，其中所述红细胞经工程化改造以表达多肽，并且其中所述多肽的表达有助于治疗所述溶酶体贮积病。
2.权利要求1所述的方法，其中所述溶酶体贮积病是法布里病，并且其中所述多肽是α半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体。
3.权利要求2所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
4.权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
5.权利要求1所述的方法，其中所述溶酶体贮积病是II型原发性高草酸尿症(PH2)，并且其中所述多肽是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
6.权利要求5所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求5-6中任一项所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:4具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述红细胞是从经工程改造以表达所述多肽的Lin-造血干细胞和/或祖细胞分化的。
9.权利要求8所述的方法，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含编码所述多肽的病毒载体，任选地是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。
10.权利要求8所述的方法，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含编码所述多肽的非病毒载体。
11.权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述红细胞是从Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞分化的。
12.一种生产红细胞的方法，包括以下步骤：(a)工程改造Lin-造血干细胞和/或祖细胞以表达多肽；和(b)在体外将经工程改造的Lin-造血干细胞和/或祖细胞分化为成熟红细胞，其中所述多肽在所述成熟红细胞中表达。
13.权利要求12所述的方法，其中所述多肽的表达提供用于酶替代疗法的酶。
14.权利要求12-13中任一项所述的方法，其中所述多肽是α半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体。
15.权利要求14所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
16.权利要求14-15中任一项所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
17.权利要求12-13中任一项所述的方法，其中所述多肽是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
18.权利要求17所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
19.权利要求17-18中任一项所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:4具有至少75％序列同一性的核酸序列编码。
20.权利要求12-19中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞通过以下产生：(1)从受试者中分离外周血单核细胞(PBMC)；(2)从所述PBMC中分离Lin-造血干细胞和/或祖细胞，任选地通过免疫选择性方法；和(3)在干细胞培养基中培养分离的Lin-造血干细胞和/或祖细胞。
21.权利要求20所述的方法，其中所述干细胞培养基包含rhIL-3和/或rhSCF。
22.权利要求12-21中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞与编码所述多肽的病毒载体，任选地鼠干细胞病毒载体(MSCV)接触。
23.权利要求12-21中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞与编码所述多肽的非病毒载体接触。
24.权利要求12-23中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：(1)在分化培养基中培养所述经工程改造的Lin-造血干细胞和/或祖细胞；(2)检测CD235a、CD117、CD71和/或所述多肽的表达水平；和任选地(3)测量所述多肽的酶活性。
25.权利要求24所述的方法，其中所述分化培养基包含rhEpo。
26.权利要求12-25中任一项的方法，其中步骤(a)中的所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包括Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
27.通过权利要求12-26中任一项的方法产生的红细胞。
28.包含权利要求27的红细胞的组合物。
29.一种治疗患有溶酶体贮积病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求27的红细胞或权利要求28的组合物。
30.一种工程改造Lin-造血干细胞和/或祖细胞的方法，包括将Lin-造血干细胞和/或祖细胞与编码多肽的载体相接触，任选地所述多肽是α半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体，或者是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
31.权利要求30的方法，其中所述载体是病毒载体，任选地是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。
32.权利要求30所述的方法，其中所述载体是非病毒载体。
33.权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
34.权利要求33所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2具有至少75％的序列同一性的核酸序列编码。
35.权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
36.权利要求35所述的方法，其中所述多肽由与SEQ ID NO:4具有至少75％的序列同一性的核酸序列编码列。
37.权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞通过以下产生：(1)从受试者中分离外周血单核细胞(PBMC)；(2)从所述PBMC中分离Lin-造血干细胞和/或祖细胞，任选地通过免疫选择性方法；和(3)在干细胞培养基中培养分离的Lin-造血干细胞和/或祖细胞。
38.权利要求37所述的方法，其中所述干细胞培养基包含rhIL-3和/或rhSCF。
39.权利要求30至38中任一项所述的方法，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
40.一种表达多肽的红细胞，其中所述多肽是α-半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体，或者是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
41.权利要求40所述的红细胞，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
42.权利要求41所述的红细胞，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少75％的序列同一性的核酸序列编码。
43.权利要求40-42中任一项所述的红细胞，其中所述红细胞是从经工程改造以表达所述多肽的Lin-造血干细胞和/或祖细胞分化的。
44.权利要求43所述的红细胞，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含编码所述多肽的病毒载体，任选地是鼠干细胞病毒载体(MSCV)。
45.权利要求43所述的红细胞，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含编码所述多肽的非病毒载体。
46.权利要求43-45中任一项所述的红细胞，其中所述红细胞是从Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞分化的。
47.一种治疗患有法布里病或II型原发性高草酸尿症(PH2)的受试者的方法，包括向所述受试者施用权利要求40-46中任一项所述的红细胞。
48.权利要求40-46中任一项所述的红细胞用于治疗法布里病或II型原发性高草酸尿症(PH2)的用途。
49.一种经工程改造以表达多肽的Lin-造血干细胞和/或祖细胞，其中所述多肽是α-半乳糖苷酶A(α-GAL A)或其功能性变体，或者是乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)或其功能性变体。
50.权利要求49所述的Lin-造血干细胞和/或祖细胞，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
51.权利要求50所述的Lin-造血干细胞和/或祖细胞，其中所述多肽由与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少75％的序列同一性的核酸序列编码。
52.权利要求49-51中任一项所述的Lin-造血干细胞和/或祖细胞，其中所述Lin-造血干细胞和/或祖细胞包含Lin-和CD34+造血干细胞和/或祖细胞。
53.一种产生红细胞的方法，包括在体外将权利要求49-52中任一项所述的经工程改造的Lin-造血干细胞和/或祖细胞分化为成熟红细胞，其中所述多肽在所述成熟红细胞中表达。
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