CN114786654A - 用于全身递送Bcl-2和Bcl-xL拮抗剂的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于Bcl‑2和Bcl‑xL抑制剂APG‑1252的白蛋白纳米制剂以压制和/或抑制癌细胞(例如,肿瘤细胞)的生长的组合物和方法。特定地,本发明涉及包括与APG‑1252缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)的纳米颗粒的组合物、用于合成这样的纳米颗粒的方法以及利用这样的纳米颗粒的系统和方法(例如在诊断和/或治疗环境中)。这样的APG‑1252的纳米颗粒制剂能够增加溶解度,防止其降解,降低血小板毒性,并扩大(改善)不同的适应症,以改善对各种癌症的抗癌疗效和淋巴结中的癌转移。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月11日提交的美国临时专利申请序列号62/946,804以及于2020年1月9日提交的美国临时专利申请序列号62/958,779的优先权,其全部内容通过援引并入本文。
技术领域
本公开提供了用于Bcl-2和Bcl-xL抑制剂APG-1252的白蛋白纳米制剂以压制和/或抑制癌细胞(例如,肿瘤细胞)的生长的组合物和方法。特定地,本发明涉及包括与APG-1252缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)的纳米颗粒的组合物、用于合成这样的纳米颗粒的方法以及利用这样的纳米颗粒的系统和方法(例如在诊断和/或治疗环境中)。这样的APG-1252的纳米颗粒制剂能够增加溶解度,防止其降解,降低血小板毒性,并扩大(改善)不同的适应症,以改善对各种癌症的抗癌疗效和淋巴结中的癌转移。
背景技术
Bcl-2家族蛋白在调节程序性细胞死亡或细胞凋亡中起关键作用(参见Bai,L.等人Eur J Cancer 50,109-110(2014))。双重Bcl-2和Bcl-xL抑制剂在治疗实体瘤方面显示出良好的疗效,但其应用受到Bcl-xL抑制期间发生的血小板靶向毒性的阻碍。
通过以下将APG-1252((R)-(3-((1-(3-((4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯基硫代)丁基)哌啶-4-羰基)氧基)丙基)膦酸)设计作为前药克服Bcl-xL抑制期间可能发生的毒性,同时保持强大的抗肿瘤效力:向BM-1244(R)-1-(3-((4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-4-(苯基硫代)丁基)哌啶-4-甲酸)(一种有效力的Bcl-2和Bcl-xL双重抑制剂)中添加磷脂质(参见Bai,L.等人Eur JCancer 50,109-110(2014))。临床前研究表明,单独使用APG-1252,在每周两次或每周一次剂量方案中,在多个肿瘤异种移植模型中实现完全和持续的肿瘤消退,包括小细胞肺癌(SCLC)、结肠癌、乳腺癌和急性淋巴细胞白血病(ALL)癌异种移植物;实现了与化疗剂的强的协同作用,表明APG-1252作为单一剂或与其他类型的抗癌药物联合治疗人类癌症可能具有广泛的治疗潜力(参见Bai,L.等人Eur J Cancer 50,109-110(2014))。APG-1252已进入1期临床试验,用于治疗SCLC或其他实体瘤患者。
在广泛的临床应用中使用APG-1252存在几个潜在的限制。第一,APG-1252是一种磷酸盐前药,其限制进入血小板的药物摄取以降低毒性。然而,为了表现出APG-1252的强抗癌疗效,活性形式BM-1244需要在肿瘤部位释放,并且通过裂解APG-1252中不稳定的酯键来维持抗肿瘤效力(参见BM-1197:a novel and specific Bcl-2/Bcl-xL inhibitorinducing complete and long-lasting tumor regression in vivo.Bai,L等人PlosOne.2014)。然而,BM-1244可以通过循环中酯键的水解而提前释放到循环中,这将导致血小板毒性并限制临床使用中的剂量递增。
第二,在制造和储存过程中保持APG-1252的不稳定的酯键的稳定性非常具有挑战性。需要严格控制这些条件以保持制剂中BM-1244的非常低百分比。在制造和储存过程中略微增加的水解产物BM-1244增加血小板毒性的风险。
第三,APG-1252具有的水性溶解度差,其难以在临床制剂中配制。为了达到用于静脉注射的临床给药浓度(最低10mg/ml),传统的方法是使用高百分比的助溶剂或表面活性剂,诸如聚氧乙烯蓖麻油、乙醇、聚乙二醇(PEG)(参见Kalepu,S.&Nekkanti,V.Acta PharmSin B 5,442-453(2015))。然而,这些助溶剂或表面活性剂与患者的毒性或输注反应有关,尤其是在高剂量使用时。例如,紫杉醇静脉注射剂泰素(Taxol)是使用这种方法最受争议的制剂。每毫升无菌无热原溶液包含6mg紫杉醇、527mg纯化的Cremophor(聚氧乙烯蓖麻油)和49.7%(v/v)脱水乙醇。由于Cremophore EL的高含量,在患者中观察到严重的超敏反应,因此所有患者都应当使用抗组胺药进行预治疗。
第四,APG-1252中磷酸盐的极性限制了其组织靶向和分布,这可能限制了其在各种实体癌中的临床适应症。
APG-1252在骨髓、淋巴结和脾中的分布有限,这可能限制其在血液系统恶性肿瘤中的临床适应症,诸如淋巴母细胞性或淋巴细胞癌(包括急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤等)、髓细胞性或骨髓性癌症(包括急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和骨髓增殖性肿瘤,诸如原发性血小板增多症、真性红细胞增多症和骨髓纤维化)。
第五,任何BCL2/BCL-XL的抑制剂都不太可能作为单一剂用于癌症治疗。需要将BCL2/BCL-XL抑制剂与其他化疗药物联合。两种类型的药物的共同递送纳米制剂将提高其疗效。
因此,需要改进的APG-1252制剂来解决上述问题。
本发明解决了这种需要。
发明内容
纳米制剂已成为提高药物疗效和降低药物毒性的成熟方法。在开发本发明实施方式的过程中进行的实验合成了APG-1252的白蛋白纳米制剂(HSA-1252),具有或不具有其他化疗药物。通过改变制造工艺参数,显示纳米制剂的大小能够在50~200nm之间调整。优化了冻干工艺。对冻干前后的大小分布、ζ电位、药物浓度进行表征。观察制剂的稳定性,包括溶液中的稳定性、稀释稳定性和长期储存稳定性。此外,在动物模型中评估了血小板毒性。进一步地,在肿瘤细胞中进行了抗癌疗效,以证明纳米制剂和游离药物在抗肿瘤疗效上等效。
因此,这样的结果和实施方式表明用于局部和全身递送小分子的Bcl-2和Bcl-xL蛋白拮抗剂的新类型的药物递送系统(例如,APG-1252)。
因此,本公开提供了用APG-1252抑制癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性以压制和/或抑制这样的癌细胞(例如,肿瘤细胞)生长的组合物和方法。特定地,本发明涉及包括与APG-1252缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)的纳米颗粒的组合物、用于合成这样的纳米颗粒的方法以及利用这样的纳米颗粒的系统和方法(例如在诊断和/或治疗环境中)。
因此,在某些实施方式中,本发明提供了包括与APG-1252缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)的纳米颗粒的组合物。
在一些实施方式中,这样的纳米颗粒包括与APG-1252缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)的白蛋白。在一些实施方式中,这样的纳米颗粒(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)内的APG-1252浓度为大约10-15mg/mL(例如,5-20mg/mL;6-19mg/mL;7-18mg/mL;8-17mg/mL;9-16mg/mL)。在一些实施方式中,这样的纳米颗粒(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)的大小为大约50-200nm(例如,40-210nm;45-205nm;60-190nm;70-180nm;100-150nm;等)。
在开发本发明实施方式的过程中进行的实验确定白蛋白纳米制剂APG-1252在APG-1252之外形成了非常稳定的纳米壳,其在循环中保持稳定。这种牢固结合的白蛋白纳米壳通过以下机制降低了APG-1252的血小板毒性:(1)降低血液循环中的浓度,(2)减少血小板摄取,(3)防止APG-1252在循环中的过早降解。
这样的实验进一步确定了白蛋白纳米制剂APG-1252增加了APG-1252在制造和储存条件下的稳定性。水解产物BMS-1244的百分比控制良好,未检出其他相关物质。牢固结合的白蛋白纳米壳可以减缓APG-1252的水解并延长制剂的贮藏寿命。
这样的实验进一步确定了白蛋白纳米制剂APG-1252增加了APG-1252的溶解度。APG-1252的溶解度能够大幅度增加,并且满足10~15mg/ml的临床剂量要求。与现有制剂相比,白蛋白制剂在不添加引起临床超敏反应的表面活性剂的情况下,表现出更好的安全性。
这些实验进一步确定了白蛋白纳米制剂APG-1252将提高抗癌疗效,并扩大不同类型癌症的临床适应症。白蛋白纳米制剂APG-1252具有组织靶向性,并且增强各器官中的组织分布,对残留肿瘤的靶向器官具有更好的疗效。这些用于优选组织靶向的潜在用途可以扩展用于治疗淋巴瘤、源自骨髓的癌症和血液癌、淋巴结中的癌转移、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌和GI癌以及肉瘤。
这些实验进一步确定了白蛋白纳米制剂APG-1252将提高抗癌疗效并扩大血液系统恶性肿瘤或骨髓疾病的临床适应症。白蛋白纳米制剂APG-1252能够增加骨髓、淋巴结和脾中的累积。这些用于这样的优选组织靶向的潜在用途可以扩展用于治疗血液系统恶性肿瘤,诸如淋巴母细胞性或淋巴细胞癌(包括急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤等)、髓细胞性或骨髓性癌症(包括急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和骨髓增殖性肿瘤,诸如原发性血小板增多症、真性红细胞增多症和骨髓纤维化)。
这样的实验进一步确定了白蛋白纳米制剂APG-1252可以与其他化疗药物(诸如例如紫杉醇、去西他赛和任何其他化疗药物)一起配制在一种纳米制剂中,其可以将不同药物共同递送到癌细胞中。这将提高临床疗效。
因此,在某些实施方式中,本发明提供了用于治疗受试者中癌症的方法,所述方法包括给药药学有效量的组合物,该组合物包括一种或多种与能够抑制来自受试者的至少一种癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的剂缔合的纳米颗粒。
在一些实施方式中,能够抑制来自受试者的至少一种癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的剂是APG-1252。能够抑制来自受试者的至少一种癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的剂不仅限于APG-1252。实际上,任何能够抑制来自受试者的至少一种癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的剂是可以与纳米颗粒缔合用于本文所述的目的的APG-1252。例如,可以将其他选择性BCL-2/xl抑制剂或BCL-2家族抑制剂封装在白蛋白纳米颗粒中以减少血小板毒性并增加抗肿瘤疗效,诸如BM-1244、ABT-737、ABT-263、ABT-199、A-1155463、氯化白屈菜红碱、氯化脱氢紫堇碱、S55746、WEHI-539盐酸盐、棉酚、TW-37、A-385358、(R)-(-)-乙酸棉酚、AZD4320、脱氢紫堇碱、HA14-1、BH3I-1、(R)-(-)-棉酚、(S)-乙酸棉酚、Navitoclax-哌嗪、MCL-1/BCL-2-IN-1、MCL-1/BCL-2-IN-3、Bcl-2-IN-2、BAD(103-127)、(+)-阿朴棉子酚、去吗啉基Navitoclax-NH-Me、口服可用BCL-XL选择性抑制剂A-1331852、XZ739(CRBN依赖性PROTAC BCL-XL降解剂)、PROTAC Bcl2降解剂-1和其他BCL-2家族抑制剂,诸如pan-bcl-2抑制剂Sabutoclax、奥巴克拉甲磺酸盐以及MCL-1抑制剂S63845、AZD-5991、(R)-MIK665(一种特定的Mcl-1抑制剂)、AMG-176、MIK665、A-1210477、Maritoclax、UMI-77、ML311和PROTAC Mcl1降解剂-1、黄花夹竹桃黄酮、MCL-I/BCL-2-IN-2和Pyridoclax。
这样的方法不限于特定的给药方式。在一些实施方式中,给药是全身给药。
在一些实施方式中,组合物与化疗剂共同给药。在一些实施方式中,化疗剂是以下中的一种或多种:阿地白介素、六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、博来霉素、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、克拉立滨、西沙必利、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、多西他赛、多柔比星、屈大麻酚、依泊汀α、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、格拉司琼、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、甲酰四氢叶酸、甲地孕酮、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧氯普胺、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥美拉唑、昂丹司琼、紫杉醇(TAXOL)、毛果芸香碱、丙氯拉嗪、利妥昔单抗、他莫昔芬、泰素、盐酸拓泊替康、曲司珠单抗、长春碱、长春新碱和酒石酸长春瑞滨。
在一些实施方式中,与APG-1252缔合的纳米颗粒进一步与一种或多种被配置为靶向癌细胞的剂缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)。
在一些实施方式中,被配置为靶向癌细胞的剂是选自由以下组成的组的肿瘤抗原:α-辅肌动蛋白-4,Bcr-Abl融合蛋白,Casp-8,β-联蛋白,cdc27,cdk4,cdkn2a,coa-1,dek-can融合蛋白,EF2,ETV6-AML1融合蛋白,LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白,HLA-A2,HLA-A11,hsp70-2,KIAAO205,Mart2,Mum-1、2和3,neo-PAP,I类肌球蛋白,OS-9,pml-RARα融合蛋白,PTPRK,K-ras,N-ras,磷酸丙糖异构酶,Bage-1,Gage 3、4、5、6、7,GnTV,Herv-K-mel,Lage-1,Mage-A1、2、3、4、6、10、12,Mage-C2,NA-88,NY-Eso-1/Lage-2,SP17,SSX-2和TRP2-Int2,MelanA(MART-I),gp100(Pmel 17),酪氨酸酶,TRP-1,TRP-2,MAGE-1,MAGE-3,BAGE,GAGE-1,GAGE-2,p15(58),CEA,RAGE,NY-ESO(LAGS),SCP-1,Hom/Mel-40,PRAME,p53,H-Ras,HER-2/neu,BCR-ABL,E2A-PRL,H4-RET,IGH-IGK,MYL-RAR,EB病毒抗原,EBNA,人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7,TSP-180,MAGE-4,MAGE-5,MAGE-6,p185erbB2,p180erbB-3,c-met,nm-23H1,PSA,TAG-72-4,CA 19-9,CA72-4,CAM17.1,NuMa,K-ras,β-联蛋白,CDK4,Mum-1,p16,TAGE,PSMA,PSCA,CT7,端粒酶,43-9F,5T4,791Tgp72,α-甲胎蛋白,13HCG,BCA225,BTAA,CA125,CA15-3(CA 27.29\BCAA),CA 195,CA242,CA-50,CAM43,CD68\KP1,CO-029,FGF-5,G250,Ga733(EpCAM),人EGFR蛋白或其片段,诸如人EGFR残基306–325(SCVRACGADSYEMEEDGVRK(SEQ ID NO:1))以及残基897–915(VWSYGVTVWELMTFGSKPY(SEQ IDNO:2)),HTgp-175,M344,MA-50,MG7-Ag,MOV18,NB\70K,NY-CO-1,RCAS1,SDCCAG16,TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-缔合的蛋白),TAAL6,TAG72,TLP,TPS,WT1(以及Wt1-衍生的肽序列:WT1 126–134(RMFP NAPYL(SEQ ID NO:3))、WT1 122–140(SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQID NO:4))以及WT1 122–144(SGQARMFPNAPYLPSCLESQPTI(SEQ ID NO:5))、MUC1(以及MUC1-衍生肽和糖肽,诸如RPAPGS(SEQ ID NO:6)、PPAHGVT(SEQ ID NO:7)以及PDTRP(SEQ ID NO:8)),LMP2,EGFRvIII,独特型,GD2,Ras突变体,p53突变体,蛋白酶3(PR1),存活蛋白,hTERT,肉瘤易位断裂点,EphA2,EphA4,LMW-PTP,PAP,ML-IAP,AFP,ERG(TMPRSS2 ETS融合基因),NA17,PAX3,ALK,雄激素受体,周期蛋白B1,多唾液酸,MYCN,RhoC,TRP-2,GD3,岩藻糖GM1,间皮素,sLe(动物),CYP1B1,PLAC1,GM3,BORIS,Tn,GloboH,NY-BR-1,RGS5,SART3,STn,碳酸酐酶IX,PAX5,OY-TES1,精子蛋白17,LCK,HMWMAA,AKAP-4,XAGE 1,B7H3,豆荚蛋白(Legumain),Tie2,Page4,VEGFR2,MAD-CT-1,FAP,PDGFR-α,PDGFR-β,MAD-CT-2,Fos-相关抗原1,ERBB2,叶酸受体1(FOLR1或FBP),IDH1,IDO,LY6K,fms-相关酪氨酸激酶1(FLT1,公认为VEGFR1),KDR,PADRE,TA-CIN(重组HPV16L2E7E6),SOX2,醛脱氢酶及其衍生物。
在一些实施方式中,被配置为靶向癌细胞的一种或多种剂缀合至纳米颗粒的外表面。在一些实施方式中,被配置为靶向癌细胞的一种或多种剂被封装在纳米颗粒内。
基于本文包含的教导,额外的实施方式对于相关领域的技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1.HSA-1252的大小分布随高压均质机使用的不同循环和压力而变化。
图2.优化的HSA-1252制剂的外观和大小分布。
图3.冻干工艺中不同参数的影响
图4.纳米-1252和临床使用的制剂临床-1252在PBS、盐水和水中的外观。
图5.通过平均粒度(左)和分布/PDI分析HSA-1252在长期储存期间的制剂稳定性。
图6.通过HP分析了APG-1252在长期储存期间的化学稳定性。
图7.HSA-1252和临床制剂的血小板毒性。以不同剂量:10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg给药临床-1252和纳米-1252之后小鼠的血小板计数和平均血小板体积(MPV)。
图8.以不同剂量:10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg给药临床-1252和纳米-1252之后小鼠血液的苏木精和伊红(H&E)染色。红色圆圈和圆点显示血小板
图9.以不同剂量:10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg给药临床-1252和纳米-1252之后小鼠血液的血液学结果。红色圆圈和圆点显示血小板。
图10.APG-1252与白蛋白的相互作用
图11.HSA-1252在稀释5至5000倍后的大小分布。
图12.HSA-1252在生理条件下最长达24小时的大小分布。
图13.HSA-1252和临床-1252的APG-1252在37度下血浆中的体外水解。
图14.APG-1252和BMS-1244血浆浓度与时间曲线。向小鼠给药纳米-1252或临床-1252。
图15.CD-1IGS小鼠的不同组织中APG-1252和BMS-1244浓度与时间曲线。向小鼠给药纳米-1252或临床-1252。
图16.不同类型小鼠(BALB/c、NOD_SCID小鼠和BALBc/macro-消耗小鼠)骨髓、脾和淋巴结中APG-1252和BMS-1244浓度与时间曲线。
图17.HSA-1252和APG-1252(单药)或与依鲁替尼联用对套细胞淋巴瘤(B细胞非霍奇金淋巴瘤)细胞系Mino和Z138和Rec的细胞毒性。
图18.HSA-1252和APG-1252(单药)或与依鲁替尼联用对红白血病(erythroleukemic)HEL、巨核细胞白血病SET-2和鲁索替尼耐药HEL细胞系的细胞毒性。
图19.HSA-1252和APG-1252(单药)或与白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)联用对乳腺癌细胞(HCC1937、MDA-231、SUM149)的细胞毒性。
定义
为了便于理解本发明,许多术语和短语定义如下:
如本文所用,如本文所用的术语“复合”涉及生物大分子剂(例如,抗原、佐剂等)与纳米颗粒和/或微粒的非共价相互作用。
如本文所用,如本文所用的术语“缀合”表示生物大分子剂(例如,抗原、佐剂等)与纳米颗粒和/或微粒之间的共价键缔合。
如本文所用,术语“包封”是指被包封或完全包含在纳米颗粒和/或微粒内部的生物大分子剂(例如,抗原、佐剂等)的位置。
如本文所用,术语“吸收”是指被吸收并稳定保留在纳米颗粒和/或微粒的内部即外表面内部的生物大分子剂(例如,抗原、佐剂等)。
如本文所用,术语“吸附”是指生物大分子剂(例如,抗原、佐剂等)附着到纳米颗粒和/或微粒的外表面。这样的吸附优选通过静电吸引发生。静电吸引是两个或多个带相反电荷或离子化学基团之间产生的吸引或键合。通常,吸附典型地是可逆的。
如本文所用,术语“混合”是指溶解、分散或悬浮在纳米颗粒和/或微粒中的生物大分子剂(例如,抗原、佐剂等)。在一些情况下,生物大分子剂可以均匀地混合在纳米颗粒和/或微粒中。
如本文所用,术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物),包括但不限于人类、非人灵长类、啮齿动物等,其将成为特定治疗的接受者。通常,在指人受试者时,术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
如本文所用,术语“样品”以其最广泛的含义使用。在某种意义上,它意味着包括从任何来源获得的标本或培养物,以及生物和环境样品。生物样品可以从动物(包括人)获得,并且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品,诸如血浆、血清等。环境样品包括环境材料,诸如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。然而,这些实例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。
如本文所用,术语“体外”是指人工环境和在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以包括但不限于试管和细胞培养。术语“体内”是指自然环境(例如,动物或细胞)以及在自然环境中发生的过程或反应。
具体实施方式
受损的细胞凋亡是癌症的标志之一并且有助于肿瘤进展和对常规癌症治疗的抵抗。主要的细胞凋亡途径之一是线粒体介导的内在途径,其由线粒体外膜透化(MOMP)定义。在分子水平上,MOMP受促凋亡和抗凋亡B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白组之间的动态相互作用控制。抗凋亡Bcl-2家族的蛋白质,包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和Bfl1/A1,通过隔离促凋亡Bcl-2家族成员(诸如Bax、Bak、Bim、Bid和Puma)来抑制MOMP(参见BM-1197:a noveland specific Bcl-2/Bcl-xL inhibitor inducing complete and long-lasting tumorregression in vivo.Bai,L等人Plos One.2014)。
已显示BCL-2在多种淋巴恶性肿瘤的存活中起主导作用。ABT-199(Venetoclax)是一种选择性Bcl-2抑制剂,其已被证明可治疗慢性淋巴细胞白血病。但是,它不适用于实体瘤。BCL-XL随后被鉴定为相关的促存活蛋白,并且与多种实体瘤和血液恶性肿瘤的耐药性和疾病进展有关。双重Bcl-2和Bcl-xL靶向抑制剂在治疗实体瘤方面很有前景。ABT-263是双重Bcl-2和Bcl-xL靶向抑制剂之一,已被证明在复发性小细胞肺癌、难治性或复发性淋巴恶性肿瘤和其他实体瘤的临床试验中很有前景(参见Phase II study of single-agentnavitoclax(ABT263)and biomarker correlates in patients with relapsed smallcell lung cancer.RudinCM等人Clin Cancer Res.2012)。然而,BCL-XL也是血小板中的主要生存因子。BCL-XL的药理学抑制导致体内血小板半衰期缩短和剂量依赖性血小板减少。血小板毒性是双重Bcl-2和Bcl-xL抑制剂临床应用的主要障碍。
BM-1244是一种有效力的Bcl-2和Bcl-xL双重抑制剂。APG-1252是BM-1244的前药,旨在通过添加磷酸脂阻断与Bcl-xl的结合来克服血小板的靶向毒性。为了使活性形式BM-1244在肿瘤部位释放并保持抗肿瘤效力,使用不稳定的酯键制备前药(参见BM-1197:anovel and specific Bcl-2/Bcl-xL inhibitor inducing complete and long-lastingtumor regression in vivo.Bai,L等人Plos One.2014)。这种策略在一定程度上减少了副作用并进入I/II期临床试验。但是由于酯键不稳定,部分BM-1244仍会在循环中释放,并引起副作用,其限制了临床使用的剂量。另一方面,它要求在制造和储存期间精确控制产品的BM-1244百分比。只有-20度才能储存,以减少水解,这使临床应用非常困难。因此,对于临床使用,需要进一步降低APG-1252的血小板毒性。
在开发本发明实施方式的过程中进行的实验开发了APG-1252(HSA-1252)的白蛋白纳米制剂。白蛋白纳米制剂在APG-1252的外部形成了非常稳定的纳米壳,其在循环中保持稳定和整合。这种牢固结合的白蛋白纳米壳降低了APG-1252的血小板毒性。HSA-1252在浓度为50mg/Kg时未显示出明显的血小板消耗,而临床使用的制剂则诱导显著的血小板消耗。这种增强可能是由于APG-1252的血小板摄取或血液滞留时间减少以及药物水解减少。
另一方面,通过白蛋白纳米制剂,APG-1252的溶解度能够大幅度提高,并且满足10~15mg/ml的临床剂量要求。最重要的是,白蛋白制剂避免了制剂中常用的表面活性剂的超敏反应,以增加溶解度。
纳米颗粒的大小显示在50至200nm范围内可调,大小分布窄(PDI<0.15)。纳米制剂在冻干工艺中被证明是稳定的,并且在从冻干粉末再悬浮后保持相同的大小分布。最后,长期稳定性研究表明HSA-1252在6个月的储存期间是稳定的。与临床-1252相比,HSA-1252的水解率略高,但在至少13个月内保持在可接受的范围内。临床-1252由于药物和赋形剂反应而引入了新的杂质,这可能给患者带来潜在风险。由于窄的大小分布和体外稳定性,HSA-1252显示出高的临床转译潜力。
因此,本公开提供了用APG-1252抑制癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性以压制和/或抑制这样的癌细胞(例如,肿瘤细胞)生长的组合物和方法。特定地,本发明涉及包括与APG-1252缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)的纳米颗粒的组合物、用于合成这样的纳米颗粒的方法以及利用这样的纳米颗粒的系统和方法(例如在诊断和/或治疗环境中)。
白蛋白纳米制剂还可以将其他治疗剂或药物与APG-1252共同封装,这能够将剂共同递送至靶组织,以达到协同治疗效果或降低毒性。
本发明不限于与被配置用于治疗、预防或改善各种类型的疾患(例如癌症)的APG-1252缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)的特定类型或种类的纳米颗粒。
在某些实施方式中,使用的纳米颗粒是与APG-1252缔合的白蛋白纳米制剂。
纳米颗粒的额外的实例包括但不限于富勒烯(又名C60、C70、C76、C80、C84)、内嵌金属富勒烯(EMI's)布基球,其在它们的富勒烯笼内包含额外的原子、离子或簇)、三金属氮化物模板化内嵌金属富勒烯(TNT EMEs、高对称性四原子分子簇内嵌体,其在碳笼内的三金属氮化物模板中形成)、单壁和多壁碳纳米管、支链和树枝状碳纳米管、金纳米棒、银纳米棒、单壁和多壁硼/硝酸盐纳米管、碳纳米管豆荚(具有内部金属富勒烯和/或其他内部化学结构的纳米管)、碳纳米角、碳纳米角豆荚、脂质体、纳米壳、树枝状聚合物、量子点、超顺磁性纳米颗粒、纳米棒和纤维素纳米颗粒。颗粒实施方式还可以包括具有提高有效性或选择性的能力的微粒。其他非限制性示例性纳米颗粒包括玻璃和聚合物微球和纳米球,可生物降解的PLGA微球和纳米球,金、银、碳和铁纳米颗粒。
纳米颗粒的其他实例包括但不限于顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、类富勒烯材料、无机纳米管、树枝状聚合物、具有共价连接的金属螯合物的树枝状聚合物、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳和量子点。在一些实施方式中,纳米颗粒是金属纳米颗粒(例如,金、钯、铂、银、铜、镍、钴、铱或它们中的两种或更多种的合金的纳米颗粒)。纳米颗粒可以包括核或核和壳,诸如核-壳纳米颗粒。
在某些实施方式中,本发明提供了一种组合物,该组合物包括与癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的一种或多种小分子拮抗剂缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)的纳米颗粒(例如,白蛋白)。
这样的组合物不限于Bcl-2和Bcl-xL的特定小分子拮抗剂。在一些实施方式中,Bcl-2和Bcl-xL的小分子拮抗剂是APG-1252。
在某些实施方式中,本发明提供了组合物,该组合物包括与癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的一种或多种拮抗剂(例如APG-1252)缔合的纳米颗粒(例如白蛋白),其中任何种类的生物大分子剂(例如,核酸、肽、糖脂等)进一步与纳米颗粒缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)。
在一些实施方式中,生物大分子剂是肽。
例如,在一些实施方式中,肽是抗原。
在一些实施方式中,抗原是肿瘤抗原。抗原可以是肿瘤抗原,包括肿瘤相关或肿瘤特异性抗原,诸如但不限于α-辅肌动蛋白-4,Bcr-Abl融合蛋白,Casp-8,β-联蛋白,cdc27,cdk4,cdkn2a,coa-1,dek-can融合蛋白,EF2,ETV6-AML1融合蛋白,LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白,HLA-A2,HLA-A11,hsp70-2,KIAAO205,Mart2,Mum-1、2和3,neo-PAP,I类肌球蛋白,OS-9,pml-RARα融合蛋白,PTPRK,K-ras,N-ras,磷酸丙糖异构酶,Bage-1,Gage 3、4、5、6、7,GnTV,Herv-K-mel,Lage-1,Mage-A1、2、3、4、6、10、12,Mage-C2,NA-88,NY-Eso-1/Lage-2,SP17,SSX-2和TRP2-Int2,MelanA(MART-I),gp100(Pmel 17),酪氨酸酶,TRP-1,TRP-2,MAGE-1,MAGE-3,BAGE,GAGE-1,GAGE-2,p15(58),CEA,RAGE,NY-ESO(LAGS),SCP-1,Hom/Mel-40,PRAME,p53,H-Ras,HER-2/neu,BCR-ABL,E2A-PRL,H4-RET,IGH-IGK,MYL-RAR,EB病毒抗原,EBNA,人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7,TSP-180,MAGE-4,MAGE-5,MAGE-6,p185erbB2,p180erbB-3,c-met,nm-23H1,PSA,TAG-72-4,CA19-9,CA 72-4,CAM 17.1,NuMa,K-ras,β-联蛋白,CDK4,Mum-1,p16,TAGE,PSMA,PSCA,CT7,端粒酶,43-9F,5T4,791Tgp72,α-甲胎蛋白,13HCG,BCA225,BTAA,CA 125,CA15-3(CA 27.29\BCAA),CA 195,CA242,CA-50,CAM43,CD68\KP1,CO-029,FGF-5,G250,Ga733(EpCAM),人EGFR蛋白或其片段,诸如人EGFR残基306–325(SCVRACGADSYEMEEDGVRK(SEQ ID NO:1))以及残基897–915(VWSYGVTVWELMTFGSKPY(SEQ IDNO:2)),HTgp-175,M344,MA-50,MG7-Ag,MOV18,NB\70K,NY-CO-1,RCAS1,SDCCAG16,TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-缔合的蛋白),TAAL6,TAG72,TLP,TPS,WT1(以及Wt1-衍生的肽序列:WT1 126–134(RMFP NAPYL(SEQ ID NO:3))、WT1122–140(SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQID NO:4))以及WT1 122–144(SGQARMFPNAPYLPSCLESQPTI(SEQ ID NO:5))、MUC1(以及MUC1-衍生肽和糖肽,诸如RPAPGS(SEQ ID NO:6)、PPAHGVT(SEQ ID NO:7)以及PDTRP(SEQ ID NO:8))),LMP2,EGFRvIII,独特型,GD2,Ras突变体,p53突变体,蛋白酶3(PR1),存活蛋白,hTERT,肉瘤易位断裂点,EphA2,EphA4,LMW-PTP,PAP,ML-IAP,AFP,ERG(TMPRSS2 ETS融合基因),NA17,PAX3,ALK,雄激素受体,周期蛋白B1,多唾液酸,MYCN,RhoC,TRP-2,GD3,岩藻糖GM1,间皮素,sLe(动物),CYP1B1,PLAC1,GM3,BORIS,Tn,GloboH,NY-BR-1,RGS5,SART3,STn,碳酸酐酶IX,PAX5,OY-TES1,精子蛋白17,LCK,HMWMAA,AKAP-4,XAGE 1,B7H3,豆荚蛋白(Legumain),Tie2,Page4,VEGFR2,MAD-CT-1,FAP,PDGFR-α,PDGFR-β,MAD-CT-2,Fos-相关抗原1,ERBB2,叶酸受体1(FOLR1或FBP),IDH1,IDO,LY6K,fms-相关酪氨酸激酶1(FLT1,公认为VEGFR1),KDR,PADRE,TA-CIN(重组HPV16 L2E7E6),SOX2和醛脱氢酶。
在一些实施方式中,其中生物大分子是肽。在一些实施方式中,肽是促肾上腺皮质激素(ACTH)、促生长素肽、促黑素细胞激素(MSH)、催产素、加压素、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、CRF相关肽、促性腺激素释放激素相关肽(GAP)、促生长素释放因子(GRF)、促黄体素释放激素(LH-RH)、促食欲素、催乳素释放肽(PRP)、生长抑素、促甲状腺素释放激素(THR)、THR类似物、降钙素(CT)、CT前体肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、胰岛淀粉素、胰高血糖素、胰岛素、胰岛素样肽、神经肽Y(NPY)、胰多肽(PP)、肽YY(PYY)、胆囊收缩素(CCK)、CCK相关肽、促胃液素释放肽(GRP)、促胃液素、促胃液素相关肽、促胃液素抑制肽、胃动素、促胰液素、舒血管肠肽(VIP)、VIP相关肽、心房钠尿肽(ANP)、脑利尿钠肽(BNP)、C型利尿钠肽(CNP)、速激肽、血管紧张素、肾素底物、肾素抑制剂、内皮素、内皮素相关肽、阿片肽,、胸腺肽、肾上腺髓质素肽、咽侧体神经(allostatin)肽、β-淀粉样蛋白片段、抗微生物肽、抗氧化肽、细胞凋亡相关肽、袋细胞肽(BCP)、铃蟾肽、骨Gla蛋白肽、可卡因和苯丙胺相关转录(CART)肽、细胞粘附肽、趋化肽、补体抑制剂、皮质抑素肽、纤连蛋白片段、纤维蛋白相关肽、FMRF、FMR酰胺相关肽(FaRP)、甘丙肽、甘丙肽相关肽、生长因子、生长因子相关肽、G-治疗性肽结合蛋白片段、瓜林素(Gualylin)、尿鸟苷素、抑制素肽、白细胞介素(IL)、白细胞介素受体蛋白、层粘连蛋白片段、瘦素片段肽、蜚蠊肌激肽、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PAPCAP)、胰抑释素、多肽重复链、信号转导试剂、凝血酶抑制剂、毒素、胰蛋白酶抑制剂、病毒相关肽、辅助肽类似物、α交配因子、抗心律失常肽、厌食肽、α-1抗胰蛋白酶、牛松果体抗生殖肽、三肽囊素(Bursin)、C3肽P16、钙黏着蛋白肽、嗜铬粒蛋白A片段、避孕四肽、芋螺睡眠肽(Conantokin)G、芋螺睡眠肽T、甲壳动物心脏活性肽、C-端肽、细胞色素b588肽、抗拴肽(Decorsin)、美味肽、δ睡眠诱导肽、苯甲二氮(Diazempam)结合抑制剂片段、一氧化氮合酶阻断肽、OVA肽、血小板钙蛋白酶抑制剂(P1)、纤溶酶原激活物抑制剂1、脚底(Rigin)、精神分裂症相关肽、钾钠治疗肽酶抑制剂-1、精子活化肽(Speract)、精子激活肽、系统素、凝血酶受体激动剂、促吞噬肽、激脂激素、尿毒症五肽、抗冻多肽、肿瘤坏死因子(TNF)、水蛭[Des Asp10]抗栓肽、L-鸟牛磺酸(Ornithyltaurine)盐酸盐、对氨基苯乙酰促吞噬肽、Ac-Glu-Glu-Val-Val-Ala-Cys-Pna(SEQ ID NO:9)、Ac-Ser-Asp-Lys-Pro,Ac-rfwink-NH2,Cys-Gly-Tyr-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO:10)、D-Ala-Leu,D-D-D-D-D(SEQ ID NO:11)、D-D-D-D-D-D(SEQ ID NO:12)、N-P-N-A-N-P-N-A(SEQ ID NO:13)、V-A-I-T-V-L-V-K(SEQ IDNO:14)、V-G-V-R-V-R(SEQ ID NO:15)、V-I-H-S,V-P-D-P-R(SEQ ID NO:16)、Val-Thr-Cys-Gly、R-S-R、海胆精子激活肽、SHU-9119拮抗剂、MC3-R拮抗剂、MC4-R拮抗剂、格拉莫德、HP-228、α2-纤溶酶抑制剂、APC肿瘤抑制因子、早孕因子、γ干扰素、腺体激肽释放酶(Kallikrei)N-1、胎盘核糖核酸酶抑制剂、萨尔科莱克素(Sarcolecin)结合蛋白、表面活性蛋白D、维尔姆斯肿瘤抑制因子、GABAB 1b受体肽、朊病毒相关肽(iPRP13)、胆碱结合蛋白片段、端粒酶抑制剂、心脏抑制素(Cardiostatin)肽、内皮抑制素衍生肽、朊病毒抑制肽、N-甲基D-天冬氨酸受体拮抗剂和C-肽类似物。
在一些实施方式中,肽选自177Lu-DOTA0-Tyr3-奥曲肽(Octreotate)、醋酸阿巴瑞克、ADH-1、阿法诺肽(Afamelanotidec)、美拉诺坦-1(melanotan-1)、CUV1647、阿必鲁肽、抑蛋白酶多肽、精氨酸升压素(Argipressin)、醋酸阿托西班、杆菌肽、苯替酪胺、BH3结构域、比伐卢定、比伐卢定三氟乙酸水合物、布利莫德(Blisibimod)、硼替佐米、布舍瑞林、醋酸布舍瑞林、降钙素、卡贝缩宫素(Carbetocin)、醋酸卡贝缩宫素、杀菌肽A和B、雨蛙肽(Ceruletide)、雨蛙肽二乙胺、西曲瑞克、醋酸西曲瑞克、环孢菌素、西仑吉肽(Cilenitidec)、EMD121974、醋酸可的瑞林(Corticorelin)注射液、hCRF、可的瑞林绵羊三氟醋酸盐(triflutate)、可的瑞林三氟乙酸盐(trifluoroacetate)、促肾上腺皮质素、替可克肽(Cosyntropin)、ACTH 1-24、醋酸替可克肽(tetracosactide hexaacetate)、达巴凡星、达托霉素、醋酸地加瑞克、地普奥肽(Depreotide)三氟乙酸盐(加高锝酸钠(sodiumpertechnetate))、醋酸去氨加压素、去氨加压素DDAVP、杜拉鲁肽、艾卡拉肽(Ecallantide)、依多曲肽(Edotreotide)(加钇-90)、醋酸依那普利、依那普利马来酸盐(或2-丁二酸盐)、恩夫韦肽、依替巴肽、艾塞那肽、醋酸加尼瑞克、醋酸格拉默(Glatiramer)、谷胱甘肽、戈那瑞林,、醋酸戈那瑞林、GnRH、LHRH、戈舍瑞林、醋酸戈舍瑞林、短杆菌肽、醋酸组氨瑞林、人降钙素、艾替班特、醋酸艾替班特、IM862、奥谷法奈(oglufanide)二钠、KLAKLAK、醋酸兰瑞肽、来匹卢定、亮丙瑞林(Leuprolide)、醋酸亮丙瑞林、亮丙琳林(leuprorelin)、利拉糖肽、赖诺普利、利司那肽、赖氨加压素、爪蟾抗菌肽2、MALP-2Sc、巨噬细胞活化脂肽-2合成物、醋酸那法瑞林、奈西立肽、NGR-hTNF、醋酸奥曲肽、奥古霉素、缩宫素、帕瑞肽、培奈萨肽(Peginesatide)、五肽促胃液素、喷曲肽(加铟-111)、苯加压素、抗菌蛋白(Pleurocidin)、普兰林肽、普罗瑞林、促甲状腺素释放素、TRH、TRF、鲑鱼降钙素、醋酸沙拉新、促胰液素(人)、促胰液素(猪)、司美鲁肽、醋酸丝拉克肽、ACTH、促肾上腺皮质素、醋酸舍莫瑞林、GRF 1-29、西那普肽、芦西纳坦(lucinactant)中的KL4、辛卡利特、醋酸生长释素、GHRH、GHRF、GRF、醋酸生长抑素、斯帕格鲁马(Spaglumat)镁(或钠)盐、P物质、四水他替瑞林(Taltirelin hydrate)、特度鲁肽、替考拉宁、替拉万星(Telavancin)、特立帕肽、醋酸特利加压素、替可克肽、胸腺法新、胸腺素a-1、胸腺喷丁、曲巴那尼(Trebananib)、曲普瑞林、双羟萘酸曲普瑞林(Triptorelin pamoate)、酪丝亮肽(Tyroserleutide)、乌拉立肽、万古霉素、醋酸伐普肽、血管活性肠肽醋酸盐、Vx-001c、TERT572Y、醋酸齐考诺肽、α5-α6Bax肽和β-防御肽。
在一些实施方式中,肽是有助于用组合物实现所需目的的任何肽。例如,在一些实施方式中,肽是有助于治疗任何类型的疾病和/或疾患(例如,癌症)的任何肽。
在一些实施方式中,生物大分子剂是核酸。这样的实施方式涵盖任何类型的核酸分子,包括但不限于RNA、siRNA、微小RNA、干扰RNA、mRNA、复制子mRNA、RNA类似物和DNA。
根据本发明,上述纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)可用于已被诊断为患有癌症或有患癌症风险的患者,通过以治疗有效的方式向患者给药纳米制剂。在一种实施方式中,患者可能患有实体瘤,诸如乳腺、卵巢、前列腺、肺、肾、胃、结肠、睾丸、头颈、胰腺、脑、黑色素瘤和其他组织器官肿瘤和血液肿瘤,诸如淋巴瘤和白血病,包括急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、T细胞淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤。
纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)可以单独给药或与其他治疗剂联合给药。治疗剂是例如化疗剂或生物治疗剂、放射治疗或免疫治疗。可以对特定癌症进行任何合适的治疗性治疗。化疗剂和生物治疗剂的实例包括但不限于阿地白介素、六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、博来霉素、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、克拉立滨、西沙必利、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、多西他赛、多柔比星、屈大麻酚、依泊汀α、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、格拉司琼、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、甲酰四氢叶酸、甲地孕酮、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧氯普胺、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥美拉唑、昂丹司琼、紫杉醇毛果芸香碱、丙氯拉嗪、利妥昔单抗、他莫昔芬、泰素、盐酸拓泊替康、曲司珠单抗、长春碱、长春新碱和酒石酸长春瑞滨。对于前列腺癌治疗,可与抗CTLA-4联用的优选化疗剂是紫杉醇
这样的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)被包括的最优量和最优给药方案可由本领域技术人员确定而无需过度实验。例如,纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)可被制备用于静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.注射、腹膜内(i.p.)注射、肌肉内(i.m.)注射。肽注射的优选方法包括s.c、i.d.、i.p.、i.m.以及i.v.。优选的DNA注射方法包括i.d.、i.m.、s.c、i.p.和i.v.。例如,可给予1至500mg、50μg至1.5mg、优选10μg至500μg的肽或DNA的剂量,这将取决于相应的肽或DNA。该范围的剂量已成功用于先前的试验(Brunsvig P F,等人,Cancer Immunol Immunother.2006;55(12):1553-1564;M.Staehler,等人,ASCO meeting 2007;Abstract No3017)。给药疫苗组合物的其他方法是本领域技术人员已知的。
在某些实施方式中,如本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)进一步与一种或多种治疗剂缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)。这样的实施方式不限于特定类型或种类的治疗剂。
在一些实施方式中,治疗剂被配置用于治疗和/或预防癌症。这样的治疗剂的实例包括但不限于化疗剂、抗癌剂、抗血管生成剂、肿瘤抑制剂、抗微生物剂等。
在一些实施方式中,治疗剂被配置用于治疗和/或预防自身免疫性疾患和/或炎性疾患。这样的治疗剂的实例包括但不限于改善疾病的抗风湿药(例如,来氟米特、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹)、生物制剂(例如,利妥昔单抗、英利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、戈利木单抗)、非甾体抗炎药(例如布洛芬、塞来昔布、酮洛芬、萘普生、吡罗昔康、双氯芬酸)、镇痛剂(例如对乙酰氨基酚、曲马多)、免疫调节剂(例如阿那白滞素、阿巴西普)、糖皮质激素(例如泼尼松、甲基泼尼松)、TNF-α抑制剂(例如,阿达木单抗、培化舍单抗、依那西普、戈利木单抗、英利昔单抗)、IL-1抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。在一些实施方式中,治疗剂包括但不限于英利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、肠胃外金或口服金。
在一些实施方式中,治疗剂被配置用于治疗和/或预防心血管相关疾患(例如,动脉粥样硬化、心力衰竭、心律失常、心房颤动、高血压、冠状动脉疾病、心绞痛等)。已知可用于治疗和/或预防心血管相关疾患的治疗剂的实例包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂(例如,贝那普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利)、腺苷、α阻滞剂(α肾上腺素能拮抗剂药物)(例如可乐定、胍那苄、拉贝洛尔、酚苄明、特拉唑嗪、多沙唑嗪、胍法辛、甲基多巴、哌唑嗪)、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)(例如坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦酯、替米沙坦、依普沙坦、氯沙坦、他索沙坦、缬沙坦)、抗凝剂(例如,肝素磺达肝癸钠、华法林、阿地肝素、依诺肝素、瑞肝素、达肝素、那屈肝素、亭扎肝素)、抗血小板剂(例如,阿昔单抗、氯吡格雷、依替巴肽、噻氯匹定、西洛他唑、双嘧达莫、磺吡酮、替罗非班)、β阻滞剂(例如,醋丁洛尔、倍他洛尔、卡替洛尔、美托洛尔、喷布洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、纳多洛尔、吲哚洛尔、噻吗洛尔)、钙通道阻滞剂(例如氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、硝苯地平、维拉帕米、地尔硫卓、尼卡地平、尼莫地平、尼索地平)、利尿剂、醛固酮阻滞剂、袢利尿剂(例如布美他尼、呋塞米、依他尼酸(ethacrynic acid)、托拉塞米)、保钾利尿剂、噻嗪类利尿剂(例如,氯噻嗪、氯噻酮、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氧噻嗪、美托拉宗、聚噻嗪、喹沙酮、三氯噻嗪)、inoptropics、胆汁酸螯合剂(例如消胆胺、降胆宁(coletipol)、考来维仑)、贝特类(例如氯贝丁酯、吉非贝齐、非诺贝特)、他汀类(例如,阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀)、选择性胆固醇吸收抑制剂(例如,依折麦布)、钾通道阻滞剂(例如,胺达隆、伊布利特、多非利特)、钠通道阻滞剂(例如,丙吡胺、美西律、普鲁卡因胺、奎尼丁、氟卡尼、莫里西嗪、普罗帕酮)、溶栓剂(例如,阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、链激酶、尿激酶)、血管收缩药、血管扩张药(例如肼苯哒嗪、米诺地尔、美卡拉明、异山梨酯、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯、硝酸甘油)。
通常,如此形成的纳米颗粒是球形的并且具有约40至200nm的直径(例如,30-220nm;35-215nm;45-190nm;55至180nm;75-150nm;90至130nm;100–110nm;等)。在一些实施方式中,纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)经受尺寸排阻色谱法以产生更均匀的制剂。
在一些实施方式中,如本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)进一步与剂缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合),用于确定给药的颗粒的位置。可用于此目的的剂包括荧光标签、放射性核素和造影剂。
合适的显像剂包括但不限于荧光分子,例如由分子探针(Molecular Probes)(荧光探针和研究产品手册(Handbook of fluorescent probes and research products))描述的那些,诸如罗丹明、荧光素、德克萨斯红、吖啶橙、Alexa Fluor(各种)、别藻蓝蛋白、7-氨基放线菌素D、BOBO-1、BODIPY(各种)、钙黄绿(Calcien)、钙红(Calcium Crimson)、钙绿、钙橙、6-羧罗丹明6G、级联蓝、级联黄、DAPI、DiA、DID、Di1、DiO、DiR、ELF 97、伊红、ER示踪剂蓝白、EthD-1、溴化乙锭、Fluo-3、Fluo4、FM1-43、FM4-64、Fura-2、Fura红、烟酸己可碱(Hoechst)33258、烟酸己可碱33342、7-羟基-4-甲基香豆素、Indo-1、JC-1、JC-9、JOE染料、丽丝胺罗丹明B、荧光黄CH、LysoSensor蓝DND-167、LysoSensor绿、LysoSensor黄/Blu、Lysotracker绿FM、Magnesium绿、Marina蓝、Mitotracker绿FM、Mitotracker橙CMTMRos、MitoTracker红CMXRos、单溴代二苯甲烷、NBD胺、NeruoTrace 500/525绿、尼罗河红、俄勒冈绿、太平洋蓝。POP-1、碘化丙啶、罗丹明110、罗丹明红、R-藻红蛋白、Resorfin、RH414、Rhod-2、罗丹明绿、罗丹明123、ROX染料、钠绿、SYTO蓝(各种)、SYTO绿(各种)、SYTO橙(各种)、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、四甲基罗丹明B、TOT-1、TOT-3、X-rhod-1、YOYO-1、YOYO-3。在一些实施方式中,提供神经酰胺作为显像剂。在一些实施方式中,S1P激动剂作为显像剂提供。
此外,放射性核素可用作显像剂。合适的放射性核素包括但不限于Fe(III)、Fe(II)、Cu(II)、Mg(II)、Ca(II)和Zn(I1)、铟、镓和锝的放射性物质。其他合适的造影剂包括通常用于在顺磁性T1型MIR造影剂中螯合的金属离子,并且包括二价和三价阳离子,诸如铜、铬、铁、钆、锰、铒、铕、镝和钬。可以螯合并用于放射性核素成像的金属离子包括但不限于金属,诸如镓、锗、钴、钙、铟、铱、铷、钇、钌、钇、锝、铼、铂、铊和钐。此外,已知可用于中子捕获放射治疗的金属离子包括硼和其他具有大核横截面的金属。也合适的是用于超声造影和X射线造影组合物的金属离子。
其他合适的造影剂的实例包括不透射线的气体或气体发射化合物。
在一些实施方式中,如本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)进一步与靶向剂缔合(例如,复合、缀合、包封、吸收、吸附、混合)。在一些实施方式中,靶向剂用于有助于将本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)递送至所需的身体区域。靶向剂的实例包括但不限于抗体、受体配体、激素、维生素和抗原,然而,本发明不受靶向剂的性质的限制。在一些实施方式中,抗体对疾病特异性抗原是特异性的。在一些实施方式中,受体配体包括但不限于CFTR、EGFR、雌激素受体、FGR2、叶酸受体、IL-2受体、糖蛋白和VEGFR的配体。在一些实施方式中,受体配体是叶酸。
在一些实施方式中,本发明还提供了包括如本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)的试剂盒。在一些实施方式中,试剂盒包括一种或多种产生这样的纳米制剂所必需的试剂和工具,以及使用这样的纳米制剂的方法。
如本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)可以通过任何合适的分析技术表征大小和均匀性。这些包括但不限于原子力显微镜(AFM)、电喷雾电离质谱、MALDI-TOF质谱、13C核磁共振光谱、高效液相色谱(HPLC)尺寸排阻色谱(SEC)(配备有多角度激光散射、双UV和折射率检测器)、毛细管电泳和凝胶电泳。这些分析方法确保了纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)群体的均匀性,并且对于最终用于体内应用的生产质量控制非常重要。
在一些实施方式中,凝胶渗透色谱法(GPC)用于分析纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)。在一些实施方式中,大小分布和ζ电位通过使用例如Malven Nanosizer仪器的动态光散射(DLS)来确定。
在考虑临床应用的情况下,在本发明的一些实施方式中,将纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)被制备为适合于预期应用的形式的药物组合物的一部分。通常,这需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。在一些实施方式中,本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)与适当的盐和缓冲液联合使用,以使组合物以稳定的方式递送以允许被靶细胞摄取。当将纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)引入患者中时,也可以使用缓冲剂。水性组合物包括对细胞有效量的分散在药学上可接受的载体或水性介质中的纳米制剂。这种组合物也称为接种物。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当给药于动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用,“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。除非任何常规介质或剂与本发明的载体或细胞不相容,否则考虑其在治疗组合物中的使用。补充性活性成分也可以掺入组合物中。
在本发明的一些实施方式中,活性组合物包括经典药物制剂。给药根据本发明的这些组合物是通过任何常见的途径,只要靶组织可通过该途径可得。这包括口腔、鼻、颊、直肠、阴道或局部。替代地,可以通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射进行给药。
如本文所述的活性纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)也可以肠胃外或腹膜内或肿瘤内给药。在与表面活性剂诸如羟丙基纤维素适当混合的水中制备作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在一般储存和使用条件下,这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
适用于其他给药方式的其他制剂包括阴道栓剂和阴道栓。也可以使用直肠拴或栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型,通常含药,用于插入直肠、阴道或尿道。插入后,栓剂软化、熔化或溶解在腔内液体中。一般来说,对于栓剂,传统的粘结剂和载体可以包括,例如,聚亚烷基二醇或甘油三酯;这样的栓剂可以由含有0.5%至10%范围内,优选1%-2%的活性成分的混合物形成。阴道栓剂或栓通常呈球形或卵形,并且每个重约5g。阴道药物有多种物理形式,例如乳膏、凝胶或液体,它们已脱离栓剂的经典概念。纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)也可以被配制成吸入剂。
本发明还包括涉及如本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)与一种或多种另外的活性剂的共同递送或共同给药的方法。实际上,本发明的另一方面是提供通过将本发明的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)与这样的另外的活性剂共同给药来增强现有技术疗法和/或药物组合物的方法。在共同给药程序中,剂可以同时或顺序给药。在一些实施方式中,本文所述的纳米制剂(例如,与APG-1252缔合的白蛋白)在其他一种或多种活性剂之前给药。要共同给药的一种或多种剂取决于所治疗病症的类型。
实验
提供以下实施例是为了证明和进一步说明本发明的某些优选实施方式和方面,而不应解释为限制其范围。
实施例1.
本实施例描述了实施例II-VI的材料和方法。
化学品和试剂.
APG-1252和BM-1244由亚盛医药(中国江苏)提供。白蛋白(人)美国药典5%购自Grifols Biologicals Inc.(洛杉矶(LosAngeles),美国)。高效液相色谱(HPLC)级乙腈购自Sigma-Aldrich(圣路易斯(St Louis),密苏里州,美国),HPLC柱(C18 3.5μm)购自Waters(马萨诸塞州(Massachusetts),美国)。使用Milli-Q水系统(Millipore,贝德福德(Bedford),马萨诸塞州,美国)获得超纯去离子水。氯化钠注射液(0.9%)购自Hospira Inc.(森林湖,伊利诺伊州(IL),美国)。CellTiter 96TMAQueous非放射性细胞增殖检测试剂盒购自PromegaTM(麦迪逊(Madison),威斯康星州(WI),美国)。
HSA-1252的制备
通过将1252(200mg)溶解到氯仿(2ml)中来制备有机相。然后将20ml市售HSA溶液(5%)与有机相混合,并通过转子-定子均质器(Ultra-Turrax T25,8K rpm–12K rpm,5min)剧烈分散以产生乳状乳液。然后将乳液通过高压均质机(Nano DeBEE)处理,参数设置为压力=15,000psi–20,000psi,冷凝温度=5℃,循环=6。通过旋转蒸发器除去产物中剩余的有机溶剂。最终的纳米悬浮液用0.22μm滤膜过滤,以及然后直接放入10ml小瓶中(2ml/小瓶)进行冻干(一次干燥温度=-5℃,30h,二次干燥温度=30℃,6h)。在密封前将小瓶充满氮气并储存在-20℃下。
HSA-1252的表征
使用Malvern Zetasizer Nano ZS通过动态光散射(DLS)确定大小分布和ζ电位。通过HPLC测定纳米制剂中的APG-1252浓度。简单地说,HSA-1252制剂用乙腈(1:4v/v)稀释,超声处理10min,以及在4℃下10,000rpm下离心15min。通过HPLC分析上清液中的APG-1252浓度,水流动相设置为pH为3.5±0.1的磷酸盐缓冲液,以及有机流动相使用乙腈。采用Agilent C18柱(150mm×4.6mm,3.5μm)进行分离,检测波长设置为254nm。
HSA-1252冻干工艺的优化
优化了冻干工艺中的一次干燥温度。热处理固定为5℃,30min和-40℃,1h。一次干燥工艺设置了三个不同的温度点(-10℃、0℃、10℃),并在150mTorr真空下持续10h。二次干燥温度固定为30℃,4h。实际制剂温度由热检测器监测。
冻干粉的再悬浮
将HSA-1252和临床使用的制剂(临床-1252)两者的冻干粉末用不同的介质(包括水、盐水和PBS)再悬浮。
APG-1252在制剂制备和冻干工艺期间的稳定性.
通过上述方法在制剂制备和冻干工艺之前和之后测量APG-1252及其水解产物BM-1244的含量。
HSA-1252冻干粉末的储存稳定性评价
将不同小瓶的HSA-1252冻干粉末置于-20℃、4℃和25℃下。在每个采样时间点(0个月、1个月、3个月、6个月),取小瓶并用氯化钠注射液(0.9%)悬浮,药物浓度为10mg/ml。然后,测量APG-1252含量和大小分布。
实施例II.
本实施例描述了HSA-1252制剂的制备和表征。
成功制备了HSA-1252。制剂中APG-1252终浓度可以达10-15mg/mL,其满足临床i.v给药要求。
如图1所示的,通过改变高压均质器中使用的压力和循环,纳米颗粒的平均大小可以从56nm调整到180nm,并且可以获得窄的大小分布(PDI<0.15)。冻干后,大小分布和ζ电位没有改变。
一种优化制剂的特性如图2所示。制剂混悬液在轻微蓝光下是澄清的,并且没有观察到大的沉淀物。z平均大小为72.28±0.318nm,PDI为0.135±0.003,ζ电位为-20.67±1.17mV。
实施例III.
本实施例描述了HSA-1252制剂的冻干工艺优化和冻干产物表征。
通过改变一次干燥温度(-10℃、0℃、10℃)优化了HSA-1252的冻干工艺。如图3所示的,随着托盘温度的升高,制剂冷冻干燥所需的时间减少。尽管在所有情况下都产生了“蛋糕”形式,但在干燥温度设置为10℃的情况下确实发生了温度突然升高。
HSA-1252的冻干粉末在不同介质(水、盐水和PBS)中的再悬浮时间短,在1min内。如图4所示的,HSA-1252再悬浮后的外观是透明的,带有轻微的蓝光。与纳米制剂相比,临床使用的制剂再悬浮时间较长,并且在高浓度下不能很好地再悬浮。临床-1252的外观并不透明。
实施例IV.
本实施例描述了HSA-1252在制备和冻干工艺期间的稳定性。
由于APG-1252不稳定,可以在水中水解成BM-1244,因此在制备和冻干工艺期间控制BM-1244的百分比。优化程序之后,与原药(0.16%)相比,观察到最终冻干产物(0.176%)中1244没有明显增加。基于HPLC分析未检测到其他新杂质。
实施例V.
本实施例描述了HSA-1252冻干粉末的制剂稳定性。
HSA-1252冻干粉末在-20、4、25℃下储存6个月。观察再悬浮后的大小分布。如图5所示的,z平均值和PDI在所有三个温度下都没有显著变化。这些结果表明,冻干粉末在储存6个月期间是稳定的。
实施例VI.
本实施例描述了HSA-1252冻干粉末的长期化学稳定性。
在-20℃和4℃下,测量HSA-1252和临床制剂冻干粉末的长期储存稳定性研究长达13个月。如图6所示的,HSA-1252中APG-1252的含量在储存期间在两个温度下均在99%以上。在此期间HSA制剂中未发现新杂质。BMS-1244的含量在4℃略有增加,小于0.5%。对于临床-1252,在此期间发现了新杂质(杂质9)。结果表明,与临床-1252相比,两种HSA-1252的水解率都略高,但在至少13个月内仍保持在可接受的范围内。然而,临床-1252由于药物和赋形剂反应而引入了新的杂质,这可能给患者带来潜在风险。
实施例VII.
本施例描述了实施例VIII和IX的材料和方法。
HSA-1252与临床使用的制剂相比的血液学毒性
接下来的实验测试了HSA-1252与临床使用的制剂(临床-1252)相比的血小板毒性。向CD-1小鼠(雌性,6-8周,Charles River)静脉内注射两种制剂,并且1252的量设定为10、50、100mg/Kg。给药1、4、24小时和7天后,采集全血并进行血液学分析测试。进行以50mg/kg的剂量给药两种制剂4h和24h后的小鼠血液涂片染色以观察血小板数量。
APG-1252与白蛋白之间的相互作用
SYBYL软件用于模拟APG-1252与白蛋白之间的相互作用。高对接值(13.47)代表APG-1252与白蛋白的结合能力非常强。
HSA-1252制剂的稀释稳定性
HSA-1252冻干粉末用氯化钠注射液(0.9%)悬浮,药物浓度为10mg/ml。然后将悬浮液稀释5、50、500、5000倍。在稀释后立即通过动态光散射(DLS)测量大小分布。
HSA-1252在中等模拟生理条件下的稳定性
为了模拟生理条件下制剂的稀释,将再悬浮的HSA-1252(用氯化钠注射剂)在5%HSA中稀释5,000倍。Nanosight(NS300)分析用于监测血浆中制剂的大小分布和颗粒浓度变化。还检测了不同的时间点以分析纳米颗粒在血浆中的动力学。
药物水解测定的体外测试
为了测试HSA-1252是否可以延迟APG-1252水解为BMS-1244,将两种不同的制剂在小鼠血浆中孵育,并在37℃下以100rpm的速度旋转。在不同的时间点,收集少量血浆并与乙腈混合以从蛋白质中提取游离药物。超声和离心后,收集上清液以分析不同组中1244的百分比。
测量药物循环时间的药代动力学研究
HSA-1252和临床制剂通过静脉内注射以50mg/kg的剂量给药于小鼠(CD-1,雌性,n=5)。在不同时间点(0.5h、2h、4h、8h、24h和48h)采集血液,并通过LC-MS检测血液和血浆中的药物浓度(1252和1244二者)。
体外血小板摄取
1252的纳米制剂还可以通过阻止其吸收药物来降低血小板毒性。因此,将两个制剂组与血浆一起孵育不同的时间点。然后根据公布的步骤分离血小板,并且使用LC-MS检测血小板中的药物浓度。
实施例VIII.
本实施例表明,APG-1252的白蛋白纳米制剂通过白蛋白纳米颗粒的特殊性质降低了APG-1252的血小板毒性。
与临床使用的制剂相比,HSA-1252挽救了1252的血小板毒性
如图7所示的,两种制剂在10mg/kg的低剂量下,均未观察到明显的血小板毒性。然而,当剂量增加到50mg/Kg时,临床制剂早在给药后4h就观察到血小板数量显著减少,并且这种现象持续至少24h。HSA制剂在该剂量下表现出较好的血小板安全性,并且给药后24h仅观察到血小板轻微减少。在整个研究过程中,没有观察到HSA制剂的血小板体积显著变化。这种对HSA制剂的血小板保护作用也在100mg/Kg剂量下被发现,这表明HSA-1252可以成功挽救APG-1252的血小板毒性。
如图8所示的涂片血液染色证实了通过血液学分析观察到的血小板毒性。两种制剂均以50mg/Kg给药后,每组随机抽取3份血液样品,分别在4h和24h时间点进行染色。载玻片中的血小板用红点标记,以易于观察。临床制剂4h观察到血小板明显减少,24h后其仅略有改善。然而,HSA制剂中的血小板在4h时没有显示出明显的变化。在24h(#3)时,只有一张载玻片显示血小板减少,这仍然优于临床制剂组中的任何载玻片。为了比较这两种制剂的其他血液毒性,还观察了不同时间点(4h、24h和7d)不同剂量(10mg/Kg、50mg/Kg和100mg/Kg)的白细胞和红细胞相关参数。如图9所示的,在这两种制剂之间未观察到显著差异,表明HSA制剂在其他血细胞中的表现与临床制剂相似。
APG-1252与白蛋白具有强相互作用
与临床制剂相比,纳米制剂显示出显著更好的血小板毒性(参见图10)。据推测,白蛋白可能在药核的外部形成稳定的壳,其可以保持稳定并防止药物在循环中的释放。因此,我们首先计算APG-1252与白蛋白的相互作用。根据SYBYL软件模拟,APG-1252具有的cLog P为8.35,这表明亲液性非常高。APG-1252与白蛋白具有强相互作用。对接值为13.47。
稀释后HSA-1252保持稳定
纳米颗粒将在i.v注射后被稀释。在此测试稀释稳定性以确保白蛋白纳米颗粒在循环中保持稳定。如图11所示的,HSA-1252的大小在5到5000倍稀释后保持一致。
HSA-1252在带血行进时保持稳定
注射后,HSA-1252颗粒随血液传播并逐渐分布在组织中。为了测试纳米颗粒是否在循环中整合而不是解离,进行了将HSA-1252在5%HSA培养基中孵育并在37度摇动的实验。如图12所示的,HSA-1252在长达24h的生理条件下表现出强的稳定性。来自不同时间点的模式大小为约100nm,并且随着孵育时间没有显著变化。有趣的是,颗粒浓度没有随时间变化,证实了纳米颗粒在生理条件下没有解离或聚集的假设。
药物水解测定的体外测试
与临床制剂相比,纳米制剂显示出显著更好的血小板毒性(参见图13)。据推测,一个可能的原因可能是由于纳米制剂的1244的延迟水解。在4度下HSA-1252将1252水解为1244的速度降低。然而,在生理条件下(血清,37度,100rpm摇动)12小时,纳米组与临床使用的制剂相比,有1244%轻微下降。
体内药代动力学
另一个假设是白蛋白制剂降低了血液中APG-1252和BMS-1244的浓度。如图14所示的,与临床制剂相比,HSA制剂中APG-1252在血液中的分布明显更快。对于每个时间点,与临床使用的制剂相比,在HSA制剂中观察到浓度低2-5倍。同样,这种纳米制剂中的活性化合物BMS-1244在血液和血浆样品二者中也低得多。
结论
HSA-1252制剂在体外和体内均表现出强的稳定性。与Abraxene(紫杉醇的白蛋白制剂)不同,其是紫杉醇的白蛋白制剂并在稀释150-200倍后易于消散,HSA-1252即使在稀释5,000倍后仍稳定,并在血浆中保持结构长达24小时。HSA-1252在浓度为50mg/Kg时未显示出明显的血小板消耗,而临床使用的制剂则诱导显著的血小板消耗。这种增强可能是由于1252的血小板摄取或血液滞留时间减少以及药物水解减少。因此,HSA-1252被证明能够挽救APG-1252的血小板毒性,其进一步增强该药物的治疗窗口并达到更好的疗效。
实施例IX.
白蛋白稳态循环由新生儿Fc受体(FcRn)介导,因此白蛋白纳米颗粒的组织分布受到FcRn的影响,FcRn在许多细胞类型中广泛表达。临床使用的白蛋白制剂在胰腺和肺中达到与紫杉醇相似的浓度,而在胰腺和肺中的组织/血浆比显著高于紫杉醇,与与紫杉醇相比,这与Abraxane治疗胰腺癌和肺癌的卓越疗效相关。与紫杉醇相比,在III期临床试验中并未显示出优于紫杉醇的疗效。我们之前的数据确实表明,并没有改善胰腺、肺或乳腺的组织/血浆比,这解释了临床数据(参见Different nanoformulations alter the tissue distributionof paclitaxel,which aligns with reported distinct efficacy and safetyprofiles.Li F等人Mol.Pharm.2018)。这些结果表明,白蛋白纳米颗粒可以提高包封药物在胰腺、肺癌和转移性乳腺癌(肺是主要转移器官)中的组织/血浆比,从而提高药物在这三种癌症中的疗效。现在APG-1252的临床试验集中在肺癌上。假设白蛋白纳米颗粒将进一步提高药物在肺癌、胰腺癌和转移性乳腺癌中的疗效。为了证明这一假设,将进行实验以测试体内组织分布,以研究HSA-1252制剂和临床使用制剂的组织分布差异。测试HSA-1252是否可以提高1252在胰腺癌、肺癌和转移性乳腺癌中的疗效的体内疗效研究也将进行测试。
如图15所示的,纳米-1252能使APG-1252在乳腺内的积累增加2倍,其水解产物BMS-1244能增加1-1.5倍。纳米制剂的这种特殊性质可能会提高该药物在乳腺癌中的疗效。需要提及的是,BMS-1244在48小时内低于APG-1252的10%,因此认为仅APG-1252浓度与疗效有关。
另一方面,纳米-1252减少了结肠中的积累,这可能与结肠中较低的毒性相关。
实施例X.
本实施例描述了HSA-1252和APG-1252的细胞毒性。
在不同的癌细胞系中比较了HSA-1252和APG-1252的细胞毒性。将细胞接种于96孔板中,每孔3000个细胞,培养24h,每孔以连续稀释的方式加入适量的药物。孵育72h后,通过CellTiter 96TM水性非放射性细胞增殖试剂盒检测细胞增殖。
测试了HSA-1252和APG-1252单独或与依鲁替尼联用对套细胞淋巴瘤(B细胞非霍奇金淋巴瘤)细胞系Mino和Z138和Rec的细胞毒性。如图17所示的,HSA-1252和APG-1252单独在三种细胞系中的细胞毒性相似。依鲁替尼是临床上淋巴瘤和白血病的一线疗法,但其疗效受到获得性耐药性的限制。HSA-1252与依鲁替尼的组合大大增加了细胞毒性。
也测试了HSA-1252和APG-1252(单药)或与依鲁替尼联用对红白血病(erythroleukemic)HEL、巨核细胞白血病SET-2和鲁索替尼耐药HEL细胞系的细胞毒性。如图18所示的,HSA-1252和APG-1252单独在HEL和SET-2细胞系中的细胞毒性相似。HSA-1252与依鲁替尼的组合大大增加了在所有三种细胞系中的细胞毒性。
在乳腺癌细胞系HCC-1937、MDA-231和SUM149中比较了HSA-1252和APG-1252的细胞毒性。如图18所示的,与游离药物相比,HSA-1252显示出相似的疗效,这表明纳米制剂不会改变APG-1252的疗效。此外,HSA-1252增加了化疗药物Abraxane在所有三种细胞系中的细胞毒性。
通过援引并入
出于所有目的,本文引用的每个专利文件和科学文章的全部公开内容通过援引并入本文。
等价物
在不背离本发明的精神或本质特征的情况下,本发明可以以其他具体形式体现。因此,前述实施方式在所有方面都被认为是说明性的,而不是限制在此描述的本发明。因此,本发明的范围由所附权利要求书而不是由前面的描述来指定,并且落入权利要求书的等同意义和范围内的所有变化都旨在包含在其中。
序列表
<110> 密执安大学评议会(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN)
<120> 用于全身递送Bcl-2和Bcl-xL拮抗剂的组合物和方法
<130> PPI22171001US
<150> US 62/946,804
<151> 2019-12-11
<150> US 62/958,779
<151> 2020-01-09
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
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<400> 16
Val Pro Asp Pro Arg
1 5
Claims (13)
1.一种组合物,包括与癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的一种或多种拮抗剂缔合的纳米颗粒,其中,所述纳米颗粒是基于白蛋白的纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述组合物能够抑制癌细胞中的Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性。
4.根据权利要求1所述的组合物,其中,具有Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的一种或多种拮抗剂的所述纳米颗粒进一步与抗原缔合。
5.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述纳米颗粒的平均粒度在50-200nm之间。
6.根据权利要求1所述的组合物,其中,APG-1252的浓度在10-15mg/mL之间。
7.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述纳米制剂在APG-1252的外部具有非常稳定的纳米壳,其在循环中保持稳定;其中所述纳米壳能够通过以下机制降低APG-1252的血小板毒性:(1)降低血液循环中的浓度,(2)降低血小板摄取,(3)防止循环中APG-1252的过早降解。
8.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述纳米制剂能够提高APG-1252在制造和储存条件期间的稳定性;其中水解产物BMS-1244的百分比控制良好,并且未检测出其他相关物质;其中牢固结合的白蛋白纳米壳能够减缓APG-1252的水解并延长所述制剂的贮藏寿命。
9.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述纳米制剂能够提高APG-1252的溶解度;其中APG-1252的溶解度能够大幅度提高,并且满足10~15mg/ml的临床给药要求而无需添加表面活性剂。
10.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述Bcl-2和Bcl-xL蛋白活性的一种或多种拮抗剂选自BM-1244、ABT-737、ABT-263、ABT-199、A-1155463、氯化白屈菜红碱、氯化脱氢紫堇碱、S55746、WEHI-539盐酸盐、棉酚、TW-37、A-385358、(R)-(-)-乙酸棉酚、AZD4320、脱氢紫堇碱、HA14-1、BH3I-1、(R)-(-)-棉酚、(S)-乙酸棉酚、Navitoclax-哌嗪、MCL-1/BCL-2-IN-1、MCL-1/BCL-2-IN-3、Bcl-2-IN-2、BAD(103-127)、(+)-阿朴棉子酚、去吗啉基Navitoclax-NH-Me、口服可用BCL-XL选择性抑制剂A-1331852、XZ739(CRBN依赖性PROTAC BCL-XL降解剂)、PROTAC Bcl2降解剂-1和其他BCL-2家族抑制剂,诸如pan-bcl-2抑制剂Sabutoclax、奥巴克拉甲磺酸盐以及MCL-1抑制剂S63845、AZD-5991、(R)-MIK665(一种特定的Mcl-1抑制剂)、AMG-176、MIK665、A-1210477、Maritoclax、UMI-77、ML311和PROTAC Mcl1降解剂-1、黄花夹竹桃黄酮、MCL-I/BCL-2-IN-2和Pyridoclax。
11.一种治疗被诊断为患有癌症或有患癌症风险的受试者的方法,包括向所述受试者给药药学有效量的权利要求1所述的组合物,从而治疗瘤形成。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述组合物与化疗剂(例如,阿地白介素、六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、博来霉素、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、克拉立滨、西沙必利、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、多西他赛、多柔比星、屈大麻酚、依泊汀α、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、格拉司琼、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、甲酰四氢叶酸、甲地孕酮、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧氯普胺、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥美拉唑、昂丹司琼、紫杉醇(TAXOL)、毛果芸香碱、丙氯拉嗪、利妥昔单抗、他莫昔芬、泰素、盐酸拓泊替康、曲司珠单抗、长春碱、长春新碱和酒石酸长春瑞滨)共同给药。
13.根据权利要求11所述的方法,其中,所述癌症选自乳腺、卵巢、前列腺、肺、肾、胃、结肠、睾丸、头颈、胰腺、脑、黑色素瘤和其他组织器官肿瘤,癌转移至淋巴结,以及起源于骨髓的血液肿瘤,诸如淋巴瘤和白血病,包括急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、T细胞淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤。
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