CN114774328A - 一株能下调il-17并缓解便秘的短双歧杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能下调IL‑17并缓解便秘的短双歧杆菌及其应用，属于微生物领域。本发明提供的短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260能够有效缓解便秘小鼠的首粒黑便时间、肠道推进率以及粪便含水量，具有明显改善便秘表观病理指标的作用；拥有优良的吸附苯并芘的能力；在炎症指标的检测中，短双歧杆菌对于促炎因子IL‑17和IL‑1β具有显著的下调作用，更加适合伴有肠道炎症的便秘患者。

Description

一株能下调IL-17并缓解便秘的短双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株能下调IL-17并缓解便秘的短双歧杆菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
随着饮食结构变化及生活节奏的改变，便秘患者的数量越来越多，虽然便秘不会直接威胁人们的生命安全，但是这种疾病所带来的危害却是不容忽视的。具体体现在：便秘可以加重原有的消化道症状，如消化功能进一步紊乱、导致和加重肛门直肠疾病，长期便秘可能导致结肠恶性肿瘤；便秘患者用力排便可诱发心脑血管事件；部分肠道内代谢产物可影响大脑功能；便秘患者生活质量明显下降，并且患者可能出现情绪障碍。
根据罗马Ⅳ标准，便秘患者的判断标准：至少25％的排便感到费力；至少25％的排便为 干球状便或硬便；至少25％的排便有肛门直肠阻塞感或梗阻感；至少25％的排便需要手法帮 助(如用手指助便、盆底支持)；便次<3次/周；在不使用泻药时很少出现稀便等现象。
便秘的病因机制可能是多因素的，例如部分药物治疗的副作用，本身生活的不规律、不 健康，或是由炎症、分泌功能障碍、胃肠道运动障碍和胃肠道神经支配改变等多种原因共同 作用，从而使肠道组织发生病理损伤，减缓肠道蠕动，或是肠道对粪便中水分的重吸收有所 增加，使粪便的排泄时间与排便频率得到很大程度的改变。
正是由于便秘这种疾病的多种特点，疾病的治疗越来越得到众多的关注。其中治疗的手 段包括食物中多添加富含膳食纤维的食物，增加自己的运动量，改善不良作息，症状严重者 可以使用渗透性或刺激性泻药，如聚乙二醇、乳果糖或蒽醌衍生物等，但是这类泻药常会引 起依赖性，甚至恶心、腹痛、腹泻等副作用。现阶段，利用益生菌来缓解便秘是一种新兴的、 效果良好且副作用较小的一种方法，但其具体的缓解机制等还需要得到更深入的研究。
虽然有研究人员通过检测便秘患者粪便标本及结肠黏膜菌群后发现，便秘患者结肠黏膜 及粪便标本中双歧杆菌属水平较正常人群相比均降低，同时粪便标本中乳酸杆菌属比例也有 所减少，但是具体采用何种双歧杆菌能够有效的缓解便秘，还需要研究。
苯并芘(Benzopyrene)作为一种含苯环的稠环芳烃化合物，广泛存在于环境中，是一种 高活性的致癌物和诱变剂，具有胚胎毒性。苯并芘在人体内降解速度缓慢，仅仅靠机体自身 没有办法将苯并芘含量降解到安全水平，极大影响人体健康。有研究证明，双歧杆菌的菌体 对苯并芘具有吸附作用。
而目前大多是采用双歧杆菌三联或者四联活菌来治疗便秘，双歧杆菌三联或者四联活菌 是一种混菌益生菌，需要多种益生菌共同作用。
目前，针对双歧杆菌相关的生理特性与功能特性等研究已有国内外的学者正在进行，但 仍旧存在一些不清晰的途径与机制，需要继续探究下去。无论是将其直接食用还是制成其他 功能性食品，都有非常大的应用前景，不仅能够预防便秘疾病的发生还能缓解便秘的症状， 还能调节肠道菌群的组成。通过对双歧杆菌缓解便秘进行研究，将会对食品科学、微生物学 以及预防医学等各方面产生巨大的影响，由于现有技术所面临的具有缓解便秘作用的双歧杆 菌功能单一且部分功能较不突出，因此，需要进行双歧杆菌对便秘缓解作用的研究。
发明内容
技术问题
本发明要解决的技术问题是，提供一株主要针对肠道炎症状态和胃肠活性肽、微生物的 代谢产物及从而能够有效缓解便秘的短双歧杆菌，并且提供该菌株的应用。
技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株短双歧杆菌(B.breve)，该菌株与模型组相比， 白细胞介素17下调了35.8％，白细胞介素1β下调了62.4％，小肠推进率增加64.6％，粪便含 水量增加了14.2％，首粒黑便时间减少了29.4％，提供相应益生菌制剂、发酵食品以及功能 性食品，从而预防及缓解便秘及其导致的炎症。
本发明提供了一株短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260，所述短双歧杆菌CCFM1260于2022 年4月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号 楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62366。
所述短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260是从北京市9月龄男性的粪便中分离筛选出的，该 菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBIStandard Nucleotide BLAST中进行核酸序列比对，结果显示与双歧杆菌属的核酸序列相似度为100％； 结果显示菌株为短双歧杆菌，将其命名为短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260。
在本发明的一种实施方式中，所述短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260具有下述生物学特性：
(1)菌体特征：为革兰氏染色阳性的无芽孢杆菌，菌体约0.5-1.3μm×1.5-8μm，多形性 明显。
(2)菌落特征：在含0.1％L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基上划线培养48h后形成明显的菌落，直径在0.2-2.5mm之间，圆形，凸面或透镜状，微白，不透明，有平滑至粘液状 的柔软表面，不形成菌丝体。
(3)生长特性：该菌株最适生长温度为36-38℃，32-38℃生长良好，但是能够在45℃ 下进行生长，成活率高。最适初始pH为6-7，pH 5.5或以下生长较少。在含有葡萄糖的培养 液中厌氧培养生长良好，培养20h即进入对数期后期或稳定期前期，液体管混浊，最终pH为4.0-4.8。
(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力。
(5)具有粘附性，能够较好的粘附在结肠癌细胞HT-29上。
(6)能显著提高便秘小鼠的粪便含水量、降低首粒黑便时间以及增加小肠推进率，下调 结肠组织白细胞介素-17和白细胞介素-1β，进而缓解便秘及便秘带来的炎症，且效果良好。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述短双歧杆菌(B.breve) CCFM1260。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂含有所述短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260 的湿菌体或冻干后的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260在微生物菌剂中的添 加量不低于1×108CFU/g或1×108CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂的制备方法包括，将短双歧杆菌CCFM1260 以体积比4％的接种量接种于培养基中活化获得菌液，用缓冲液清洗菌液后，使用冻干保护剂 进行重悬，于35～38℃厌氧条件下预培养50～70min，再在-15～(-20)℃预冻8～14h，真空冷冻 干燥制得。
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌制剂制备方法包括，将培育在含0.08％L-半胱 氨酸盐酸盐的MRS培养基中的短双歧杆菌CCFM1260，以体积比4％的接种量接种于同样培 养基中活化获得菌液，用pH为6.8～7.2磷酸盐缓冲液清洗菌液2次，使用冻干保护剂进行重 悬，控制菌液浓度大于1010CFU/mL，于37℃厌氧条件下预培养50～70min，再在-15～(-20)℃ 预冻8～14h，真空冷冻干燥制得。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂含有130g/L脱脂奶粉、20g/L蔗糖、20g/L 海藻糖，余量为水。
本发明还提供了一种用于缓解便秘的产品，所述产品中含有上述短双歧杆菌(B.breve) CCFM1260，或上述微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括食品或药品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260、药物 载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润 湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括但不限于颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸 剂或口服液。
本发明还提供了一种用于缓解便秘并缓解结肠炎症的产品，所述产品中含有上述短双歧 杆菌(B.breve)CCFM1260，或上述微生物制剂。
本发明还提供了一种发酵食品，所述发酵食品包括固态发酵食品、液态发酵食品或半固 态发酵食品。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品或果蔬制品。
在本发明的一种实施方式中，所述乳制品包括发酵乳制品、含乳饮料以及乳粉；所述豆 制品包括豆奶、豆乳饮料、豆乳粉；所述果蔬制品包括甜菜、白菜、胡萝卜、白萝卜、海带、 黄瓜、黄桃、荔枝、杨梅制品。
本发明还提供了上述短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260，或上述微生物菌剂在制备缓解便 秘并缓解结肠炎症的产品中的应用。
本发明还提供了上述短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260，或上述微生物菌剂在制备缓解便 秘的产品中的应用。
本发明还提供了上述短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260，或上述微生物菌剂在制备具有如 下至少一种功能的药物或功能性食品中的应用：
(a)促进肠道蠕动，提高粪便含水量，提高小肠推进率/全肠道蠕动；
(b)下调结肠组织中细胞白介素17和白细胞介素1β含量；
(c)具有优秀的吸附苯并芘的能力。
有益效果
(1)本发明的短双歧杆菌CCFM1260活力保持良好，且具有一定的耐酸碱性与粘附性， 能显著提高便秘小鼠的粪便含水量，首粒黑便时间比模型组缩短了29.4％，小肠推进率比模 型组提高了45.1％，结肠组织中的炎症因子白细胞介素17(IL-17)较模型组小鼠明显下调了 35.8％，同时，结肠组织中的白细胞介素1β(IL-1β)比模型组小鼠明显下调了62.4％。
(2)本发明的短双歧杆菌CCFM1260能够吸附致癌物质苯并芘，苯并芘吸附率为86.65％，比短双歧杆菌CCFM642高出40.37％，比短双歧杆菌ATCC15701高出31.61％。
(2)短双歧杆菌CCFM1260，能够明显下调炎症指标并提高小肠推进率，不仅能够减轻 结肠的炎症进而缓解便秘，与通过泻药缓解便秘的方法相比，避免一定副作用减少肠道损伤。 因此，本发明的短双歧杆菌CCFM1260可以用于制备缓解或治疗便秘的药物。短双歧杆菌属 于《可用于食品的菌种名单》中的一种，还可以应用于食品中，从而广泛发挥其作用，具有 广阔的应用前景。
生物材料保藏
一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1260，其分类学命名为Bifidobacterium breve，已于2022年4月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No： 62366，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
附图说明
图1：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260菌株对用洛哌丁胺诱导产生便秘的小鼠缓解便秘 相关指标的示意图；A：首粒黑便时间，B：小肠推进率，C：粪便含水量。
图2：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠结肠中白 细胞介素17(IL-17)含量变化示意图。
图3：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260菌株干预后，洛哌丁胺诱导便秘的小鼠结肠中白 细胞介素1β(IL-1β)含量变化示意图。
图4：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260吸附苯并芘能力示意图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的雄性BALB/c小鼠购自江苏南京集萃药康生物科技有限公司。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：牛肉膏10g；胰蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；无水乙酸钠5 g；MgSO4·7H2O 0.1g；MnSO4·H2O 0.05g；柠檬酸氢二铵2g；K2HPO4·3H2O 2.6g；吐温80 1mL；L-半胱氨酸盐酸盐0.8g；定容至1L；调节pH为6.8±0.2。高压蒸汽灭菌115℃，20min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加2％琼脂粉。
MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸的液体培养基：在MRS液体培养基的基础上 添加0.08％半胱氨酸盐酸盐。
下述实施例中所涉及的短双歧杆菌菌悬液的制备
将短双歧杆菌划线接种至MRS固体培养基中，在37℃条件下培养72h得到单菌落，将 制备得到的单菌落接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h进行活化；
将活化3代后的菌液以2％的接种量接种至1L的MRS液体培养基中，振荡混匀后于厌 氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用无菌生理盐水(含0.05％-0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐)进行清洗2次，同样以相同条件进行离心，去上清后，用10％的脱脂乳进行重悬，根据灌胃所需要的菌体浓度以及灌胃量分装再进行冻干获 得灌胃前备用菌粉，-80℃冰箱冻存2周。
在进行动物实验前，将冰箱中冻存的菌粉取出，加入定量的无菌生理盐水得到菌悬液， 震荡均匀后用平板倾注法测定初始和冻存2周后的活菌数量。
实验结果：初始活菌数为5×109CFU/mL，冻干2周后活菌数为4.1×109CFU/ml，数量级并没有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。
实施例1：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260的获得
具体步骤如下：
1、双歧杆菌菌株的分离筛选：
(1)使用一次性无菌取便器采集北京市9月龄男性的粪便，将粪便样品在含有低聚果糖 的MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸的液体培养基中，于厌氧培养箱 (N2:CO2:H2＝80:10:10)中富集12h；
(2)将粪便样品用无菌生理盐水进行梯度稀释后涂布于添加了无菌的100μg/mL莫匹罗 星、50U/mL制霉菌素的MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)L-半胱氨酸盐酸盐的固体平板上， 培养24-48h；
(3)选取符合双歧杆菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出双歧杆菌所选 菌株；
(4)将上述单菌落培养于液体MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸培养液中培 养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。
2、双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
(1)将步骤1所筛选得到的革兰氏阳性菌菌株在液体MRS+质量百分数(0.05％-0.1％) 半胱氨酸培养基中培养24h，然后取1mL培养物8000rpm离心2min；
(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸的pH 6.5的0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
(3)重悬于200μL添加了0.25％(质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；
(4)添加50μL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50μL浓度 为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
(5)添加300μL浓度为0.139g/mL、pH 6.5的盐酸轻胺，并于室温放置10min；
(6)分别添加200μL 15％(质量百分数)的三氯乙酸和4M HCl；
(7)添加200μL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1M HCl，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌。
3双歧杆菌的分子生物学鉴定
(1)取步骤2筛选出并且活化3代的菌体(培养12-48h)1mL用于菌种鉴定，6000r/min 离心3min，弃上清得菌体。
(2)加入1mL无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心1min，弃上清得菌体，加入500μL无菌水重悬，作为菌液模板。
(3)16S rDNA PCR体系：
A.细菌16S rDNA，20μL PCR反应体系：
27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，1μL；模板，1μL；ddH2O，8μL。
B.PCR条件：
94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃2min；72℃10min；step2-4 30×；12℃2min。
(4)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×Loading buffer混合，上样量2μL， 120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(5)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，其序列结果为序列如SEQ ID NO.1所示，并将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果，结果显示菌株为短双歧杆菌，将其命名为短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260，-80℃保藏备用；
实施例2：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260对洛哌丁胺诱导产生便秘相关症状的缓解
具体步骤如下：
(1)短双歧杆菌CCFM1260的制备
将短双歧杆菌CCFM1260菌种于-80℃冰箱取出后，划线于MRS固体培养基中，37℃厌 氧培养48h，挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，制备得到种子液；
将制备得到的种子液以2％(v/v)的接种量接种于新的MRS液体培养基中，于37℃厌 氧培养24h，按照同样的方式再次培养一代，制备得到短双歧杆菌CCFM1260发酵液；
然后将制备得到短双歧杆菌CCFM1260发酵液在6000r/min、4℃条件下离心5min，用 10％的脱脂乳进行重悬，制得菌悬液，可用于动物实验。
(2)取5周龄的健康雄性BABL/c小鼠30只，适应环境1周，随机分为5组：对照组、 模型组、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM642组(该菌株公开于DOI： 10.3389/fmicb.2019.01721的论文中)、短双歧杆菌组CCFM1260组和短双歧杆菌ATCC15701 (购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection,ATCC))组，每组含小鼠6 只，灌胃菌悬液的剂量为5×109CFU/mL，每天早上9点开始灌胃，每次0.2mL。
实验动物分组及处理方法见表1：
表1实验动物分组
Figure BDA0003641690400000081
在第35天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿 重。冻干后，称重即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。
粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重
在第34天，空白对照组给予0.2mL无菌水，模型组、长双歧杆菌CCFM642组、短双 歧杆菌组CCFM1260组和短双歧杆菌ATCC15701组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(20 mg/kgb.w)，1h后，分别向每组灌胃墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠排首粒黑便 的时间。
第35天，各组小鼠禁食不禁水过夜。第36天，对照组灌胃0.2mL生理盐水，模型组、长双歧杆菌CCFM642组、短双歧杆菌组CCFM1260组和短双歧杆菌ATCC15701组均灌胃 0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(20mg/kg b.w)，30min后，各组分别灌胃墨汁，30min后处死 小鼠，打开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到 墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照以下公式计算小肠推进率。
小肠推进率(％)＝(墨汁推进长度(cm))/(小肠总长度(cm))×100％
粪便含水量、排首粒黑便时间、小肠推进率实验结果如图1所示，由图1可知，灌胃短 双歧杆菌CCFM1260后小肠推进率可达69.45％，比便秘模型组提高了45.1％(P<0.0001)， 粪便含水量可达48.46％，比便秘模型组提高了5.7％(P＝0.3787)；灌胃短双歧杆菌CCFM1260 后显著缩短排首粒黑便时间(189.6min)，比便秘模型组缩短了29.4％(P＜0.0001)。
其中小肠推进率与首粒黑便时间这两项指标都显著优于长双歧杆菌CCFM642和短双歧 杆菌ATCC15701，能够显著提升小鼠肠道蠕动速率。综上，短双歧杆菌CCFM1260具有提升 肠道蠕动能力，从而缓解便秘的功能。
实施例3：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260下调便秘小鼠结肠组织中白细胞介素17(IL-17) 含量
(1)BABL/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
(2)第36天处死小鼠后，将收集到的小鼠结肠组织进行破碎研磨，制成匀浆，12000g， 15min离心取上清，采用小鼠白细胞介素17检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线 计算出结肠组织白细胞介素17的浓度，利用BCA总蛋白试剂盒测得结肠组织的总蛋白含量， 最终结果为白细胞介素17与总蛋白浓度的比值。
实验结果如图2所示，由图2可知，使用洛哌丁胺进行造模后，模型组小鼠结肠中白细胞 介素17相对含量(与总蛋白含量的比值为6.278×10-7)与对照组小鼠(与总蛋白含量的比值 为4.190×10-7)相比显著提升了49.8％(P＝0.0036)，这表明模型组小鼠的促炎细胞因子的含 量提升，结肠更容易产生炎症。
灌胃短双歧杆菌CCFM1260后，小鼠结肠中的白细胞介素17的含量(与总蛋白含量的比 值为4.033×10-7)比模型组小鼠明显下调了35.8％(P＝0.0019)。长双歧杆菌CCFM642对于IL-17 无显著的下调作用(P＝0.1107)，短双歧杆菌ATCC15701对于IL-17也无显著的下调作用 (P＝0.6826)。
白细胞介素17是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性 反应和免疫反应，是公认的炎症因子，与血液、消化、尤其是心血管系统疾病密切相关。白 细胞介素17含量下降，对于结肠便秘导致的结肠慢性炎症具有缓解作用，进而缓解便秘。
实施例4：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260下调便秘小鼠结肠组织中白细胞介素1β(IL-1β) 含量
(1)BABL/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。
(2)第36天处死小鼠后，将收集到的小鼠结肠组织进行破碎研磨，制成匀浆，12000g， 15min离心取上清，采用小鼠白细胞介素1β检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线 计算出结肠组织白细胞介素1β的浓度，利用BCA总蛋白试剂盒测得结肠组织中的总蛋白含量， 最终结果为白细胞介素1β与总蛋白浓度的比值。
实验结果如图3所示，由图3可知，使用洛哌丁胺进行造模后，模型组小鼠结肠中白细胞 介素1β相对含量(与总蛋白含量的比值为2.288×10-6)与对照组小鼠(与总蛋白含量的比值 为1.553×10-6)相比显著下降了47.3％(P＝0.0276)，这表明模型组小鼠的促炎细胞因子IL-1β 含量上升，结肠炎症程度更高。而灌胃短双歧杆菌CCFM1260后，结肠中白细胞介素1β的含 量(与总蛋白含量的比值为0.859×10-6)比模型组小鼠显著下调了62.4％(P＝0.0001)。
IL-1β是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放 大炎症反应。CCFM1260组白细胞介素1β含量下降，对于结肠便秘导致的结肠慢性炎症具有 缓解作用，进而对于便秘的缓解具有显著作用。
实施例5：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260能吸附苯并芘
将实施例2中得到的短双歧杆菌CCFM1260的发酵液在6000r/min、4℃条件下离心5min，离心获得的菌泥用无菌生理盐水重悬至菌体浓度调整为5×108CFU/mL，取1mL菌悬液，4℃，8000r/min离心10min，弃上清得到菌体，加入1mL工作液(先使用1mg苯并芘 溶于10mL二甲基亚砜中，再取1mL该混合液溶于9mL的无菌去离子水中，得到浓度为 10μg/mL的苯并芘工作液)。37℃培养4h后，8000r/min离心10min，收集上清作为样品。 加入0.5mL氯仿，避光过夜。取有机相，用HPLC检测苯并芘的含量。以不含菌体的工作液 为阳性对照，含同等浓度菌体的无菌蒸馏水为阴性对照。用高效液相色谱仪，Insert Sustain C18 色柱进行检测，紫外检测波长为290nm，流动相为色谱级纯乙醇，柱温为39.9℃，流速1 mL/min，进样量为20μL。
双歧杆菌菌体对苯并芘的吸附率(％)＝[(阳性对照中苯并芘的含量-样品中苯并芘的含 量)/阳性对照中苯并芘的含量]×100％
结果如图4所示，短双歧杆菌CCFM1260的苯并芘吸附率为86.65％，比短双歧杆菌CCFM642高出40.37％(P＝0.0035)，比短双歧杆菌ATCC15701高出31.61％(P＝0.0085)， 显示出优异的吸附苯并芘的能力。
实施例6：利用本发明短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260制造发酵食品
选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后， 立即降温至37℃，再接入本发明制备的短双歧杆菌CCFM1260菌剂发酵剂，使其浓度达到 108CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明短双歧杆菌CCFM1260活菌 的果蔬饮料。
利用本发明能够使用短双歧杆菌CCFM1260发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品 包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所 述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
本发明制备的发酵食品能够缓解小鼠的便秘症状，下调小鼠结肠组织的IL-17和IL-1β 含量，缓解结肠的炎症。
实施例7：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260的应用
具体步骤如下：
短双歧杆菌CCFM1260可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
挑取实施例1获得的短双歧杆菌CCFM1260的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用pH为7.4 的PBS缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用含有130g/L脱脂乳、20g/L 海藻糖和20g/L蔗糖的保护剂溶液将短双歧杆菌CCFM1260菌体重悬至细胞浓度为1×1010 CFU/mL，得到短双歧杆菌CCFM1260菌液；将短双歧杆菌CCFM1260菌液冷冻干燥，得到 短双歧杆菌CCFM1260菌粉；冻干菌粉占总份额的10％，其次依次加入总重计2％硬脂酸作 润滑剂，3％CMC-Na，15.5％低聚半乳糖，7.8％低聚木糖，7.8％菊粉、乳糖醇、赤藓糖醇、 木糖醇，并加入淀粉等其它辅料进行压片，得到片剂。
取1g片剂灌胃便秘模型小鼠，能够缓解小鼠的便秘症状，下调小鼠结肠组织的IL-17和 IL-1β含量，缓解结肠的炎症。
实施例8：短双歧杆菌(B.breve)CCFM1260的应用
具体步骤如下：
短双歧杆菌CCFM1260可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
挑取实施例1获得的短双歧杆菌CCFM1260的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃ 培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中， 于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养 基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用pH为 7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心1 0min，得到菌体；用含有130g/L脱脂乳、 20g/L海藻糖和20g/L蔗糖的保护剂溶液将短双歧杆菌CCFM1260菌体重悬至细胞浓度为1 ×1010CFU/mL，得到短双歧杆菌CCFM1260菌液；将短双歧杆菌CCFM1260菌液冷冻干燥， 得到菌粉。
取含活菌总数1×109CFU的菌粉每天灌胃便秘模型小鼠，能够缓解小鼠的便秘症状，下 调小鼠结肠组织的IL-17和IL-1β含量，缓解结肠的炎症。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株能下调IL-17并缓解便秘的短双歧杆菌及其应用
<130> BAA220006A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 442
<212> DNA
<213> Bifidobacterium breve
<400> 1
gccgtcatca aagtcggcgc ggccaccgag gtcgaggcca aggagcgtaa gcaccgcatc 60
gaagacgccg tgcgcaacgc caaggccgct atcgaagagg gcctgctgcc cggcggtggc 120
gtggcgctcg tccaggctgc caagaaggcc gagtccgcag aagccgtcac ttcgctgacc 180
ggcgaagagg ccactggtgc cgccatcgtg ttccgcgcca tcgaggcccc gatcaagcag 240
atcgccgaga actccggcgt gtccggtgac gtggtgttca acaaggttcg cgagctgccg 300
gagggtcagg gtttcaacgc cgccaccgac acctacgagg atctgctggc cgccggcgtc 360
gccgacccgg tcaaggtcac ccgctccgct ctgcagaacg ccgcgtccat cgccggcctg 420
ttcctgacac ccgaaggagc tt 442

Claims (10)

1.一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1260，已于2022年4月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：62366。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1260。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述短双歧杆菌CCFM1260在微生物菌剂中的添加量不低于1×108CFU/g或1×108CFU/mL。
4.如权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
5.一种用于缓解便秘的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1260，或权利要求2～4任一所述的微生物制剂。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为食品或药品。
7.一种发酵食品，其特征在于，所述发酵食品为利用权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1260或权利要求2～4任一所述的微生物制剂发酵制备得到的发酵食品。
8.根据权利要求7所述的发酵食品，其特征在于，所述发酵食品包括固态发酵食品、液态发酵食品或半固态发酵食品。
9.权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1260或权利要求2～4任一所述的微生物菌剂在制备缓解便秘的产品中的应用。
10.权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1260或权利要求2～4任一所述的微生物菌剂在制备具有如下至少一种功能的药物或功能性食品中的应用：
(a)下调结肠组织中白细胞介素17和白细胞介素1β含量；
(b)促进肠道蠕动，提高粪便含水量，提高肠道推进率，减少首粒黑便时间；
(c)具有优异的吸附苯并芘的能力。
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